МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

ОРЛОВА ОЛЕНА АНАТОЛІЇВНА

УДК : 616.45-0001.1/.3-02: 546.-21:591

Модуляція апоптозу і внутрішньониркові регуляторні системи при
експериментальній нирковій недостатності

14.01.32 — медична біохімія

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ — 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Луганському державному медичному університеті МОЗ
України.

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор Комаревцева

Ірина Олександрівна, завідувач кафедри

медичної хімії Луганського державного

медичного університету МОЗ України.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Левицький Євген Леонідович,
провідний науковий співробітник Інституту фармакології та токсикології
АМН України (Київ);

доктор медичних наук, професор Гоженко Анатолій Іванович, завідувач
кафедри загальної патофізіології Одеського державного медичного
університету;

доктор біологічних наук, професор Дмитренко Микола Петрович, завідувач
біохімічної лабораторії Інституту екогігієни і токсикології ім. Л.І.
Медведя (Київ).

Провідна установа:

Інститут геронтології АМН України, відділ біохімії (Київ).

Захист дисертації відбудеться 01.12.2005 р. о 1330 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.003.07 при Національному
медичному університеті ім. О.О.Богомольця (м. Київ, пр.Перемоги, 34,
фізико-хімічний корпус НМУ).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного
університету ім. О.О.Богомольця (м. Київ, пр. Перемоги, 34,
фізико-хімічний корпус НМУ).

Автореферат розісланий 01.11.2005 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Толстих О.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Гостра ниркова недостатність (ГНН), викликана
ішемією/гіпоксією, проявляється складним симптомокомплексом
патофізіологічних змін в нирках. Одним з них є апоптоз. У зв’язку з
вивченням апоптозу виникла необхідність перегляду ряду концептуальних
основ в біохімічних механізмах ниркових патологій [Єрмоленко В.М.,2000,
De Broe M.E., 2001, Noiri E., 2001, Ueda N.,2000].

Ішемія/гіпоксія в органах та клітинах викликає апоптоз через зміни ва
мітохондріях, внаслідок утворення вільних радикалів, проникності
мітохондріальної мембрани та виділенню апоптогенных факторів, таких як
цитохром с і білків сімейства Вс1-2. Є дані про залучання опіоїдних
рецепторів до протекторних механізмів „ішемія/реперфузійного” синдрому,
так званого феномену „ішемічного прекондиціювання” [Реброва Т.Ю. ,
Маслов Л.Н., Лишманов А.Ю, 2001, Лишманов Ю.Б., Маслов Н.М., 2003, Krick
S., Platoshyn O., Sweeney M, 2001]. Замість колишніх уявлень про
загибель клітин багатоклітинного організму як негативне по значущості
явище, що ідентифікується з некрозом, сформувався новий погляд, згідно з
яким загибель частини клітин в межах організму є закономірним і
необхідним процесом , саме існування багатоклітинного організму має на
увазі баланс життя і смерті на рівні клітинних популяцій, що його
складають.

Біохімічні механізми регуляції апоптозу дуже складні і, як показали
дослідження останніх років, практично не змінилися в процесі еволюції,
що дає основу судити про фундаментальну біологічну роль апоптозу.

Механізми розвитку апоптозу, його індуктори і супресори вивчаються на
експериментальних моделях. Однією з класичних експериментальних моделей
апоптозу в нирках є гостра ниркова недостатність (ГНН).

При гострій нирковій недостатності (ГНН) ішемічного, токсичного або
обструктивного генезу апоптоз розвивається в клітинах канальців. У цих
випадках має місце і некроз клітин, і ще невідомо, який з цих двох
ініційованих механізмів загибелі клітин є ведучим. При різних фазах ГНН
швидкість апоптозу нерівномірна: він може персистирувати або
сповільнюватися [Wang W,2003]. Апоптоз при ГНН також може розвиватися як
адекватна відповідь на пошкодження. У цих випадках це розглядається як
фізіологічний баланс контролю і заборони перебільшеної компенсаторної
проліферації.

При гострій нирковій недостатності змінюється експресія і позаклітинних,
і внутрішньоклітинних чинників регуляції апоптозу.

Актуальність проблеми полягає в можливості корекції цього процесу при
різних захворюваннях, в тому числі ниркових. Відомо, що запуск клітинної
загибелі, що програмується, здійснюється як специфічними сигналами
(цитокинами, гормонами), так і неспецифічними (радіація, гіпертермія,
ішемія, окислювальний стрес) [Goligorsky M.S, 2002]. Причому, може
відбуватися як індукція апоптозу, так і його супресія. Порушення
регуляції апоптозу приводить до виникнення різних захворювань,
пов’язаних з посиленням або, навпаки, ингібуванням апоптозу. І, навпаки,
деякі захворювання можуть приводити до виражених порушень регуляції
апоптозу, які спричиняють розвиток запалення, імунодефіциту, анемії,
поліорганної недостатності і т.і. Отже, вивчення біохімічних механізмів
регуляції даного процесу при різній патології дозволить певним чином
впливати на окремі його етапи з метою їх корекції. Можна виділити два
напрямки у вивченні апоптозу. З одного боку, досліджуються існуючі
сигнальні і рецепторні шляхи, що регулюють апоптоз. Ці дані можна
використати, застосовуючи ендогенні медіатори. З іншого боку, ведеться
пошук речовин, здатних направлено впливати на процеси апоптозу,
пригноблюючи або активуючи його. Відомі на сьогодня морфологічні і
біохімічні маркери апоптозу повинні в перспективі сприяти більш
глибокому розумінню механізмів патогенезу захворювань, поліпшенню
диференціальної діагностики і створенню принципово нових напрямів
терапії.

Мета дослідження. Встановити роль біохімічних регуляторних систем нирок
— опіоїдних рецепторів, обміну оксиду азоту, КАТФ-каналів,
сфінгомієлин-сфінгозинового шляху, ангіотензинової і простаноїдної — в
модуляції апоптозу при експериментальній гострій нирковій недостатності.

Завдання дослідження:

Розробити моделі стимульованого апоптозу в умовах експериментальної
гострої ниркової недостатності (ГНН) (преренально-гемодинамичної;
ренальної ) з біохімічною верифікацією патологічного процесу.

Вивчити ступінь розвитку апоптотичних процесів біохімічно за
ДНК-фрагментацією в зіставленні з морфологічною детекцією при
використанні ядерного барвника Хехст в нирковій тканині за умов розвитку
експериментальної гострої ниркової недостатності.

З’ясувати наявність експресії індуцибельної синтази оксиду азоту за
вмістом стабільних метаболітів оксиду азоту нітрит- і нітрат-аніонів в
тканині нирок при різних моделях гострої ниркової недостатності.

Виявити біохімічні механізми модуляції апоптотичних процесів в нирках
через активацію опіоїдних рецепторів.

Встановити роль опіоїдних рецепторів в регуляції К+АТФ-каналів
мітохондрій в нирках за умов стимульованого апоптозу.

Розглянути ангіотензинову і простаноїдну системи нирок як фактори
модуляції апоптозу при експериментальній гострій нирковій недостатності.

Вивчити активність сфінгомієлінового метаболічного шляху в нирках, як
одного з сигнальних шляхів апоптозу при експериментальних моделях ГНН.

Провести кореляційний аналіз взаємозв’язку між активацією
сфінгомієлінового метаболічного шляху і активністю ключових ферментів
(лактатдегідрогенази, супероксиддисмутази) , і активацією інших участків
обміну (протеолізу) в нирках в умовах стимульованого апоптозу.

Вивчити ЯМР-релаксацію протонів тканинної води нирок при
експериментальній гострій нирковій недостатності.

Дослідити ЯМР-параметри в нирках за умов модуляції апоптозу.

Об’єкт дослідження: нирки, плазма крові, сеча білих щурів статевого віку
при експериментальних моделях гострої ниркової недостатності.

Предмет дослідження: стан апоптотичного процесу в нирках при
експериментальних моделях гострої ниркової недостатності.

Методи дослідження: спектрофотометричний, електрофорез, диференціальне
центрифугування, тонкошарова хроматографія, ЯМР-релаксометрія,
флуоресцентна мікроскопія та статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Встановлено, що біохімічні і
морфологічні зміни в клітинах нирок, пов’язані з активацією апоптотичних
процесів, мають однотиповий якісний та кількісний характер як при
„ішемія-реперфузійному синдромі”, так і при „гліцерольній ” моделі
гострої ниркової недостатності. Модифікований метод визначення вмісту
оксиду азоту за його кінцевими метаболітами – нітрит- і нітрат-аніонам в
тканинах і біологічних рідинах. Вперше на різних моделях ГНН встановлена
активація метаболічного шляху сфінгомієлину , що пов’язано із зниженням
вмісту сфінгомієлину і підвищенням рівня вільних сфінгоїдних основ в
тканині нирок. Вперше виявлено кореляційний зв’язок між активацією
метаболічного шляху сфінгомієлину і активністю ключових ферментів
(лактатдегідрогеназа, супероксиддисмутаза), активацією протеолізу в
тканині нирок за умов стимульованого апоптозу. Вперше в опитах in vivo
показано інгібіторну дію даларгіну, каптоприлу і стимулюючу дію
індометацину на програму клітинної загибелі в умовах розвитку ГНН.
Вперше на моделях ГНН розкрито антиапоптотичний механізм стимуляції
д-опіоїдних рецепторів через активацію К+АТФ – каналів мітохондрій і
активацію NO – синтази і – проапоптотичний механізм в нирках інтактних
щурів, котрий реалізується не через д-опіоїдні рецептори. Встановлено,
що на початковій стадії розвитку ГНН помірна гіперпродукція оксиду азоту
в нирках носить цитотоксичний характер. Але підвищений вміст оксиду
азоту при інгібуванні індуцибельної NO-синтази вказує на його
компенсаторну роль. Отримані дані дозволяють судити про біфункціональний
характер дії оксиду азоту при експериментальній гострій нирковій
недостатності. Вперше отримано ЯМР-показники ниркової тканини за умов
розвитку експериментальної ГНН і при модуляції програми клітинної
загибелі. Встановлено, що модуляція апоптозу через регуляторні
внутрішньониркові системи пов’язана із зміною ЯМР-релаксації протонів
тканинної води.

Обґрунтованість і достовірність наукових положень, висновків та
рекомендацій. Обґрунтованість і достовірність роботи забезпечена значним
об’ємом експериментальних досліджень: 1 модель гострої ниркової
недостатності — 324 щурів, 11 модель гострої ниркової недостатності 288
щурів, експериментальні групи 1 моделі із застосуванням модуляторів 396
щурів, експериментальні групи 11 моделі із застосуванням модуляторів —
396 щурів, експериментальні групи інтактних тварин із застосуванням
модуляторів 351 щурів; із застосуванням сучасних і високочутливих
методів: ЯМР-релаксометрія, флуоресцентна мікроскопія і
спектрофотометрія; аналізу і інтеграції експериментальних даних.

Наукова значущість роботи. На етіологічно різних моделях гострої
ниркової недостатності встановлено вклад опіоїдних рецепторів, К+АТФ –
каналів, оксиду азоту, сфінгоїдних основ, ангіотензинової і
простаноїдної систем в модуляцію апоптотичних процесів в нирках, що
дозволить поглибшити знання про програму клітинної загибелі на
молекулярному рівні і встановити ії роль в патогенезі ГНН. Активація
опіоїдних рецепторів в нирках викликає різні ефекти в розвитку апоптозу:
у фізіологічних умовах – проапоптотичний та антиапоптотичний – за умов
розвитку експериментальної ГНН. Проапоптотичний ефект опіоїдних
рецепторів реалізується не через д-опіоїдні рецептори і не залежить від
рівня оксиду азоту, а їх антиапоптотична дія є NO- залежним процесом і
запускається через д-опіоїдні рецептори з участю К+АТФ – каналів.
Про/антиапоптотична дія препаратів – даларгіну, каптоприлу,
нітроаміногуанідину, індометацину може бути корисною при фармакологічних
дослідженнях, пов’язаних із використанням даних препаратів в
експериментальній і клінічній практиці. Розуміння ролі оксиду азоту в
регуляції апоптозу розкриє шляхи фармакологічної корекції донаторами або
блокаторами ендогенного оксиду азоту в клінічній практиці. Вивчення
показників ЯМР-релаксації протонів тканинної води нирок в аспекті
розвитку апоптозу, з одного боку, дозволить розкрити Н+- механізми
регуляції клітинного об’єму , а з іншого – підведе патогенетичну базу
ГНН під діагностику ступеня ниркової патології методом
ЯМР-релаксометрії. Вперше на основі експериментальних даних показана
можливість модуляції апоптотичних процесів через регуляторні
внутрішньониркові системи: опіоїдні рецептори, К+АТФ – канали, обмін
оксиду азоту, сфінгомієлин-сфінгозиновий шлях, ангіотензинову та
простаноїдну системи, механізм дії котрих пов’язаний із перерозподілом
внутрішньо- і позаклітинної фракції тканинної води нирок. Отримані
результати розвивають наукові представлення про біохімічну модуляцію
апоптотичних процесів при патологіях та сприяють новим дослідженням по
розробці терапевтичних заходів в клінічній уронефрології.

