НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛЛАДІНА

Лиманський Олександр Петрович

УДК 577.2

577.32

Модифікація та функціоналізація зондів і субстратів для
нанобіотехнології

03.00.20 – біотехнологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у лабораторії нових та маловивчених інфекційних
захворювань Інституту мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН
України (м. Харків).

Науковий доктор медичних наук, професор

консультант – Волянський Юрій Леонідович,

Інститут мікробіології та
імунології ім. І.І. Мечникова

АМН України, м. Харків,

директор інституту.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,
чл.-кор. НАН України

Малюта Станіслав Станіславович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

завідувач відділу молекулярної генетики;

доктор біологічних наук, професор

Стародуб Микола Федорович,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,

головний науковий співробітник;

доктор фізико-математичних наук, професор

Малюкін Юрій Вікторович,

Інститут сцинтиляційних матеріалів НТК «Інститут монокристалів» НАН
України,

завідувач відділу нанокристалічних матеріалів.

Захист відбудеться “29” жовтня 2007 року о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.
Палладіна НАН України за адресою: 01601, Київ-30, вул. Ле-онтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім.
О.В. Палладіна НАН Украї-ни (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий 26 вересня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук
Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Аналіз тенденцій розвитку суспільства
засвідчує, що прогрес як люд-ства взагалі, так і окремих країн наразі та
у найближчі часи в значній мірі визначатиметься нано-технологіями. Тому
у провідних наукових країнах розроблено пріоритетні національні
нанотехно-логічні проекти. При цьому вважають, що існують певні ризики
вкладення коштів, але підкреслю-ють, що значно більші ризики виникають у
разі невкладення останніх…

Здатність молекул ДНК до регульованого та високоорганізованого
складання перетворює її на ідеальний матеріал для нанотехнології та
нанобіотехнології (галузі біотехнології, яка направлена на вивчення та
створення матеріалів з покращеними фізичними, хімічними та біологічними
влас-тивостями на нанорівні, фундаментальні дослідження якої базуються
на маніпулюванні біологіч-ними системами з використанням
нанотехнологічного обладнання). Увага широкого кола дослід-ників прикута
до ДНК навіть через п’ятдесят з лишком років після відкриття структури
цієї моле-кули. Величезний інтерес вчених та актуальність таких
досліджень обумовлені як роллю, що віді-грає ДНК у найважливіших
клітинних процесах, так і можливістю одержати принципово нову
ін-формацію через розробку новітніх технологій та методів дослідження.

Потужним імпульсом для розвитку нанобіотехнології, структурної
нанобіології, нановірусоло-гії стала розробка численних варіантів
скануючої зондової мікроскопії. Найпоширений з таких ме-тодів
(атомно-силова мікроскопія, АСМ) відкрив безпрецедентні можливості для
візуалізації, ма-ніпулювання та аналізу поодиноких молекул, у тому числі
за фізіологічних умов. “Оком” атомно-силового мікроскопа, або своєрідним
біосенсором, є зонд, який приєднано до кантилевера. Попе-редні
дослідження (Gaub, 1994) показали, що сила розриву між взаємодіючими
поверхнями на рів-ні поодиноких пар молекул надає нову та надзвичайно
цінну інформацію щодо природи взаємодії: можливо відрізнити специфічну
взаємодію від неспецифічної, та навіть енергетично рівновеликі взаємодії
також можуть бути диференційовані. Ковалентне зв’язування біополімерів
із зондом атомно-силового мікроскопа перетворює останній на
мономолекулярний біосенсор. За його допо-могою можливо вивчати тонкі
особливості взаємодії ліганда з рецептором, а також локалізувати
специфічні рецептори на поверхні зразка.

Створення зондів для вивчення поверхневих властивостей клітин та
локалізації білків на повер-хні і всередині клітинного ядра, дослідження
структури молекул ДНК при іммобілізації на суб-стратах з різними
поверхневими властивостями для фундаментальних і прикладних досліджень
за допомогою скануючої зондової мікроскопії є актуальними задачами
сучасної нанобіотехнології, яка виникла на стику нанотехнології,
молекулярної біології, електроніки, фізики та хімії поверхні.

Визначальна роль в отриманні високоякісних зображень біополімерів
за допомогою АСМ від-водиться процедурі модифікації субстрату для
іммобілізації молекул. Раніше було розвинено де-кілька методів
підготовки зразка ДНК, які нині використовують у багатьох лабораторіях
через простоту процедури. Для попередньої обробки слюди, субстрату для
АСМ, з метою підвищення її афінності до ДНК використовували ди- та
тривалентні катіони (Hansma et al., 1994; Bustamante et al., 1997),
природні та синтетичні поліаміни (Okada et al., 1998; Jovin et al.,
2001; Langowski et al., 2003). Також для візуалізації ДНК були
застосовані субстрати з напилюванням золота, на поверхні якого утворені
самоасоційовані моношари тіогруп (Hegner, 1993). Поряд з зазначеними
методами, через наявність у них ряду вузьких міст, було розроблено інші
підходи до модифікації слюди – об-робкою похідними аміносиланів у
розчині та у газовій фазі (Любченко, 1992). Проте залишилися
невирішеними питання стосовно структури лінійних молекул ДНК, механізму
компактизації су-перспіральних ДНК, іммобілізованих на поверхні слюди.
Доцільність проведення таких дослід-жень обумовлена можливістю одержання
додаткової фундаментальної інформації, яка може на-близити до розуміння
особливостей компактизації ДНК в ядрах еукаріотів, нуклеоїдах бактерій
та іммобілізації на субстраті.

Незважаючи на відомі методи модифікації зондів та іммобілізації
ДНК на слюді, технологія

створення модифікованих зондів та субстратів із заданими властивостями
(а саме регульованою поверхневою щільністю заряду та гідрофобністю) для
фундаментальних та прикладних дослід-жень в галузі нанобіотехнології не
була реалізована на момент початку досліджень.

Дисертація присвячена розв’язанню наукових проблем
нанобіотехнології, що пов’язані з мані-пулюванням біополімерами, –
створенню субстратів з регульованими поверхневими властивостя-ми,
розробці модифікованих зондів (як універсальних компонентів біосенсорів)
та зондів, функці-оналізованих біомакромолекулами, для силової
мікроскопії впізнавання поодиноких молекул, мо-лекулярним механізмам
компактизації та структурі лінійних і суперспіральних ДНК,
іммобілізова-них на субстраті, візуалізації комплексів, що утворює
РНК-полімераза (РНКП) бактеріофага Т7 з ДНК-матрицею при елонгації
транскрипції.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Дисертаційна робота пов’я-зана з плановими темами лабораторії нових та
маловивчених інфекційних захворювань Інституту мікробіології та
імунології ім. Мечникова АМН України: АМН 40/2001 “Розробка
молекулярно-генетичних тест-систем для раннього виявлення збудникiв
туберкульозу і генотипування мікобак-терій”, № держреєстрації
0101U001328; АМН 47/2002 “Вивчення геномної організації Bacillus
an-thracis та розробка молекулярно-генетичних тест-систем для детекції
та типування збудника сибір-ської виразки”, № держреєстрації
0102U001570; АМН 59/2004 “Вивчення геномної організації та розробка
молекулярно-генетичних тест-систем для детекції та типування
коронавірусу людини, зчепленого з тяжким гострим респіраторним
синдромом”, № держреєстрації 0104U002959, в рам-ках яких автор був
відповідальним виконавцем.

Мета і завдання дослідження. Метою дослідження була розробка
нанобіотехнологічних підходів до візуалізації і маніпулювання
поодинокими молекулами і клітинами та визначення шля-хів і молекулярних
механізмів компактизації молекул суперспіральної ДНК при іммобілізації
на субстраті.

Об’єктом дослідження є модифіковані та функціоналізовані
біополімерами зонди та суб-страти для атомно-силової мікроскопії,
процеси іммобілізації ДНК і білків на їхніх поверхнях.

Предметом дослідження є процеси модифікації та
функціоналізації біополімерами зондів та субстратів для атомно-силової
мікроскопії, структура молекул ДНК, іммобілізованих на поверх-ні
амінослюди. Для досягнення зазначеної мети, зважаючи на існуючий стан
проблеми, у роботі були поставлені та вирішені наступні задачі:

1. Розробити технологію наноманіпулювання (витягнення, стиснення)
лінійними та суперспіраль-ними молекулами ДНК при іммобілізації на
амінослюді.

2. Вивчити зміни конформації лінійних та суперспіральних ДНК в
залежності від поверхневих властивостей слюди, на якій іммобілізовані
молекули ДНК.

3. Створити технологію аміномодифікації зондів для атомно-силової
мікроскопії у газовій фазі з можливістю їх наступної функціоналізації
біополімерами.

4. Розробити схеми функціоналізації АСМ-зондів біополімерами на основі
амінозондів з приєдна-ними молекулами амінореакційних лінкерів, бичачого
сироваткового альбуміну та ДНК.

5. Охарактеризувати поверхневі властивості аміномодифікованих та
функціоналізованих біополі-мерами зондів за різних іонних умов за
допомогою атомно-силової мікроскопії у режимі силових вимірювань.

6. Вивчити комплекси, що утворює РНК-полімераза бактеріофага Т7 з
ДНК-матрицею в процесі транскрипції.

7. Розробити методичні підходи для АСМ-візуалізації інтактних клітин
безпосередньо у буферно-му розчині.

Методи дослідження. Для візуалізації біополімерів у повітрі
та інтактних клітин безпосе-редньо у водному середовищі використовували
атомно-силову мікроскопію. Вимірювання сили адгезії для різних пар
поверхонь зонд-субстрат проводили за допомогою атомно-силової
мікроско-пії в режимі силових вимірювань. Комп’ютерний аналіз
застосовували для пошуку неканонічних структур у геномі мікроорганізмів,
а стандартну полімеразну ланцюгову реакцію – для отримання ампліконів,
які використовували як ДНК-матрицю при проведенні транскрипції.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що
молекули ДНК, на відміну від відомої їхньої властивості – витягування
під впливом прикладеної сили, – можуть бути також стиснуті. Такі
стиснуті суперспіральні молекули ДНК, які характеризуються відстанню між
нукле-отидами вздовж осі спіралі 1,94 Е ( Н ( 2,19 Е, були віднесені до
нової форми – S-ДНК, модель якої побудовано.

Візуалізація стиснутих молекул суперспіральної ДНК стала можливою
завдяки створенню ме-тодики отримання модифікованої амінослюди з
підвищеною гідрофобністю та поверхневою щіль-ністю заряду на відміну від
раніше застосованої стандартної амінослюди. Крім того, вперше пока-зано,
що при іммобілізації на модифікованій амінослюді довжина осі
суперспіралі молекул ДНК зменшується при підвищенні рівня
суперспіралізації молекул на відміну від раніше встановленого факту
незмінності довжини осі суперспіралі за зазначених умов. Вперше
продемонстровано, що суперспіральні молекули ДНК компактизуються
укладанням вдвічі та вчетверо з утворенням осей суперспіралі другого та
третього порядку відповідно.

Вперше візуалізовано висококомпактизовані структури, утворені
поодинокими суперспіральни-ми ДНК, – напівсфероїди, сфероїди та тороїди,
на відміну від раніше досліджених мультимолеку-лярних агрегатів ДНК. На
основі аналізу отриманих АСМ-зображень розроблено модель конфор-маційних
переходів молекул суперспіральної ДНК при підвищенні щільності
супервитків та рівня компактизації.

Вперше одержані та охарактеризовані аміномодифіковані зонди для
атомно-силової мікроскопії за допомогою їхньої модифікації в парах
похідного аміносилану. На відміну від відомих модифі-кованих зондів, що
отримують модифікацією у розчині і які характеризуються наявністю на
по-верхні самоасоційованих моношарів молекул, одержані в даній роботі
амінозонди мають істотно меншу поверхневу щільність реакційних аміногруп
завдяки розробленій технології модифікації зондів у газовій фазі. Це
особливо важливе для наступної функціоналізації зондів біополімерами з
метою зменшення їхньої кількості на поверхні зонда при вивченні
взаємодії пар поодиноких моле-кул, іммобілізованих на поверхнях зонда та
субстрату.

Вперше детально охарактеризовані термодинамічно стабільні
інвертовані повтори для штамів патогенних мікобактерій туберкульозу
H37Rv та CDC1551 з повністю секвенованим геномом, які характеризуються
різною вірулентністю.

Вперше показано, що об’єм молекули ДНК, іммобілізованої на
АСМ-субстраті, який визначено безпосередньо з АСМ-зображення та
відповідного перерізу молекули, збігається з теоретичним об’ємом ДНК.

Принципову новизну несе пояснення ефекту розширення адсорбованої на
слюді ДНК за раху-нок зміни висоти та ширини молекули (при збереженні
об’єму молекули) на відміну від існуючого пояснення через недосконалості
процедури підготовки зразка ДНК (висушування, рухливість на субстраті)
та недостатню точність вимірювання атомно-силового мікроскопа.

Розроблено принципово новий метод витягування молекул
суперспіральної та лінійної ДНК при іммобілізації на поверхню амінослюди
із зменшеною поверхневою щільністю заряду.

Аміномодифіковані зонди охарактеризовані не тільки величиною сили
адгезії, а й роботою сили адгезії. Тим самим показано можливість
одержання нової інформації стосовно їхніх поверхневих властивостей з
силових графіків.

Практичне значення одержаних результатів. Одним із важливих
напрямків сучасної на-нобіології і нанобіотехнології є створення
біосенсорів, які дозволяють локалізувати протеїни на поверхні та
всередині клітинного ядра, на основі АСМ-зондів, функціоналізованих
біополімерами, специфічними до зазначених протеїнів. Розроблені автором
технології, схеми, методичні підходи та емпірично визначені протоколи
направлені на вирішення даної проблеми.

