НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ПІВДЕННИХ МОРІВ
ім. О. О. КОВАЛЕВСЬКОГО
ЛАДИГІНА
ЛЮДМИЛА ВОЛОДИМИРІВНА
УДК 582.232: 579.8
Мікроводорості як кормові об’єкти личинок мідій і устриць
03.00.17 – гідробіологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Севастополь – 2007
Дисертація є рукопис
Робота виконана в Інституті біології південних морів
ім. О. О. Ковалевського НАН України, м. Севастополь
Науковий керівник: кандидат біологічних наук
старший науковий
співробітник
Іванов Валерій
Миколайович
Інститут біології
південних морів
НАН України,
завідуючий відділом
марикультури і
прикладної океанології
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук
Паршикова Тетяна
Вікторівна
Київський національний
університет
ім. Тараса Шевченка
завідуюча кафедрою фізіології і
екології рослин
доктор біологічних наук
Рябушко Віталій Іванович
Інститут біології південних морів НАН України
завідуючий відділом біологічного
тестування
Провідна установа: Одеський національний університет ім.
І.І.Мечникова
Захист дисертації відбудеться “__6__” _червня__________ 2007 р. в
___14____ годин на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 50.214.01 при
Інституті біології південних морів
НАН України за адресою: 99011, м. Севастополь, пр. Нахімова, 2
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту біології
південних морів НАН України за адресою: 99011, м. Севастополь, пр.
Нахімова, 2
Автореферат розісланий “_ 3____” ___травня____________ 2007 р.
Вчений секретар
спеціалізованої ради Д 50.214.01
доктор біологічних наук
професор
А.В. Гаєвська
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. За останні десятиріччя структура і чисельність
природних популяцій двостулкових молюсків у Чорному морі зазнали значних
змін (Іванов, 1976., Хребтова, 1986). В 70-і роки ХХ ст. знизилася
чисельність чорноморської устриці Ostrea edulis (L.), яка з масового
виду перейшла до розряду рідкісного, зникаючого і була занесена до
Червоної книги СРСР, а потім -України і Росії. Тому в тепер не
доводиться говорити про промислові запаси двостулкових молюсків, а їх
добування не виправдане ні з економічної, ні з екологічної точок зору
(Ivanov, 1992).
На початку 70-х років минулого століття в Україні розпочала інтенсивно
розвиватися марикультура мідії Mytilus galloprovincialis (Lam.), а у
80-і роки – тихоокеанської устриці Crassostrea gigas (Th.),
інтродукованої в Чорне море з Далекого Сходу замість зникаючої О.
edulis. Тихоокеанська устриця є основним об’єктом культивування в
світовому устрицівництві, що обумовлено її екологічною пластичністю,
стійкістю до захворювань, добрими смаковими якостями і високими темпами
росту (Grisel, 2001). Проте, в Чорному морі цей молюск залишається
рідкісним і природних банок не утворив, через те технологія його
розведення повинна базуватися на культивуванні молоді в устричних
розплідниках. Вирощування личинок і молоді в розплідниках дозволяє
проводити селекційну роботу, значно підвищити виживання молюсків, а
також збільшити ефективність роботи морських господарств.
Ефективність вирощування личинок у розпліднику багато в чому залежить
від особливостей їх живлення. Основним видом корму для плідників,
личинок і спату мідій та устриць є мікроводорості. Їх харчова цінність
визначається кількісним і якісним складом, проте дані про трофічні
потреби личинок мідій і устриць відсутні.
Створення на базі Інституту біології південних морів НАН України
розплідника по вирощуванню личинок мідій і устриць, обумовило
необхідність модернізації біотехніки культивування мікроводоростей,
спрямованої, перш за все, на визначення оптимальних рівнів концентрації
водоростей і щільності посадки личинок на різних стадіях розвитку.
Особливу актуальність ці роботи набувають у зв’язку з необхідністю
розробки практичних рекомендацій для промислового отримання великих
біомас мікроводоростей, які використовуються як корм для личинок і спату
двостулкових молюсків, вирощуваних у розпліднику.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
у відділі марикультури і прикладної океанології ІнБПМ НАНУ і являється
частиною комплексної програми досліджень в рамках науково-дослідних тем
з держбюджетної тематики Національної академії наук України:
“Моделювання природних і штучних екосистем з метою прогнозування
ресурсів і обгрунтування методів марикультури” (№ державної реєстрації
0182.8027773; 1981 – 1985); “Фізіолого-біохімічні основи продукування
речовини для створення сучасної марикультури” (№ державної реєстрації
0187.0012496; 1986 – 1990; 1990 – 1996); “Вивчити загальні
еколого-продукційні процеси меліорації середовища і марикультури в
прибережних районах Чорного моря” (№ державної реєстрації 0196U022106;
1996 – 1999); “Структурно-функціональні основи біорізноманітності
морських угруповань” (№ державної реєстрації 0199U001388; 1999 – 2002);
“Розробка наукових основ біотехнологій відтворення і використання
морських ресурсів” (№ державної реєстрації 0101U001448; 2001 – 2005);
“Вивчення функціонування морських біотехнологічних комплексів і їхньої
взаємодії з навколишнім середовищем” (№ державної реєстрації
0I06U00I586; 2006 – 2010), за темою ДКНТ: “Розробити і здійснити
комплекс біотехнічних заходів для вирощування чорноморських водоростей
(філофора), молюсків (мідій, устриць) і риб (камбали-калкана): визначити
наукові основи створення фермерських господарств для їх культивування
(03.04.07/020-92; 03.04.00/022к-95; 1992-1996 рр.). Автор брала участь
у виконанні перерахованих тем як виконавець.
