АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ГЕРОНТОЛОГІЇ

КАЧУЛА СЕРГІЙ ОЛЕКСАНДРОВИЧ

УДК 577.15/.11: 542.978:612.391

Метаболізм ксенобіотиків — субстратів цитохрому р450 в умовах
голодування, введення індукторів та інгібіторів

03.00.04 – біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ-2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Вінницькому національному медичному університеті
ім.М.І.Пирогова МОЗ України

Науковий керівник: Доктор медичних наук, професор Пентюк Олександр
Олексійович, завідувач кафедри загальної та біологічної хімії
Вінницького національного медичного університету ім.М.І. Пирогова,
завідувач медико-біологічної лабораторії Інституту хімії поверхні НАН
України

Офіційні опоненти: Доктор медичних наук, Літвінова Надія Володимирівна,
головний науковий співробітник відділу біохімічної фармакології
Інституту фармакології та токсикології АМН України

Доктор медичних наук, доктор біологічних наук професор Жуков Віктор
Іванович, завідувач кафедри загальної та біологічної хімії Харківського
державного медичного університету МОЗ України

Провідна установа: Національний медичний університет

ім. О.О. Богомольця МОЗ України, кафедра біоорганічної, біологічної та
фармацевтичної хімії, м.Київ

Захист дисертації відбудеться » 20 » травня 2004 року о 13 год на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.551.01 при Інституті
геронтології АМН України за адресою: 04114, м. Київ, вул. Вишгородська,
67

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту геронтології АМН
України ( 04114, м. Київ, вул. Вишгородська, 67).

Автореферат розісланий «_14___» квітня 2004 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.551.01,

кандидат медичних наук Потапенко Р.І.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. В процесі еволюції в живих організмах сформувались
ферментні системи, які забезпечують їх виживання в умовах агресивного
хімічного оточення. Ці системи представлені численними родинами
ферментів та їх множинними формами, які здійснюють окислення,
відновлення, гідроліз та кон’югацію чужорідних речовин. Система
біотрансформації ксенобіотиків тісно поєднана з метаболізмом ендогенних
речовин і для більшості ферментів знайдені, як ксенобіотичні так і
ендобіотичні субстрати.

В більшості випадків метаболічні перетворення ксенобіотиків ведуть до
прискорення їх елімінації та зменшення біологічної активності [Nagahara
N. et al., 1999; Markowitz J.S., Patrick K.S., 2001; Desta Z. et al.,
2002]. Однак, нерідко в процесі метаболізму чужорідних речовин
утворюються реакційноздатні інтермедіати та активні форми кисню, які
ковалентно зв’язуються з клітинними макромолекулами, компонентами
мембран, ініціюють оксидативний стрес [Бутенко Г.М., 2002; Губський
Ю.І., Левицький Є.Л., 2002; Залесский В.Н., Великая Н.В., 2003; Bailey
M.J., Dickinson RG., 2003; Guengerich FP., 2003]. До такого типу
ксенобіотиків належать бромбензол та тетрахлорметан, які утворюють
реакційноздатні епоксиди та трихлорметильний радикал, відповідно
[Rombach E.M., Hanzlik R.P., 1999; Weber L.W. et al., 2003].

Тому зрозуміло, що індукція чи блокування активності метаболізуючих
ферментів може істотно вплинути на метаболізм ксенобіотиків та їх
токсичність. Наявність численних ферментів та поліморфізм їх множинних
форм, існування індукторів та інгібіторів з різним спектром дії,
унеможливлює апріорне прогнозування біологічних наслідків інтерференції
ксенобіотиків з модуляторами ферментів. Відомим індуктором є
фенобарбітал, який підсилює експресію більше 50 генів, включаючи
більшість ксенобіотик-метаболізуючих ферментів [Rushmore T.H., Kong
A.N., 2002]. Ацетон належить до індукторів, які переважно підвищують
активність Р4502Е1 і мало впливають на активність інших ферментів [Chen
R.M., Ueng T.H., 1997; Braun L. et al., 1998]. Особливим спектром дії
володіють сірковмісні сполуки часнику, які переважно індукують ферменти
другої фази метаболізму ксенобіотиків [Yang C.S. еt al., 2001].

Процеси біотрансформації ксенобіотиків можуть суттєво змінюватись при
різних фізіологічних станах, голодуванні, зміні раціону харчування,
захворюваннях, під впливом фармакотерапії [Парамонова Г.И., 2002; Nebert
D.W., Russell D.W., 2002]. Цукровий діабет, ожиріння, високожирове
харчування посилюють утворення активних інтермедіатів ксенобіотиків, як
це показано щодо парацетамолу [Lucas D. et al., 1998; Lieber C.S.,
2000].