Вперше розроблена автором технологія аміномодифікації зондів в
парах похідного аміносилану може бути використана як для виробництва
аміномодифікованих зондів для атомно-силової мікро-скопії, так і для їх
наступної функціоналізації біомолекулами. Розроблена у роботі технологія
от-римання амінослюди з заданими властивостями також може бути з успіхом
використана при амі-номодифікації зондів. Зазначимо, що отримання
аміноповерхні зонда із зменшеною гідрофобністю та поверхневою щільністю
заряду (по аналогії з поверхнею амінослюди із зменшеною поверхне-вою
щільністю заряду) дозволить зменшити щільність експонованих на поверхні
зонда реакційних аміногруп, а отже, і щільність кон’югованих з ними
біополімерів, що необхідно для одного з на-прямків нанобіології –
силової мікроскопії впізнавання поодиноких молекул.

Запропонований підхід витягування молекул ДНК може бути
застосований в експерименталь-них роботах з фундаментальних досліджень
взаємодії ДНК з білками за наявності прикладеної до ДНК сили натягу.
Структурні параметри S-ДНК можуть бути використані при моделюванні
кон-формації молекул ДНК на поверхні з різними властивостями при
взаємодії з білками, пептидно-нуклеїновими кислотами, природними
поліамінами в умовах підвищеної щільності заряду.

Запропоновані методики обчислення об’єму молекул ДНК,
іммобілізованих на амінослюді, без-посередньо з АСМ-зображень з
застосуванням відповідних подовжніх перерізів, а також методика оцінки
поверхневих властивостей амінослюди через візуалізацію адсорбованих
суперспіральних молекул ДНК можуть знайти застосування у фундаментальних
дослідженнях з нанобіології біопо-лімерів.

Отримані принципово нові результати з компактизації поодиноких
суперспіральних молекул ДНК – візуалізації тороїдів, напівсфероїдів,
сфероїдів, а також джгутоподібних молекул, які укла-даються вдвічі у
декілька етапів, – можуть бути використані у вищих навчальних закладах у
кур-сах біофізики, мікробіології, молекулярної біології та, можливо, з
часом і нанобіології та нанобіо-технології.

Одержані дисертантом результати з компактизації ДНК використовують
у Харківському націо-нальному університеті ім. Каразіна у курсах лекцій
з фізики біополімерів, молекулярної біології та генетики.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок здобувача
полягає у формулюванні ідеї, обґрунтуванні мети та задач дисертаційної
роботи, а також методів їх вирішення шляхом ініцію-вання серії
досліджень структурних особливостей геномної ДНК мікроорганізмів та
механізму компактизації ДНК з метою отримання як фундаментальної
інформації щодо структури лінійних та суперспіральних молекул ДНК, так і
створення технології модифікації та наступної функціона-лізації
АСМ-зондів біополімерами та технології отримання амінослюди з заданими
властивостями.

Наведені у дисертації теоретичні та експериментальні результати
отримані автором самостійно [1-3, 6, 7, 9-22, 27-31] та під його
науковим керівництвом [4, 8, 23-26, 32-39].

В роботах [1-4, 6-39] авторові належать ідея дослідження, вибір
методів та розробка методич-них підходів; постановка задачі роботи [5]
була здійснена разом з проф. Любченком Ю.Л.

Основні експериментальні результати у роботі [5], наведені у
дисертації, отримані автором са-мостійно, у роботах [2, 4, 10, 12, 15,
23-25], опублікованих із співавторами, – разом із к.б.н., с.н.с.
Лиманською О.Ю. Авторові належать ідеї отримання амінослюди з заданими
властивостями, роз-робка технології та схеми модифікації та
функціоналізації біополімерами АСМ-зондів, створення моделі
компактизації суперспіральної ДНК при підвищенні рівня
суперспіралізації. Відкриття та побудова моделі стиснутої форми ДНК
(S-ДНК) було проведено разом із Лиманською О.Ю. та Ли-манською Л.О. В
усіх роботах автор брав участь в обговоренні отриманих результатів,
підготовці та написанні статей.

Планування дисертаційної роботи, коректування та обговорення методик
дослідження, інтер-претація отриманих результатів з визначення
термодинамічно стабільних інвертованих повторів у геномі мікобактерій
проведені разом з науковим консультантом д.м.н., проф. Волянським Ю.Л.

Автор висловлює щиру подяку д.м.н., проф. Волянському Ю.Л. за
постійну підтримку, числен-

ні плідні обговорення та корисні зауваження, д.ф.-м.н., с.н.с. Косевич
М.В. за щиру допомогу та ретельне рецензування роботи, а також к.б.н.,
с.н.с. Лиманській О.Ю. за конструктивні коментарі та внесок в оформлення
результатів роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні результати
дисертації були представлені авто-ром у вигляді стендових доповідей та
обговорені на нижченаведених конференціях: 2-ій конфе-ренції з оптичної
спектроскопії біомолекулярної динаміки (м. Ейлат, Ізраїль, 2006); 5-ому
Євро-пейському біофізичному конгресі 15th IUPAB & 5th EBSA (м.
Монпель’є, Франція, 2005); Міжна-родній конференції “Microtechnologies
for the New Millennium Symposium, Bioengineered and Bioin-spired
Systems” (м. Маспаломас, Іспанія, 2003); 1-ому конгресі Європейського
товариства мікробі-ологів (м. Любляна, Словенія, 2002); 8-ому
Міжнародному симпозіумі “Molecular Aspects of Che-motherapy” (м.
Гданськ, Польща, 2001); Міжнародному симпозіумі “Scanning Probe
Microscopy, Sensors and Nanostructures” (м. Токіо, Японія, 2001);
конференції для молодих науковців, аспіран-тів та студентів з
молекулярної біології і генетики (м. Київ, 2001); 185-ому з’їзді
Електрохімічного товариства (м. Сан-Франциско, США, 1994); 2-ій
Міжнародній конференції “Nanometer Scale Sci-ence and Technology” (м.
Москва, Росія, 1993); семінарах Інституту біохімії і біофізики Польської
академії наук (м. Варшава, Польща, 2002), лабораторії клітинного ядра та
сигнальних механізмів університету Кіото (м. Кіото, Японія, 2004),
лабораторії молекулярної мікробіології університету Арізони (м. Темпі,
США, 1998-1999), відділу нанокристалічних матеріалів Інституту
сцинтиляцій-них матеріалів НТК «Інститут монокристалів» НАН України (м.
Харків, 2006), Інституту молеку-лярної біології та генетики НАН України
(м. Київ, 2006, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 39
наукових праць, у тому числi 22 статті у фахових наукових журналах, з
яких 13 є одноосібними, включаючи 1 огляд, 14 тез допові-дей на наукових
конференціях, отримано три патенти України.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу,
дев’яти розділів, висновків, списку використаних джерел, додатків. Її
повний обсяг становить 351 сторінку машинописного тексту, з яких текст
займає 309 сторiнок. Дисертацію проілюстровано 100 рисунками та 15
табли-цями. Перелік використаної літератури обсягом 33 сторінки охоплює
349 джерел. Загальний обсяг п’яти додатків становить 9 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи досліджень. В роботі використано лінійну
ДНК фага ( довжиною 48502 пари нуклеотидів (п.н.) фірми Promega (США),
суперспіральну ДНК pUC8 (довжина 2665 п.н.), лiнiйну та суперспіральну
ДНК pGEMEX (довжина 3993 п.н.; Promega, США), бичачий сиро-ватковий
альбумін (БСА, 5 фракція; Pierce, США).

Атомно-силова мікроскопія. Для візуалізації лінійних та
суперспіральних молекул ДНК, білків у повітрі та клітин у буферному
розчині використовували атомно-силовi мікроскопи Nano-scope III з
D-сканером та Nanoscope IV MultiMode System (Veeco Instruments Inc.,
CШA) з E-скане-ром, який забезпечує максимальний дiапазон сканування до
12 мкм. Переважна більшість АСМ-зображень ДНК була записана за допомогою
вібруючого варіанта АСМ у повітрі у режимі “висо-та” з використанням
кантилеверів OMCL-AC160TS (Olympus Optical Co., Японія) з резонансною
частотою 340-360 кГц та константою твердості 42 Н/м, а також стандартних
незагострених зондів фірми KTEK International (Росiя) з резонансною
частотою 300-360 кГц.

Силові вимірювання. Для характеристики аміномодифікованих
субстратів, аміномодифіко-ваних та функціоналізованих біополімерами
зондів (шляхом вимірювання сили адгезії) застосову-вали атомно-силову
мікроскопію в режимі силових вимірювань. Вимірювання було проведено з
V-подібними кантилеверами із нітриду кремнію з золотим напилюванням,
використовуючи зонд Е (Microlevers, Park Sсientific Instruments, Inc.,
США), та OMCL-TR400PSA (Olympus Optical Co., Японія). Графіки відхилення
зонда – Z позиція, тобто залежності відхилення зонда від відстані між
поверхнями зонда та слюди (в подальшому силові графіки), записані за
вертикальної частоти ска-нування 1 Гц та Z-амплітуди 50-200 нм. Графіки
сила – відстань, з яких визначали силу адгезії та роботу сили адгезії,
отримані перетворенням графіків відхилення зонда – Z позиція за
допомогою програмного забезпечення Nanoscope III (версія 4.23b15) та
Nanoscope IV (версія 5.12r3, Veeco In-struments Inc., США). Величину
сили адгезії, що відповідає максимальному відхиленню зонда на кривій
віддалення, визначали як силу розриву, тобто силу, яку необхідно
прикласти для виведення із контакту поверхонь зонда і субстрату.

Константу твердості визначали індивідуально для кожного кантилевера
за допомогою методу резонансної частоти Клевленда (Cleveland, 1993).
Значення сили адгезії та її роботи усереднювали для 50-196 графіків
віддалення для різних варіантів модифікації АСМ-зондів. Всього для
характе-ризування АСМ-зондів і субстратів було записано та оброблено
понад 4000 силових графіків. Ста-тистичну обробку проводили за допомогою
програмних пакетів Kaleidagraph (версія 3.01, США) та Origin (версія 5,
США).

Модифікація і функціоналізація АСМ-зондів та субстратів.
Процедуру отримання стан-дартної амінослюди та амінозондів
(модифікованих зондів, поверхня яких рівномірно покрита амі-ногрупами)
здійснювали за допомогою модифікації свіжосколотої слюди аміногрупами у
парах перегнаного 3-амінопропілтриетоксісилану (АПТЕС), який отримано
від Aldrich (США), United Chemical Technologies, Inc. (США) та Wakenyaku
(Японiя). В ході виконання дисертаційної роботи розроблено та створено
дві установки для вакуумної перегонки АПТЕС. Перший варіант установ-ки
було застосовано в університеті Арізони (США), а другий варіант, який
дозволив отримати амі-нослюду з можливістю регулювання поверхневої
щільності заряду та гідрофобності, – в універси-теті Кіото (Японія).

Для функціоналізації амінозондів використовували два
гомобіфункціональних лінкерних аген-ти, що містять на обох кінцях
амінореакційну ефірну групу (NHS-ефір): дисукцинімідил суберат (Pierce,
США) (ДСС-лінкер) та етиленгліколь-біс (N-гідроксисукцинімідний ефір
янтарної кисло-ти) (ЕГС-лінкер). Процедуру наступної функціоналізації
АСМ-зондів, для якої використовували бичачий сироватковий альбумін
(БСА), ДНК та глютаральдегід, проводили у комерційній рідинній чашечці
АСМ.