Мета і завдання дослідження. Мета роботи – оптимізувати умови живлення
личинок устриці Crassostrea gigas і мідії Mytilus galloprovincialis при
вирощуванні в розпліднику. Для досягнення наміченої мети були поставлені
завдання:
виявити трофічні потреби личинок мідій і устриць;
визначити якісний і кількісний склад корму для личинок;
скласти харчові раціони для личинок устриць і мідій;
підібрати оптимальні умови для масового культивування мікроводоростей –
корму для личинок;
вибрати оптимальний режим вирощування личинок устриць і мідій в
контрольованих умовах.
Об’єкт дослідження. Личинки устриці Crassostrea gigas і мідії Mytilus
galloprovincialis; культури одноклітинних мікроводоростей Isochrysis
galbana, Monochrysis lutheri, Tetraselmis suecica, Dunaliella viridis,
Phaeodactylum tricornutum, Chaetoceros calcitrans.
Предмет дослідження. Вплив якісного складу корму на ріст личинок
двостулкових молюсків; ростові і біохімічні характеристики кормових
видів мікроводоростей,
Методи дослідження. В роботі використовувалися апробовані в
гідробіології і біохімії методики, фотоколориметричні і
спектрофотометричні методи визначення вмісту білка, вуглеводів, ліпідів
і каротиноїдів; загальноприйняті методи визначення біомаси і швидкості
росту мікроводоростей.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в розпліднику апробовані
елементи біотехніки масового культивування мікроводоростей – корму для
личинок мідій і устриць, в проточному і накопичувальному режимах.
Визначені швидкість росту і динаміка накопичення урожаю мікроводоростей
залежно від фази росту і умов культивування. Вперше досліджено
накопичення каротиноїдів личинками устриць і показано їх трансформація
устричним спатом. Виявлені трофічні потреби личинок мідій і устриць.
Вперше складені харчові раціони для личинок устриць і мідій, залежно від
стадій розвитку, з урахуванням кількісного і якісного складу
мікроводоростей.
Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень роблять
істотний внесок у розв’язання проблеми розплодження двостулкових
молюсків в контрольованих умовах. Одержані результати успішно адаптовані
в устричному розпліднику ІнБПМ, а також при виконанні селекційних робіт
з двостулковими молюсками. Оптимізація біотехніки культивування кормових
видів мікроводоростей дозволить одержувати великі біомаси водоростей
заданого біохімічного складу в напівпромислових масштабах. Виявлені
трофоекологічні особливості личинок мідій і устриць дають можливість
одержувати життєстійку молодь у розплідниках для задоволення потреб
марикультури молюсків в Україні.
Особистий внесок претендента. Дисертаційна робота є самостійним
науковим дослідженням. На базі устричного розплідника ІнБПМ НАНУ
здобувачем організований блок напівпромислового культивування кормових
видів водоростей. Увесь комплекс експериментальних робіт з культивування
мікроводоростей, визначення їх морфологічних і біохімічних показників,
аналіз і узагальнення результатів виконані автором самостійно. В працях,
опублікованих у співавторстві, внесок претендента полягав в обговоренні
цілей і завдань досліджень, проведенні експериментів, аналізі
результатів експериментів і узагальненні одержаних даних. Із статей,
опублікованих в співавторстві, в дисертації використані лише дані,
одержані автором. Права співавторів публікацій не порушені.
Апробація роботи. Результати досліджень були представлені на:
науковій конференції “Стан і перспективи науково – практичних розробок в
галузі марикультури” (Ростов-на-Дону, 1996), 2-ому Гідроекологічному
з’їзді (Київ, 1997), Четвертій нараді з вивчення молюсків (наземних,
прісноводих і морських) “ Молюски: проблеми систематики, екології і
філогенії” (Санкт-Петербург, 1998), Всеукраїнській науково-практичній
конференції “ Молюски. Основні результати, проблеми та перспективи
досліджень” (Житомир, 2002), Міжнародній конференції “Еволюція морських
екосистем під впливом вселенців і штучної смертності фауни”
(Ростов-на-Дону, 2003), III Міжнародній конференції “Морські
технології: проблеми й рішення -2004” (Керч, 2004), III Міжнародній
конференції “Актуальні проблеми сучасної альгології” (Харків, 2004), IV
Міжнародній конференції “Морські технології: проблеми й рішення – 2005”
(Керч, 2005), III Міжнародній конференції “Молюски: Результати,
проблеми, і перспективи досліджень” (Житомир, 2006), IХ Міжнародній
науково-практичній конференції “Сучасні проблеми екології популяцій”
(Бєлгород, 2006).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковані 24 праці (п’ять без
співавторів), з них 17 статей у спеціалізованих наукових виданнях,
рекомендованих ВАК України, 7 праць – у наукових збірниках, матеріалах і
тезах національних і міжнародних конференцій.