Практичне значення отриманих результатів. Впровадження отриманих
результатів в практику здійснюється такими шляхами:

розроблені і модифіковані автором методики застосовуються при проведенні
клініко-лабораторних і наукових досліджень в Науково-дослідному центрі
Луганського державного медичного університету та ряді медичних установ
м. Луганська;

матеріали дисертації опубліковані в друкарських роботах, докладалися на
з’їздах і науково-практичних конференціях;

результати роботи використовуються у навчальному процесі при вивченні
докторантами, аспірантами і науковими співробітниками методів
біохімічного аналізу тканин і клітинних культур;

характеристика ряду лікарських препаратів, що широко використовуються
при ниркових патологіях, може розглядатися через регуляцію процесів
апоптозу (як індуктори, так і супресори), що внесе позитивний вклад в
клінічну практику;

ЯМР-параметри тканини можуть бути використані при оцінці гомеостазу
нирок при введенні препаратів із різною про/антиапоптотичною
спрямованістю.

Особистий внесок дисертанта. Дисертація є самостійною роботою автора,
яка провела експериментальні дослідження на щурах (1575) по визначенню в
нирках фрагментації ДНК, вмісту метаболітів оксиду азоту, сфінгомієлину,
сфінгозину, активності ключових ферментів, протеолізу, ЯМР-релаксації за
умов стимульованого апоптозу та при його модуляції.

Автором проведено інформаційний пошук та аналіз літературних джерел.
Самостійно оцінила та проаналізувала отримані результати досліджень з
використанням засобів статистики, кореляційного аналізу. Інтерпретація
отриманих результатів, основні положення та висновки, які представлені
до захисту, належать авторові. Підготовлено самостійні, а також сумісні
друковані роботи. Автор щиро вдячний за допомогу і спільну роботу:
Комарєвцевій І.О., Макогон Н.В.

Впровадження результатів дослідження. Результати досліджень, що ввійшли
до дисертації, докладені на XVI З’їзді Українського фізіологічного
товариства (Вінниця, 2002), XI Конгресі міжнародного товариства
українських лікарів (Луганськ, 2002), VIII З’їзді Українського
біохімічного товариства (Чернівці, 2002), Науково-практичній конференції
(Євпаторія, 2003), Всеукраїнській з міжнародною участю
науково-практичної конференції “Впровадження досягнень теоретичної
медицини в практику охорони здоров’я” (Київ, 2004), Науково-практичній
конференції, присвяченій 10-річчю Луганського державного медичного
університету (Луганськ, 2004).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковано у 27 наукових роботах, з
них 10 без співавторів, 21 публікація основного вмісту дисертації в
наукових виданнях, затверджених ВАК України.

Структура дисертації. Дисертація складається з вступу, 7 розділів,
висновків, списку літератури, додатку. Викладена на 301 сторінці,
містить 85 таблиць, ілюстрована 12 малюнками. Список літератури включає
517 найменувань.

Робота виконана на кафедрі медичної хімії Луганського державного
медичного університету (зав.кафедри д.м.н., проф. І.О. Комаревцева).
Науковий консультант — д.м.н., професор І.О.Комаревцева.

ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали досліджень. У експериментальній частині роботи були
використані білі щури-самці 16-18-ти тижневого віку, маса тварин
складала m=250±50 мг. Тварин тримали в стандартних умовах віварію. У
експериментах було використано 1575 тварин. Гостру ниркову недостатність
(ГНН) формували двома моделями. 1 модель — ішемія /реперфузія- шляхом
двостороннього перетискання ниркової ніжки протягом 30 хвилин [Liberthal
W., Menza S., Levine J.,1998]. Операцію проводили під тіопенталовим
наркозом в дозі 10 мг/мл, в стерильних умовах. У контрольних тварин
проводили двосторонні надрізи шкіри і м’язів в ділянці спини. 11 модель-
“гліцерольна” — шляхом двостороннього внутрішньом’язового введення 50%
розчину гліцеролу з розрахунку 10 мл на 1кг ваги тварини [Nath K. A.,
Bella G., Vercellotti G.M., et al.,1992]. Контрольним тваринам вводили
відповідний об’єм фізіологічного розчину. Тварин спостерігали в ранній
період розвитку ГНН через 1 годину після ішемії (контроль-2) і протягом
1, 2, 3-х діб (ГНН-1, ГНН-2, ГНН-3). Декапітацію тварин проводили під
легким ефірним наркозом. Модуляцію апоптозу через внутрішньониркові
регуляторні системи проводили за наступною схемою. Даларгін (синтетичний
лей-енкефалін D-Ala2 ,Lue5 ,Arg6 ) вводили внутрішньоочеревинно в дозі
100 мкг/кг маси тварини за 20 хвилин до операції (до ін’єкції гліцеролу)
і протягом 1, 2, 3-х діб розвитку ГНН, одноразово. Інтактним тваринним
даларгін та інші препарати вводили аналогічно протягом 1, 2, 3-х діб
одноразово. Ін’єкцію налоксону в дозі 0,5 мг/кг вводили
внутрішньоочеревинно за 20 хвилин до формування ГНН і протягом періоду
спостереження, одноразово. Інгібітор iNOS (індуцибельної синтази оксиду
азоту) — аміногуанідин нітрат вводили внутрішньоочеревинно в дозі 10
мг/кг. Ін’єкцію інгібітору здійснювали за 20 хвилин до розвитку ГНН і на
протязі перших трьох діб ГНН, одноразово. Блокування
ангіотензин-перетворюючого ферменту на фоні розвитку ГНН здійснювали
шляхом попереднього введення каптоприлу в дозі 1,3 мг/кг. Препарат
вводили внутрішньоочеревинно протягом 1, 2, 3-х діб, одноразово. Для
блокади циклооксигеназного шляху метаболізму арахідонової кислоти
використали індометацин в дозі 5 мг/кг, який заздалегідь розчиняли в
спиртовому розчині. Селективне інгибування К+АТФ — каналів викликали
ін’єкцією глібенкламіду в дозі 0,3 мг/кг, аналогічно. При паралельному
введенні препарат №1 вводили за 40 хвилин до формування ГНН, а препарат
№2 — за 20 хвилин. Протягом 1, 2 і 3-х діб розвитку ГНН ін’єкцію
препарату №2 проводили через 20 хвилин після введення препарату №1,
одноразово. Інтактним тваринам вводили препарати за аналогічною схемою.

Методи досліджень. Для підтвердження розвитку гострої ниркової
недостатності у щурів визначали рівень клубочкової фільтрації за
кліренсом креатиніну, активність гамма-глутамілтранспептидази в плазмі
крові. Морфологічні дослідження ниркової тканини проводили
загальновизнаними гістологічними методами. Нирки щурів фіксували в
розчині формальдегіду, заливали в парафін, готували зрізи і проводили
забарвлення за допомогою гематоксиліну-еозину.

Для визначення низькомолекулярних фрагментів ДНК нами був використаний
метод гель-електрофорезу[Cain K., Inayat-Hussain S.H., Wolfe J.T., Cohen
G.M.,1994] та метод спектрофотометричного визначення фрагментованої ДНК
в нашій модифікації. Метод заснований на кольоровій реакції накопичених
в клітинах нирок низькомолекулярних фрагментів ДНК, екстрагованих в
розчин з низькою іонною силою, з дифеніламіновим реагентом [Messmer
U.K., Verena A.B.,1996]. Суть модифікації полягала в тому, що з проби
заздалегідь віддалялися некротичні уламки ДНК. Морфологічну детекцію
апоптозу проводили з використанням ядерного флюоресцентного барвника
Хехст [Cohen J.J. ,1993]. Експеримент був проведений в науковій
лабораторії Інституту фізіології ім. А.А. Богомольця.

Вміст оксиду азоту визначали за його стабільними метаболітами нітрит- і
нітрат-аніонами з використанням реактиву Грисса [Green L.C., Wagner
D.A., Glogowski J. et al.,1982]. Для проведення даного аналізу нами була
модифікована методика, яка дозволяє визначати нітрит- і нітрат-аніони в
одній пробі. Оскільки реакція діазотування є специфічною тільки для
нітритів, то для визначення нітрату необхідне їх попереднє відновлення.
Як відновник нами був використаний цинковий пил.

Виділення сфінгомієлину з тканини проводили поетапно. На першому етапі
витягували загальну ліпідну фракцію з ниркової тканини за методом Фолча
[Кучеренко Н.Е., Васильев А.Н., 1985]. На другому етапі виділяли фракцію
фосфоліпідів із загальної ліпідної фракції за методом Васьковського
[Лемешко В.В, Бровкович В.М., Листопад А.П., 1991]. Вміст сфінгомієлину
визначали в елюатах проб після розділення фракції загальних фосфоліпідів
методом тонкошарової хроматографії на стандартних пластинках “Silufol” в
системі розчинників хлороформ: метанол: вода (65:30:5). Фракцію
сфінгомієлину з пластинок еюлювали сумішшю розчинників хлороформ:
метанол (2:1). Кількість сфінгомієліну визначали за методом Чена [Chan
Ch., Goldcorn T., 2000]. Пробу сфінгомієліну спалювали до неорганічного
фосфату, потім проводили кольорову реакцію з хромогенним реагентом.
Оптичну щільність забарвлених проб вимірювали при л = 700 нм. Вміст
неорганічного фосфату визначали за калібрувальною кривою стандартного
розчину КН2РО4.

Для виділення вільного сфінгозину нами був використаний метод,
заснований на екстракції сфінгоїдних основ діетиловим ефіром, в нашій
модифікації. Модифікація полягала у відсутності етапу гідролізу
сфінгомієлінів. Кількісно пул вільного сфінгозину визначали за методом
Lauter — Trams, заснованого на утворенні забарвленого комплексу
сфінгозину і метилоранжу [Lauter C.J., Trams C.G.,1962]. Проби
спектрофотометрували при л = 415 нм. Кількість вільного сфінгозину
визначали за калібрувальною кривою стандартного розчину сфінгозину
(Amersham).

Визначення активності супероксиддисмутази проводили біохімічним методом
по її здатності інгібувати накопичення продукту аутоокислення адреналіну
в лужному середовищі, який поглинає при л =347 нм [Сирота Т.В.,1999].
Методом диференціального центрифугування з гомогената виділяли
мітохондріальну фракцію. Ступінь інгібування ферментом швидкості
аутоокислення адреналіну розраховували за формулою. Визначення
активності лактатдегідрогенази проводили за стандартною біохімічною
методикою з використанням 2,4-динітрофенілгідразина.

Визначення протеолітичної активності тканини нирок проводили з
використанням азосполук ферментів казеїну і колагену, які є маркерами
лізису високомолекулярних білків і колагену. У лужному середовищі рН ці
азосполуки виступають як субстрати для визначення активності протеїназ.
Екстинкцію проб вимірювали при л =440 нм і перераховували за формулою на
1 час інкубації і 1 г тканини.

Активність гамма-глутамілтранспептидази в сироватці крові щурів
визначали з використанням спеціального набору [Nielsen L.G., 1987].
Активність ферменту визначали методом постійного часу.

Дослідження зміни часу релаксації протонів тканинної води нирок
проводили методом ЯМР-релаксометрії на ядрах 1Н, in vitro
(ЯМР-релаксометр фірми “Вruker”). Нирки на льоду подрібнювали на тонкі
зрізи, потім їх осушували. Нирки зважували на електронній вазі
“Sartorius” (ФРГ) і для ЯМР-досліджень були взяті однакові наважки, маса
яких становила 750±5 мг. Скляну пробірку (діаметр 10 мм) з тканиною
вміщували в комірку ЯМР-релаксометра для вимірювання релаксації протонів
тканинної води.

Т1 визначали за методом “inversion-recovery”, використовуючи 180о — Т —
90о пульсову послідовність по 40 точках, а Т2 — за методом CPMG. Після
визначення Т1 і Т2, показники розкладали на біекспоненти і
розраховували Ра і Рв, що характеризують внутрішньоклітинний і
позаклітинний об’єм тканинної води, відповідно. Ці дані, як і визначення
Т1 і Т2, оброблялися автоматично персональним комп’ютером “Minispec” за
допомогою серійного інтерфейсу RS і 232С по програмних пакетах фірми
“Bruker”.

Таким чином, нами були використані методики, що дозволяють виявити
біохімічні зміни в тканині нирок, плазмі, сироватці крові, сечі в
умовах розвитку гострої ниркової недостатності і стимуляції апоптотичних
процесів. Сумісний підхід морфологічної та біохімічної детекції апоптозу
в нирках дозволив встановити правильність вибраних моделей для вивчення
стимуляції програми клітинної загибелі та її модуляції при даному
синдромі.

Статистична обробка даних проводилася з використанням оригінальної
програми Microsoft Excel 97 традиційними методами варіаційної
статистики. Достовірність відмінності середніх оцінювали з використанням
t-критерію Ст?юдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Детекція апоптозу в тканині нирок при експериментальній ГНН. У наших
дослідженнях при різних моделях гострої ниркової недостатності були
виявлені морфологічні ознаки розвитку апоптозу. У зрізах нирок дослідних
тварин (на 2 і 3-ю добу), забарвлених флуоресцентним барвником
нуклеїнових кислот Хехст 33342, була присутня значна кількість клітин,
здатних до апоптозу. Виявлено характерні для різних стадій апоптозу
зміни ядер. На першій стадії апоптозу спостерігалася конденсація
ядерного хроматину і його розташування по периферії ядра у вигляді
кілець, півкілець або серпів. Друга стадія супроводжувалася зменшенням
розмірів ядер, зміною їх форми і фрагментацією. Фазово-контрастна
мікроскопія показала, що клітини з апоптотичними змінами часто були
зменшені в розмірах і відділені від пласта ниркових клітин. У зрізах
нирок контрольних тварин відзначені вище зміни практично не виявлялися.