Субстрати для АСМ, які використовували для іммобілізації
біополімерів, можна розташувати у порядку зростання гідрофобності та
поверхневої щільності позитивного заряду: свіжосколота слю-да < амінослюда зі зменшеною гідрофобністю < стандартна амінослюда < модифікована аміно-слюда. Підготовка зразків ДНК для АСМ та ПЛР. На смугу амінослюди площею 1 см2 наносили краплю розчину ДНК у ТЕ буфері (10 мM трис-HCl рН 7,9, 1 мM ЕДТА) об’ємом 10 мкл, промива-ли після 2-хвилинної експозиції деіонізованою водою, обдували потоком аргону та витримували зразок під тиском 100 мм рт. ст. протягом 20 хвилин. Лінійну ДНК pGEMEX отримували ферментативною обробкою суперспіральної ДНК pGEMEX (рис. 1) рестриктазою ScaI (New England Biolabs, Англія). Сконструйовані праймери обмежували фрагмент ДНК, що містить промотор та область термінації транскрипції Т7 РНК-полімерази. Для ампліфікації фрагмента лінійної ДНК використовували полімеразну ланцюгову реакцію. Для очищення ампліфікованого фрагмента ДНК використовували наступну процедуру. Після проведення електрофорезу вирізали смугу гелю, що містить амплікон, при цьому опромінюючи гель довгохвильовим випромінюванням УФ-джерела низької інтенсивності (BioRad, США). Для подальшої очистки амплікона від нуклеотидів, праймерів, ДНК-полімерази та бромистого етидію використовували набір QIA-quick PCR purification kit (QIAgen, Японія) відповідно до рекоменда- цій виробника, а також екстракцію фенол/хлороформом з наступним переосадженням етанолом (рис. 2). Для проведення ПЛР, крім стандартної Taq ДНК-полімерази (Promega, США), використовували термостабільнi ДНК-полімерази високої точності двох видів – Pyrobest ДНК-полімеразу (TaKaRa Co., Японія) та Invitrogen Platinum ДНК-полімеразу (Invitrogen, Японія). Для молекулярного моде-лювання структури ДНК використовували вільно поширюваний програмний пакет VMD (версія 1.8.3). Візуалізація ціанобактерій. В роботі використано клітини ціанобактерій штаму Synechocys-tis PCC 6803. Вимірювання проводили у 50 мM TES буфері (N-трис [гідроксиметил]-метил-2-амі-ноетансірчана кислота) за кімнатної температури. Для отримання зображень ціанобактерій у бу-ферному розчині використовували стандартну скляну рідинну чашечку. АСМ-зображення у вод-ному розчині було записано у вібруючому варіанті АСМ, за частоти сканування 3-4 Гц та ампліту-ди 20-40 мВ за допомогою стандартних V-подібних кантилеверів з константою твердості K = 0,20-0,27 Н/м (Digital Instruments, США). Проведення транскрипції. Як матрицю для транскрипції використовували амплікон довжи-ною 1414 п.н., що містив промотор та область термінації транскрипції РНК-полімерази бактеріо- Рис. 2. Очищені амплікони після прове- дення електрофорезу, вирізання смуги Рис. 1. Аналіз суперспіральної ДНК pGEMEX1 з ПЛР-продуктом і обробки за допомо- після проведення електрофорезу у 2 % агарозі гою набору для екстракції QIAquick та наступного забарвлення бромистим етидієм. extraction kit. Ампліфікація з ДНК-по- 1 – суперспіральна ДНК pGEMEX1 (3993 п.н.); лімеразою: 1 – Pyrobest TaKaRa; 2 – 2 – неочищений амплікон довжиною 1414 п.н.; Invitrogen Platinum. М – 1000 п.н. мар- 3 – 1000 п.н. маркер молекулярної маси кер фага Т7. Реакцію транскрипції проводили з використанням наборiв для транскрипції за допомогою Т7 РНК-полімерази (Promega, США), MegaScript T7 (Ambion, США) та набору від New England Biolabs (Англія) за різних температурних та часових параметрів. Для видалення матриці ДНК та деградації ДНК, що може контамінувати препарат РНК, після проведення транскрипції до реакцій-ної суміші додавали ДНКазу І (Ambion, США) та інкубували протягом 15 хв. за температури 37 оС. Для інактивації ДНКази реакційну суміш інкубували за температури 70 оС протягом 10 хв. Для контролю ефективності транскрипції після зупинки транскрипції проводили електрофорез у 1,2 % агарозному гелі, що містив 1,8 % формальдегіду. Результати досліджень та обговорення. Візуалізація тягнених молекул ДНК. Поверхня слюди, стандартного субстрату для іммобі-лізації біомолекул при АСМ-дослідженнях, негативно заряджена у буферних розчинах за ней-тральних значень рН та невисокої іонної сили (Butt, 1991). Тому для іммобілізації за даних умов на поверхні слюди негативно заряджених молекул ДНК використовують декілька підходів, що до-зволяють змінити сумарний поверхневий заряд слюди з негативного на позитивний. Методика приготування зразка ДНК на амінослюді забезпечує сильне зв’язування молекул ДНК з субстра-том за рахунок суперпозиції електростатичних і вандерваальсових сил. При цьому іммобілізацiя молекул ДНК на поверхнi амінослюди у водному розчині здійснюється переважно через електро-статичну взаємодію між негативно зарядженими фосфатними групами ДНК та позитивно зарядже-ними аміногрупами слюди (рис. 3). Добре відомо, що ДНК є еластичною молекулою, яка може бути витягнутою, подібно до пру-жини. І такі тягнені молекули ДНК зі збільшеною відстанню між нуклеотидами уздовж осі дуплек-са були отримані та вивчені декiлькома групами дослiдникiв. За допомогою сучасних методів на-номаніпулювання поодинокими молекулами було встановлено, що молекулу ДНК можна розтяг-нути у 1,7 разу до міжнуклеотидної відстані Н = 5,8 Е на відміну від Н = 3,4 Е для В-ДНК (Cluzel et al., 1996; Bustamante et al., 1996). Беручи до уваги вiдомі експериментальні дані про еластичність молекул ДНК (Leuba et al., 2004) та важливість дослідження фундаментальних мікромеханічних властивостей молекули ДНК, нами розроблено новий метод отримання витягнутих молекул ДНК з їх наступною візуалізацією за допомогою АСМ. Розроблений метод є надзвичайно простим та ефективним: він дозволяє отри-мувати тягненi молекули ДНК (рис. 4) при експозиції краплі розчину ДНК на поверхні амінослю-ди зі зменшеною гідрофобністю та поверхневою щільністю заряду. Тягнені молекули ДНК форму-ються у процесі пiдготовки зразка для АСМ-візуалізації, а саме, при промиванні слюди ультрачис-тою водою після експозиції з розчином ДНК. Важливо, що точно таку ж процедуру підготовки зразка з інтенсивним промиванням направленим потоком води поверхні слюди ми використовува-ли і для стандартної, і для модифікованої амінослюди із збільшеною гідрофобністю та поверхне-вою щільністю заряду. Проте тягнені молекули ДНК формувалися тільки на поверхні амінослюди зі зниженою гідрофобністю. Аналіз сукупності даних з візуалізації лінійних та суперспіральних Рис. 3. АСМ-зображення молекули ДНК фага (, іммобілізованої на стандартній амінослюді. Розмір кадру 1,8 мкм Ч 1,8 мкм. Наведено шкалу градацій кольору, яка відповідає діапазону координати Z від 0 до 4,6 нм ДНК на різних субстратах вказує, що формування витягнутих молекул ДНК обумовлено поверхне-вими властивостями субстрату, на якому вони іммобілізовані під впливом механічної енергії спря-мованого потоку води. Через використання амінослюди зі зменшеною щільністю поверхневих аміногруп різко змен-шується число утворених зв’язків між електронегативними сайтами ДНК та позитивно заряджени-ми аміногрупами слюди. Тому під впливом струму води молекули ДНК витягуються паралельно напрямку, в якому проводиться промивання поверхні слюди. Вимірювання контурної довжини по-одинокої нативної молекули ДНК з субнанометровою роздільною здатністю, що є відмітною особ-ливістю АСМ, дозволяє визначити, знаючи кількість пар нуклеотидів в даній молекулі, відстань між нуклеотидами вздовж осі подвійної спіралі ДНК. Відстанню між основами, або райзом (rise), називається відстань між площинами основ, а відстанню між нуклеотидами вздовж осі спіралі (Н) – проекція відстані між основами на вісь подвійної спіралі ДНК. Збільшення контурної довжини суперспіральних молекул ДНК (ссДНК) pGEMEX від 1243 нм (характерного значення для неви-тягнутої молекули) до 1943 нм (рис. 5а) та 2140 нм (рис. 5б) означає, що витягування ссДНК у 1,56 та у 1,72 разу призводить до зростання міжнуклеотидної відстані до H = 4,87 Е та H = 5,36 Е від-повідно. Отримані дані для тягнених молекул ДНК pGEMEX добре узгоджуються з раніше опублі-кованими результатами дослідження тягнених ДНК різними методами, в тому числі і за допомо-гою методу оптичного пінцета (Leuba et al., 2003). Дуже важливим є той факт, що тягнуті молеку-ли ДНК одержано на поверхні амінослюди із зменшеною поверхневою щільністю аміногруп. Від- Рис. 4. АСМ-зображення витягнутих молекул ДНК фага (, якi iммобiлiзованi на амінослюді зі зменшеною поверхневою щільністю аміногруп. Розмір кадру 7,5 мкм Ч 7,5 мкм разу виникає низка питань. Чи можливо отримати амінослюду з заданими властивостями, а саме з підвищеною поверхневою щільністю аміногруп? Що буде відбуватися з молекулою ДНК при ім-мобілізації на поверхні амінослюди з підвищеною щільністю аміногруп? Якщо на амінослюді із зменшеною поверхневою щільністю аміногруп молекули ДНК витягуються, чи можуть вони бути стиснутими подібно до пружини при іммобілізації на поверхні слюди з підвищеною щільністю аміногруп? Пошуку відповідей на ці запитання були присвячені дослідження, результати яких на-ведено у наступних розділах роботи. S-ДНК – суперспіральна ДНК з відстанню 1,94 – 2,19 Е між парами основ вздовж осі дуплекса. За допомогою АСМ-візуалізації молекул ДНК та вимірювання їхньої контурної довжи-ни була визначена відстань між нуклеотидами вздовж осі спіралі ДНК. Показано, що для лінійної Рис. 5. АСМ-зображення витягнутих суперспіральних молекул ДНК pGEMEX, іммобілізова-них на амінослюді зі зменшеною щільністю аміногруп. (а) – контурна довжина ДНК L = 1943 нм, що відповідає відстані між нуклеотидами вздовж осі подвійної спіралі Н = 4,87 Е. Розмір кадру 1,13 мкм Ч 1,13 мкм. (б) – контурна довжина ДНК L = 2140 нм, Н = 5,36 Е. Розмiр кадру 1,07 мкм Ч 1,07 мкм ДНК (а саме для амплікона, отриманого після проведення ПЛР з використанням високоточних ви-дів термостабільної ДНК-полімерази), іммобілізованої на свіжосколотій слюді, контурна довжина зменшується у порівнянні із очікуваним теоретичним значенням, характерним для В-ДНК. На ос-нові визначеної відстані (Н = 3,07 Е) зроблено припущення, що лінійні молекули ДНК, адсорбова-ні на гідрофільній слюді, знаходяться у А-формі, перехід до якої індукують як висушування зразка, так і взаємодія з поверхнею слюди. Для суперспіральної ДНК pGEMEX, іммобілізованої на свіжосколотій слюді (рис. 6а), були ві-зуалізовані плектонемічні суперспіральні молекули ДНК, що характеризуються невисоким значен-ням щільності супервитків (7 суперспіральних витків, або вузлів, у = - 0,024). Раніше аналогічні зображення були отримані для плазмідних ДНК, адсорбованих на субстратах, оброблених полiка-тiонами полілізином, сперміном (Jovin et al., 2003; Tanigawa et al., 1998). Суперспіральні молекули ДНК pGEMEX на стандартній амінослюді (рис. 6б) компактизованіші, однак їхня контурна довжи-на, обмірювана із АСМ-зображення, лише незначно менша (L = 1216 нм) у порівняннi з контур-ною довжиною плектонемічних молекул ДНК на слюді з катіонами Mg2+ (L = 1243 нм, рис. 6а). Для молекул ДНК, зображених на рис. 6а, довжина суперспіральної осі (осі подвійної спіралі су-перспіральної молекули ДНК, яка може бути закрученою у вигляді спіралі на відміну від осі ліній-ної молекули ДНК) становить l = 466 нм. В той же час на модифікованій амінослюді (рис. 6в) з підвищеною гідрофобністю та поверхне-вою щільністю позитивного заряду порівняно із стандартною амінослюдою поряд з плектонеміч-ними суперспіральними молекулами ДНК були візуалізовані поодинокі молекули з надзвичайно високим рівнем компактизації, ступінь суперспіралізації яких значно вищий у порівнянні з раніше досягнутим рівнем як експериментально, так і розглянутим теоретично. Рис. 6. АСМ-зображення поодиноких суперспіральних молекул ДНК pGEMEX, іммобілізова-них на різних субстратах: свіжосколотій слюді (а), отримане після нанесення краплі розчину ДНК у 10 мM HEPES буфері, що містить 2,5 мM MgCl2, стандартній амінослюді (б) та моди-фікованій амінослюді (в). Контурна довжина ДНК pGEMEX становить: (а) – 1243 нм; (б) – 1216 нм; (в) – 873 нм. Довжина суперспіральної осі молекул ДНК: (а) – 466 нм; (в) – 382 нм. Розмір кадру: а – 583 нм Ч 583 нм; б – 500 нм Ч 500 нм; в – 500 нм Ч 500 нм Молекула суперспіральної ДНК на рис. 6в, іммобілізована на модифікованій амінослюді, різко відрізняється за своїми параметрами від молекул ДНК на рис. 6а та рис. 6б: кількість вузлів зросла до 11, довжина суперспіральної осі зменшилася до 382 нм, а розрахована із АСМ-зображення кон-турна довжина склала 873 нм (!). Оскiльки довжина секвенованої послiдовності ДНК pGEMEX становить 3993 п.