Голодування є одним з поширених фізіологічних станів, супроводжує багато
захворювань і здатне суттєво змінити реакцію організму на дію багатьох
лікарських препаратів та токсикантів. Вже нетривале голодування (доба та
більше) може привести до важкого ураження печінки терапевтичними дозами
парацетамолу [Miles F.K. et al., 1999]. Механізми змін токсичності
ксенобіотиків при голодуванні остаточно не з’ясовані, тим більше, що не
завжди має місце підвищення їх токсичності, а нерідко реєструється і
зниження, як це показано щодо амфотерицину [LeBrun M. еt al., 1999]. Не
виключено, що зміни чутливості голодуючого організму до дії токсикантів
є наслідком перебудови ксенобіотик-метаболізуючих ферментних систем.
Виявилось, що цитохром Р4502Е1, який причетний до метаболічної активації
ксенобіотичних субстратів типу етанолу, парацетамолу,
нітрозодиметиламіну, толуолу, одночасно приймає участь у перетворенні
ацетону в субстрат глюконеогенезу — молочну кислоту [Lieber C., 1997;
Kalapos M.P., 2003] і його активність значно зростає при цукровому
діабеті, ожирінні, голодуванні. Однак, комплексних досліджень впливу
голодування на систему метаболізму ксенобіотиків, які б охоплювали не
лише ферменти окислювальної фази, але і кон’югаційні системи, ще не
проведено. Не з’ясовано, які саме метаболічні процеси, крім активації
цитохрому Р4502Е1, є відповідальними за формування зміни чутливості
голодуючого організму до дії ксенобіотиків. Існує необхідність більш
детального вивчення механізмів, через які відбуваються зміни
толерантності організму до ксенобіотиків, при різних фізіологічних і
патологічних станах, включаючи голодування, індукцію та інгібування
метаболізуючих ферментів. З’ясування цих питань дасть можливість
розробити ефективні підходи до прогнозування та попередження
несприятливої дії ксенобіотиків.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана в рамках планової НДР кафедри загальної та біологічної
хімії Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова:
“Використання модуляторів активності метаболізуючих ферментів та
сорбентів в якості засобів корекції фармакологічної активності та
токсичності лікарських засобів”(№ держреєстрації – 0101V002832).

Мета роботи: На основі дослідження біохімічних механізмів змін системи
біотрансформації ксенобіотиків під впливом голодування та введення
індукторів та інгібіторів метаболізуючих ферментів, експериментально
обґрунтувати підходи до підвищення опірності організму до несприятливої
дії ксенобіотиків в умовах голодування.

Задачі дослідження:

Оцінити вплив голодування та введення ацетону, фенобарбіталу, препарату
часнику INOD’AIL на ферментні системи першої (цитохроми Р4502Е1, 1А2,
2С, 2D, 3А) та другої фази метаболізму ксенобіотиків (глюкуроніл-,
сульфо-, глутатіон- та ацетилтрансферази) в печінці, нирках та легенях
щурів.

Оцінити силу кореляційного зв’язку активності ферментів метаболізму
ксенобіотиків з метаболічним статусом голодуючих тварин, а саме, з
рівнем глюкози, вільних жирних кислот, кетонових тіл в крові, вмістом
глікогену і активністю глюкозо-6-фосфатази в печінці.

В дослідах in vitro за допомогою специфічних інгібіторів оцінити
ізоензимний спектр монооксигеназних активностей, що індукуються при
голодуванні, введенні ацетону та фенобарбіталу.

Дослідити вплив голодування, введення ацетону, фенобарбіталу та
препарату INOD’AIL на біотрансформацію модельних препаратів —
сульфадимезину, амідопірину, ацетаніліду, толуолу, індометацину,
бромбензолу. Оцінити в якій мірі введення УДФ-глюкози та сульфату натрію
здатне компенсувати порушення метаболізму ксенобіотиків при голодуванні.

З’ясувати в якій мірі утворення активних інтермедіатів бромбензолу
залежить від активності метаболізуючих ферментів та дослідити вплив
голодування, індукторів і інгібіторів цих ферментів та препарату часнику
INOD’AIL на гепато-, нефро- та пульмотоксичність бромбензолу і
гепатотоксичність тетрахлорметану.

Об’єкт дослідження: печінка, нирки, легені, кров щурів, що голодували
або отримували індуктори чи інгібітори метаболізуючих ферментів.