Структура і об’єм дисертації. Дисертація викладена на 165 сторінках
машинописного тексту; складається із 8 розділів, висновків, списку
використаної літератури і трьох додатків. Текст дисертації містить 25
таблиць і 32 рисунки. Список використаних джерел включає 187
найменувань, у тому числі іноземних -111.
МІКРОВОДОРОСТІ – ОСНОВА СТВОРЕННЯ ХАРЧОВИХ ЛАНЦЮГІВ В АКВАКУЛЬТУРІ
Розглянуті сучасні уявлення про роль мікроводоростей в аквакультурі.
Дана характеристика водоростей, що використовуються як корм для
двостулкових молюсків, показана їх харчова цінність. Відзначено, що живі
мікроводорості є єдиним оптимальним кормом для вирощуваних личинок,
незважаючи на те, що знайдені альтернативні корми, такі як дріжджі,
бактерії, водоростеві пасти або концентрати.
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Робота виконана в 1998-2006 рр. на базі устричного розплідника відділу
марикультури ІнБПМ НАНУ. Процес культивування мікроводоростей у
розпліднику включає зберігання колекції кормових видів водоростей,
підготовку стартових культур і масове культивування мікроводоростей.
Стартові культури нарощували в колбах об’ємом 2 л в накопичувальному
режимі при температурі 22-24°С і постійній аерації, використовуючи
живильне середовище Конвея (Walne P.R. 1966) у власній модифікації. Для
освітлення використані люмінесцентні лампи LD-40. Культури водоростей
заздалегідь адаптували до декількох рівнів інтенсивності світла в
діапазоні від 17,2, 86 до 172 мкЕ м-2 с-1.
Концентрацію клітин в культурах визначали за допомогою камери Горяєва
під мікроскопом МБД – 6 (х 175) в трьох повторностях. Питому швидкість
росту мікроводоростей (µ ) розраховували за рівнянням: µ = lg Ct – lg C0
/t • lg 2 (C0 і Ct концентрації в початковий момент часу і через
проміжок t, діб) (Стейниер, 1983). Залежність швидкості росту
мікроводоростей від інтенсивності світла описували рівнянням: У = с •
tanh ((b•x)/c). Величину сирої біомаси водоростей (В) визначали за
формулою: B (мг/л) = Vкл • С, де V- об’єм клітини, С- концентрація
(Сеничкина, 1978, 1995).
– концентрація культури після розбавлення (Перт, 1978; Тренкеншу,
2005).
Біохімічний аналіз водоростей виконували на пробах відібраних в
логарифмічній фазі, у фазі уповільнення швидкості росту і наприкінці
стаціонарної фази росту. Масову частку білка, ліпідів і вуглеводів у
сухій речовині (%) визначали фотоколориметричними методами. Вміст
загального білка аналізували за Лоурі (Lowry, 1951), ліпідів – за
допомогою фосфорно-ванілінового реактиву (Ahlglen, 1991), вуглеводів –
за кольоровою реакцією з L-триптофановим реактивом (Методи, 1988).
Якісний і кількісний вміст каротиноїдів в мікроводоростях і в личинках
устриць аналізували за методикою Карнаухова (1988) і Repeta (1997).
Фракції каротиноїдів ідентифікували за хроматографічними показниками
(Rf) і спектральними характеристиками пігментів (Repeta, 1997).
Концентрацію каротиноїдів визначали за оптичною щільністю екстрактів в
області 450 нм на спектрофотометрі “Cпекол-10”, з використанням
коефіцієнтів питомої екстинкції (Johansen, 1974; Jeffery, 1997).
Експерименти з вивчення щільності посадки личинок, концентрації корму і
складу мікроводоростей поставлені за методом латинського квадрата 4х4.
Досліди проводили з личинками на стадії велігера при температурі 21?С і
з личинками на стадії веліконхи при температурі 25?С тривалістю
відповідно 3 і 4 доби. На першому етапі експерименту були задані
наступні рівні факторів: щільність посадки личинок 5, 10, 15 і 20 тис.
лич./л; на другому етапі – 3, 5, 7 і 9 тис. лич./л; сумарна концентрація
корму – 50, 100, 150 і 200 тис. кл./мл (Пиркова, 2004).
( R – швидкість споживання, кл/лич. в доб.; Cc і Се – концентрація
мікроводоростей в контролі і досліді; L – кількість личинок в 1 мл; Н –
тривалість досліду) (Fritz, 1984). Термін перетравлення мікроводоростей
личинками устриць вивчали за допомогою люмінесцентного мікроскопа МЛ –
2А (х 154), використовуючи шкалу Lucas і Rangel (1983). Для
математичної обробки даних (H ± i; CV %; r – коефіцієнт кореляції) і
побудови графіків використовували пакети комп’ютерних програм Excel і
Graрher. Статистичний аналіз результатів факторних експериментів
проводили з використанням дисперсійного і регресійного аналізу.
МОРФОЛОГІЧНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ МІКРОВОДОРОСТЕЙ
У розділі наводиться морфологічна характеристика шести видів
мікроводоростей, що використовуються як корм для личинок мідій і
устриць. Показано, що в результаті адаптації мікроводоростей, з колекцій
водоростей ІнБПМ і IFREMER (Франція) до нових умов культивування,
одержані штами, відмінні за морфологічними характеристиками від
початкових культур.
ВПЛИВ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ НА РІСТ
МІКРОВОДОРОСТЕЙ
Під час масового культивування мікроводоростей інтенсивність процесу
біосинтезу може бути збільшена при оптимальних рівнях факторів, що
впливають на їх ріст і фізіологічний стан. До таких факторів відносяться
світло, температура, вуглецеве живлення.
Світло. При вирощуванні мікроводоростей Isochrysis galbana,
Dunaliella viridis, Chaetoceros сalcitrans при інтенсивності світла
17,2 ; 86 і 172 мкЕ м-2 с-1 і температурі 24?С графіки залежності
швидкості росту водоростей від інтенсивності світла складалися з двох
ділянок: а) швидкість росту зростала пропорційно збільшенню
інтенсивності світла; б) швидкість росту зростала незначно або взагалі
не збільшувалася з підвищенням інтенсивності світла (рис.1).
Максимальні значення швидкості росту мікроводоростей були відмічені при
збільшенні освітлення від 86 до 140 мкЕ м-2 с-1 і склали відповідно
0,99 діб-1, 0,92 діб-1і 0,18 діб-1для I. galbana, С. сalcitrans, D.
viridis, а коефіцієнт кореляції цих показників був 0,90, 0,81 і 0,67
відповідно у зазначених видів.
Показано, що при інтенсивності світла 17,2 мкЕ?м-2с-1 стадія
логарифмічного росту тривала 35 діб. Максимальна концентрація клітин
становила 5,83, 1,25 і 0,36 млн. кл/мл відповідно – у I. galbana, D.
viridis і С. сalcitrans. При інтенсивності світла 86 мкЕ м-2 с-1 стадія
логарифмічного росту скоротилася до 22 діб у I. galbana і D. viridis
і до 26 – у С. сalcitrans. Максимальні концентрації культур підвищились
до 15,85, 1,50 і 1,03 млн.кл/мл відповідно у I. galbana, D. viridis і
С. сalcitrans, а середньодобовий приріст склав 1,32 х 106, 10 х 104 і 8
х 104 кл/мл доб. При збільшенні інтенсивності світла до 172 мкЕ ?м -2
с-1 фаза логарифмічного росту тривала 16 діб – у I. galbana і D.
viridis і 20 діб – у С. сalcitrans. Максимальні концентрації культур
збільшилися до 18,55, 1,8 і 1,23 млн. кл/мл відповідно у I. galbana, D.
viridis і С. сalcitrans.
Виявлено, що у водоростей, які належать до різних систематичних груп
(золотисті, діатомові, зелені), інтенсивність світла, коли починається
світлове насичення, практично не відрізняється. Так, світлове насичення
у I. galbana, D. viridis, С. сalcitrans наступає при 140 – 172 мкЕ
?м-2 с-1 .
Температура. Внаслідок пристосування до різних температурних умов
мікроводорості зазнають ряд змін; в першу чергу, змінюється швидкість їх
росту. Мікроводорості D. viridis, I. galbana і P. tricornutum вирощували
в накопичувальному режимі при температурі 15?С і 25 ?С (рис. 2).
Найбільший темп росту у I. galbana і D. viridis спостерігався при
температурі 25?С. Максимальна концентрація водоростей склала відповідно
18,53 і 3,32 млн. кл/мл. Середньодобовий приріст при температурі 25?С
був в два рази вищий, ніж при 15?С.
0 У діатомової водорості P. tricornutum найвища інтенсивність поділу
клітин відмічалась при температурі 15?С. Максимальне значення
концентрації клітин досягало 59,06 млн. кл/мл, а середньодобовий приріст
– 3, 37 млн. кл/мл доб., що в три рази вище, ніж при 25 ?С.
Вуглецеве живлення водоростей. При масовому культивуванні
мікроводоростей рівень вуглецевого живлення посилювали додаванням 2%
СО2. При вирощуванні I. galbana і D. viridis з аерацією (без додавання
СО2) максимальні концентрації водоростей склали відповідно 11,57 і 1,9
млн. кл/мл (рис. 3). При аерації газоповітряною сумішшю, яка містить
2% СО2, забезпечуючи оптимальній рівень рН середовища (7,5 – 8,2),
максимальні концентрації I. galbana і D. viridis збільшилися відповідно
до 14,58 і 2,96 млн. кл/мл. Середньодобовий приріст водоростей був в 5
або в 3 рази вищий, у порівнянні з вирощуванням без додавання
вуглекислого газу.
Рис. 3 Динаміка росту мікроводоростей у залежності від вуглецевого
живлення
БІОХІМІЧНИЙ СКЛАД КОРМОВИХ ВИДІВ МІКРОВОДОРОСТЕЙ
Загальний біохімічний склад мікроводоростей (білки, вуглеводи, ліпіди)
визначали на трьох стадіях розвитку: логарифмічній, стадії уповільнення
росту і стаціонарній стадії (табл.1).