н., була визна-чена відстань між нуклеотидами вздовж осі подвійної спіралі ДНК. І якщо для ДНК pGEMEX, зо-браженої на рис. 6а, міжнуклеотидна відстань H = 3,11 Е, то для надсуперспіралізованої ДНК на рис. 6в розраховане значення склало Н = 2,19 Е (!). Значення Н = 3,11 Е узгоджується з раніше на-веденими фактами незначного зменшення контурної довжини ДНК, висушеної на слюді, у припу-щенні В-форми ДНК (Bustamante et al., 2003). Однак величина Н = 2,19 Е вказує на те, що супер-спіральні молекули ДНК, іммобілізовані на амінослюді з підвищеною щільністю заряду, зазнають значних внутрішньомолекулярних перетворень, якi ведуть не тільки до збільшення рівня суперспі- ралізації, але і до значного зменшення міжнуклеотидної відстані. Відстань між нуклеотидами для інших надсуперспіральних молекул ДНК варіювала від 1,94 Е до 2,19 Е (рис. 7 та рис. 8). Як один із параметрів, який дозволяє відрізнити поодиноку молекулу від димера та інших висо-кокомпактизованих структур, утворених декількома молекулами, ми вибрали об’єм молекули ДНК, розрахований безпосередньо із АСМ-зображення відповідної молекули. Його значення не-значно відрізняється від теоретично розрахованого виключеного об’єму молекули ДНК pGEMEX (Vвикл. = 4010 нм3) та дозволяє надійно диференцiювати поодинокі молекули ДНК від агрегатів. Для точнішого обчислення об’єму ми використовували не обмірюване в одному місці значення ви-соти молекули (яке значно варіює для надсуперспіралізованих ДНК: за характерної висоти однієї нитки подвійної спіралі h = 0,3-0,4 нм висота у вузлах, утворених двома нитками ДНК, що перети-наються, може досягати hmax = 1,3-1,8 нм), а, як правило, подовжній переріз молекули січною пло- Рис. 7. (а) АСМ-зображення поодинокої надсуперспіральної ДНК pGEMEX в S-формі, отри-мане після іммобілізації на поверхню модифікованої амінослюди. Розмір кадру 250 нм Ч 250 нм. Відстань між нуклеотидами вздовж осі дуплекса для даної молекули Н = 2,19 Е. Стрілка-ми показано дві нитки, кожна із яких утворена подвійною спіраллю ДНК, закручені в праву надсуперспіральну ДНК з чітко помітними 11 надвитками (вузлами). (б), (в) Подовжні пере-різи суперспіральної молекули ДНК pGEMEX. Січну площину проведено перпендикулярно площині рисунка через лінію, показану на вставках. Об’єм молекули розраховано як добуток ширини молекули на суму площ подовжніх перерізів. Шість (рис. 7б) та п’ять піків (рис. 7в) на профілях перерізів відповідають шести та п’яти вузлам. (г) Тривимірне зображення моле-кули. Стрілками вказано нитки дуплекса, що частково розійшлися та утворюють надсупер-спіральну молекулу. (д) Поперечний переріз, виконаний через нитки дуплекса, що розійшли-ся. На вставці показано лінію, через яку проведено січну площину. Два піки відповідають профілям перерізів двох ниток, із яких було визначено їхню висоту. Максимальна висота пі-ка відповідає висоті фрагмента молекули. Стрілками на перерізі та на вставці вказано пік та відповідна йому подвійна спіраль ДНК, висота якої становить h = 0,38 ( 0,05 нм щиною, перпендикулярною площині слюди. Із наведених в табл. 1 параметрів молекул суперспі-ральних ДНК можна бачити, що значення об’єму для надсуперспіральних молекул ДНК (поз. 3-5 в табл. 1, рис. 6в, рис. 7 та рис. 8) збігається зі значенням об’єму для поодинокої суперспіральної молекули (поз. 1 табл. 1, рис. 6а) в межах погрішності вимірювання (± 7,1 %). Рис. 8. (а) АСМ-зображення поодинокої лівої надсуперспіральної ДНК pGEMEX в S-формі. Розмір кадру 250 нм Ч 250 нм. (б) Тривимірне зображення молекули. (в) Профіль поперечно-го перерізу, виконаного січною площиною вздовж лінії, яку показано на вставці. Стрілки вказують на пік та відповідний йому фрагмент нитки подвійної спіралі ДНК, висота якої становить h = 0,38 нм. (г) Профіль поперечного перерізу, виконаного вздовж лінії, показаної на вставці. Стрілка вказує на пік, із якого було визначено висоту відповідної частини подвій-ної спіралі ДНК h = 0,40 нм Іншим важливим результатом, що свідчить про надсуперспіралізацію поодиноких молекул, а не джгутів, є висота закручених ниток, утворених дволанцюговою ДНК. На АСМ-зображенні (рис. 7а) та на тривимірному зображенні даної молекули (рис. 7г) стрілками вказано чітко помітні нитки даної молекули. Виміряна висота цих ниток, які частково розійшлися (рис. 7д), показує, що зазна-чені нитки утворено дволанцюговою ДНК, оскільки висота кожної нитки (h = 0,38 нм) дорівнює висоті нитки поодинокої іммобілізованої на немодифікованій слюді молекули ДНК (поз. 1, табл. 1), що, в свою чергу, збігається з літературними даними з АСМ-вимірювання висоти ДНК, адсорбова-ної на субстраті (Tanigawa et al., 1998). Аналогічні вимірювання були проведені і для іншої надсу-перспіральної молекули ДНК (рис. 8). Як значення об’єму (поз. 4, табл. 1), так і вимірювання висо-ти ниток даної молекули (h = 0,38-0,40 нм) підтверджує, що і дана надсуперспіральна структура утворена однією (!) молекулою ДНК. Значення об’ємів для інших візуалізованих висококомпакти-зованих структур (напівсфероїда, сфероїда, димерів, тримера) підтверджують надійність даного методу визначення об’єму конденсованих структур та ефективність їхньої диференціації. Такі стиснуті, подібно до пружини, суперспіральні молекули ДНК зі зменшеною відстанню між нуклеотидами вздовж осі дуплекса Н ~ 2 Е порівняно з добре відомими формами ДНК було назва-но нами новою формою ДНК – S-ДНК (“S” – від англійського слова “spring” або пружина). Таблиця 1 Параметри суперспіральних молекул ДНК pGEMEX, визначені із АСМ-зображень Чи існують просторові обмеження для нуклеотидів в S-ДНК? Побудовані нами моделі фрагмен-та S-ДНК (рис. 9а) та В-ДНК (рис. 9б) довжиною 15 п.н. демонструють принципову можливість іс-нування стиснутих молекул S-ДНК, які можуть бути проміжним етапом при компактизації пооди-ноких суперспіральних молекул до рівня сфероїдів та мінітороїдів. Наведені результати свідчать, що стискування суперспіральних молекул ДНК обумовлено поверхневими властивостями субстра-ту – високою гідрофобністю та поверхневою щільністю заряду модифікованої амінослюди, – на якому іммобілізовані молекули ДНК. Важливо, що при цьому утворюються як ліві, так і праві над-суперспіральні молекули ДНК, які були візуалізовані. Отримані результати показують, що надсуперспіралізація, яка веде до стискування поодиноких молекул ДНК, може відбуватися in vitro за відсутності протеїнів, а необхідною умовою цього є ви-сокі поверхнева щільність позитивного заряду та гідрофобність субстрату, на якому іммобілізова-на суперспіральна ДНК. Стискування ДНК, знайдене нами, – вельми цікаве явище у структурній організації нуклеїнових кислот. Виходячи із отриманих даних, його механізм уявляється далеко не тривіальним. У створе-них експериментальних умовах, можливо, реалізується вплив дуже багатьох факторів. По-перше, Рис. 9. Модель фрагмента ДНК довжиною 15 пар нуклеотидів в S-формі (відстань між пара-ми основ вздовж осі спіралі Н = 2,0 Е) (а) та В-формі (Н = 3,4 Е) (б). Послідовність „+”-нитки: 5ґ - ааg gtc ttc ggt cgt - 3ґ. Спіральний повтор для обох форм ДНК становить 10,5 пар нуклео-тидів на виток це висока щільність позитивного поверхневого заряду амінослюди, на якій іммобілізовані молеку-ли ДНК. По-друге, різка зміна екранування фосфатних груп (як наслідок іммобілізації на субстраті з підвищеною щільністю позитивного заряду), що призводить до підвищеної нейтралізації їхнього негативного заряду. По-третє, можливе сильне перегрупування сітки водневих зв'язків зв'язаної води в області стекінга пар основ. По-четверте, можливим є конкурентне вбудовування NH2-груп поверхневого шару амінослюди у міжплощинний водневий зв'язок нуклеотидів. Компактизація суперспіральної ДНК на модифікованій амінослюді. Раніше було показа-но (Vinograd et al., 1971), що довжина осі суперспіральної ДНК залишається постійною при збіль-шенні щільності супервитків і становить ~ 35 % контурної довжини релаксованої молекули. Ця умова виконується для молекул ДНК pGEMEX, що iммобiлiзовані на свіжосколотiй слюдi, яка ха-рактеризується вiдносно невисокою поверхневою щiльнiстю заряду. Іммобілізація суперспiраль-них ДНК на модифікованій амінослюді, що має підвищену поверхневу щільність заряду у порів-нянні не тільки зі свіжосколотою, а й зі стандартною амінослюдою, веде до істотної компактизації молекул ДНК (рис. 10), які характеризуються подальшим зменшенням довжини суперспіральної осі. З 108 індивідуальних молекул ссДНК, якi було досліджено, найхарактерніші варіанти молекул Рис. 10. Зображення суперспіральної ДНК pGEMEX (довжина 3993 п.н.) у повітрі, отримане за допомогою атомно-силового мікроскопа після нанесення розчину ДНК у ТЕ буфері на по-верхню стандартної амінослюди (а) та модифікованої амінослюди (б), яка характеризується вищим рівнем гідрофобності та підвищеною поверхневою щільністю аміногруп (тобто підви-щеною щільністю позитивного заряду) порівняно зі стандартною амінослюдою. Представле-но суперспіральні молекули ДНК з різним рівнем компактизації: від плектонемічних (а) до надсуперспіральних молекул (б) з різною довжиною суперспіральної осі (дві молекули у то-роїдальній та наближеній до тороїдальної конформації показано білими вертикальними стрілками), а також у конформації сфероїда (два сфероїди показано похилими чорними стрілками). Розмір кадру зображень 2 мкм Ч 2 мкм з відповідними параметрами представлено в табл. 2 i табл. 1. З них кількість плектонемічних су-перспіральних ДНК (позиція А2 у табл. 2) з низькою щільністю супервитків у ~ -0,02 дорівнює 21 %; надсуперспіральні ДНК з високим значенням у ~ -0,13, що утворюють суперспіральну вісь першого порядку (В3), – 12 %; надссДНК, що утворюють вісь суперспіралі другого порядку (С3, В2, С2), – 27 %; молекули, що утворюють суперспіральну вісь третього порядку (D2, D3, E2), – 14 %; найбiльш висококомпактизовані молекули – сфероїди – 17 %. Довжина суперспіральної осі першого порядку молекул ссДНК становить ~ 466 – 570 нм. При підвищенні рівня компактизації ДНК утворюється вісь суперспіралі другого порядку (рис. 11) дов-жиною ~ 280 нм (що становить ~ 20 % від контурної довжини релаксованої молекули). В результа-ті подальшої компактизації утворюються молекули з ще вдвічі меншою довжиною суперспіраль-ної осі (довжина осі третього порядку дорівнює l = 140 нм, що становить ~ 10 % від контурної дов-жини релаксованої молекули, поз. D2 у табл. 2), мінітороїди діаметром ~ 50 нм (рис. 12), а також молекули у сферичній конформації – напівсфероїди та сфероїди (рис. 11). Оскільки раніше конденсацію ДНК під впливом різних факторів було виявлено тільки для ди-мерів, тримерів, але не для поодиноких молекул ДНК (Hansma, 1997; Dunlap, 1997), розглянемо детальніше С-подібну надсуперспіральну молекулу (рис. 11), конформація якої подібна до тороїда. АСМ-зображення цієї молекули з вищою роздільною здатністю (рис. 11а) та її тривимірне зобра-ження (рис. 11в) наочно демонструють, що дану надссДНК утворено декількома чітко помітними Таблиця 2 Параметри надсуперспіральних молекул ДНК pGEMEX, визначені із АСМ-зображень. У дужках вказано кількість візуалізованих молекул для кожного варіанта. Значення виключеного об’єму для ДНК pGEMEX дорівнює V = 4010 нм3 нитками (стрілками вказано частину молекули, утворену трьома нитками, які локально розійшли-ся). Показаний на рис. 11б профіль перерізу, проведеного через ці нитки (на вставці показано лі-нію, вздовж якої проведено січну площину перпендикулярно площині рисунка), дозволяє визначи-ти їх висоту. Необхідно відзначити, що вимірювання висоти біомолекули, іммобілізованої на суб-страті, з субнанометровою роздільною здатністю (!) є вкрай важливою особливістю атомно-сило-вої мікроскопії, що вигідно відрізняє її і в цьому відношенні від електронної мікроскопії. Оскільки висота двох ниток ДНК становить h = 0,3 нм (що відповідає характерному значенню висоти для дволанцюгової молекули ДНК, іммобілізованої на слюді (Tanigawa et al., 1998)), а висота третьої нитки дорівнює h = 0,6 нм, то це означає, що дві нитки надссДНК, що розійшлися, є дволанцюго-вими нитками ДНК, а нитку, висота якої дорівнює подвійній висоті молекули ДНК на слюді (h = 0,6 нм), утворено двома закрученими дволанцюговими нитками. Рис. 11. АСМ-зображення (а), профiлi перерізiв (б) i (г) та тривимірне зображення (в) пооди-нокої надсуперспіральної ДНК pGEMEX, що утворила вісь суперспіралі другого порядку. (а) Стрілками показано нитки ДНК, що розійшлися, профіль перерізу яких наведено на рис. 11б. Чорна стрілка вказує на сфероїд. (б) Лінію, уздовж якої проведено січну площину через три нитки, що розійшлися, показано на вставці. Висота двох піків становить h = 0,3 нм, а висота третього піка – h = 0,6 нм. (г) Профіль перерізу, проведеного через нитки надсуперспіральної ДНК, що розійшлися; січну площину проведено уздовж лінії, показаної на вставці. Висота цих ниток становить h = 0,3 нм, що відповідає висоті нитки дволанцюгової ДНК. Розмір кад-ру 250 нм Ч 250 нм Таким чином, аналіз цього профілю перерізу показав, що С-подібну надссДНК утворено чотир-ма дволанцюговими нитками ДНК. Оскільки контурна