Нами було встановлено, що рання фаза розвитку гострої ниркової
недостатності супроводжувалася підвищеною кількістю низькомолекулярних
фрагментів ДНК в клітинах нирок (за методом гель-форезу та
дифеніламінового тесту). З наведених даних (Мал. 1 ) витікає, що в
експериментальних групах І моделі (ішемія/реперфузія) і ІІ моделі
(“гліцерольна”) спостерігається підвищений вміст фрагментованої ДНК в
порівнянні з групою контролю-1. І модель: на 1 добу — в 3,5 рази, на 2
добу — в 5,4 рази, на 3 добу — в 4,4 рази. У групі 60-ти хвилинної
постішемії (контроль-2) встановлено недостовірне підвищення деградації
ДНК. У групах ГНН ІІ моделі наростання фрагментації ДНК відбувалося
різкіше, ніж в групах І моделі. Динаміка вмісту фрагментованої ДНК в
клітинах нирок мала максимум на 2 добу (для 1 і 11 моделей). Отже,
початкова фаза розвитку гострої ниркової недостатності супроводжується
активацією апоптотичних процесів в нирках з піком на 48-72 год. після
реперфузії.

Мал.1 Вміст фрагментованої ДНК в клітинах нирок при експериментальній
ГНН.

Найбільш інтенсивно апоптотичні процеси проходили у тварин ІІ моделі, що
відповідає максимальній кількості низькомолекулярних фрагментів ДНК, в
порівнянні з групами 11 моделі.

Таким чином, наші біохімічні та морфологічні дослідження підтвердили, що
початкова фаза розвитку ГНН в тканині нирок супроводжується кількісними
і якісними змінами, характерними для апоптотичної форми клітинної
загибелі.

У літературі, присвяченій активації апоптозу при ГНН, практично немає
даних про зміну активності ферментів антиоксидантної системи, вмісту
NO?, протеолітичної активності тканини нирок.

Гостра ниркова недостатність супроводжується істотною активацією
тканинного протеолізу: інтенсивність протеолітичної деградації
високомолекулярних білків збільшувалася на 18,1% (1 доба), на 34,2 % (2
доба), на 20,9 % (3 доба) для експериментальних груп 1 моделі в
порівнянні з контролем-1. А колагеназна активність ниркової тканини
протягом перших трьох діб реперфузії підвищилася в 1,2 рази.

При “гліцерольній” моделі також спостерігалася активація протеолізу, але
з більшою інтенсивністю як за азоколом, так і за азоказеїном. Це можна
пояснити додатковим до гіпоксії впливом токсичної дії гліцеролу на
клітини ниркової тканини. Так, протягом розвитку ГНН від 1 до 3-ї доби
лізис азоказеїну підвищувався на 30,5%, на 32,9%, на 28,7%, а лізис
азоколу — в 1,3 рази, в 1,3 рази, в 1,2 рази. Отже, ішемія / гіпоксія
нирок супроводжується посиленням активації протеолізу в тканині. Цей
факт може вказувати на збільшення окислених білків, як перших мішеней
для протеаз та на перевищення катаболічних процесів над анаболічними на
останній стадії розвитку програмованої загибелі клітин.

Нами була встановлена позитивна кореляційна залежність між лізисом
високомолекулярних білків (rxy=0,80) і колагену (rxy=0,96) і ступенем
фрагментації ДНК в нирках.

Одна з ліній захисту проти оксидантного стресу в нирках представлена
внутрішньоклітинними ферментами-антиоксидантами, такими як
супероксиддисмутаза (СОД), каталаза, глутатіонпероксидаза і
глутатіонредуктаза. В літературі практично немає даних про зміну
активності антиоксидантних ферментів при експериментальній гострій
нирковій недостатності в її ранній фазі розвитку. Паралельно з
активацією гліколізу в клітинах ниркової тканини відбувалося різке
зниження активації СОД. Результати свідчать, що у тварин спостерігалося
виражене порушення активності СОД: на 1-у добу після реперфузії
ферментативна активність знизилася в 2,7 рази, на 2-у добу — в 4,5 рази
і на 3-ю добу — в 3,3 рази. Через 1 годину після ішемії також
спостерігалося зменшення активності СОД в 1,6 рази, в порівнянні з
групою контролю. В експериментальних групах 11 моделі динаміка виявилася
подібною: в 2,7 рази, в 4,8 рази і в 3,6 рази, відповідно на 1, 2 і 3-ю
добу. Отже, на початку розвитку ГНН ферментативна активність СОД сильно
пригнічена, що не може не позначитися на всій антиоксидантній системі
клітин. Виходячи з отриманих нами даних про посилення активації
протеолізу, можна пояснити зниження ферментативної активності СОД за
рахунок її металокаталізованого окислення (МКО) [Мещишен І.Ф., Польовий
В.П.,1999]. Нами встановлено кореляційний зв’язок між активністю СОД і
активацією протеолізу (rxy=-0,73), між активністю СОД і фрагментацією
ДНК (rxy=-0,99) з досить високими коефіцієнтами кореляції.

Отже, за отриманими даними можна зробити висновок, що порушення
ферментативної активності СОД та активації тканинного протеолізу нирок
порівняний із ступенем деградації ДНК і , відповідно, з активацією
апоптотичних процесів.

Особлива роль в регуляції процесів клітинної загибелі належить оксиду
азоту (NO), який може виступати як чинник виживання або служити сигналом
загибелі, в залежності від концентрації та типу клітин. Паралельно із
зростанням числа клітинних функцій, регульованих NO, збільшується і
список захворювань, пов’язаних з порушенням синтезу і /або виділення NO
[Malyshev I.Yu.,Manukhina E.B.,1999]. На сьогодні точно не встановлено
цитотоксичний або цитопротекторний ефект виявляє NO при ГНН.

Нами було встановлено, що після розвитку гострої ниркової недостатності
в експериментальних групах 1 моделі спостерігалося значне збільшення
концентрації стабільних метаболітів NO2- і NO3- в тканині нирок в
порівнянні з групою контролю. При цьому динаміка зміни NO виявилася
неоднозначною: із збільшенням рівня NO від 1 до 2-ї доби і деяким
зниженням до 3-ї доби. У експериментальних групах 11 моделі ГНН також
спостерігалася помірна генерація NO. Динаміка рівня NOх була
аналогічною: від 1 до 2-ї доби — плавне збільшення, а на 3-ю добу —
плавне зниження показника. Відомо, що при розвитку патологічних
процесів, що проходять на фоні ішемії і гіпоксії в клітинах тканин
посилюється синтез NO, NO2-, NO3- і, одночасно, підвищується активність
нітритредуктазної системи, як адаптаційні механізми.

Зміна вмісту нітрит- і нітрат-іонів в тканині нирок при гострій нирковій
недостатності виявилася різною. Концентрація NO2- в групах одно-, двох-
і тридобових тварин 1 моделі була достовірно знижена в порівнянні з
контрольною групою, мінімум цього показника спостерігався на 3-ю добу.
При “гліцерольній” моделі вміст нітрит-аніонів знижувався, але
недостовірно і був нижче базального рівня. Вміст нітрит- і
нітрат-аніонів в сечі і плазмі щурів виявився також підвищеним в
порівнянні з групою контролю. Так, при експериментальній ГНН збільшення
NOх в сечі однодобових тварин становило 17,2%, дводобових — 21,3%,
тридобових — 25,9%. Ми також проаналізували сумарний вміст стабільних
метаболітів оксиду азоту в безбілкових пробах плазми. Встановлено, що у
експериментальних щурів 1 і 11 моделей він був достовірно підвищеним в
порівнянні з групою контролю-1.

При порівнянні загального вмісту NOх в плазмі крові і сечі щурів було
виявлено, що рівень NO2- в плазмі достовірно підвищувався від 1 до 3-ї
доби, а в сечі на першу добу спостерігалося зниження і тільки на третю
добу — перевищення контрольних значень.

Отже, гостра ниркова недостатність (ГНН) супроводжується підвищеним
вмістом оксиду азоту в тканині нирок, сечі і плазмі. При цьому рівень
нітритів в тканині недостовірно знижується, а рівень нітрату достовірно
підвищується. Дані результати дозволяють передбачити, що в початковій
фазі ГНН цитотоксичний ефект оксиду азоту може превалювати над
цитопротекторним, можливо, внаслідок утворення пероксинітриту [Walker
L.M., York J.L., Imam S.Z. et al., 2001]. Була виявлена позитивна
кореляційна залежність між деградацією ДНК і накопиченням нітрит- і
нітрат-аніонів (rxy=0,89), негативний кореляційний зв’язок між
активністю СОД і накопиченням сумарних метаболітів оксиду азоту
(rxy=-0,76) і позитивна кореляційна залежність між вмістом стабільних
метаболітів оксиду азоту і активацією протеолизу високомолекулярних
білків і колагену (rxy=0,95, rxy=0,78).

Є літературні дані, що інгібування iNOS у щурів перед формуванням
ниркового ішемічного пошкодження призводить до певного захисту нирок
[Cuzzocrea S.et al. 2000, Ling H., Edelstein Ch., Gengaro P., 1999]. З
метою виявлення біфункціональної дії оксиду азоту при ГНН ми провели
інгибування iNOS і вивчили активацію протеолізу, активність СОД і
ступінь деградації ДНК. Наші дослідження встановили, що ініціювання
активації протеолізу, фрагментації ДНК і інгібування СОД можуть бути
значно скасовані ингібіцією iNOS-синтази, можливо, внаслідок супресії
продукції пероксинітриту.

В експериментальних групах гострої ниркової недостатності 1 і 11
моделей ін’єкція інгібітора iNOS кількісно знизила рівень фрагментації
ДНК в нирках в порівнянні з групами гострої ниркової недостатності,
однак, цей показник не досяг базального рівня (Мал.2).

Мал.2. Вміст фрагментованої ДНК в клітинах нирок при інгібуванні
активності iNOS на фоні розвитку ГНН.

Так, на 1- у добу спостерігалося зниження деградації ДНК в 1,2 рази (1,3
рази), на 2-у добу — в 1,3 рази (1,3 рази), на 3-ю добу — в 1,2 рази
(1,2 рази) для груп 1 моделі (11 моделі). Така динаміка дозволяє
передбачити, що інгібіція iNOS дещо знижує рівень апоптозу, мабуть, за
рахунок ослаблення токсичної дії пероксинітриту, а, отже, регуляторна
роль оксиду азоту в умовах ішемії/реперфузії і гіпоксії спрямована на
нормалізацію клітинних процесів. Разом з тим оксид азоту не в змозі
забезпечити повний багаторівневий захист від негативних наслідків
програмованої клітинної загибелі, що підтверджується підвищеним вмістом
фрагментованої ДНК в клітинах нирок в умовах гострої ниркової
недостатності.

Наші експерименти з попереднім введенням щурам нітроаміногуанідину
показали позитивний ефект інгібування iNOS на інтенсивність протеолізу і
активність СОД, в порівнянні з групами гострої ниркової недостатності.
Інтенсивність протеолізу виявилася зниженою, активність СОД при цьому
була достовірно підвищеною, що можна зв’язати з цитотоксичною дією
оксиду азоту (або накопичення пероксинітриту) і поліпшенням стану
антиоксидантного захисту при інгібіції індуцибельної NO-синтази.
Біфункціональний характер дії оксиду азоту полягає в тому, що підвищений
вміст його метаболітів на ранній стадії ГНН є елементом компенсаторної
реакції, але на тлі розвитку оксидантного стресу (за літературними
даними)[ Walker L.M., York J.L., Imam S.Z. et al.,2001] ця роль оксиду
азоту перетворюється на негативну (можливо внаслідок накопичення
пероксинітриту).

Роль опіоїдних рецепторів в модуляції апоптозу в тканині нирок.
Встановлено, що ендогенна опіоїдна система бере участь практично у всіх
процесах життєдіяльності організму. Між тим опіатергічній модуляції
апоптозу в нирках в експериментальній і клінічній літературі
приділяється мало уваги.

Опіоїдні рецептори широко представлені на периферії. Вони знайдені в
нирках [Stein C.M.D,1995], що підтверджено нашими власними
дослідженнями.