Таблиця 1
Максимальний вміст білка, вуглеводів, ліпідів
в мікроводоростях при накопичувальному культивуванні
Вид водоростей Вміст, % СВ
білка* вуглеводів** ліпідів***
Isochrysis galbana 49,8 ± 1,21 40,7 ± 0,23
25,6 ± 0.09
Dunaliella viridis 37,1 ± 0,21 20,6 ± 0,13
18,0 ± 0,10
Tetraselmis suecica 30,4 ± 0,31 24,1 ± 0,08
20,9 ± 0,21
Phaeodactylum tricornutum 40,7 ± 0,2 30,3 ± 0,10
20,0 ± 0,08
Chaetoceros calcitrans 41,35±0,28 43,2 ± 0,08
27,0 ± 0.09
Примітка: * – логарифмічна фаза росту; **- фаза уповільнення росту;
*** – стаціонарна фаза росту
В логарифмічній фазі відзначено високий рівень білка у всіх досліджених
видів водоростей. Максимальний вміст білка складав – 49,8 і 40,7 %
відповідно – у I. galbana і P. tricornutum; а мінімальна кількість –
30,4% – у T. suecica. Частка вуглеводів варіювала від 15,2% – у D.
viridis до 28,4 % – у I. galbana.
У фазі уповільнення швидкості росту в клітинах відбувається значне
зростання вмісту вуглеводів і зниження вмісту білка. Максимальну
кількість вуглеводів виявлено у С. calcitrans і I. galbana (43,2 і 40,7
%), а мінімальну – у D. viridis (20,6%). Частка ліпідів варіювала від
7,3% – у D. viridis до 15,2% – у I. galbana.
Наприкінці стаціонарної фази росту мікроводоростей встановлено зменшення
вмісту білка і вуглеводів в 1,5 – 2 рази і збільшення кількості ліпідів
в 2 – 2,5 рази відповідно у I. galbana і С. calcitrans і в 3 – 3,5 рази
– у T. suecica і P. tricornutum. Оптимальний рівень азоту (16,5
мг/л) в живильному середовищі Конвея сприяв інтенсивному синтезу білка
водоростями в логарифмічній фазі росту. В процесі розвитку культур
(зниження швидкості росту, збільшення концентрації клітин) відбувалося
зниження концентрації нітратів в середовищі, що стало причиною зменшення
вмісту білка і збільшення частки вуглеводів і ліпідів.
Фракційний склад каротиноїдів в мікроводоростях. Якісний і кількісний
склад каротиноїдів досліджений у чотирьох видів мікроводоростей: I.
galbana, P. tricornutum, D. viridis і T. suecica. Домінуючими фракціями
каротиноїдів у D. viridis і T. suecica були ?–каротин, лютеїн і
ксантофіли віолоксантинового ряду (неоксантин і віолоксантин).
Мікроводорості I. galbana і P. tricornutum, незважаючи на різне
систематичне положення, мали схожий склад каротиноїдів. Домінуючими
фракціями каротиноїдів у цих водоростей є фукоксантин, ?–каротин і
діадиноксантин; I. galbana містить слабо виявлену фракцію неоксантину.
Сумарний вміст каротиноїдів у водоростях залежав від фази росту.
Максимальну їх кількість виявлено на стаціонарній фазі росту. У I.
galbana вміст ?–?аротину в логарифмічній фазі росту майже в два рази
вищий, ніж у стаціонарній фазі – 317 мкг/г (СВ), тоді як вміст
фукоксантину і діадиноксантину суттєво зростав у міру росту культури. В
логарифмічній фазі росту концентрація фукоксантину і діадиноксантину
становила відповідно 340 і 135 мкг/г, а в стаціонарній фазі вона
збільшилася відповідно до 912 і 521 мкг/г (рис. 4).
У P. tricornutum вміст всіх фракцій каротиноїдів досягав максимального
значення на стаціонарній фазі росту (див. рис. 4). Вміст ?–каротину
збільшився в 16,6 рази: з 8,7 до 144 мкг/г, а фукоксантину – в 2 рази
порівняно з логарифмічною фазою росту і склав 521 мкг/г. Концентрація
діадиоксантину збільшилася в 1,4 рази (з 72 до 102 мкг/г).
В зелених водоростях D. viridis і T. suecica максимальний вміст
домінуючої фракції – лютеїну відзначено на стаціонарній фазі росту: 630
і 585 мкг/г, що в 8 – 9 разів більше, ніж в логарифмічній фазі росту
(рис. 5). Максимальні концентрації ?–?аротину у D. viridis і T. suecica
були визначені для стаціонарної фази: 311 і 292 мкг/г, що в 6 разів
більше, ніж в логарифмічній.
I. galbana P. tricornutum I.
galbana P. tricornutum
логарифмічна
стаціонарна
Рис. 4 Вміст каротиноїдів в мікроводоростях Isochrysis galbana і
Phaeodactylum tricornutum на різних фазах росту.