довжина наведеної надссДНК становить L = 260 нм, це означає, що дану компактизовану структуру утворено поодинокою кільцевою молеку-лою ДНК, “складеною навпіл”. Зазначимо, що за контурної довжини L = 260 нм число ниток ДНК у профілі перерізу для димера повинно було б становити вісім. o J H J L O P ??? <екількома молекула-ми. Іншою візуалізованою нами структурою, зовні схожою на сфероїд на АСМ-зображенні з неви-сокою роздільною здатністю, є мінітороїд. З профiлiв перерізів на рис. 12б та рис. 12в можна бачи-ти, що три із чотирьох сегментів тороїда мають однакову висоту (h = 1,74 нм), а четвертий сегмент має майже вдвічі меншу висоту (h = 0,84 нм). Це означає, що у четвертому сегменті число обертів джгута ссДНК менше, ніж у інших трьох сегментах, тобто мінітороїд являє собою своєрідне міні-кільце з розрізом у верхній частині, довжина якого дорівнює чверті довжини кола. Рис. 12. АСМ-зображення (а), профілi перерізiв (б) i (г) та тривимірне зображення (в) пооди-нокої надсуперспіралізованої ДНК pGEMEX, що утворила мінітороїд. (а) Розмір кадру 250 нм Ч 250 нм. (б) Висота двох фрагментів тороїда, через які проведено січну площину, дорів-нює h = 1,74 нм. (г) Висота iнших двох фрагментів тороїда, визначена з профiлю перерізу, до-рівнює h = 1,74 нм та h = 0,84 нм вiдповiдно. Трикутниками показано пік на профiлi перерізу та рівень, відносно якого було проведено вимірювання його висоти. Висота цього сегмента мінітороїда дорівнює h = 1,74 нм. (а, г) Зовнішній діаметр мінітороїда – 50-60 нм, внутрішній – 15-25 нм На основі аналізу отриманих АСМ-зображень нами запропоновано схему поетапної компакти-зації як для поодиноких молекул ДНК, так і для димерів (рис. 13). Позиції В1, С1, D1, Е1, якi виді-лені прямокутником, відповідають димерам ссДНК, що визначено на основі обчислення об’ємів вищезгаданих молекул, всі інші позиції – поодиноким молекулам. Найменш компактизовані моле-кули наведено на поз. А1-А3, найкомпактизованіші – на поз. Е1-Е3. На поз. А3 наведено зобра-ження ссДНК pGEMEX, іммобілізованої на свіжосколотій слюді з іонами Mg2+. Молекули ссДНК pGEMEX, іммобілізовані на стандартній амінослюді (поз. А1, А2) з високим значенням поверхне-вої щільності заряду у порівнянні із свіжосколотою слюдою, мають інший вигляд. Вони схожі на Рис. 13. Модель компактизації молекул суперспіральної ДНК, що запропонована на основi отриманих АСМ-зображень ДНК pGEMEX. A1, A2 – стандартна амінослюда, А3 – свіжоско-лота слюда, інші АСМ-зображення отримані на модифiкованiй амінослюді. Стрiлки вказу-ють напрямок етапiв подальшої компактизацiї ДНК; прямокутником видiлено чотири диме-ри. При підвищенні поверхневої щільності заряду, або кількості протонованих аміногруп (тобто при переході від свіжосколотої і стандартної амінослюди до модифікованої амінослю-ди), утворюються різні топологiчнi варіанти компактизованих молекул ДНК. B3 – надссДНК, що утворює вісь суперспіралі 1 порядку; B2, C2, C3 – надссДНК, що утворюють вісь супер-спіралі 2 порядку; D2 – надссДНК, що утворює вісь суперспіралі 3 порядку; E2, E3 – сферої-ди; D3 – мінітороїд, утворений поодинокою молекулою ДНК плектонемічні молекули ДНК, але є компактизованішими, тобто локалізованими на меншій площі субстрату. При переході до модифікованої амінослюди, яка характеризується значно більшою поверхне-вою щільністю заряду у порівнянні зі стандартною амінослюдою, спостерігається кілька варіантів компактизації ссДНК. На першому етапі зростає кількість вузлів і утворюються надсуперспіральні молекули ДНК (В3), тобто своєрідні джгути (рис. 14б). Кількість вузлів для даної молекули стано-вить n = 19 та, як наслідок, значення щільності супервитків ( = -0,13. Кількість вузлів в молекулі було розраховано візуально з АСМ-зображення (біла крапка, або пляма, на АСМ-зображенні від-повідає вузлу), а також за допомогою побудови профілів перерізу молекули. У другому варіанті молекулу ДНК було розбито на декілька фрагментів, для кожного з яких побудовано подовжній переріз молекули по висоті площиною, перпендикулярною площині рисунка. Характер поперечно-го профілю перерізу та значення висоти ниток молекули, які локально розійшлися, свідчать про те, що джгутоподібна структура утворена поодинокою молекулою ссДНК. Рис. 14. АСМ-зображення суперспіральної ДНК pGEMEX з різною довжиною осі суперспіра-лі. ДНК іммобілізована на свіжосколотій слюді з буфера, що містить іони Mg2+ (а), та на мо-дифікованій амінослюді (б-г). (а) Довжина осі суперспіралі становить l = 466 ± 5 нм (для обох молекул), ( = (0,024. (б) l = 567 нм, ( = (0,13; молекула містить 19 вузлів. Чорною та білою стрілками вказано фрагменти ДНК, які відповідають ниткам дволанцюгової ДНК, що розій-шлися, та їхньому перетинанню відповідно. (в) Надсуперспіральна ДНК, що характеризуєть-ся віссю суперспіралі другого порядку довжиною l = 279 нм та числом вузлів, що дорівнює семи. (г) Надсуперспіральна ДНК, довжина осі суперспіралі третього порядку якої становить l = 140 нм. Верхня границя наведеної шкали градацій кольору, що відповідає значенню висо-ти об’єкта на АСМ-зображенні, становить: (а) – 5 нм, (б) – 7 нм, (в) – 7 нм, (г) – 8 нм Нами також візуалізовано молекули ДНК, які мають значно меншу довжину осі суперспіралі – l = 279 нм (рис. 14в) та l = 140 нм (рис. 14г). Оскільки об’єм обох молекул збігається з об’ємом по-одинокої молекули ДНК pGEMEX, можна припустити, що молекулу з l = 279 нм (рис. 14в) утворе-но в результаті складання вдвічі молекули з l = 567 нм (рис. 12б), а молекулу з довжиною осі l = 140 нм (рис. 14г) – складанням вдвічі молекули з довжиною осі l = 279 нм (рис. 14в). Таким чином, при іммобілізації молекул ссДНК на поверхні амінослюди з підвищеною щільністю аміногруп ві-зуалізовано надсуперспіральні ДНК, що утворюють осі суперспіралі другого (рис. 14в) та третього порядку (рис. 14г), довжина яких приблизно в два та чотири рази менша, ніж довжина осі супер-спіралі першого порядку (рис. 14б) відповідно. Компактизацiя на модифікованiй амінослюдi вiдбувається не тiльки для поодиноких молекул ДНК, а й для олігомерів. Молекули, АСМ-зображення яких показано у поз. В1, С1, D1, Е1 (рис. 13), утворюють димери, що визначено нами на основі обчислення їхніх об’ємів. Спочатку дві плектонемічнi молекули (А1, А2) утворюють джгутоподібні структури (В1). У подальшому мож-ливе формування тороїда (С1, D1) або джгута (Е1), довжина суперспіральної осі якого становить чверть контурної довжини релаксованої молекули. Позиція D2 також відповідає тороїду, утворе-ному двома молекулами надссДНК. Повертаючись до схеми компактизації ДНК (рис. 13), зазначимо, що на другому етапі джгуто-подібна молекула (В3) складається вдвічі – довжина суперспіральної осі зменшується в два рази (С3, В2, С2, рис. 14в). На цьому етапі можливе як подальше формування джгутів (С3), так і утво-рення тороїдів (С2). На третьому етапі утворюються коротші джгути з ще вдвічі меншою довжи-ною суперспіральної осі l ~ 140 нм (D2). Крім того, можливе формування мінітороїда (D3) як iз то-роїда (С2), так і з джгутовидної молекули (С3). На четвертому етапі подальша компактизація торо-їдів та джгутів веде до виникнення напівсфероїдів (Е2) та сфероїдів. Цікаво відзначити, що мініто-роїди виникають як групами, так і поодинокими структурами. Намагаючись відповісти на запитання, чому різні молекули ДНК компактизовані до різного рів-ня, можна припустити, що (і) на поверхні модифікованої амінослюди протоновані аміногрупи ло-калізовані неоднорідно; (іі) найкомпактизованiшi структури – сфероїди та напівсфероїди – утво-рюються на ділянках модифікованої амінослюди з максимальною щільністю активних аміногруп. Локалізація морфологічно близьких форм ссДНК (мінітороїдів, джгутоподібних молекул з дов-жиною осі суперспіралі l ~ 570 нм та l ~ 280 нм) на ділянках слюди розміром ~ 500 нм Ч 500 нм вказує на те, що поверхнева щільність заряду модифікованої амінослюди варіює. А наявність тако-го градієнта щільності заряду спричиняє різне екранування фосфатних груп ДНК та, як наслідок, утворення варіантів компактизованих ссДНК, що морфологічно відрізняються. Крім того, дослі-джуваний зразок ДНК містить набір топоізомерів, що характеризуються різною щільністю супер-витків. У випадку, якщо характерний час компактизації ДНК має близьке значення до часу досяг-нення молекулами ДНК поверхні амінослюди, топоізомери з різною кількістю супервитків можуть конденсуватися в агрегати з різним рівнем компактизації. Таким чином, запропонована модель компактизації ДНК демонструє, що в умовах високої по-верхневої щільності заряду субстрату, на якому іммобілізовані молекули ДНК, можлива надзви-чайна компактизація не тільки димерів, тримерів ДНК, але й поодиноких молекул ДНК з поетап-ним складанням молекул вдвічі та формуванням осей суперспіралі другого та третього порядків. Однією з причин подовжнього стискування та внутрішньомолекулярної компактизації ДНК може бути збільшення гнучкості ДНК при збільшенні рівня нейтралізації фосфатних груп (саме це пе-редбачає теорія Manning, 1978, а підтверджено експериментально Podesta et al., 2005). Модифікація та функціоналізація зондів і субстратів для атомно-силової мікроскопії. По-верхневі властивості стандартної амінослюди були охарактеризовані двома методами – (і) атомно-силовою мікроскопією у режимі силових вимірювань та (іі) візуалізацією лінійних та суперспі-ральних молекул ДНК, адсорбованих на амінослюді. Режим силових вимірювань контактного ва-ріанта АСМ був застосований для характеристики амінослюди та амінозондів, а також амінозондів, функціоналізованих молекулами ДНК, глютаральдегiду, гомобiфункцiональними лiнкерними агентами та бичачого сироваткового альбумiну шляхом визначення сили адгезії та роботи сили ад-гезії між поверхнями, що взаємодіють. Один цикл силових вимірювань складається із двох етапів: (i) зближення поверхонь зонда та субстрату при переміщенні сканера від деякого заданого поло-ження відносно осі Z до положення Z = 0 та (ii) їхнього наступного віддалення від положення ска-нера Z = 0 до заданого значення Z. При цьому записують два силових графіки, що відповідають зближенню зонда та субстрату з відстані Z = 90-180 нм до Z = 0 нм та наступному їхньому відда-ленню (рис. 15). Характер обох графіків для пар поверхонь аміномодифікована слюда – зонд та свіжосколота (немодифікована) слюда – зонд у буферних розчинах за різних іонних умов вказує Рис. 15. Силові графіки, або залежності “відхилення зонда – відстань”, для пар поверхонь, що взаємодіють, аміномодифікована слюда – зонд та немодифікована свіжосколота слюда – зонд у водних розчинах за різних іонних умов: а – свіжосколота слюда - зонд, ТЕ буфер; (б-г) – амінослюда - зонд; б - ТЕ буфер, pH 7,6; в - 10ЧТЕ буфер, pH 7,6; г - 7 мМ NaOH, рН 11,2 на особливості міжмолекулярних сил між поверхнями зонда та субстрату, що взаємодіють. Аміногрупи, що покривають поверхню слюди після її модифікації за допомогою АПТЕС, є по-зитивно зарядженими за рН 7,6. Це призводить до адгезивного ефекту між позитивно зарядженою амінослюдою та негативно зарядженим зондом (рис. 15б) завдяки електростатичній взаємодії між аміногрупами модифікованої слюди та гідроксигрупами зонда. Сила адгезії між амінослюдою та зондом зменшується у 1,5-2 рази при зростанні іонної сили у 10 разів (рис. 15в) з наступним ще значнішим екрануванням заряду аміногруп за рН 11,2 (рис. 15г). Крім стандартної амінослюди (АП1-слюди) аналогічні силові вимірювання з тими ж самими кантилеверами було проведено для АП2-слюди (час обробки якої в парах АПТЕС становив 2 години при збереженні всіх інших пара-метрів протоколу модифікації), для якої було знайдено зростання сили адгезії та, отже, поверхне-вої щільності позитивного заряду порівняно з АП1-слюдою. Ми випробували значну кількість протоколів аміномодифікації слюди та нітриду кремнію в парах АПТЕС, але найвищу якість АСМ-зображень плектонемічної суперспіральної ДНК було досягнуто для стандартної та модифі-кованої амінослюди. Зазначимо, що нам також не вдалося отримати якісні АСМ-зображення ДНК, іммобілізованої на АП2-слюді. Цей факт наочно демонструє надзвичайну залежність якості АСМ-зображення ДНК, адсорбованої на слюді, навіть від невеликих змін протоколу модифікації слюди. Переваги поєднання методики іммобілізації ДНК на амінослюді з можливостями АСМ (над традиційними методами електронної та кріоелектронної мікроскопії) дозволили нам візуалізувати таку неканонічну структуру, як хрест, що утворений інвертованими повторами, суперспіральної ДНК pUC8. Зображення сcДНК pUC8 на стандартній амінослюді, отримане за допомогою вібрую-чого варіанта ACM у повітрі (рис. 16), показує, що хрест виглядає як різко окреслені виступи на нитці ДНК з довжиною пліч (тобто шпильок), яку можна оцінити безпосередньо із АСМ-зобра- Рис. 16. АСМ-зображення суперспіральної плазміди pUC8 (довжина становить 2665 п.