Спектр дії синтетичного лей-енкефаліну даларгіну досить широкий і
відображує функції регуляторних пептидів, направлених на підтримку
гомеостазу. Препарат володіє гіпотензивною, антистресовою,
антиішемічною, антигіпоксичною та іншими діями [Куковська І .Л.,1998,
Маслов Л.Н., Лишманов Ю.Б.,2002]. Можна передбачити, що маючи
антиоксидантні властивості, даларгін буде впливати і на процеси апоптозу
[Diao C.T., Li L., Lau S.Y., et al. ,2000, Singhal P.C., Sharma P.,
Sanwal V., et al.,1998]. Результати досліджень з даларгіном приведені на
Мал.3, з якого виходить, що синтетичний лей-енкефалін істотно знижує
ступінь деградації ядерної ДНК в експериментальних групах тварин
(ГНН+дал) в порівнянні з групами ГНН. Так, в групах I моделі в першу
добу вміст ф-ДНК знизився на 25,1 %, на другу добу — на 20,4 % і на 3-ю
добу — на 27,1 %. У групах II моделі спостерігалася аналогічна
тенденція: на 1- у добу — на 20,5%, на 2-у добу — на 40,3 %, на 3-ю добу
— на 34,4 %. Отже, намітилася тенденція до поліпшення функціонального
стану клітин на 2-3-ю добу. У контрольній групі-2 (для 1 моделі)
достовірних змін не спостерігалося. При паралельному введенні даларгіну
і налоксону не спостерігалося зниження фрагментації ДНК в групах як I,
так і II моделей, вміст ф-ДНК відповідав таким показникам в групах ГНН.
Тобто попереднє блокування опіоїдних рецепторів (ОР) налоксоном усувало
антиапоптозний ефект даларгіну, що вказує на рецептор-залежний механізм
дії агониста.

Мал.3. Вміст фрагментованої ДНК в клітинах нирок при модуляції апоптозу
при експериментальній ГНН.

Протилежними виявилися результати в групах інтактних тварин (І-1, І-2,
І-3) після введення агониста опіоїдних рецепторів. У порівнянні з
контролем — 1 спостерігалося різке збільшення ступеня деградації ДНК в
клітинах ниркової тканини після ін’єкції даларгіну. При тривалому
введенні даларгіну від 1 до 3-ї доби — плавне підвищення вмісту ф-ДНК
(Мал.4). Якщо порівнювати показники груп І-1, І-2, І-3 з показниками
експериментальних груп гострої ниркової недостатності, то простежується
підвищення їх значень. Для групи І-1 вміст ф-ДНК збільшився на 3,9 %
(8,3 %), для групи І-2 — на 2,1 % (0,9 %) (недостовірно), для групи І-3
— на 9 % (8,2 %) для І моделі (для II моделі), відповідно. Попередня
блокада опіоїдних рецепторів повністю усувала проапоптозну дію даларгіну
в нирках інтактних щурів, що вказує на опіоїд-рецепторно-залежний
розвиток апоптозу. Таку дію синтетичного опіоїда можна охарактеризувати
як модуляція апоптозу через периферичні опіоїдні рецептори [Singhal
P.C., Kapasi A.A., Franki N.,2000].

Таким чином, ми зіткнулися з різними ефектами опіоїдних рецепторів на
процеси апоптозу в фізіологічних умовах та при ішемії/гіпоксії. Оскільки
ефекти даларгіну реалізуються через два типи рецепторів д- і м-, ми
передбачили, що стимуляція апоптозу даларгіном в нормі і його
інгибування за умов гострої ниркової недостатності реалізується через
різні опіоїдні рецептори.

Для підтвердження цього припущення ми застосували глібенкламід —
блокатор АТФ-чутливих К+-каналів, стимуляція яких даларгіном
здійснюється через д 1- опіоїдні рецептори [Лишманов Ю.Б., Маслов Н.М.,
2003].

Глібенкламід блокував протекторну дію даларгіну в групах моделі
ішемії/реперфузії, що вказує на участь д1- опіоїдних рецепторів в
реалізації антиапоптотичного механізму через активацію АТФ-чутливих
мітохондріальних К+-каналів (Мал.5).

Мал.4. Вміст фрагментованої ДНК в клітинах нирок інтактних щурів на фоні
введення даларгіну, налоксону, каптоприлу, індометацину.

Стимуляція апоптозу даларгіном у інтактних тварин, мабуть, реалізується
через м — рецептори, на що вказує відсутність блокуючого ефекту під дією
глібенкламіду (Мал.6).

Отже ще одним фактором модуляції апоптозу в нирках можуть бути
мітохондріальні К+АТФ – канали.

Мал.5. Вміст фрагментованої ДНК в нирках на фоні блокування К+АТФ —
каналів при ГНН.

Чи пов’язаний антиапоптозний ефект екзогенного опіоїду з активацією NO-
синтаз? Ми провели дослідження впливу даларгіну на рівень метаболітів
оксиду азоту. Попередня стимуляція опіоїдних рецепторів даларгіном
сприяла значному зниженню сумарного рівня NOх у всіх експериментальних
групах ГНН. При цьому зменшення склало: в контролі-2 — 31,7%, на 1-у
добу — 42,5%, на 2-у добу — 47,3%, на 3-ю добу — 27,3% в порівнянні з
групою контролю (1 модель). Для експериментальних груп 11 моделі
спостерігалося наступне зменшення концентрації NOх: на 1 добу — 22,5%,
на 2 добу — 15,6%, на 3 добу — 15,3%. Динаміка вмісту окислених
метаболітів NO була різною: вміст нітрат-аніонів -NO3- під впливом
даларгіну зменшився, але його значення не перевищувало таких в групі
контролю, а концентрація нітрит-аніонів — NO2- достовірно збільшувалася
і перевищила такі контрольні значення (для 1 моделі). Для
експериментальних груп II моделі динаміка вмісту NO3- — іонів мала
аналогічну динаміку, а для NO2- — іонів збереглася тенденція до
збільшення концентрації. Отже, виражений антирадикальний ефект даларгіну
супроводжувався істотним зниженням синтезу і/або звільнення NO. Також
встановлено протигіпоксичну дію даларгіну за зниженням рівня лактату в
нирковій тканині щурів при різних моделях ГНН.

Мал.6. Вміст фрагментованої ДНК в нирках інтактних щурів на фоні
блокування К+АТФ – каналів.

При паралельному введенні щурам налоксону і даларгіну спостерігалося
скасування ефекту даларгіну щодо вмісту оксиду азоту, це вказує на
реалізацію його ефектів через опіоїдні рецептори. Отже, регуляція
системи оксиду азоту в тканині нирок можлива за участю опіоїдних
рецепторів. Попередня інгібіція індуцибельної NO-синтази не відбилася на
вмісті метаболітів оксиду азоту під дією даларгіну, що вказує на його
здатність стимулювати інші ізоформи NO-синтази.

У групах інтактних щурів після активації опіоїдних рецепторів (ОР)
екзогенним опіоїдом вміст NOх в нирках плавно збільшувався від 1 до 3-ї
доби в порівнянні з групою контролю-1. Достовірні зміни спостерігалися
тільки на третю добу. Попереднє введення налоксона усувало ефект
даларгіну, пов’язаний з накопиченням NO. Отже, за фізіологічних умов
підвищення продукції оксиду азоту під дією екзогенного лей-енкефаліну
опосередковано через активацію опіоїдних рецепторів (ОР) тільки при
тривалому введенні (після трьох діб).

Попереднє інгібування iNOS-синтази не відбилося на вмісті метаболітів
оксиду азоту під дією даларгіну в нирках інтактних щурів. Отримані
результати можна пояснити тим, що, опіоїдні рецептори беруть участь у
підтримці рівня оксиду азоту за рахунок активації конститутивної NOS,
яка є істотною для забезпечення нормалізації гемодинаміки в нирках. В
умовах норми спільне введення нітроаміногуанідину і даларгіну не змінило
рівень вмісту метаболітів оксиду азоту в тканині нирок. Можна заключити,
що біохімічна активність даларгіну в нормі пов’язана із запуском
програми клітинної загибелі через інші опіоїдні рецептори і не
опосередкована участю оксиду азоту, а в умовах стимульованого апоптозу
(моделі ГНН), навпаки, направлена на виживаність клітин і пригнічення в
них апоптотичних процесів через активацію д1- опіоїдних рецепторів з
участю системи оксиду азоту.

Не менш цікавий результат наших досліджень, пов’язаний з лігандами ОР,
був виявлений в дослідах з введенням антагоніста ОР — налоксону перед
нирковим пошкодженням. Блокада опіоїдних рецепторів (ОР) налоксоном
призвела до значного зниження деградації ДНК у порівнянні з групами
гострої ниркової недостатності. Так, для I моделі в групі контролю-2 не
спостерігалося змін у вмісті ф-ДНК, на 1-у добу зниження становило
20,3%, на 2-у добу — 14,8%, на 3-ю добу — 20,8% від таких показників в
групах ГНН-1, ГНН-2, ГНН-3, відповідно. У групах II моделі на 1-у добу
-13,5%, на 2-у добу -18,4%, на 3-ю добу-17,9%. Після ін’єкції налоксону
у інтактних щурів спостерігалося підвищення фрагментації ДНК, але
меншим, ніж при введенні даларгіну. На першу добу деградація ДНК
підвищилася в 2,5 рази, на другу — 2,4 рази і на третю — в 2 рази, в
порівнянні з контролем.

Отже, налоксон як антагоніст даларгіну також сприяє зниженню деградації
ДНК в клітинах нирок в умовах стимульованого апоптозу, але його
антиапоптозна дія виражена слабкіше в порівнянні з екзогенним
лей-енкефаліном. Виявлені ефекти можуть бути пов’язані з неспецифічною
мембранопротекторною дією і специфічного зв’язування з опіоїдними
рецепторами [Головко А.И., Головко С.И., Леонтьева Л.В.,2003].
Реалізація цих ефектів налоксону, очевидно, буде визначатися дозою, що
вводиться, а також відмінностями в аффінності і щільності розподілу
різних підтипів м-ОР. Тому є підстави вважати, що налоксон, хоча і
відноситься до антагоністів ОР, але, виявляючи часткові властивості
агонистів, може впливати і на регуляцію програми клітинної загибелі.

Таким чином, модуляція програми клітинної загибелі у вибраних нами
моделях ГНН через опіоїдні рецептори спрямована на захист клітин нирок
і пригніченню процесів апоптозу. Цитопротекторний ефект агонистів і
антагоністів ОР являється NO — опосередкованим. А за фізіологічних умов
біохімічна активність лігандів ОР поєднана з запуском програми клітинної
загибелі, механізм їх дії реалізується незалежно від рівня оксиду азоту.

Ренін-ангіотензинова та простаноїдна системи нирок як фактори модуляції
апоптозу. Ангіотензин 11 (АТ 11) грає важливу роль в розвитку і
прогресуванні ГНН. Чи існує залежність між рівнем АТ11 і апоптозом в
нирках? Як в експериментальних моделях, так і в клінічних дослідженнях
встановлено підвищення ниркового рівня АТ 11. Підвищена активація
ангіотензину 11 при ГНН є джерелом АФК і NO. Тому обговорювати питання
про регуляцію апоптозу в умовах блокади РАС слід з урахуванням тісної
взаємодії останньої з вільнорадикальними процесами в нирковій тканині,
тим більше, що про зв’язок антиоксидантного ефекту даного препарату на
нирки при ГНН відомо мало.

Блокада активності АПФ призвела до зниження деградації ядерної ДНК в
клітинах нирок в двох моделях ГНН. Так, на 1-у добу після реперфузії
фрагментація ДНК зменшилася в 1,2 рази, на 2-у добу — в 1,3 рази, на
3-ю добу — в 1,2 рази. У групах II моделі показники були наступними: на
1- у добу — в 1,2 рази, на 2-у добу — в 1,4 рази, на 3-ю добу — в 1,5
рази в порівнянні з групами ГНН (Мал.3).

Введення експериментальним тваринам каптоприлу супроводжувалося
достовірним зниженням протеолітичної активності як за азоказеїном, так і
за азоколом, в порівнянні з групами ГНН в I і II моделях. Активність СОД
значно підвищувалася від 1 до 3-ї доби, в I моделі — в 1,3 рази, в 1,5
рази, в 1,2 рази; у II моделі — в 1,3 рази, в 1,4 рази, в 1,3 рази,
відповідно, в порівнянні з групами ГНН. При аналізі показників системи
NO встановлено, що під впливом каптоприлу дещо знизилося накопичення
і/або утворення кінцевих метаболітів оксиду азоту. При цьому рівень
оксиду азоту зберігався підвищеним, тобто блокада
ангіотензин-перетворюючого ферменту не послабила активацію процесів
синтезу NO в нирках, схильних до ішемії/гіпоксії.

, h ¬ Oe O t

?

E

th

4

b

d

?¤???d

th

„ Oe &

p

r

t

CJ

Ue

CJ

j

???¤?????бути пов’язана з накопиченням брадикінину. На сьогодні внесок
брадикінину в ефект інгібіторів АПФ продовжує обговорюватися [Fillipatos
G.,Uhal B.D. ,2003]. Але за накопиченими експериментальним даними можна
припустити, що сприятливі апототичні ефекти інгібіторів АПФ, мабуть,
пов’язані не тільки із зменшенням активних форм кисню і ослабленням ОС,
але й внаслідок підвищення рівня брадикінину, що впливає на продукцію
NO. Для підтвердження цієї гіпотези ми провели серію дослідів з
інтактними щурами. Після ін’єкції каптоприлу в нирках цих тварин
спостерігалося підвищення вмісту стабільних метаболітів оксиду азоту в
порівнянні з контрольною групою, з групами інгібування iNOS, яке
кількісно наближалося до рівня NO в експериментальних групах ГНН. При
цьому спостерігалася активація апоптотичних процесів. Так, на 1-у добу
значення NOх підвищилося на 32,4%, на 2-у добу — на 36,5%, на 3-ю добу —
на 38,4%, в порівнянні з контролем. При цьому вміст нітритів дещо
знизився. Тенденція до активації NO- системи в нирках зберігалася й
після попередньої інгібіції iNOS. Вміст стабільних метаболітів в цих
групах відповідав таким показникам в групах з блокадою АПФ. Отже,
блокада АПФ супроводжується у інтактних щурів активацією інших ізоформ
NOS, яка, можливо, опосередковується через накопичення брадикінину.