D. viridis T. suecica
D. viridis T. suecica
логарифмічна
стаціонарна
Рис. 5 Вміст каротиноїдів в зелених мікроводоростях Dunaliella viridis і
Tetraselmis suecica на різних фазах росту
Відомо, що морські тварини, у тому числі двостулкові молюски, не
синтезують каротиноїдів de novo, через те їх поява в організмі молюсків
є результатом надходження з водоростей (Maoka, 2005). Дослідження
накопичення каротиноїдів личинками і спатом устриць показали, що
каротиноїдний склад личинок на стадії педівелігера і водоростей, якими
вони живились, співпадає. Каротиноїди личинок представлені незначною
кількістю неоксантину і яскраво вираженими фракціями фукоксантину і
?-каротину.
Склад каротиноїдів спату устриць відрізнявся від такого в
мікроводоростях, які входять до складу корму. Окрім фракцій
неоксантину і ?-каротину, у спаті з’являються нові фракції каротиноїдів,
що може бути пов’язано з процесом трансформації каротиноїдів
водоростей.
Елементи керованого культивування мікроводоростей. Біохімічний склад
мікроводоростей можливо цілеспрямовано регулювати, змінюючи умови їх
культивування. Так, від форми азотного живлення в середовищі, на якому
вирощували I. galbana, залежав рівень вмісту білка у водорості.
Максимальну кількість білка, відзначено в логарифмічній фазі росту на
середовищі, складовою частиною якого були нітрати або сечовина, у
концентрації відповідно 40,19 і 44,96% (табл. 2).
Таблиця 2
Вміст білка і ліпідів в культурі I. galbana на різних стадіях росту
за різних умов азотного живлення.
Вміст компонентів сухої речовини, % СВ Фаза росту Хімічна форма азоту
Нітрати Нітрити Сечовина
Білок Л 40,19 ± 0,79 37,36 ± 1,23 44,96 ± 0,83
УР 34,50 ± 0,94 34,58 ± 0,96 35,98 ± 1,49
С 28,01 ± 1,31 33,46 ± 1,41 28,48 ± 1,51
Ліпіди Л 21,87 ± 0,47 27,5 ± 3,11 32,33 ± 0,58
УР 34,03 ± 0,50 33,58 ± 0,58 42,05 ± 0,51
С 38,49 ± 0,51 41,61 ± 0,51 31,96 ± 0,98
Примітка: Л – логарифмічна фаза росту; УР–фаза уповільнення росту; С–
стаціонарна фаза росту
Водорості, вирощені на сечовині, містили більше ліпідів, ніж на
нітратах або нітритах. Максимальну кількість ліпідів відзначено на фазі
уповільненого росту – 42,05%. Отже, сечовина може бути використана як
форма азотного живлення для отримання біомаси мікроводорості I. galbana
“поліпшеного” біохімічного складу.
Біохімічний склад водорості I. galbana змінювався залежно від
температурного режиму культивування (рис. 6).
Рис. 6 Вплив температури на біохімічний склад мікроводорості Isochrysis
galbana: В – вуглеводи, Б – білок, Л – ліпіди.
Вміст білка у I. galbana на логарифмічній фазі росту при температурі
16 і 28?С вірогідно не відрізнявся і склав відповідно 44,7 і 39,6%.
Проте, достовірну відмінність вмісту білка відзначено залежно від фази
росту мікроводорості. Так, при 16?С максимальний вміст білка в
логарифмічній фазі росту склав 44,7%, в стаціонарній – 28,5%, а при
температурі 28?С відповідно 39,8 і 27,1%. Вміст ліпідів не залежав від
фази росту мікроводорості при температурі 28?С, однак різниця була
достовірною при температурі 16?С і становила 19 і 35 % відповідно на
логарифмічній і стаціонарній фазах.
МОДИФІКАЦІЯ БІОТЕХНІКИ КУЛЬТИВУВАННЯ МІКРОВОДОРОСТЕЙ ДЛЯ МАСОВОГО
ВИРОБНИЦТВА КОРМУ
Масове культивування мікроводоростей здійснювали в двох режимах:
накопичувальному (періодична культура) і безперервному (напівпроточна
культура) (Перт, 1978; Тренкеншу, 2005). Накопичувальний спосіб
культивування мікроводоростей застосовувався під час вирощування корму
для личинок мідій і устриць, які знаходяться на пізніх стадіях
розвитку, або підрощування спату. При вирощуванні водоростей головним
завданням було отримання за короткий проміжок часу біомаси потрібного
біохімічного складу, через те найбільший інтерес становили три фази
росту: логарифмічна, уповільнення росту і початок стаціонарної фази.
Ростовими характеристиками водоростей у накопичувальному режимі
культивування були питома швидкість росту і продуктивність (табл. 3).
Максимальні значення виявлені в логарифмічній фазі росту, мінімальні –
в стаціонарній.
У логарифмічній фазі росту водорості практично не обмежені мінеральними
компонентами, тому їх якісний склад характеризується максимальним
вмістом білка, необхідного личинкам на ранніх стадіях розвитку. У фазі
уповільнення питома швидкість росту водоростей зменшувалася в 1,5 – 2
рази, в порівнянні з логарифмічною фазою, внаслідок зниження
концентрації біогенів, а біохімічний склад водоростей характеризувався
накопиченням вуглеводів.