н.) у повітрі. Розмір кадру: (а) – 858 нм Ч 858 нм; (б) – 372 нм Ч 372 нм; (в) – 134 нм Ч 134 нм. Стрілками показано хрестоподібну структуру ження. Аналіз наших експериментальних результатів показує, що в утворенні шпильки беруть участь 11-12 пар нуклеотидів, а термодинамічний аналіз інвертованих повторів підтвердив, що хрест утворено 52 нуклеотидами. Для порівняння зазначимо, що паліндромні ділянки, у яких за допомогою методів двовимірного електрофорезу та обробки нуклеазами були зареєстровані хрес-топодібні структури у ДНК фага (Х 174, плазмід pBR322, ColE1, pAO3, становлять 9-13 п.н. у спі-ральних ділянках кожної з шпильок хреста, а їхні петлі містять 3-5 нуклеотидів (Lilley, 1980; Lya-michev et al., 1984). Вільна енергія (G шпильки, яка утворює хрест у ДНК pUC8, становить -17,8 ккал/моль. З метою з’ясування зв’язку між шпильковими структурами (які було візуалізовано нами для плазміди pUC8 у вигляді утвореного ними хреста) та вірулентністю мікроорганізмів нами були до-сліджені два ізоляти патогенних мікобактерій туберкульозу з повністю секвенованим геномом – лабораторний штам Mycobacterium tuberculosis H37Rv та високопатогенний ізолят CDC1551. Було знайдено, що обидва ізоляти містять по 8 довгих інвертованих термодинамічно стабільних повто-рів довжиною 48-62 нуклеотиди та з вільною енергією (G = -38,9 – -56,2 ккал/моль, з яких 6 шпи-льок повністю збігаються. В той же час у геномі CDC1551, на відміну від H37Rv, на 5(-кінці (мат-ричного ланцюга ДНК) локалізована високостабільна шпилька довжиною 58 нуклеотидів. Припус-кається, що локалізація високостабільної шпильки з (G = -53,9 ккал/моль в області 5(-кінця мат-ричного ланцюга ДНК ізоляту CDC1551 може призводити до різного ступеня стабілізації РНК-транскриптів або різної ефективності термінації транскрипції для РНК-полімерази штаму CDC1551 порівняно з ізолятом H37Rv. Це, в свою чергу, незважаючи на те, що ступінь гомології ДНК двох ізолятів мікобактерій становить понад 98 %, може служити однією із причин різної ві-рулентності штамів. З метою візуалізації біооб’єктів безпосередньо у фізіологічному середовищі були досліджені ін-тактнi ціанобактерії та визначенi їхнi лінійнi розміри. Для збільшення сили взаємодії клітина – субстрат ціанобактерії Synechocystis PCC 6803 були iммобiлiзованi на стандартнiй амiнослюдi у TES буфері. Із АСМ-зображень було визначено, що середній розмір ціанобактерій у буферному розчині становить приблизно 70 нм Ч 90 нм, а їхня висота дорівнює ~ 20 нм. Модифікація зондів аміногрупами, як і у випадку аміномодифікації слюди, призводить до поя-ви піка на графіку віддалення залежності сила – відстань (рис. 17). Рис. 17. Залежності відхилення зонда – відстань для пари поверхонь амiнозонд – свiжосколо-та слюда у водних розчинах: а – силові графіки у ТЕ буфері; б – у 10ЧТЕ буфері; в – за рН 11,2 Після аміномодифікації зондів в парах АПТЕС, як і для амінослюди, виникає значна (до 4,6 нН) сила адгезії. Цей адгезивний ефект, як і для аміномодифікованої слюди, обумовлений, в основно-му, електростатичною взаємодією між позитивно зарядженими аміногрупами зонда та негативно зарядженими силанольними групами слюди. Наші дані показують, що збільшення іонної сили в 10 разів призводить до зменшення сили адгезії між амінозондом та слюдою в 1,7-2 рази. Розкид зна-чень сил адгезії може бути пояснений різним радіусом заокруглення зондів, а також утворенням на їхній поверхні амiношарів з різною щільністю аміногруп. На наступному етапі аміномодифіковані АСМ-зонди були функціоналізовані, тобто було під-тверджено, що аміногрупи амінозондів є реакційними, та вони можуть бути кон’юговані з біомо-лекулами при використанні добре відомої хімії іммобілізації амінів. Для функціоналізації аміно-зондів були використані нековалентне зв’язування ДНК та ковалентна взаємодія з глютаральдегі-дом (ГА). Ковалентне зв’язування аміногруп амінозонда з карбонільними групами ГА призводить до утворення Шиффової основи (Knapp, 1991). В результаті відбувається зменшення поверхневої щільності позитивного заряду амiнозонда та, отже, сили адгезії для системи амiнозонд + ГА – слю-да. Взаємодія негативно заряджених фосфатних груп молекул ДНК з позитивно зарядженими амі-ногрупами амінозонда призводить до їхньої нейтралізації та зникнення ефекту адгезії. В цьому ви-падку силові криві для амiнозонда з іммобілізованою ДНК у ТЕ буфері подібні до силових графі-ків для пари немодифікований зонд – свіжосколота слюда. Силові графіки амiнозонд + ДНК у ТЕ буфері, що записані з інтервалом в декілька секунд, показують, що молекули ДНК, якi адсорбовані на амiнозонді, є лабільними: під впливом прикладеної сили з’являються один або декілька піків адгезії (рис. 18). В процесі силових вимірювань ці піки можуть зникати та з’являтися знову. Неко- Рис. 18. Залежності відхилення зонда – відстань для аміномодифікованого зонда, функціона-лізованого ДНК. (а, б) – амiнозонд + ДНК – свiжосколота слюда, ТЕ буфер. Графіки одержано з інтервалом у декілька секунд валентне зв’язування амінозонд – ДНК та ковалентна взаємодія амінозонд – глютаральдегід пока-зали можливість функціоналізації модифікованих амінозондів, що може знайти застосування в до-слідженнях структурних особливостей поверхонь клітин, визначенні їхніх мікромеханічних влас-тивостей, моніторингу клітинної динаміки in vitro. Силові графіки системи амiнозонд – амiнослюда демонструють наявність значного адгезивного ефекту, незважаючи на те, що обидві поверхні несуть сумарний позитивний заряд. Істотно більш високе значення роботи сил адгезії (тобто площі під кривою віддалення) для пари амiнозонд – амi-нослюда при приблизно однаковому піковому значенні сили адгезії з парою амiнозонд – слюда вказують на утворення значно більшої кількості міжмолекулярних зв’язків між амiнозондом та амiнослюдою порівняно з парою поверхонь амiнозонд – слюда. З метою з’ясування механізму іммобілізації ДНК на модифікованій аміноповерхні нами були отримані зображення ДНК на амiнослюді за високої іонної сили I = 900 мM Na+ та рН 9. Незважа-ючи на елімінацію електростатичних сил взаємодії між аміногрупами на поверхні слюди та нега-тивно зарядженими фосфатними групами ДНК за I = 900 мM Na+, на поверхні амінослюди все ще існують сайти для зв’язування нуклеїнових кислот. Ці дані дозволяють припустити, що у зв’язу-ванні молекул ДНК як з аміноповерхнею модифікованого зонда, так і з поверхнею модифікованої слюди беруть участь не тільки електростатичні сили, але можливим є утворення водневих зв’язків між аміногрупами аміноповерхні з електронегативними сайтами ДНК. Оскільки вандерваальсові сили не залежать від pH (Butt, 1991), взаємодію ДНК з амінозондом (як і у випадку амінослюди за pH 9, I = 10 мM Na+), на нашу думку, обумовлено суперпозицією електростатичних та вандерва-альсових сил. На основі методики аміномодифікації АСМ-зондів розроблено загальну схему їхньої функціо-налізації та отримано зонди, функціоналізовані бичачим сироватковим альбуміном (БСА), які мо-жуть бути використанi для вивчення процесів молекулярного впізнавання (рис. 19). Процедура мо-дифікації та функціоналізації АСМ-зонда включає три етапи. Спочатку шляхом модифікації в па-рах похідного аміносилану був отриманий амінозонд, з поверхневими аміногрупами якого на дру- Рис. 19. Схема функціоналізації зондів для атомно-силової мікроскопії. (а) Немодифікований АСМ-зонд з нітриду кремнію. (б) АСМ-зонд, поверхня якого вкрита аміногрупами. На пер-шому етапі в результаті обробки в парах похідного аміносилану (АПТЕС) поверхня зонда мо-дифікована ковалентно приєднаними аміногрупами. (в) Зонд, поверхня якого містить ДСС-лінкер, що має вільний амінореакційний кінець (NHS-ефір). На другому етапі аміногрупи амінозонда реагують з NHS-ефірною групою гомобіфункціонального амінореакційного ДСС-лінкера. (г) Зонд з ковалентно приєднаними молекулами бичачого сироваткового альбуміну (БСА). На третьому етапі амінореакційні групи ДСС-лінкера взаємодіють з лізиновими за-лишками БСА гому етапі взаємодіяв амінореакційний гомобіфункціональний лінкер. На заключному етапі зонд з ковалентно приєднаним лінкером ДСС був функціоналізований молекулами БСА. Отримані АСМ-зонди було охарактеризовано на різних етапах модифікації за допомогою АСМ у режимі силових вимірювань (як після кожного етапу модифікації, так і тільки для зонда з приєднаним БСА) – із силових графіків (рис. 20) визначено силу адгезії та роботу сили адгезії. Рис. 20. Силові графіки аміномодифікованого зонда після (а) функціоналізації амінореакцiй-ним гомобіфункціональним ДСС-лінкером та (б) іммобілізації бичачого сироваткового аль-буміну Оскільки поверхнi модифікованого та функціоналізованого зондiв за своїми властивостями по-дібнi до поверхонь модифікованої та функціоналізованої слюди відповідно, процес функціоналіза-ції був також охарактеризований шляхом візуалізації молекул ДНК та БСА, iммобiлiзованих на модифікованій та функціоналізованій слюді. Відмітною особливістю аміномодифікації зонда за допомогою АПТЕС (рис. 19) є те, що одна молекула АПТЕС взаємодіє з трьома поверхневими ОН-групами зонда. Тим самим кількість аміногруп на поверхні зонда, обробленого АПТЕС, може бути істотно меншою, ніж для зонда, обробленого, наприклад, за допомогою етаноламіну з на-ступним утворенням самоасоційованих моношарів (Reiner et al., 2003). Використання гомобіфункціонального амінореакційного лінкерного агента також спрямоване на зменшення кількості молекул-рецепторів на поверхні зонда. Можливим є варіант, при якому один амінореакційний кінець лінкера (NHS-ефір) взаємодіє з аміногрупою зонда, а другий кінець залишається вільним – з цим реакційним кінцем лінкера можуть взаємодіяти аміногрупи лізинових залишків БСА. Однак також можливе зв’язування обох NHS-кінців лінкера з аміногрупами зонда, що зменшує кількість вільних аміногруп на поверхні амінозонда. Візуалізація комплексів ДНК – Т7 РНК-полімераза при елонгації транскрипції. Для дослі-дження структури комплексів Т7 РНК-полімераза – ДНК іммобілізацію біомолекул проводили на свіжосколоту слюду з додаванням іонів магнію. ДНК-матриця для транскрипції була сконструйо-вана таким чином, що містила промотор та область термінації транскрипції Т7 РНКП асиметрично локалізованими на кінцях амплікона довжиною 1414 п.н. (його контурна довжина становила 435 ( 15 нм). В процесі транскрипції утворюються елонгаційні комплекси, які характеризуються типовими вигинами для комплексів ДНК – білок (рис. 21). Транскрипцію можна розглядати як своєрідне ска-нування ДНК-матриці РНК-полімеразою. Напрямок сканування задається послідовністю промото-ру у матричному ланцюгу ДНК (Milligan, 1987). Але для пошуку промотору та виключення мож-ливості пропуску сайту промотору такою високоточною "машиною", якою є РНКП, на нашу дум-ку, цей молекулярний мотор починає сканування з одного з кінцевих фрагментів ДНК. Саме цією обставиною ми пояснюємо доволі велике число візуалізованих кінцевих комплексів, або комплек-сів, які передують утворенню комплексів ініціації транскрипції. Наші припущення узгоджуються з експериментальними результатами з АСМ-візуалізації дифузії РНКП протягом пошуку промотору (Guthold, 1999) та моделлю переміщення білка вздовж ДНК (швидкого перенесення білка між різ-ними фрагментами ДНК за допомогою механізмів одновимірної дифузії та слабкого неспецифіч-ного зв’язування) (Berg, 1981). Рис. 21. АСМ-зображення комплексів Т7 РНКП та ДНК. Молекули Т7 РНКП виглядають як сфери діаметром близько 8 нм. Білі стрілки вказують на комплекси, що утворили молекула Т7 РНКП та ДНК, а чорні – на РНК-транскрипти. Транскрипція проведена за кімнатної тем-ператури протягом 60 хв. Розмір кадру: (а) – 348 нм ( 348 нм; (б) – 306 нм ( 306 нм; (в) – 298 нм ( 298 нм; (г) – 299 нм ( 299 нм. Контурна довжина молекул становить: (а) – 445-450 нм, (б) – 454-457 нм Зазначимо, що при взаємодії молекули ДНК з Т7 РНКП утворюються специфічні та неспеци-фічні комплекси. Специфічне зв'язування (взаємодія з промотором) є відносно нечутливим до змі-ни іонної сили розчину, але воно залежить від конформації фрагмента ДНК. Неспецифічні комп-лекси ДНК – Т7 РНКП утворюються за рахунок електростатичної взаємодії позитивно заряджених залишків полімерази з негативно зарядженими фосфатними групами ДНК. Серед доволі великого масиву проаналізованих комплексів ДНК – Т7 РНКП (понад 200) були візуалізовані комплекси, утворені полімеразою саме з термінальними (тобто кінцевими) фрагментами ДНК (близько 30 Рис. 22. АСМ-зображення (а) та тривимірне зображення (б) комплексів, що утворили моле-кули Т7 РНК-полімерази з термінальними фрагментами ДНК-матриці. Біла стрілка вказує на комплекс ініціації, а чорна – на комплекс в області термінації транскрипції. (а) – розмір кадру – 297 нм Ч 297 нм. Наведено шкалу градацій сірого кольору, яка