Предмет дослідження: активність ферментів 1 та 2 фаз метаболізму
ксенобіотиків, процеси токсифікації та детоксикації ксенобіотиків —
субстратів цитохрому Р450, можливість фармакологічної корекції їх
токсичності.

Методи дослідження: біохімічні, фармакологічні та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено, що навіть
короткочасне голодування (1-3 дні) супроводжується змінами профілю
цитохром Р450-залежних монооксигеназ та кон’югуючих ферментів в печінці,
нирках і легенях і порушеннями звичайних співвідношень між ферментами
першої та другої фази метаболізму ксенобіотиків. Під впливом голодування
посилюються активність цитохромів Р4502E1 та 3А та залежні від Р4502E1
етапи біотрансформації ацетаніліду, бромбензолу та толуолу. Це
проявляється зростанням екскреції з сечею меркаптуратних метаболітів
ацетаніліду і бромбензолу та метаболіту толуолу — гіпурової кислоти.
Однак, голодування веде до пригнічення монооксигеназних активностей,
каталізованих Р4502D, 2C та 1A2, що проявляється ослабленням залежних
від Р4502С процесів метаболічної елімінації індометацину та утворення
крезольних метаболітів толуолу.

Голодування обмежує здатність організму до кон’югації з глюкуроновою
кислотою, сульфатом та глутатіоном, причиною чого є пригнічення
УДФ-глюкуронілтрансферази, фенолсульфотрансферази,
глутатіон-S-трансферази та зменшення доступності кофакторів кон’югації.
На рівні цілого організму це проявляється зменшенням екскреції з сечею
глюкуронідних та сульфатних метаболітів ацетаніліду та бромбензолу.
Однак голодування, викликає підвищення вмісту ацетил-КоА та активності
N-ацетилтрансферази в печінці і посилює елімінацію з сечею
ацетильованого сульфадимезину.

Встановлено, що індуковані голодуванням зміни в активності ферментів
тісно корелюють зі ступенем активації процесів глюконеогенезу, ліполізу
і особливо кетогенезу, а введення тваринам ацетону імітує зміни
викликані голодуванням. Профіль монооксигеназних активностей індукованих
ацетоном є ідентичним такому, що виникає при голодуванні, але
відрізняється від такого індукованого плейотропним індуктором
фенобарбіталом, що підтверджено застосуванням інгібіторів, специфічних
до ізоформ цитохрому Р450.

Голодування та введення щурам ацетону, етанолу та фенобарбіталу значно
посилює токсичні ефекти бромбензолу щодо печінки, нирок і легенів. Це є
наслідком активації залежних від Р4502E1 реакцій утворення токсичних
метаболітів бромбензолу та гальмування шляхів, пов’язаних з кон’югацією
його метаболітів з глюкуроновою кислотою та сульфатом.

Інгібітори Р4502E1 — діетилдітіокарбамат та диметилсульфоксид і препарат
INOD’AIL є ефективними протекторами токсичності тетрахлорметану та
бромбензолу. Вони гальмують ССl4-залежну пероксидацію ліпідів мікросом,
зменшують утворення токсичних метаболітів бромбензолу, а INOD’AIL, крім
того ще посилює кон’югацію останніх з глюкуроновою кислотою та
сульфатом.

В умовах стимулювання процесів кон’югації введенням УДФ-глюкози та
сульфату натрію, відбуваються позитивні зміни профілю метаболітів
бромбензолу в сечі: зменшується частка меркаптуратів та бромкатехолів і
зростає частка нетоксичних кон’югованих бромфенолів. Введення
УДФ-глюкози зменшує токсичну дію бромбензолу щодо печінки, нирок та
легень.

На противагу голодуванню та введенню ацетону, препарат ІNOD’AIL
пригнічував активності, асоційовані з P4502E1, але стимулював активності
пов’язані з P4501А2, 2С, 2D, УДФ-глюкуронілтрансферази,
фенолсульфотрансферази та глутатіон-S-трансферази. На рівні цілісного
організму вплив INOD’AIL проявляється гальмуванням каталізованих P4502E1
реакцій метаболізму ацетаніліду, толуолу та бромбензолу, посиленням
кон’югації з глюкуроновою кислотою та сульфатом, зменшенням токсичності
бромбензолу та CCl4.

Високий індивідуальний рівень експресії Р4502E1 є предиктором підвищеної
чутливості щурів до гепатотоксичної дії бромбензолу і CCl4, а висока
активність глутатіон-S-трансферази, УДФ-глюкуронілтрансферази та
фенолсульфотрансферази, навпаки пов’язана зі зменшенням їх токсичності.