Таблиця 3
Ростові характеристики мікроводоростей на різних фазах росту
в накопичувальному режимі при масовому культивуванні
Фаза
росту Питома швидкість росту
діб-1 Продуктивність
г · добу-1
1
2 3 4
1 2 3 4
Логарифмічна 0,43 0.38 0,37 0,18 47,99 113,35 89,67 3,49
Уповільнення 0,15 0,21 0,17 0,13 29,93 74,50 58,94 2,75
Стаціонарна 0,01 0,15 0,04 0,04 3,02 13,93 11,02 1,1
Примітка: 1 – Isochrysis galbana; 2 – Tetraselmis suecica; 3 –
Dunaliella viridis; 4 – Chaetoceros calcitrans
На стаціонарній фазі росту водоростей припиняється поділ клітин, через
те питома швидкість росту і продуктивності – мінімальні, в порівнянні з
іншими стадіями. В результаті відзначено зміну співвідношення їх
біохімічних параметрів: у клітинах відбувалося накопичення ліпідів.
Напівпроточне культивування мікроводоростей. Напівпроточне культивування
характеризується безперервним ростом водоростей на протязі досліду, який
пов’язаний з вилученням певної біомаси і внесенням в культуру живильного
середовища (рис. 7).
Основою управління ростом водоростей при такому культивуванні було
розбавлення культури. Водорості починали розбавляти наприкінці
логарифмічної фази росту: на 9-й день – для T. suecica і D. viridis і
8-й день – для I. galbana і Р. tricornutum.
I
a
ae
¤
¦
I
oe
o
dII?OOL
?
//iaeYOOOYOOIOOOOOOAE1/4
o
o
\
i
‚@?
‚@?
o
o
&
F
&
F
&
&
F
«†¬?¬neeeeaaaTHTHOeOeOeaEEAA?
@
???0?????
AE
??¬IeaeI»?
AE
^„
AE
AE
AE
????
???\???????
AE
AE
AE
AE
AE
????
??????????
????
”y\
E
????
??????
AE
AE
AE
AE
AE
AE
”y\
E
Dl??A.AE”E$E(EaeE–E?E|E~E‚ELIIIeIoooeYUUII1/2«UU™‹
e
e
e
e
e
e
$
$
3/4nAn
0o2o
?o?o
AE
o O
(тобто щоденному зливі 3 л водоростей) відзначено зниження
концентрації культур з 9, 87 до 8,35 млн. кл/ мл – у I. galbana, з
16,52 до 12,9 млн. кл/мл – у Р. tricornutum, з 2,31 до 1,76 млн.кл/мл –
у T. suecica і з 2,19 до 1,62 – у D. viridis з подальшим поверненням
за добу до початкового рівня густини. При такому режимі культивування
водоростей можна щодня отримувати до 460 мг сухої біомаси I. galbana,
420 мг Р. tricornutum, 1368 мг T. suecica і 1456 мг D. viridis, з
максимальним вмістом білка.
ВПЛИВ СКЛАДУ КОРМУ
НА РІСТ ЛИЧИНОК УСТРИЦЬ І МІДІЙ
Оптимальні умови для росту личинок велетенської устриці. Методом
факторного експерименту, поставленого за схемою латинського квадрата
4х4, визначені оптимальні значення концентрації корму, його складу і
щільності посадки личинок устриць і мідій на їх ріст і виживання.
Експеримент з личинками С. gigas провадився в два етапи: 1 – личинки на
стадії велігера; 2 – личинки на стадії веліконхи. На стадії велігера
сумарна концентрація корму була задана в діапазоні 50 – 200 тис. кл./мл,
щільність посадки личинок 5, 10, 15 і 20 тис. лич./л. У результаті
математичної обробки даних показано, що середньодобовий приріст личинок
велетенської устриці на стадії велігера не залежить від заданої в
досліді концентрації корму (Fексп. = 2,92 Fтабл. = 4,8). Шляхом порівняння максимального і
мінімального значень з найменшим значущим рангом показано, що величина
середньодобового приросту личинок вірогідно відрізняється при зміні
складу корму.
Максимальний приріст виявлено під час використання корму, який
складається з I. galbana, при концентрації 50 тис. кл./мл (біомаса 1,96
х 106 мг/л). Приблизно такий же приріст личинок – 10,5 мкм/добу при
щільності посадки 20 тис. лич./л і концентрації I. galbana 100 тис.
кл/мл. Таким чином, оптимальні умови для росту велігерів устриці
наступні: склад корму – I. galbana в межах 50 – 100 тис. кл /мл і
щільність посадки від 5 до 20 тис. лич./л.
В експерименті з личинками устриць на стадії веліконхи сумарна
концентрація корму була задана в діапазоні 50 – 200 тис. кл./мл,
щільність посадки личинок 3, 5, 7 і 9 тис. лич./л. Концентрація
мікроводоростей виявилася значущим фактором для росту личинок на стадії
веліконхи: Fексп. = 34,01 > Fтабл. = 4,8 і Fексп. = 43,22 > Fтабл. =
4,8 (для числа степінів вільності 3 і 6 і 5% рівня значущості).