відповідає діапазону висоти від 0 до 5 нм. Транскрипцію проводили протягом 65 хв. за Т = 31 оС комплексів). Типові АСМ- та тривимірне зображення таких комплексів наведено на рис. 22. Наяв-ність декількох молекул Т7 РНКП, що утворили комплекс з поодинокою молекулою ДНК, під-тверджує, що після початку транскрипції однією молекулою Т7 РНКП інша молекула ферменту може зв'язатися з термінальним фрагментом ДНК-матриці, що локалізований поряд з промотором Т7 РНКП, для проведення наступної преініціації та елонгації транскрипції. В області термінації транскрипції декілька молекул Т7 РНКП можуть бути зв’язаними з ДНК- матрицею (показано чорною стрілкою на рис. 22). Ці дані узгоджуються з результатами роботи Epstein et al. (2003), в якій показано можливість об’єднання молекул РНКП в процесі елонгації транскрипції – більшість внутрішніх та зовнішніх блоків транскрипції (сигналів паузи та зупинки) зникають, якщо більше ніж одна молекула РНКП ініціює транскрипцію з одного і того ж промото-ру. Навпаки, при проведенні саме поодинокого циклу транскрипції наявність внутрішніх терміна-торів істотно впливає на швидкість елонгації та вихід повновимірних транскриптів. Нами візуалізовано і РНК-транскрипти, що утворилися після проведення транскрипції. Про те, що в результаті транскрипції синтезуються РНК-транскрипти очікуваної довжини, свідчила наяв-ність відповідної смуги на електрофореграмі після проведення електрофорезу за денатуруючих умов продуктів транскрипції. РНК-транскрипти виглядають як конденсовані структури, як і в по-передніх дослідженнях з АСМ-візуалізації РНК (Hansma, 1999), оскільки, на нашу думку, для візу-алізації витягнутих неконденсованих молекул РНК необхідно змінити поверхневі властивості суб-страту (слюди). В И С Н О В К И У дисертації наведено нове вирішення наукової проблеми створення для досліджень у галузі нанобіотехнології амінозондів (як компонентів біосенсорів) та амінослюди з заданими поверхне-вими властивостями (як субстрату для іммобілізації біополімерів) шляхом модифікації у газовій фазі. На основі узагальнення даних, отриманих за допомогою атомно-силової мікроскопії (АСМ), полімеразної ланцюгової реакції, шляхом розробки підходів до візуалізації та наноманіпулювання поодинокими молекулами доведено, що ДНК, іммобілізована на амінослюді, є еластичною моле-кулою, яка може бути не тільки розтягнута, але й стиснута, а також компактизується до рівня сфе-роїдів через три етапи послідовного складання вдвічі. 1. Вперше розроблено технологію отримання амінослюди, субстрату для іммобілізації біополі-мерів для досліджень за допомогою атомно-силової мікроскопії, з заданими властивостями – регу-льованою гідрофобністю та поверхневою щільністю заряду. Поряд з відомою стандартною аміно-слюдою, отриманою модифікацією в парах аміносилану, за рахунок варіювання умов модифікації слюди отримано модифіковану амінослюду як з підвищеною гідрофобністю та поверхневою щіль-ністю аміногруп, так і зі зменшеною порівняно із стандартною амінослюдою. 2. Вперше розроблено технологію отримання аміномодифікованих АСМ-зондів в газовій фазі на відміну від існуючого підходу аміномодифікації у розчині. За допомогою АСМ в режимі сило-вих вимірювань показано, що значення сили адгезії для пари поверхонь амінозонд – слюда (як і для пари стандартна амінослюда – зонд) зменшувались у ряду I = 10 мM Na+( I = 100 мM Na+ ( pH 11,2. Модифіковані амінозонди функціоналізовано через нековалентне зв’язування з ДНК та ковалентну взаємодію з глютаральдегідом. 3. Розроблено схему функціоналізації АСМ-зондів протеїнами та проведено їхню функціоналі-зацію бичачим сироватковим альбуміном (БСА). Модифіковані амінозонди з ковалентно приєдна-ним амінореакційним лінкером та БСА охарактеризовано шляхом силових вимірювань – визначе-но значення сили адгезії та роботи сили адгезії як після кожного етапу функціоналізації, так і тіль-ки для зонда з приєднаним БСА. 4. Розвинуто новий експериментальний підхід витягування молекул ДНК. Тягнуті лінійні моле-кули ДНК фага ( та тягнуті суперспіральні молекули ДНК pGEMEX візуалізовані на поверхні амі-нослюди із зменшеною гідрофобністю та поверхневою щільністю аміногруп. Визначене безпосе-редньо з АСМ-зображення збільшення контурної довжини тягнених ссДНК pGEMEX довжиною 3993 п.н. означає, що молекули ссДНК витягнуто у 1,5-1,7 разу порівняно з В-формою ДНК, що призвело до зростання відстані між нуклеотидами вздовж осі спіралі до H = 4,87 – 5,36 Е. 5. Доведено, що ДНК являє собою своєрідну молекулярну пружину – молекула ДНК може бути не тільки витягнута, але й стиснута. На модифікованій амінослюді поряд з плектонемічно супер-спіральними молекулами ДНК були візуалізовані поодинокі молекули з надзвичайно високим рів-нем компактизації, ступінь суперспіралізації яких значно вищий у порівнянні з раніше досягнути-ми експериментально та розглянутими теоретично. Відстань між нуклеотидами вздовж осі спіралі для цих суперспіральних молекул ДНК змінювалася у діапазоні 1,94 Е < H < 2,19 Е. Такі стиснуті суперспіральні молекули ДНК зі зменшеною міжнуклеотидною відстанню вздовж осі дуплекса по-рівняно з відомими формами ДНК віднесено до нової форми ДНК – S-ДНК, для якої визначений нахил основ та побудована модель. Важливо, що при цьому утворюються як ліві, так і праві надсу-перспіральні ДНК. 6. Візуалізацією лінійних та суперспіральних молекул ДНК на чотирьох субстратах з різними поверхневими властивостями доведено, що стискування молекул ДНК обумовлено поверхневими властивостями субстрату – високою гідрофобністю та щільністю заряду модифікованої амінослю-ди. 7. Вперше візуалізовано етапи компактизації поодиноких молекул суперспіральної ДНК pGEMEX, іммобілізованих на модифікованій амінослюді. Показано, що компактизація поодино-ких молекул відбувається через три етапи послідовного складання навпіл із зменшенням довжини осі суперспіралі, тобто з утворенням осей суперспіралі другого та третього порядків. 8. Вперше візуалізовані напівсфероїди та сфероїди – структури, утворені поодинокими супер-спіральними молекулами ДНК, – та показано, що тороїди також можуть бути утворені поодиноки-ми молекулами ДНК. На основі аналізу отриманих зображень запропоновано модель можливих конформаційних переходів суперспіральної ДНК in vitro за відсутності протеїнів при зростанні рівня компактизації ДНК. Компактизація поодиноких суперспіральних молекул ДНК обумовлена екрануванням негативно заряджених фосфатних груп ДНК, що взаємно відштовхуються, позитив-но зарядженими аміногрупами амінослюди. 9. Показано, що новий метод характеризації субстратів, заснований на візуалізації конформації плектонемічно суперспіральних молекул ДНК, є надзвичайно інформативним навіть порівняно з АСМ у режимі силових вимірювань, оскільки дозволяє отримати додаткову інформацію про по-верхневі властивості субстрату, на якому іммобілізовані молекули ДНК. Візуалізовано хрестопо-дібну структуру суперспіральної ДНК pUC8 і показано, що розмір стебла її шпильки становить 11 пар нуклеотидів, а петля містить 4 нуклеотиди. 10. Візуалізовано РНК-транскрипти (у вигляді джгутоподібних конденсованих структур) та комплекси, що утворює РНК-полімераза (РНКП) бактеріофага Т7 з ДНК-матрицею (яка містить промотор та термінатор транскрипції Т7 РНКП) в процесі транскрипції. Показано, що на одній мо-лекулі ДНК-матриці 2-3 молекули Т7 РНКП одночасно утворюють як специфічні комплекси з кін-цевими фрагментами ДНК-матриці, так і комплекси в області термінації та в процесі елонгації транскрипції. Візуалізовані комплекси ДНК – Т7 РНКП з трьома молекулами білка на одній моле-кулі ДНК-матриці відповідають етапам ініціації, елонгації та термінації транскрипції. ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ 1. Лиманский А.П. Визуализация крестообразной структуры суперспиральной ДНК посредством атомно-силовой микроскопии // Биофизика. – 2000. – Т. 45, № 6. – С. 1039-1043. 2. Лиманський О.П., Лиманська О.Ю. Атомно-силова мікроскопія: від візуалізації молекул ДНК та клітин до вимірювання сили міжмолекулярних взаємодій // Биологический вестник. – 2001. – Т. 5, № 1-2. – С. 124-132. 3. Лиманский А.П. Исследование аминомодифицированной слюды как субстрата для атомно-сило-вой микроскопии нуклеиновых кислот // Біополімери і клітина. – 2001. – Т. 17, № 4. – С. 292-297. 4. Лиманський О.П., Лиманська О.Ю. Вивчення геномної ДНК мікроорганізмів методом атомно-силової мікроскопії // Цитология и генетика. – 2002. – Т. 36, № 4. – С. 30-36. 5. Limansky A., Shlyakhtenko L., Schaus S., Henderson E., Lyubchenko Y. Aminomodified probes for ato-mic force microscopy // Probe Microscopy. – 2002. – Vol. 2, № 3-4. – Р. 227-234. 6. Лиманский А.П. Исследование аминомодифицированных зондов для атомно-силовой микроско-пии биомолекул // Біополімери і клітина. – 2002. – Т. 18, № 1. – С. 62-70. 7. Лиманський О.П. Вивчення хрестоподібної структури суперспіральної ДНК плазміди pUC8 за допомогою атомно-силової мікроскопії та комп'ютерного моделювання // Біополімери і клітина. – 2002. – Т. 18, № 5. – С. 401-405. 8. Лиманський О.П., Лиманська О.Ю. Візуалізація ціанобактерій у водному розчині за допомогою атомно-силової мікроскопії // Цитология и генетика. – 2003. – Т. 37, № 1. – С. 68-71. 9. Лиманский А.П. Атомно-силовая микроскопия: от визуализации молекул ДНК и белков до изме-рения силы межмолекулярных взаимодействий // Успехи современной биологии. – 2003. – Т. 123, № 6. – С. 531-542. 10. Лиманский А.П., Лиманская О.Ю., Волянский Ю.Л. Компьютерный анализ инвертированных повторов в геноме микобактерий туберкулеза // Журнал микробиологии, эпидемиологии и имму-нобиологии. – 2004. – № 5. – С. 48-52. 11. Лиманський О.П. Надсуперспіралізація та компактизація суперспіральної ДНК // Цитология и генетика. – 2005. – Т. 39, № 2. – С. 64-71. 12. Лиманська О.Ю., Лиманська Л.О., Лиманський О.П. S-форма ДНК – надсуперспiральна макро-молекула з ~ 2 Е вiдстанню мiж парами нуклеотидів вздовж осi дуплекса // Біополімери і клітина. – 2005. – Т. 21, № 6. – С. 515-524. 13. Лиманский А.П. Визуализация ампликонов после проведения полимеразной цепной реакции // Биофизика. – 2005. – Т. 50, № 6. – С. 1019-1024. 14. Лиманская Л.А., Лиманский А.П. S-форма ДНК – суперспиральная ДНК с 1.94 – 2.19 Е рассто-янием между парами оснований вдоль оси дуплекса // Молекулярная биология. – 2006. – Т. 40, № 1. – С. 122-136. 15. Лиманська О.Ю., Лиманська Л.О., Лиманський О.П. Компактизацiя суперспiральної ДНК на модифiкованiй амiнослюдi // Біополімери і клітина. – 2006. – Т. 22, № 1. – С. 18-28. 16. Лиманський О.П. Аміномодифіковані зонди з ковалентно приєднаними молекулами для атом-но-силової мікроскопії // Цитология и генетика. – 2006. – Т. 40, № 1. – С. 70-80. 17. Лиманский А.П. Функционализация аминомодифицированных зондов для атомно-силовой микроскопии // Биофизика. – 2006. – Т. 51, № 2. – С. 225-235. 18. Лиманская Л.А., Лиманский А.П. Компактизация единичных молекул суперспиральной ДНК, адсорбированных на аминослюде // Биоорганическая химия. – 2006. – Т. 32 , № 5. – С. 494-510. 19. Лиманський О.П. Візуалізація комплексу ДНК з Т7 РНК-полімеразою за допомогою атомно-си-лової мікроскопії // Біополімери і клітина. – 2007. – Т. 23, № 1. – С. 3-13. 20. Лиманський О.П. Візуалізація комплексів РНК-полімерази бактеріофага Т7 з ДНК-матрицею при елонгації транскрипції // Укр. біохім. журн. – 2007. – Т. 79, № 1. – С. 94-103. 21. Лиманський О.П. Візуалізація РНК-транскриптів за допомогою атомно-силової мікроскопії // Цитология и генетика. – 2007. – Т. 41, № 2. – С. 12-18. 22. Лиманский А.П. Компактизация единичных молекул суперспиральной ДНК, иммобилизован-ных на аминослюде: от дуплекса к минитороидальной и сферической конформации // Биофизика. – 2007. – Т. 52, № 2. – С. 252-260. 23. Пат. 13571Україна, МКІ C12Q 1/04, C12Q 1/68. Спосіб модифікації слюди, субстрату для атом-но-силової мікроскопії: Пат. 13571 Україна, МКІ C12Q 1/04C 12 Q 1/68 / Лиманський О.П., Лиман-ська О.Ю., Волянський А.Ю., Руденко С.С., Драч М.І., Лиманська Л.О., Клімов О.І. (Україна); Ін-ститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України. – № 200508247; Заявл. 22.08.2005; Опубл. 17.04.2006. – 14 с. 24. Пат. 17942 Україна, МКІ C12Q 1/04, C12Q 1/68. Спосіб витягнення лінійних та суперспіраль-них молекул ДНК: Пат. 17942 Україна, МКІ C12Q 1/04C 12 Q 1/68 / Лиманський О.П., Лиманська О.Ю., Волянський А.Ю., Руденко С.С., Драч М.І., Лиманська Л.О., Клімов О.І. (Україна); Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України. – № 200604603; Заявл. 25.04.2006; Опубл. 16.10.2006. – 8 с. 25. Пат. 17981 Україна, МКІ C12Q 1/04, C12Q 1/68. Спосіб стиснення лінійних та суперспіральних молекул ДНК: Пат. 17981 Україна, МКІ C12Q 1/04C 12 Q 1/68 / Лиманський О.П., Лиманська О.Ю., Волянський А.Ю., Руденко Л.М., Кучма І.Ю., Лиманська Л.О., Пугач Н.