Потрібно зазначити, що величини обмеженого протеолізу виявили негативну
кореляційну залежність з активністю СОД (rxy = -0,77) в нирках при
введенні каптоприлу на фоні розвитку ГНН. Також встановлена
оберненопропорційна кореляційна залежність між фрагментацією ДНК і
активністю СОД (rxy = -0,98) в нирках за аналогічних умов.

Наше дослідження показало, що каптоприл має антиоксидантну активність і
спричиняє в нирковій тканині достовірне зниження інтенсивності
протеолітичної активності, накопичення метаболітів оксиду азоту і
підвищення активності системи антиоксидантного захисту (СОД). Отже, нами
був встановлений також і антиапоптозний ефект каптоприлу, який виразився
в зменшенні ступеня деградації ДНК. Таким чином, отримані дані свідчать,
що тканинна ангіотензинова система як на початковій фазі розвитку ГНН,
так і за фізіологічних умов являється одним з факторів модуляції
апоптозу в нирках. При цьому спостерігається взаємозв’язок між системою
NO і РАС, опіоїдними рецепторами і РАС.

Вивчення ефектів простаноїдів — сьогодні вважається одним з
перспективних напрямків, який допоможе зрозуміти механізми регуляції
міжклітинних комунікацій, в тому числі і в регуляції апоптотичних
процесів. Вважають, що оскільки простагландини гальмують апоптоз клітин,
то інгібіція їх синтезу нестероїдними протизапальними препаратами (НПЗП)
може сприяти нормалізації життєвого циклу клітин в зоні запалення і
пригніченню неконтрольованої проліферації пухлинних клітин [Насонов
Е.Л.,2000]. Особлива увага НПЗП приділяється як регуляторам апоптозу
клітин [Насонов Е.Л.,2000].

В умовах розвитку гострої ниркової недостатності під дією індометацину
було відмічено значне збільшення фрагментації ДНК на 1-3-ю добу в
порівнянні з експериментальними групами ГНН. Вміст ф-ДНК при
паралельному інгібіруванні iNOS та блокуванні циклооксигенази (ЦОГ) був
також підвищеним в порівнянні з групами ГНН і практично не відрізнявся
від показників груп із застосуванням індометацину. Отже, нами отримано
проапоптотичний ефект індометацину в нирках при експериментальній
гострій нирковій недостатності. Ми підтвердили, що індометацин, як
блокатор переважно ЦОГ-1, реалізує свої нефротоксичні властивості і
через ініціювання апоптозу. Ін’єкція блокатора ЦОГ призвела до значного
зниження вмісту стабільних метаболітів оксиду азоту в порівнянні з
групами ГНН. Так в групі контролю-2 сумарний вміст NOx зменшився в 1,5
рази, кількість NO3 — — в 1,6 рази, а NO2- — не змінилася, в порівнянні
з групами ГНН. В експериментальних групах простежувалася така ж
тенденція, рівень NOx знижувався в 1,7 рази на кожну добу для 1 моделі і
— в 1,5 рази, відповідно, в групах 11 моделі. При цьому динаміка зміни
нітрит-іонів виявилася різною. У групах 1 моделі вміст NO2- достовірно
не змінювався, а в групах 11 моделі — достовірно зменшувався від 1 до
3-ї доби в 1,6 рази, в 1,9 рази і в 1,6 рази, відповідно.

Отже, блокування циклооксигеназного шляху арахідонової кислоти на фоні
розвитку ГНН призводить до значного зниження (але не до базального
рівня) вмісту кінцевих метаболітів оксиду азоту в тканині нирок, але при
цьому рівень NO2- залишається незмінним тільки при ішемічному впливі.
Попереднє введення нітроаміногуанідину достовірно не змінювало вміст
метаболітів оксиду азоту в групах ГНН+ бл. iNOS +бл.ЦОГ в порівнянні з
групами ГНН+бл.ЦОГ, як для 1, так і для 11 моделей. Отже, дія
індометацину реалізується незалежно від NO. Можна передбачити, що
регуляторна система оксиду азоту і продукти циклооксигеназного
метаболічного шляху між собою діють синергічно та взаємодоповнено.

Мал.7. Вміст фрагментованої ДНК в клітинах нирок інтактних щурів на фоні
блокування активності циклооксигенази.

Саме розвитком індометацин-індукованого апоптозу можна пояснити високий
вміст ф-ДНК в клітинах нирок інтактних щурів (Мал.7 ).

Ін’єкція індометацину інтактним тваринам протягом трьох діб спричиняла
істотне підвищення вмісту метаболітів оксиду азоту в порівнянні з
контрольною групою. Так, на 1-у добу рівень NO3- збільшився в 1,3 рази,
на 2 і 3-ю добу — в 1,6 рази в порівнянні з контролем. Кількість
нітрит-іонів підвищувалася від першої до третьої доби, на другу добу
рівень NO2- ще відповідав базальному, а на третю — перевищував його в
1,3 рази. Таку протилежну дію індометацину в нормі можна пояснити,
передусім, його блокадою ЦОГ-1, що приводить до зниження локального
синтезу ендогенних структурних (фізіологічних) простаноїдів. Ізоформа
ферменту ЦОГ-1 відповідає за вироблення простаноїдів, що беруть участь в
регуляції ниркового кровообігу. Мабуть, пригнічення активності ЦОГ-1 у
інтактних щурів викликає стимуляцію системи оксиду азоту, як
компенсаторний механізм поліпшення гемодинаміки нирок. Блокування ЦОГ
може також призвести до накопичення попередника простаноїдів —
арахідонової кислоти, яка стимулює сфінгомієліновий цикл [Perry D.K.,
Hannum Y.A.,1998]. Нами була встановлена участь сфінгомієлинового
сигнального шляху в активації апоптозу при гострій нирковій
недостатності (див. далі).

Ми виявили, що циклооксигеназний шлях метаболізму арахідонової кислоти
відіграє значну роль в регуляції апоптозу в нирках за рахунок впливу на
ниркову гемодинаміку (через простаноїди і NO) і на сфінгомієліновий
сигнальний шлях. Ця роль є істотною для підтримки гомеостазу нирок в
нормі і важливим моментом в розвитку патологічних процесів в цьому
органі.

Сфінгомієліновий метаболічний шлях активації апоптозу в нирках.
Генератором вторинних посередників, що беруть участь в регуляції
апоптозу, є сфінгомієліновий цикл, основні компоненти якого це
сфінгомієлін, церамід, сфінгозин і ферменти сфінгомієліназа і
церамідаза. Є малочисельні літературні дані, що демонструють зміну
вмісту сфінгомієліну, цераміду і сфінгозину в розвитку індукційної фазі
гострої ниркової недостатності [Levade T., Jaffrezou J.P.,1999,
Мойсеєнко В. О.,2001, Healy А., Dempsey M., Lally C., Ryan M.P.,1998].
Показано, що ішемія спричиняє підвищення рівня сфінгозину і цераміду
приблизно на 50 % і передбачається важливе значення їх рівня в
індукційній фазі та розвитку постішемічної ГНН [Iwata M., Prington I.H.,
Zager R.A., 1995].

Недостатньо вивчені механізми передачі апоптозного сигналу з участю
сфінгомієлінового шляху при ішемічних пошкодженнях різних органів, в
т.ч. нирок. Механізм цієї активації досі не вивчений повністю, однак, на
сьогодні в літературі з’явилися дані про залежність активності основного
ферменту сфінгомієлинового циклу — сфінгомієлінази — від рівня
окислювальних процесів в клітині [Zhang P., Liu B.Jenkins G.M.,1997].
Незважаючи на безперечний зв’язок апоптозу з окислювальними реакціями,
даних про вплив сфінгозину на вільнорадикальні процеси при введенні його
тваринам в літературі ми не виявили. Зв’язок активності сфінгомієлінази
з рівнем протеолітичної активності, з рівнем оксиду азоту і активністю
СОД в нирках in vivo в літературі нами також не було виявлено.

Для визначення наявності або відсутності взаємозв’язку сфінгомієліназної
активності з апоптотичними процесами проводили дослідження зміни вмісту
сфінгомієліну і сфінгозину в нирках при експериментальних моделях ГНН.
Встановлено, що в нирках вже через 30 хвилин спостерігалося зниження
рівня сфінгомієліну в 1,4 рази в порівнянні з контролем-1. На 1-у добу
реперфузії вміст сфінгозину зменшувався ще більше — в 1,7 рази, на 2-у
добу — в 2,8 рази, на 3-ю добу — в 2,7 рази. У експериментальних групах
“гліцерольної” моделі простежувалася аналогічна тенденція: на 1-у добу
розпад сфінгомієліну становив 37,3%, на 2-у добу — 55,3%, на 3-ю добу
-54,8 % в порівнянні з контрольною групою. Динаміка зміни даного
параметра вказує на максимальний гідроліз сфінгомієліну на 2-3-ю добу
розвитку ГНН.

На Мал.8 наведені дані про зміну кількості сфінгозину при
ішемії/гіпоксії в тканині нирок щурів. Так, простежувалося підвищення
концентрації сфінгозину в нирках контрольної групи-2 в 1,8 рази, в
групах однодобових тварин — в 1,7 рази, в групах дводобових тварин — в
2,1 рази, в групах тридобових тварин — в 2,0 рази (1 модель) в
порівнянні з контролем. У групах 11 моделі простежувалася аналогічна
тенденція: на 1 добу рівень сфінгозину збільшився в 1,6 рази, на 2-у
добу — в 1,9 рази і на 3-ю добу — в 1,9 рази. З отриманих результатів
виходить, що динаміка підвищення вмісту сфінгозину і розпаду
сфінгомієліну є зворотньо- спрямованою і співпадає у часі, тобто
максимум показника за сфінгозином відповідає мінімуму показника за
сфінгомієлином, що достовірно корелює з високим коефіцієнтом rxy. Тому
цілком ймовірно, що джерелом сфінгозину, що накопичується в тканині
нирок може бути сфінгомієлін. Також була відмічена позитивна кореляційна
залежність між деградацією ДНК і накопиченням сфінгозину в тканині нирок
при ГНН. Отримані результати дають основу передбачити, що сфінгозин може
виконувати функції інформаційної молекули в нирках при стимуляції
програмованої загибелі клітин.

Мал.8. Вміст сфінгозину в тканині нирок при експериментальній ГНН.

Отже, експериментальна гостра ниркова недостатність супроводжується
деградацією сфінгомієліну та накопиченням сфінгоїдних основ в нирках.

Протилежна динаміка вмісту сфінгомієлину та сфінгозину свідчить про
активацію сфінгомієлінового метаболічного шляху. Встановлена негативна
кореляційна залежність між гідролізом сфінгомієліну і деградацією ДНК,
що опосередковано вказує на взаємозв’язок цих процесів при даних моделях
ГНН.

Потрібно зазначити, що сфінгозин виявив цілий ряд кореляційної
залежності з показниками обмеженого протеолізу, з активацією СОД, з
рівнем NO (див. матрицю кореляційних зв’язків). Так, характер зміни
сфінгозину повністю повторював характер зміни протеолізу, тобто
позитивно корелював з лізисом як за азоказеїном, так і за азоколом, а
кореляція з активністю СОД і вмістом стабільних метаболітів NOх була
обернено-пропрорційною.

Оскільки даларгін, налоксон, нітроаміногуанидин і каптоприл мають
антиоксидантні властивості, а окислювальні реакції відіграють істотну
роль в індукції апоптозу, можна передбачити вплив даних препаратів на
метаболізм сфінгозину.

Матриця кореляційних зв’язків між вмістом сфінгозину (СФЗ) і
протеолізом, активністю СОД, рівнем NOх в клітинах нирок при ГНН.