Максимальний середньодобовий приріст личинок відмічено при концентрації
корму 50 тис. кл/мл, який складав 21,6 мкм/добу, при 100 тис. кл./мл –
17,7 мкм/добу. Відмінності всіх середніх значень статистично достовірні.
Коефіцієнт кореляції приросту і концентрації корму становив r = – 0,86
(Р = 0,05), тобто спостерігається обернена залежність темпів росту і
концентрації (біомаси) мікроводоростей.
Склад корму – значущий фактор, який впливає на ріст личинок. Найбільший
середньодобовий приріст (22,6 мкм/добу) відзначений при складі корму I.
galbana + С. calcitrans; потім – при складі корму з трьох видів
мікроводоростей: I. galbana+ С. calcitrans + T. suecica (16 мкм/добу);
далі – при I. galbana + T. suecica (15,5 мкм/добу) і С. calcitrans + T.
suecica (13,8 мкм/добу). Між всіма значеннями середніх величин приросту
відмінності статистично достовірні.
Фактор “щільність посадки” виявився незначущим для середньодобового
приросту личинок, оскільки не було достовірних відмінностей
середньодобового приросту личинок при щільності посадки від 3 до 9 тис.
лич./л. При порівнянні темпу росту личинок в дослідах № 2 і № 15
(середньодобовий приріст 21,5 і 21,1 мкм/добу відповідно) в умовах
щільності посадки 3 і 9 тис. лич./л і при однаковому складі корму (I.
galbana+ С. calcitrans) середнє значення біомаси, розраховане на 1 тис.
личинок, в досліді № 2 виявилося в два рази вищим.
Отже, оптимальними умовами для росту личинок устриці С. gigas на стадії
веліконхи є: концентрація водоростей в межах 50 -150 тис. кл/мл; корм,
що складається з I. galbana + С. calcitrans у співвідношенні кліток 1:1;
щільність посадки личинок в межах 3-9 тис. лич./л.
За результатами повного факторного експерименту (ПФЕ 22) одержано
рівняння залежності середньодобового приросту личинок на стадії велігера
(1) і веліконхи (2) від щільності посадки личинок і концентрації корму:
? Y 1,2 = 2,98 + 0,62?Х2 + 0,27 ? Х1 ? Х2 – (1)
? Y 1,2 = 18,86 + 4,37?X1 – (2)
Встановлено, що на рівень виживання личинок на стадії велігера жоден з
факторів суттєво не впливає:
? Y 1,2 = 82,77.
Рівняння регресії виживання личинок, що проходять пізні стадії розвитку,
мало наступний вигляд:
? Y 1,2 = 80,72 – 2,70 ?X1 + 7,82?X2
Концентрація водоростей є визначальним фактором, який впливає на
виживання личинок на стадіях веліконхи і педівелігера. Його вплив в 2,8
рази перевищував вплив фактора щільності посадки личинок. З рівняння
виходить, що виживання личинок максимальне при низькій щільності посадки
і високому рівні концентрації корму. Якщо концентрація корму складала 70
тис. кл./мл, а щільність – 3 тис. лич./л, то виживання, було
максимальним.
Оптимальні умови для росту личинок мідії M. galloprovincialis. На
стадії велігера щільність посадки личинок змінювали від 10 до 40
тис.лич./л, концентрацію корму від 5 до 40 тис. кл./мл. В результаті
математичної обробки даних показано, що щільність посадки личинок
(Fексп. = 45,1 > Fтабл.= 4,8) і сумарна концентрація корму (Fексп. =
18,4 > Fтабл.=4,8) є значущими факторами для росту. Середньодобовий
приріст личинок рівною мірою залежав як від біомаси водоростей, так і
від щільності посадки личинок. Максимальний середньодобовий приріст
личинок (4 мкм/добу) спостерігався при щільності посадки 10 тис. лич./л
і кормі з двох видів водоростей (I. galbana і M. lutheri) в сумарній
концентрації 40 тис. кл./мл.
В експерименті з личинками мідій на стадії веліконхи і педівелігера
сумарна концентрація корму була задана в межах від 10 до 70 тис. кл./мл,
а щільність посадки від 5 до 30 тис. лич./л. Концентрація корму і
щільність посадки личинок на пізніх стадіях також виявилися значущими
факторами для зростання (Fексп. = 39,31 > Fтабл.= 4,8; Fексп. = 22,27 >
Fтабл.= 4,8). Максимальний середньодобовий приріст личинок (10,7 – 12,2
мкм/добу.) одержаний при щільності посадки 5 тис. лич./л і концентрації
корму 70 тис. кл./мл, при складі корму з трьох видів водоростей – I.
galbana, M. lutheri і P. tricornutum. Проте середньодобовий приріст при
концентрації корму 70 і 50 тис. кл./мл достовірно не відрізнявся. Таким
чином, сумарна концентрація 50 тис.кл./мл є оптимальною при
культивуванні личинок мідій на пізніх стадіях розвитку.
Виживання личинок на стадії велігера, залежав від щільності посадки
личинок. При мінімальній щільності посадки (10 тис. лич./л) виживання
має максимальне значення.
Виживання личинок на стадії веліконхи і педівелігера не залежало від їх
щільності посадки і концентрації корму (Fексп. = 0,34
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