Б. (Україна); Інсти- тут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України. – № 200604883; Заявл. 03.05.2006; Опубл. 16.10.2006. – 8 с. 26. Limansky A., Limanskaya O., Kamensky Yu., Vovk O., Vashchenko L. Study of fullerene structure by scanning tunneling microscopy // Proc. 185th Meeting of The Electrochemical Society. – San Francisco (USA). – 1994. – P. 215-216. 27. Limansky A. Chemical force microscopy of aminomodified AFM tips and substrates // Proc. Interna-tional Symp. “Scanning Probe Microscopy, Sensors and Nanostructures”. – Tokyo (Japan). – 2001. – P. 85. 28. Limansky A. Imaging of cruciform structure in supercoiled DNA by atomic force microscopy // Proc. International Symp. “Scanning Probe Microscopy, Sensors and Nanostructures”. – Tokyo (Japan). – 2001. – P. 86. 29. Limansky A. Imaging of linear and supercoiled nucleic acids in air and cells in aqueous solution by atomic force microscopy // Конф. для молодих науковців, аспірантів та студентів з молекулярної біології і генетики. – Київ (Україна). – 2001. – C. 106. 30. Lymanskiy A. Cruciform structure in supercoiled DNA: imaging by atomic force microscopy and computer modeling // Proc. 8th International Symp. on Molecular Aspects of Chemotherapy. – Gdansk (Poland). – 2001. – P. 192. 31. Lymanskiy A. Atomic force microscopy aminomodified tips and substrates for DNA immobilization // Proc. 8th International Symp. on Molecular Aspects of Chemotherapy. – Gdansk (Poland). – 2001. – P. 193. 32. Limanskii A., Limanskaya O. Inverted repeats: computer analysis of microorganisms genome and imaging of cruciform structure in DNA by atomic force microscopy // Proc. SPIEs First International Symp. on Microtechnologies for the New Millennium. – Maspalomas (Spain). – 2003. – Vol. 5119. – P. 337-348. 33. Limanskii A., Limanskaya O. Inverted repeats in microorganisms: comparison of two isolates of My-cobacterium tuberculosis with complete genome and visualization of cruciform structure in plasmid DNA by atomic force microscopy // Proc. 1st FEMS Congress of European Microbiologists. – Ljubljana (Slo-venia). – 2003. – P. 442. 34. Limanskaya O., Limanskii A. Imaging of S-DNA – new DNA form with ~ 2 Е rise per base pair // Proc. 15th IUPAB & 5th EBSA International Biophysics Congress. – Montpellier (France). – 2005. – P. 673. 35. Limanskaya O., Limanskii A. Compaction of single supercoiled DNA molecules on the modified ami-no mica // Proc. 15th IUPAB & 5th EBSA International Biophysics Congress. – Montpellier (France). – 2005. – P. 673. 36. Limanskaya O., Limanskii A. Imaging stretched and compressed supercoiled DNA // Proc. III Interna-tional Conference on Hydrogen Bonding and Molecular Interactions. – Kyiv (Ukraine). – 2006. – P. 124. 37. Limanskaya O., Limanskii A. Compaction of supercoiled DNA molecules into spheroids // Proc. III International Conference on Hydrogen Bonding and Molecular Interactions. – Kyiv (Ukraine). – 2006. – P. 125. 38. Limanskii A., Limanskaya O. Visualizing stretched and compressed single supercoiled DNA molecul-es // Proc. Optical Spectroscopy of Biomolecular Dynamics II. – Eilat (Israel). – 2006. – P. 64. 39. Limanskii A., Limanskaya O. Imaging compacted single supercoiled DNA molecules with different length of superhelix axis // Proc. Optical Spectroscopy of Biomolecular Dynamics II. – Eilat (Israel). – 2006. – P. 52. АНОТАЦІЯ Лиманський О.П. Модифікація та функціоналізація зондів і субстратів для нанобіотехно-логії. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія. – Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2007. Представлено експериментальні результати розробки та характеризації модифікованих та функ-ціоналізованих біополімерами зондів та субстратів для атомно-силової мікроскопії (АСМ), а також результати досліджень внутрішньомолекулярної компактизації поодиноких молекул ДНК при ім-мобілізації на субстраті під впливом його поверхневих властивостей. Створено та охарактеризова-но за допомогою АСМ у режимі силових вимірювань амінослюду (субстрат для іммобілізації біо-полімерів) з регульованою гідрофобністю та поверхневою щільністю заряду, а також аміномоди-фіковані і функціоналізовані біополімерами (ДНК, бичачим сироватковим альбуміном) АСМ-зон-ди. На основі АСМ-даних доведено, що ДНК представляє своєрідну молекулярну пружину, яка може бути не тільки розтягнута, але й стиснута. Поряд з тягненими лінійними молекулами ДНК фага ( та суперспіральними ДНК pGEMEX (які характеризувалися відстанню між нуклеотидами вздовж осі спіралі H = 4,87 – 5,36 Е) візуалізовано поодинокі молекули з надзвичайно високим рів-нем компактизації, ступінь суперспіралізації яких значно вищий порівняно з раніше досягнутими експериментально та розглянутими теоретично. Такі стиснуті суперспіральні молекули ДНК, які характеризувалися 1,94 Е < H < 2,19 Е, були віднесені до нової форми ДНК – S-ДНК. Встановлено, що молекули ДНК компактизуються до рівня сфероїдів через три етапи послідовного складання вдвічі із зменшенням довжини осі суперспіралі, тобто з утворенням осей суперспіралі другого та третього порядків. Ключові слова: суперспіральна ДНК, атомно-силова мікроскопія (АСМ), амінослюда, S-ДНК, надсуперспіралізація, компактизація ДНК, адсорбція ДНК, сфероїд, тороїд, силові вимірю-вання, функціоналізація зонда, хрестоподібна структура. АННОТАЦИЯ Лиманский А.П. Модификация и функционализация зондов и субстратов для нанобиотех-нологии. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.20 – биотехнология. – Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Киев, 2007. Представлены экспериментальные результаты разработки и характеризации модифицирован-ных и функционализированных биополимерами зондов и субстратов для атомно-силовой микро-скопии (АСМ), а также результаты исследований внутримолекулярной компактизации единичных молекул ДНК при иммобилизации на субстрате под влиянием его поверхностных свойств. Разработана технология получения аминослюды, субстрата для иммобилизации биомолекул для исследований с помощью атомно-силовой микроскопии, с заданными свойствами – регулируе-мой гидрофобностью и поверхностной плотностью заряда. Наряду с известной стандартной ами-нослюдой, получаемой модификацией свежесколотой слюды в парах аминосилана, посредством варьирования условий модификации слюды получена модифицированная аминослюда как с повы-шенной, так и с пониженной гидрофобностью и поверхностной плотностью аминогрупп по срав-нению со стандартной аминослюдой. Разработана технология получения аминомодифицированных АСМ-зондов в газовой фазе в от-личие от существующего подхода аминомодификации в растворе. С помощью АСМ в режиме си-ловых измерений показано, что значения сил адгезии для пары поверхностей аминозонд – слюда (как и для пары стандартная аминослюда – зонд) уменьшались в ряду I = 10 мM Na+( I = 100 мM Na+ ( pH 11,2. Аминозонды были функционализированы посредством нековалентного связыва-ния с ДНК и ковалентного взаимодействия с глютаральдегидом. Также разработана технология функционализации АСМ-зондов белками и проведена их функционализация бычьим сывороточ-ным альбумином (БСА). Модифицированные аминозонды с ковалентно присоединенным амино-реакционным гомобифункциональным линкером и БСА были охарактеризованы путем силовых измерений – определены значения силы адгезии и работы силы адгезии как после каждого этапа функционализации, так и только для зонда с присоединенным БСА. Развит новый экспериментальный подход вытягивания молекул ДНК. Тянутые линейные моле-кулы ДНК фага ( и суперспиральные молекулы ДНК pGEMEX визуализированы на поверхности аминослюды с пониженной гидрофобностью и поверхностной плотностью аминогрупп под дейст-вием направленного потока воды. Для тянутых молекул ДНК pGEMEX длиной 3993 п.н. опреде-ленное из АСМ-изображения посредством измерения контурной длины расстояние между нуклео-тидами вдоль оси спирали составило H = 4,87 – 5,36 Е. Доказано, что ДНК представляет собой своеобразную молекулярную пружину – молекула ДНК может быть не только вытянута, но и сжата. На модифицированной аминослюде наряду с плекто-немично суперспиральными молекулами ДНК были визуализированы единичные молекулы с чрезвычайно высоким уровнем компактизации, степень суперспирализации которых значительно выше по сравнению с ранее достигнутыми экспериментально и рассмотренными теоретически. Расстояние между нуклеотидами вдоль оси спирали для таких суперспиральных молекул ДНК из-менялось в диапазоне 1,94 Е < H < 2,19 Е. Такие сжатые суперспиральные молекулы ДНК с уменьшенным межнуклеотидным расстоянием по сравнению с известными формами ДНК были отнесены к новой форме ДНК – S-ДНК, для которой построена модель и определен наклон осно-ваний. При этом были визуализированы как левые, так и правые сверхсуперспиральные молекулы ДНК. Визуализацией линейных и суперспиральных молекул ДНК на четырех разных субстратах с разными поверхностными свойствами доказано, что сжатие суперспиральных молекул ДНК обус-ловлено поверхностными свойствами субстрата – высокой гидрофобностью и плотностью заряда модифицированной аминослюды. Визуализированы этапы компактизации единичных молекул суперспиральной ДНК pGEMEX, иммобилизованных на модифицированной аминослюде. Показано, что компактизация единичных молекул происходит через три этапа последовательного складывания пополам с уменьшением длины оси суперспирали, т.е. с образованием осей суперспирали второго и третьего порядков. Компактизация единичных молекул завершается образованием молекул в сферической конформа-ции. Предложена модель возможных конформационных переходов суперспиральной ДНК in vitro в отсутствие протеинов при возрастании уровня компактизации. Показано, что новый метод характеризации, основанный на визуализации конформации плек-тонемичных суперспиральных молекул ДНК, является чрезвычайно информативным даже по сравнению с АСМ в режиме силовых измерений, поскольку позволяет получить дополнительную информацию о поверхностных свойствах аминослюды. Визуализирована крестообразная структу-ра суперспиральной ДНК pUC8 и показано, что размер ее шпильки составляет 11 пар нуклеотидов, а петля содержит 4 нуклеотида. Ключевые слова: суперспиральная ДНК, атомно-силовая микроскопия (АСМ), аминослю-да, S-ДНК, сверхсуперспирализация, компактизация ДНК, адсорбция ДНК, сфероид, тороид, сило-вые измерения, функционализация зонда, крестообразная структура. SUMMARY Limanskii A.P. Modification and functionalization of probes and substrates for nanobiotechno-logy. – Manuscript. Thesis for the degree of Doctor of Science in Biology by speciality 03.00.20 – Biotechnology. – Palla-din Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences, Kyiv, 2007. Experimental results are presented on the design and characterization of the modified and functiona-lized by biopolymers probes and substrates for atomic force microscopy (AFM) and results on the intra-molecular compaction of single DNA molecules under influence of surface properties after their immobi-lization onto substrate. Amino mica (substrate for immobilization of biopolymers) with regulated hydro-phobicity and surface charge density and amino modified and functionalized by biopolymers (DNA, bo-vine serum albumine) AFM probes were obtained and characterized by force measurements mode of AFM. Based on the AFM images obtained, DNA is proved to be a molecular spring that can be stretched and compressed as well. Stretched phage ( linear DNAs and pGEMEX supercoiled DNAs (which were characterized by helical rise per base pair ranged from 4,87 to 5,36 Е), as well as single molecules with an extremely high compaction level (i.e. molecules with a significantly higher superhelix density compa-red to those previously observed experimentally and estimated theoretically) have been visualized. The distance between nucleotides along the duplex axis for these supercoiled DNA molecules was varied from 1,94 to 2,19 Е. These compressed supercoiled DNA molecules are considered to be a new form of DNA, S-DNA. It was determined that DNA molecules are compacting into spheroids by three stages of subse-quent folding in half with decreasing a length of superhelix axis, i.e. by the formation of superhelix axis of second and third orders. Keywords: supercoiled DNA, atomic force microscopy (AFM), amino mica, S-DNA, oversuper-coiling, DNA compaction, DNA adsorption, spheroid, toroid, force measurements, probe functionalizati-on, cruciform structure. Підписано до друку 27.08.2007 р. Формат 60х90/32. Друк офсет. Папір офсет. Гарнітура Таймс. Умов. друк. арк. 1,9. Тираж 100 примірників. Заказ № 183 Надруковано в видавництві АТЗТ “САММІТ-Харків” Україна, 61023, м. Харків-23, вул. Мироносицька, 86 Тел. (057) 751-80-72 PAGE 1

Похожие записи