Практичне значення одержаних результів.Отримані результати поглиблюють
уявлення про особливості функціонування системи біотрансформації
ксенобіотиків в умовах голодування та введення індукторів і інгібіторів
метаболізуючих ферментів. Голодування, введення ацетону та
фенобарбіталу, викликають несприятливі зміни метаболізму ксенобіотиків,
зокрема активують залежні від Р4502Е1 шляхи токсифікації ксенобіотиків
та ослаблюють процеси їх детоксикації, через кон’югацію.

В клінічній практиці слід обережно відноситись до призначення в умовах
голодування препаратів, здатних утворювати токсичні метаболіти та
свідомо уникати їх поєднання з іншими засобами, спроможними індукувати
Р4502Е1, чи гальмувати процеси кон’югації. Слід також брати до уваги, що
голодування супроводжується пригніченням монооксигеназних активностей
залежних від ферментів підродини Р4502C і сповільненням елімінації
нестероїдних протизапальних засобів, як це показано на прикладі
індометацину.

Токсичність бромбензолу та CCl4 значною мірою визначається
індивідуальними особливостями експресії метаболізуючих ферментів. Висока
активність цитохрому Р4502Е1 та низька активність сульфотрансферази,
УДФ-глюкуронілтрансферази і глутатіон-S-трансферази є предикторами
високої токсичності CCl4 і бромбензолу.

Препарат INOD’AIL та УДФ-глюкоза є ефективними коректорами індукованих
голодуванням та введенням індукторів змін в біотрансформації і
токсичності ксенобіотиків-субстратів цитохрому Р450.

Результати роботи використовуються в навчальному процесі та практиці
наукових досліджень кафедр біохімії та фармакології Вінницького
національного медичного університету ім.М.І.Пирогова, Українського
державного НДІ реабілітації інвалідів, м. Вінниця, кафедри біохімії
Тернопільської державної медичної академії.

Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно проаналізував наукову
літературу за темою дослідження, сформулював та обґрунтував основні
положення дисертаційної роботи і налагодив методи досліджень. Всі
експериментальні дослідження по дисертації, здобувач провів особисто.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації викладені
на 2-й Українській науковій конференції з міжнародною участю “Актуальні
проблеми клінічної фармакології”. Вінниця, 1998); на конференціях
молодих вчених Вінницького національного медичного університету
(Вінниця, 2000, 2001, 2002 рр.), на засіданні товариств фармакологів та
біохіміків (м. Вінниця, 2001, 2002); на 2 національному з’їзді
фармакологів (Дніпропетровськ, 2001) на VIII Українському з’їзді
біохіміків (м. Чернівці, 2002).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 10 наукових робіт: 6 статей
у журналах, що входять до переліку ВАК України (2 самостійно); 3 тез — в
матеріалах наукових конференцій та з’їздів; отримано патент на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 192 cторінках
машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури, розділу
присвяченому методам дослідження, 3-х розділів власних досліджень,
обговорення отриманих результатів, висновків, списку використаних
джерел. Робота проілюстрована 56 таблицями, 11 рисунками. Список
літератури містить 269 джерел (34 вітчизняних робіт та 235 робіт
іноземних авторів).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Досліди проведені на 368 білих
щурах-самцях популяції Вістар, які під час дослідів отримували
повноцінний крохмально-казеїновий напівсинтетичний раціон. Дослідження
виконані згідно правил гуманного відношення до експериментальних тварин
та затверджено комітетом з біоетики Вінницького національного медичного
університету.

Модель голодування викликали позбавленням щурів харчування протягом 1-3
діб, зберігаючи вільний доступ до води. УДФ-глюкозу (300 мг/кг) та
сульфат натрію (300 мг/кг) вводили голодуючим щурам внутрішньоочеревинно
за 3 і 6 год. до початку експерименту.

Ацетон вводили в дозах 250 та 1000 мг/кг через зонд в шлунок один раз на
добу, протягом 3-х днів. Фенобарбітал (70 мг/кг) вводили
внутрішньоочеревинно один раз на добу, протягом 5 днів. Препарат часнику
INOD’AIL (400 мг/кг) вводили перорально протягом 5 днів. Етанол (3 г/кг)
вводили через зонд в шлунок протягом 10 днів.

Метаболізм сульфадимезину оцінювали після його перорального введення в
дозі 100 мг/кг, за екскрецією з сечею метаболітів, кількість яких
визначали за методом Bratton-Marshall [Алимова М.М, Толкачевская Н.Ф.,
1962]. Біотрансформацію амiдопiрину досліджували після його
внутрішньоочеревинного введення в дозі 30 мг/кг. Метаболіти амiдопiрину
визначали за реакцією утворення iндофенолового барвника з фенолом [Попов
Т.А., Леоненко О.Б., 1977].