1 модель

Пари кореляційних зв’язків Коефіцієнт кореляції, rxy Достовірність
кореляційних зв’язків

СФЗ — протеоліз за азоказеїном

СФЗ — протеоліз за азоколом

СФЗ — СОД

СФЗ — NOх 0,99

0,82

-0,94

0,94 < 0,001 < 0,05 < 0,001 < 0,001 11 модель СФЗ - протеоліз за азоказеїном СФЗ - протеоліз за азоколом СФЗ - СОД СФЗ - NOх 0,94 0,84 -0,99 0,92 < 0,001 < 0,05 < 0,001 < 0,001 У наших дослідженнях введення даларгіну спричиняло достовірне зниження вмісту сфінгозину в нирках в порівнянні з групами ГНН. Так, на 1-у добу зменшився в 1,3 рази, на 2-у добу - в 1,3 рази, на 3-ю добу - в 1,4 рази для груп 1 моделі. У групі контроль-2 сталося незначне зниження - в 1,2 рази. В експериментальних групах 11 моделі зменшення становило 23,5%, 22,8%, 26,4%, відповідно, в одно-, дво- і тридобових тварин. При паралельному введенні антагоніста і агоніста опіоїдних рецепторів зміни вмісту сфінгозину не відбувалося, тобто налоксон повністю усував нефропротекторний ефект даларгіну, що підтверджує участь опіоїдних рецепторів в реалізації антиапоптозної дії їх лігандів. Дуже яскраво був виражений цитопротекторний ефект антагоніста опіоїдних рецепторів за зниженням вмісту СФЗ в тканині нирок в порівнянні з групами ГНН. Після ін'єкції налоксону вміст СФЗ знизився в 1,3 рази на 1-у добу, в 1,4 рази - на 2-у добу і в 1,4 рази - на 3-ю добу в групах 1 моделі. Через 1год. після ішемії показник зменшився в 1,2 рази. В експериментальних групах 11 моделі спостерігалася аналогічна динаміка зниження вмісту сфінгозину на 21,2%, на 25,9%, на 27,3%. Характер зміни вмісту сфінгозину (СФЗ) і інтенсивності протеолізу в нирках під дією лігандів опіоїдних рецепторів був односпрямованим, що вказує на цитопротекторні властивості лігандів опіоїдних рецепторів і їх здібності впливати-таки на рівень СФЗ. А взаємозв'язок між вмістом СФЗ і активністю СОД в аналогічних умовах був протилежним. Отже, при стимульованому апоптозі вплив даларгіну і налоксону приводить до зниження апоптотичних процесів в нирках за рахунок зниження рівня сфінгоїдних основ. Продемонстрована в цих умовах залежність сфінгозину з протеолізом, СОД і NO вказує на те, що даларгін і налоксон також знижують токсичну дію сфінгозину. Відносно впливу оксиду азоту на рівень сфінгозину і, навпаки, в літературі існують вельми суперечливі дані. Наші експерименти показують, що інгібірування індукованої синтази оксиду азоту спричиняє різке зниження СФЗ в тканині нирок в порівнянні з контрольною групою і помірне зменшення відносно груп ГНН. Так, для груп 1 моделі зниження вмісту СФЗ становило 31,6% на першу добу, на другу добу - 25,1% і на третю добу - 26,5 % в порівнянні з групами ГНН. У контрольній групі-2 кількість СФЗ зменшилась на 21,5%. Отже, інгібіція iNOS зв'язана із зниженням рівня сфінгозину і цілком можна говорити про NO-опосередковану дію СФЗ при ішемії/гіпоксії. За допомогою селективної блокади активності циклооксигенази продемонстрована непряма участь СФЗ в реалізації програми клітинної загибелі в умовах розвитку ГНН. У наших експериментах було встановлено, що ін'єкція індометацину не впливала на накопичення вільного сфінгозину в нирках експериментальних тварин. Так, вміст СФЗ в нирках щурів 1 і 11 моделей достовірно не відрізнявся від такого показника в групах ГНН. Блокада циклооксигеназного метаболічного шляху призводить до інгібування синтезу простаноїдїв і збереженню підвищеного рівня сфінгозину в нирках при ГНН. Було встановлено, що в умовах розвитку гострої ниркової недостатності циклооксигеназний метаболічний шлях арахідонової кислоти сприяє активації апоптотичних процесів через накопичення сфінгозину, що є одним з медіаторів апоптозу сфінгомієлинового шляху, але не є NO-опосередкованим. Каптоприл, з притаманними йому антиоксидантними властивостями, знижував підвищений рівень сфінгозину (СФЗ) в нирках при ГНН. Так, в експериментальних групах 1 моделі зниження вмісту сфінгозину на 1-у добу становило 18,8%, на 2-у добу -10,3%, на 3-ю добу -14,3%, в порівнянні з групами ГНН. У групі контролю-2 не спостерігалося достовірних відмінностей. Для 11 моделі рівень СФЗ знизився в 1,2 рази, в 1,2 рази і в 1,3 рази на 1, 2 і 3-ю добу, відповідно. Зниження рівня СФЗ в нирках під дією каптоприлу достовірно корелювало із зміною вмісту кінцевих метаболітів оксиду азоту, активністю СОД і протеолізу. Отже, блокада АПФ супроводжується пригніченням сфінгомієлінового метаболічного шляху, що пов'язано, насамперед, з поліпшенням окислювально-відновних процесів в клітині і зниженням цитотоксичної дії оксиду азоту. Таким чином, отримані результати вказують на те, що сфінгомієлиновий метаболічний шлях може являтися ще одним з факторів модуляції апоптозу в нирках при ГНН. Доказана можливість впливу на генерацію вільного сфінгозину через такі внутрішньониркові регуляторні системи, як опіоїдні рецептори, обмін оксиду азоту, ангіотензинову та простаноїдну системи. При цьому спостерігається взаємозв’язок цих систем з активацією ключових ферментів (лактатдегідрогеназа, супероксиддисмутаза) та активацією інших участків обміну (протеолізу) в нирках в умовах стимульованого апоптозу. Модуляція апоптозу в нирках інтактних тварин через ОР, оксид азоту, ангіотензинову та простаноїдну системи призвела до неоднозначного порушення метаболізму сфінгозину в тканині. Блокада опіоїдних рецепторів в нормі супроводжується менш вираженим накопиченням продуктів розпаду сфінгомієлінового циклу, незалежно від метаболізму оксиду азоту. Дія нітроаміногуанідину, спрямована на підвищення рівня СФЗ, зв'язана зі зниженням вмісту стабільних метаболітів NO, що відрізняє даний регулятор апоптозу від даларгіну і налоксону. Односпрямовану дію блокаторів активності АПФ і ЦОГ на підвищення рівня СФЗ можна зв'язати з активацією ізоформ NOS і, як наслідок, накопиченням кінцевих продуктів NOx. Отже, на основі отриманих даних, можно зробити висновок, що при експериментальній ГНН розпад сфінгомієліну зв'язаний із збільшенням кількості сфінгоїдних основ в нирках. Протилежна динаміка вмісту сфінгомієліну і сфінгозину в тканині нирок свідчить про активацію сфінгомієлінази і про накопичення продуктів сфінгомієлінового циклу. Встановлена кореляція при аналізі вмісту сфінгозину та інтенсивності протеолізу, і рівня оксиду азоту, і активності СОД в нирках щурів при ГНН. З чого виходить, що накопичення СФЗ в тканині нирок при ГНН пов'язано з накопиченням метаболітів оксиду азоту, підвищенням активації протеолізу та інгібіцією антиоксидантного ферменту СОД. Якщо підсумовувати результати, отримані при експериментальній ГНН і за фізіологічних умов, то залежність активності сфінгомієлинового шляху від впливу опіоїдних рецепторів, оксиду азоту, ангіотензинової та простаноїдної систем представляється вельми вірогідною. ЯМР-релаксація протонів тканинної води нирок при стимульованому апоптозі. Час релаксації (Т1 і Т2) є біохімічним показником зміни об'єму клітини [Fullerton G.,1992]. Всі ЯМР-параметри в різній мірі взаємопов'язані, і деякі з них можуть грати важливу роль в ідентифікації тканин і діагностиці хвороб, пов'язаних з порушенням програми клітинної загибелі. Модуляція апоптозу через внутрішньониркові регуляторні системи викликала неоднозначні зміни в релаксації ниркової тканини. Після розвитку гострої ниркової недостатності було зафіксовано збільшення спін-гратчастої (Т1) і спін-спінової (Т2) складових часу релаксації в тканині нирок у порівнянні з групою контролю. Динаміка зміни показників Т1 і Т2 між групами ГНН-1, ГНН-2 і ГНН-3 виявилася однозначною: із збільшенням від першої до третьої доби. На подовжню (Т1) - релаксацію в тканинах впливають два чинники: вміст всієї тканинної води і здатність макромолекул зв'язувати воду в гідратний шар. Параметр Т2 визначається кількістю дільниць, що приєднують кристалізовану воду, і товщиною гідрованого шару [Ling G.N., Tucser M.,1990]. Подовження Т1- і Т2- часу релаксації свідчить про повільний протонний обмін між вільною та гідрованою фракціями тканинної води, а також про ущільнення шару гідратної води. У моделях гострої ниркової недостатності перерозподіл тканинної води в нирковій тканині відбувався у бік внутрішньоклітинної, з достовірним підвищенням на 10,5 %, на 11,1 %, на 11,8%, відповідно в групах одно -, дво - і тридобових тварин, в порівнянні з контролем. Отже, на початковій стадії розвитку ГНН в тканині нирок спостерігається тенденція до набухання клітин. Накопичення протонів тканинної води приводить до збільшення об'єму і закисленню середовища. Аналіз кореляційної матриці виявив наявність достовірно значущих кореляцій в нирках між ЯМР-показниками і ступенем фрагментації ДНК. Відомо, що при гострій нирковій недостатності стимуляція апоптотичних процесів носить періодичний характер і спостерігається декілька піків апоптозу. Перший пік апоптозу припадає на ранню фазу ГНН на 2-3-ю добу, другий пік - на 7-у добу, третій пік - на 14-у добу [Kelly K.J, Molitoris B.A.,2000]. Для підтвердження припущення про зв'язок ЯМР-параметрів з апоптотичними змінами в клітинах була досліджена ЯМР-релаксація на 5-й і 7-й день розвитку ГНН. На 5-у добу розвитку ГНН час релаксації Т1 і Т2 був зниженим і перерозподіл тканинної води відбувався у бік позаклітинної в порівнянні з групами ГНН-2 і ГНН-3 (перший пік апоптозу). На сьому добу розвитку ГНН встановлено підвищення часу релаксації Т1 і зниження часу релаксації Т2 в порівнянні з групами ГНН-2 і ГНН-3, що свідчить про зростання кристалічної фракції води . На 7-у добу розвитку гострої ниркової недостатності спостерігалося незначне набухання клітин нирок, відповідне другому піку апоптозу. На 5-у добу розвитку ГНН не спостерігалося підвищення значення Ра. Даларгін - синтетичний лей-енкефалін - на протязі трьох діб розвитку ГНН спричиняв достовірне зниження Т1 і Т2 в порівнянні з групами ГНН і контролем, при цьому об'єм клітин знижувався, але його показник не виходив на базальний рівень. При цьому частка внутрішньоклітинної води достовірно зменшується від першої до третьої доби, відповідно, на 5,8 %, на 5,2%, на 6,3 % в порівнянні з групами ГНН. Відмічена позитивна кореляція між Т1, Т2, Ра і фрагментацією ДНК. При введенні налоксону також встановлено зниження Т1. Перерозподіл тканинної води відбувався у бік позаклітинної, і також простежувалася тенденція до зниження набухання клітин. Встановлена позитивна кореляція Т1, Т2 і Ра з деградацією ДНК. Ін'єкція каптоприлу супроводжувалася зниженням як показника Т1, так і Т2 ниркової тканини в порівнянні з показниками в групах ГНН. Така динаміка показників характеризується швидким протонним обміном і зменшенням щільності гідрованого шару води , що супроводжується дегідратацією тканини. Під дією каптоприлу перерозподіл тканинної води відбувався у бік позаклітинної, тобто намітилася тенденція до зниження наводнювання клітин нирок. Був виявлений позитивний кореляційний зв'язок між деградацією ДНК і ЯМР-параметрами. Інгібіція індуцибельної синтази оксиду азоту супроводжувалася зниженням показників Т1 і Т2 у нирках в порівнянні з ЯМР-параметрами тварин з гострою нирковою недостатністю (ГНН), що вказує на швидкий протонний обмін між фракціями води та поширювання гідрованого прошарку. Статистично значуще відбувався перерозподіл тканинної рідини між внутрішньо- та позаклітинним простором у бік останнього. Був також виявлений позитивний кореляційний зв'язок між величинами Т1, Т2, Ра і вмістом фрагментованої ДНК в клітинах нирок. Отже, можна зробити висновок, що даларгін, налоксон, каптоприл і нітроаміногуанідин, що проявили антиапоптотичну дію, змінюють внутрішньоклітинний об'єм з тенденцією до його зменшення. При цьому показники Т1 і Т2 для кожного препарату змінювалися неоднозначно. Ми вивчили залежність ЯМР-параметрів від вмісту стабільних метаболітів оксиду азоту в клітинах нирок при експериментальній ГНН. Кореляційний аналіз показав, що існує достовірна залежність між ЯМР-показниками і вмістом метаболітів NOx. В групах ГНН+даларгін: Т1 - NOх (r xy =0,37), Т2 - NOх (r xy =0,66), Ра - NOх (r xy =0,78); ГНН+налоксон: Т1 - NOх (r xy =0,43), Т2 NOх (r xy =0,98), Ра - NOх (r xy =0,92); ГНН+каптоприл: Т1 - NOх (r xy =0,90), Т2 -NOх (r xy =0,99), Ра - NOх (r xy =0,77); ГНН+нітроаміногуанідин: Т1 - NOх (r xy =0,96), Т2 - NOх (r xy =0,84), Ра - NOх (r xy =0,96). Мабуть, в даних умовах об'єм клітини опосередковано залежить оксиду азоту, можливо, через регуляцію іонних каналів. У дослідженнях на інтактних щурах ін'єкція даларгіну супроводжувалася зниженням показників часу релаксації Т1 і Т2 в порівнянні з контрольною групою. Перерозподіл тканинної води відбувався у бік позаклітинної фракції, тобто простежувалося деяке набухання клітин нирок в порівнянні з контролем. Так, на 1-у добу після ін'єкції даларгіну збільшення Ра становило 4,2%, на 2-у добу - 5,8 %, на 3-ю добу - 8,3%, тобто ефект був залежним від часу. Була виявлена достовірна кореляція між ЯМР-параметрами і фрагментацією ДНК. І+даларгін: Т1 - NOх (r xy =0,77), Т2 - NOх (r xy =0,98), Ра - NOх (r xy =0,92). Блокування активності АПФ призвело до деякого зниження показника часу релаксації Т1 і Т2 в клітинах нирок у порівнянні з групою контролю. Каптоприл сприяв перерозподілу тканинної води у бік внутрішньоклітинної фракції і незначному набуханню ниркових клітин. Була виявлена кореляційна залежність в динаміці ЯМР-показників і фрагментації ДНК для груп І+каптоприл: Т1- NOх (r xy =-0,98), Т2 - NOх (r xy =-0,88), Ра - NOх (r xy =0,97). Час релаксації Т1 і Т2 при введенні інгібітора індуцибельної NOS мав залежну від часу тенденцію до зниження, що є характерним для зменшення щільності гідрованої фракції води, параметр Ра плавно підвищувався відносно контрольних значень. Була виявлена кореляційна залежність в динаміці ЯМР-показників і фрагментації ДНК для груп І+нітроаміногуанідин: Т1 - NOх (r xy =-0,68), Т2 - NOх (r xy =0,97), Ра - NOх (r xy =0,88). Також були встановлені кореляційні зв'язки між ЯМР-параметрами і рівнем стабільних метаболітів NOх, які виявили неоднозначну залежність для даларгіну, каптоприлу і нітроаміногуанідину. Так, на фоні введення даларгіну динаміка зміни ЯМР-характеристик і рівня NOх була односпрямованою. Каптоприл також мав негативний кореляційний зв'язок за часом Т1 і Т2, а зміна клітинного об'єму корелювала позитивно з рівнем NOх. Для нітроаміногуанідину кореляційний зв'язок між ЯМР-параметрами і вмістом кінцевих метаболітів NOх виявився також позитивним. Отже, проапоптотична дія даларгіну, нітроаміногуанідину і каптоприлу на нирки інтактних щурів супроводжується зниженням показників часу релаксації Т1 і Т2 і підвищенням частки внутрішньоклітинної води Ра відносно контролю, тобто деяким набуханням клітин. Для даларгіну і каптоприлу ці процеси протікають на фоні підвищення метаболітів оксиду азоту, а для нітроаміногуанідину - при зниженні рівня NOх. Індометацин і глібенкламід проявили інший ефект на ЯМР-показники нирок в умовах даних моделей активації апоптозу. Введення індометацину підтримувало підвищене значення показників часу релаксації і достовірно не змінювало перерозподіл тканинної води в порівнянні з групами ГНН. Отже, індометацин підтримує набухання клітин нирок, і при цьому спостерігається позитивна кореляція між ЯМР-показниками і ступенем фрагментації ДНК. ГНН+індометацин: Т1 - ф-ДНК (rxy = 0,68), Т2 - ф-ДНК(rxy = 0,98), Ра - ф-ДНК (rxy = 0,54). Ін'єкція глібенкламіду супроводжувалася зниженням величини часу релаксації Т1 і Т2, а частка внутрішньоклітинної води Ра достовірно не змінювалася в порівнянні з групами ГНН. Також як і з попередніми препаратами була встановлена позитивна кореляція між ЯМР-показниками і фрагментацією ДНК. ГНН+глібенкламід: Т1 - ф-ДНК (rxy = 0,51), Т2 - ф-ДНК (rxy = 0,64), Ра - ф-ДНК(rxy = 0,61). Отже, індометацин і глібенкламід достовірно не змінюють клітинний об'єм, тобто підтримують незначне набухання клітин ниркової тканини при гострій нирковій недостатності. Кореляційний аналіз, проведений між ЯМР-параметрами і рівнем кінцевих метаболітів оксиду азоту, встановив достовірний позитивний зв'язок між цими показниками для глібенкламіду і негативну кореляцію за часом релаксації для індометацину. ГНН+глібенкламід: Т1 - NOх (rxy =0,87), Т2 - NOх (rxy =0,94), Ра - NOх (rxy =0,93), ГНН+індометацин: Т1 - NOх (rxy =-0,78), Т2 - NOх (rxy =-0,35), Ра - NOх (rxy =0,82). Отже, для модуляторів з апоптотичною дією зміна рівня NOх (у бік пониження) не впливає безпосередньо на клітинний об'єм (не спостерігається достовірної зміни) на фоні розвитку ГНН. У клітинах нирок інтактних щурів налоксон і глібенкламід спричиняли зниження показників ЯМР-релаксації і зберігали незмінним клітинний об'єм (Ра) у порівнянні з групами контролю. Потрібно зазначити, що ступінь апоптозу після ін'єкції налоксону був меншим приблизно в 1,5-2 рази. Певно, для лігандів опіоїдних рецепторів характерні різні механізми запуску суїцидальної програми, що відбилося на показниках ЯМР-релаксації. Судячи по їх різноманітній дії на рівень оксиду азоту, можна передбачити, що зміна клітинного об'єму пов'язана з регуляторною функцією NOх. Глібенкламід також достовірно знижував показники як Т1, так і Т2, що свідчить про поширення шару гідратної води. Була розглянута кореляційна залежність між ЯМР-параметрами і фрагментацією ДНК. У групах І+глібенкламід динаміка цих параметрів була односпрямованою і кореляція була позитивною. Блокада циклооксигенази супроводжувалася зниженням часу релаксації, але при цьому всередині груп І+індометацин відбувалася недостовірна зміна величини Т1 у бік зниження, а величини Т2 - у бік підвищення. Оскільки в експериментальних групах І+індометацин частка внутрішньоклітинної води відповідала базальному рівню, а вміст фрагментованої ДНК підвищувався, то спостерігалася негативна кореляція. Ми також простежили залежність між ЯМР-показниками і рівнем кінцевих метаболітів оксиду азоту. Встановлено, що введення налоксону і глібенкламіду спричиняє зміну вмісту кінцевих метаболітів NOх і не впливає на клітинний об'єм нирок. Індометацин, спричиняючи підвищення вмісту метаболітів NO достовірно не змінював внутрішньоклітинну частку тканинної води і, відповідно, зміни клітинного об'єму нирок. Таким чином, проведені експериментальні дослідження показали, що параметри ядерної магнітної релаксації відображають фізико-хімічні властивості клітин тканини і повідомляють важливу додаткову інформацію про стан гомеостазу при патологічних станах, зокрема, в нирках. Зміна ЯМР-параметрів під дією модуляторів про- і антиапоптотичної дії підтверджує наше припущення про участь Н+-механізмів в регулюванні клітинного об'єму. Більш глибокий аналіз внеску різних механізмів апоптозу в зміну клітинного об'єму потребує подальшого глибокого і всебічного вивчення. Висновки: Виявлені біохімічні ознаки активації апоптотичних процесів в нирках при ішемічній і “гліцерольній” моделях гострої ниркової недостатності (ГНН). Відмічено збільшення деградації ДНК (в 5,4 рази) на 2-у добу розвитку гострої ниркової недостатності для обох моделей. Встановлено, що стимуляція програми клітинної загибелі при експериментальній ГНН супроводжується підвищенням активації протеолізу (34,4%), накопичення стабільних метаболітів оксиду азоту и зниженням активності супероксиддисмутази (65%) в тканині нирок. Початкова фаза експериментальної гострої ниркової недостатності супроводжується помірним підвищенням рівню стабільних метаболітів оксиду азоту (в 2,7 рази) із максимальним вмістом на 2-3-ю добу. Виявлена роль активації опіоїдних рецепторів як фактор модуляції апоптозу в нирках. При експериментальній ГНН активація опіоїдних рецепторів супроводжується антиапоптотичний ефектом, а за фізіологічних умов – проапоптотичним. Антиапоптотичний ефект синтетичного лей-енкефаліну – даларгіну реалізується через д1-опіоїдні рецептори з активацією К+АТФ – каналів мітохондрій. За фізіологічних умов проапоптотична дія даларгіну не пов’язана з активацією К+АТФ – каналів мітохондрій і реалізується не через д-опіоїдні рецептори. Антиапоптотичний ефект блокування ангіотензин-перетворюючого ферменту пов’язаний з пониженням деградації ДНК і накопичення сфінгозину, реалізація даного ефекту носить NO- залежний характер. Блокування простаноїдної системи нирок супроводжується підвищенням вмісту фрагментованої ДНК і сфінгозину в тканині нирок при різних моделях ГНН, що вказує на захисний ефект простаноїдів. Проапоптотична дія індометацину не залежить від рівня оксиду азоту Встановлена активація сфінгомієлінового метаболічного шляху в тканині нирок при експериментальній ГНН. Вона супроводжується зниженням вмісту сфінгомієлину і накопиченням вільних сфінгоїдних основ. На основі кореляційного аналізу отримана залежність між рівнем вільних сфінгоїдних основ і активністю супероксиддисмутази (негативна), і активністю лактатдегідрогенази, і протеолітичною активністю тканини, і накопиченням стабільних метаболітів оксиду азоту (позитивна). Встановлено підвищення часу релаксації і частки внутрішньоклітинної води в нирках при експериментальній ГНН. Зміна часу релаксації пов’язана із ущільненням гідратної частки тканинної води. За умов модуляції апоптозу при ГНН через опіоїдні рецептори, обмін оксиду азоту і ангіотензинову систему спостерігалося скорочення часу релаксації і зменшення клітинного об’єму, що вказує на нормалізацію клітинних процесів в нирках. Модуляція апоптозу через простаноїдну систему нирок супроводжується скороченням часу релаксації, але без зміни клітинного об’єму нирок. Зміна ЯМР-параметрів носила NO- залежний характер. За умов норми всі дослідженні препарати (крім глібенкламіду) викликають залежну від часу деградацію ДНК, незалежно від рівня оксиду азоту. Встановлена можливість модуляції апоптотичних процесів через біохімічні регуляторні системи нирок - опіоїдні рецептори, К+АТФ –канали, обмін оксиду азоту, сфінгомієлин-сфінгозиновий шлях, ангіотензинову і простаноїдну, - механізм дії котрих пов’язаний із перерозподілом внутрішньо- та позаклітинної фракції тканинної води нирок. Список опублікованих робіт: Комарєвцева І.О., Орлова О.А., Благодаренко Є.А. Вміст оксиду азоту в тканинах нирок при активації апоптозу // Укр. біохім. журнал.-2002.-Т.74, №4а (додаток1).-С.47-50. Орлова Е.А., Комаревцева И.А. Влияние даларгина на содержание стабильных метаболитов оксида азота в почках крыс при активации апоптоза // Укр. біохім. журнал.- 2002.-Т.4,№6.-С.131-135. Орлова Е.А., Комаревцева И.А. Роль NO-синтазы в стимуляции опиатных рецепторов и устойчивости почек к оксидантному стрессу// Укр. біохім. журнал.- 2003.-Т.76,№4.-С.97-101. ОрловаО.А., Комарєвцева І.О., Комарєвцев В.М. Спосіб визначення вмісту окису азота в тканині та біологічних рідинах” №2002032337, 10 жовтня 2002р. Орлова Е.А., Комаревцев В.Н. Определение фрагментации ДНК в клетках почечной ткани // Актуальні проблеми акушерства і гінекології, клінічної імунології та медичної генетики. -Луганськ, 2001.-вип.6.-С. 206-208. Орлова О.А. Динаміка зміни концентрації сфінгомієлина і фрагментації ДНК в клітинах ниркової тканини при експериментальній гострій нирковій недостатності // Український журнал екстремальної медицини ім. Г.О.Можаєва. –2001.-№4.-С 60-63. Комаревцев В.Н., Комаревцева И.А., Орлова Е.А., Благодаренко Е.А., Фильчуков Д.А., Головченко Н.Н. Биохимические механизмы апоптоза при заболеваниях почек.// Український медичний альманах .-Луганськ.-2001.-Т.4,№5-С. 188-193. Орлова Е.А., Благодаренко Е.А., Фильчуков Д.А. Методика определения сфингомиелина в почечной ткани // Український медичний альманах. Луганськ.- 2001.-Т.4.-№5.-С.120-123. Орлова Е.А. Деградация ядерной дезоксирибонуклеиновой кислоты и ее коррекция даларгином в условиях стимуляции апоптоза // Укр.ж.екстр.мед.ім. Г.О.Можаєва.-2002.-Т.3, №4.- С.58-61. Орлова О.А. Динаміка протеолітичної активності в тканині нирок щурів за умовами окиснювального стресу // Укр.мед.альманах.-Луганськ .- 2002.-Т.5,№ 5.-С.98-99. Орлова Е.А. Протеолитическая активность ткани почек при стимуляции апоптоза на фоне введения даларгина. // Укр.мед.альманах.-Луганськ .- 2002.-Т.5,№ 6.-С.106-108. Орлова Е.А. Анализ нитритов и нитратов в ткани при экспермиментальной острой почечной недостаточности// Укр.ж.екстр.мед.ім. Г.О.Можаєва.-2002.-Т.3, №1.- С.79-82. Орлова Е.А., Клименко В.В., Бриндак Д.В., Высочин М.В., Науменко К.А. О роли сфингозина в передаче сигнала апоптоза при экспериментальной острой почечной недостаточности // Український медичний альманах.-Луганськ.-2003.-Т.6,№1.-С.83-85. Орлова Е.А., Комаревцева И.А. О роли оксидантного стресса в развитии апоптоза при экспериментальной острой почечной недостаточности// Укр.мед. альманах.-Луганськ.- 2003.-Т.6,№ 1.-С.83-85. Орлова Е.А.Влияние каптоприла на свободнорадикальные процессы в почках при экспериментальной острой почечной недостаточности// Укр.мед. альманах – Луганськ.-2003.-Т.6,№ 6.-С.116-118. Орлова Е.А., Комаревцева И.А. Коррекция активности ангиотензин-превращающего фермента как способ регуляции апоптоза// Укр.мед.альманах – Луганськ.-2003.-Т.6,№ 4.-С.103-105. Орлова Е.А., Комаревцева И.А. Апоптоз и оксидантный стресс при почечных патологіях// Укр.ж.екстр.мед.ім. Г.О.Можаєва.-2003.-Т.4, №4.- С.68-73. Орлова Е.А. Влияние даларгина на содержание сфингозина, активность СОД и апоптоз, индуцированный ишемией/ реперфузией в почках// Журн. експерім.та клін. фізіології та біохімії.-2004.-№1.-С.34-41. Орлова Е.А. Биохимическая активность налоксона в условиях стимулированного апоптоза// Укр.мед.альманах.-2004.-Т.7,№2 (додаток).-С.133-136. Орлова Е.А. Взаимосвязь ОР и К+атф –каналов в регуляции апоптоза в почках// Укр.мед.альманах.-2004.-Т.7,№4.-С.104-107. Орлова Е.А.Роль циклооксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты в регуляции апоптоза клеток почек. \\ Укр.мед.альманах – Луганськ.-2004.-Т.7,№ 1 (додаток).-С.21-24. Орлова Е.А., Сенчий В.Н. Н+-протонные механизмы клеточного объема при стимулированном апоптозе в почках по данным ЯМР-релаксометрии// Зб.наук.праць співроб. КМАПО ім.П.Л.Шупіка.-2004.-Вип.3.-С.85-88. Комарєвцева І.О.,Орлова О.А., Комарєвцев В.М., Благодаренко Є.А. Вивчення ролі сфінгомієлинового сигнального шляху активації апоптозу в тканині нирок //Фізіол.ж. (Матер. ХVI з”їзду Українського фізіологічного товариства, м. Вінниця ).-2002.-Т.48,№2.-С.7. Комаревцева И.А., Орлова Е.А., Благодаренко Е.А. Бифункциональный характер действия оксида азота в ткани почек при активации апоптоза// Укр. біохім.ж. -2002.-Т.74, №4а(додаток 1).-С.47. Орлова О.А., Вішницька І.А., Кліменко В.В. и др. Сфінгозин – активна молекула в проведенні сигналу апоптозу при експериментальній гострій нирковій недостатності// IX конгрес світової федерації українських лікарських товариств: Зб. наук. праць.-Луганськ-Київ- Чикаго.-2002.- С.274. Орлова Е.А., Фильчуков Д.А., Холина Е.А. Изменение уровня Са2+ в почках при стимулированном апоптозе// Проблеми остеології ( Матер. наук.-практ.конф.).-2003.-Т.6, №4.-С. 69. Комаревцева И.А., Орлова Е.А., Бриндак Д.В., Науменко К. А., Орлова В.В. Різноманітність активності налоксону в нирках при активації апоптозу та в нормі// Укр.мед.альманах.-2004.-Т.7,№5 (додаток).-С.87. Анотація Орлова О.А. Модуляція апоптозу і внутрішньониркові регуляторні системи при експериментальній гострій нирковій недостатності. - Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук, за спеціальністю 14.01.32 – медична біохімія. - Київський національний медичний університет ім. О.О.Богомольця. м. Київ, 2005р. Дисертація присвячена дослідженню ролі біохімічних регуляторних систем - опіоїдних рецепторів, обміну оксиду азоту, КАТФ-каналів, сфінгомієлин-сфінгозинового шляху, ангіотензинової і простаноїдної систем - в модуляції апоптозу при експериментальній гострій нирковій недостатності. В основу роботи покладено аналіз результатів дослідження в нирках щурів (1575) вмісту фрагментації ДНК, метаболітів оксиду азоту, сфінгомієлину, сфінгозину, активності супероксиддисмутази, лактатдегідрогенази, активації протеолізу, ЯМР-релаксації за умов розвитку гострої ниркової недостатності та фізіологічних умовах. Виявлені біохімічні і морфологічні ознаки активації апоптотичних процесів в нирках при ішемічній і “гліцерольній” моделях гострої ниркової недостатності (ГНН). Встановлено, що стимуляція програми клітинної загибелі при експериментальній ГНН супроводжується активацією сфінгомієлінового метаболічного шляху, накопиченням стабільних метаболітів оксиду азоту, підвищенням активації протеолізу, зниженням активності супероксиддисмутази в тканині нирок. Розкритий механізм модуляції апоптозу в нирках через активацію опіоїдних рецепторів з участю К+АТФ – каналів мітохондрій при різних моделях ГНН та в нормі. Робота є першою, в якій встановлена можливість модуляції апоптотичних процесів через регуляторні внутрішньониркові системи: опіоїдні рецептори, К+АТФ –канали, обмін оксиду азоту, сфінгомієлин-сфінгозиновий шлях, ангіотензинову і простаноїдну системи, механізм дії котрих пов’язаний із перерозподілом внутрішньо- та позаклітинної фракції тканинної води нирок. Ключові слова: апоптоз, нирки, модуляція, оксид азоту, сфінгозин, опіоїдні рецептори, К+АТФ – канали, ангіотензин-перетворюючий фермент, циклооксигеназа, ЯМР-релаксація, гостра ниркова недостатність. Аннотация Орлова Е.А. Модуляция апоптоза и внутрипочечные регуляторные системы при экспериментальной острой почечной недостаточности. - Рукопись. Диссертация на соискание научной степени доктора биологических наук, по специальности 14.01.32 - медицинская биохимия. - Киевский национальный медицинский университет им. А.А. Богомольца. г. Киев, 2005 г. Диссертация посвящена исследованию роли биохимических регуляторных систем -опиоидных рецепторов, обмена оксида азота, КАТФ –каналов, сфингомиелин-сфингозинового пути, ангиотензиновой и простаноидной систем - в модуляции апоптоза при экспериментальной острой почечной недостаточности. В основе работы лежит изучение степени развития апоптотических процессов в почечной ткани биохимически (по фрагментации ДНК) в сопоставлении с морфологической детекцией (с использованием ядерного красителя Хехст) при стимулировании программируемой клеточной гибели (ишемическая и “глицерольная” модели экспериментальной острой почечной недостаточности). Установление наличия экспрессии индуцибельной синтазы оксида азота по содержанию стабильных метаболитов оксида азота – нитрит- и нитрат-анионам в ткани почек при разных моделях ОПН. Выявление биохимических механизмов модуляции апоптотических процессов в почках через активацию опиоидных рецепторов. Изучение активности сфингомиелинового метаболического пути в почках в сигналпередающих системах апоптоза при экспериментальной острой почечной недостаточности. Рассмотреть ангиотензиновую и простаноидную системы почек как факторы модуляции апоптоза при экспериментальной острой почечной недостаточности. Изучить изменение времени релаксации протонов тканевоц воды по данным ЯМР-релаксации при экспериментальной острой почечной недостаточности. Установлено, что биохимические и морфологические изменения в клетках почек, связанные с активацией апоптотических процессов, носят однотипный качественный и количественный характер как при “ишемия/реперфузионном синдроме”, так и при “глицерольной” модели острой почечной недостаточности. Установлено, что оксид азота имеет бифункциональный характер действия, но на начальной стадии развития ОПН умеренная гиперпродукция оксида азота в почках носит цитотоксический характер. На этиологически разных моделях острой почечной недостаточности установлен вклад опиоидных рецепторов, К+АТФ – каналов, оксида азота, сфингоидных оснований, ангиотензиновой и простаноидной систем в модуляцию апоптотических процессов в почках. Активация опиоидных рецепторов в почках вызывает различные эффекты в развитии апоптоза: в физиологических условиях – проапоптотический и антиапоптотический – в условиях развития экспериментальной ОПН. Проапоптотический эффект опиоидных рецепторов реализуется не через д-опиоидные рецепторы и не зависит от уровня оксида азота, а их антиапоптотическое действие является NO-зависимым процессом и запускается через д-опиоидные рецепторы с участием К+АТФ – каналов. Установлена активация сфингомиелинового метаболического пути в ткани почек при экспериментальной ОПН. Она сопровождалась понижением содержания сфингомиелина и накоплением свободных сфингоидных оснований. На основании корреляционного анализа получена зависимость между уровнем свободных сфингоидных оснований и активностью супероксиддисмутазы (отрицательная), и накоплением стабильных метаболитов оксида азота (положительная).Блокада циклооксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты сопровождается повышением содержания фрагментированной ДНК и сфингозина в ткани почек при разных моделях ОПН, что указывает на защитный эффект простаноидов. Антиапоптотический эффект блокирования ангиотензин-превращающего фермента связан с понижением деградации ДНК и накопления сфингозина, реализация данного эффекта носит NO-зависимый характер. Установлено увеличение времени релаксации и доли внутриклеточной воды почек в условиях стимулированного апоптоза. При модуляции апоптоза в условиях ОПН через опиоидные рецепторы, оксид азота и ангиотензиновую систему наблюдалось понижение времени релаксации и уменьшение клеточного объема, что указывает на нормализацию клеточных процессов в почках. Модуляция апоптоза через простаноидную систему почек сопровождается понижением времени релаксации, но без изменения клеточного объема почек. Изменение ЯМР-параметров носит NO-зависимый характер. В условиях нормы все препараты (кроме глибенкламида) вызывают времязависимую деградацию ДНК, независимо от уровня оксида азота. Впервые на основании экспериментальных данных показана возможность модуляции апоптотических процессов через регуляторные внутрипочечные системы: опиоидные рецепторы, К+АТФ – каналы, обмен оксида азота, сфингомиелин-сфингозиновый путь, ангиотензиновую и простаноидную системы, механизм действия которых связан с перераспределением внутри- и внеклеточной фракции тканевой воды почек. Полученные результаты развивают научные представления о биохимических модуляторах апоптотических процессов при патологиях и способствуют новым исследованиям по разработке терапевтических подходов в клинической уронефрологии. Ключевые слова: апоптоз, почки, модуляция, оксид азота, сфингозин, опиоидные рецепторы, К+АТФ – каналы, ангиотензин-превращающий фермент, циклооксигеназа, ЯМР-релаксация, острая почечная недостаточность. Summary Orlova Ye.A. Apoptosis modulation end intrarenal regulatory systems in experimental acute renal failure. - Manuscript. Thesis for a Doctor's degree on speciality 14.01.32 - medical biochemistry. - Kyiv national medical university of O.O.Bohomolets. Kyiv, 2005 The thesis deals with the research of role of opioid receptors, nitric oxide, K ATP–channels, way of sphingomyelin-sphingosine, angiotensin and prostanoid system in apoptosis modulation during experimental acute renal failure development. In the basis of the work there is analysis of results of research of content of DNA fragmentation, nitric oxide metabolites, sphingomyelin, sphingosin, activity of superoxide dismutase, lactate dehydrogenase, proteolysis activation, NMR relaxation in the kidneys of the rats under the condition of acute renal failure and physiological conditions. Biochemical and morphological signs of apoptosis processes activation in kidneys in ischemic and "glycerol" models of acute renal failure (ARF) were revealed. It was assigned that stimulation of apoptosis program in experimental ARF is accompanied by activation of sphingomyelin metabolic way, storing of stable nitric oxide metabolites, increasing activation of proteolysis, decreasing superoxide dismutase activity in kidney tissue. Mechanism of apoptosis modulation in kidneys by means of opioid receptors with K+ATP -channels of mitochondrion’s in different models of ARF and in normal conditions was revealed. The work is the first one to reveal the opportunity of apoptosis processes modulation by means of intrarenal regulation systems: opioid receptors, K+ATP- channels, nitric oxide metabolism, sphingomyelin-sphyngosine way, angiotensin and prostanoid systems, mechanism of their action is connected with redistribution of intra- and extra-cellular fractions of tissular water in kidneys. Key words: apoptosis, kidneys, modulation, nitric oxide, sphingosin, opioid receptors, K+ATP- channels, angiotensin converting enzyme, cyclooxygenase, NMR relaxation, acute renal failure. Здано до набору 23.09.2005. Підписано до друку 28.09.2005 Формат 60х84 1/16 . Папір офсетний. Друк офсетний. Умовн. друк. арк. 1,9. Тираж 100. Зам. 300. Замовне. Віддруковано у видавничому центрі ЛугДМУ. 91045, м. Луганськ, кв. 50 років Оборони Луганська, 1. PAGE \* Arabic 2

Похожие записи