Ацетанiлiд, вводили внутрішньоочеревинно в дозі 100 мг/кг. Загальну
кількість його метаболітів (анiлiдних та амiнофенольних) оцінювали по
реакції дiазосполучення, частку амiнофенольних метаболітів — по реакції
утворення iндофенолового барвника [Коренман И.М., 1975; Сиггиа С., Ханна
Д.Г. 1983]. Вміст глюкуронiдів визначали карбазоловим методом [Yuki H.,
Fischman N.H.,1963], сульфатів — турбiдиметричним методом [Цевелева
И.А., 1971], меркаптурових кислот — по реакції з реактивом Елмана [Doorn
V.R. et al., 1981].

Толуол вводили перорально в дозі 100 мг/кг. Вміст гіпурової кислоти
визначали за реакцією з пірідином [Ogata M. et al., 1981], кількість
крезолів — за реакцією з 4-аміноантипірином [Коренман И.М., 1975].
Бромбензол вводили перорально в дозі 200 мг/кг. Вміст меркаптурових
кислот визначали за кількістю тіоефірів [Henderson PT. et al., 1984],
вільних та кон’югованих бромфенолів визначали за реакцією з
4-аміноантипірином [Коренман И.М., 1975], бромкатехолів — за реакцією з
хлоридом кобальту [Azouz W.M. et al., 1953].

Фармакокінетику індометацину оцінювали після перорального введення щурам
в дозі 30 мг/кг. Вміст індометацину в крові визначали через 0,5, 1, 2,
4, 8 та 12 годин методом високоефективної рідинної хроматографії
(хроматограф 1100 Leonardo (США), колонка Hypersil BDS C18, елюент 0,03М
цитратний буфер рН 3,9 – ацетонітрил, 50:50). Параметри фармакокінетики
розраховували за двохчастинною моделлю зі всмоктуванням [Холодов Л.Е.,
Яковлев В.П., 1985].

Гепатоцити одержували коллагеназним методом Сеглена [Осипова Л.А., та
співавт., 1986]. Життєздатність клітин оцінювали по їх профарбовуванню
трипановим синім, виходу лактатдегідрогенази в позаклітинну рідину та
зниженню вмісту відновленого глутатіону. Активність лактатдегідрогенази
(КФ 1.1.1.27) оцінювали по зниженню поглинання NADH [Кочетов Г.А.,
1980].

Мікросоми печінки, легень та нирок щурів отримували з
постмiтохондрiальної фракції за здатністю осаджуватись двохвалентними
катіонами. Чистоту мiкросомної фракції тестували за маркерними
ферментами мітохондрій, лізосом, плазматичних мембран та мiкросом
[А.А.Покровский, А.И.Арчаков, 1968]. В мікросомах визначали ацетанілід-
і анілінгідроксилазну активності за утворенням пара-амінофенолу,
амідопірин-N-, еритроміцин-N-, індометацин-О- та
метопролол-О-деметилазні активності — за утворенням формальдегіду
[Карузина И.И., Арчаков А.И., 1977; Коор D.R.,1986]. Активність
гексобарбіталгідроксилази оцінювали за утворенням
3-гідроксигексобарбіталу, кількість якого визначали хроматографічно
[Breyer U., Villumsen D., 1975]. Пара-нітрофенолгідроксилазну активність
оцінювали за швидкістю перетворення пара-нітрофенолу в
пара-нітрокатехол, [McCoy G.D., Koop DR., 1999]. Активність NADH і
NADPH-редуктаз (КФ 1.6.2.2 і 1.6.2.4) оцінювали за швидкістю відновлення
дихлорфеноліндофенолу [Карузина И.И., Арчаков А.И., 1977]. Активність
NADPH- та CCl4-залежного перекисного окислення ліпідів в мікросомах
визначали за утворенням малонового діальдегіду [Костюк В.А., 1991].

Активність УДФ-глюкуронілтрансферази (КФ 2.4.1.17) мікросом печінки
оцінювали за швидкістю кон’югації пара-нітрофенолу [Burchell B.,
Weatheril P., 1981]. В постмітохондріальній фракції визначали активність
N-ацетилтрансферази (КФ 2.3.1.5) за швидкістю кон’югації
пара-амінобензойної кислоти [Weber W.W., King C.M., 1981],
фенолсульфотрансферази (КФ 2.8.2.1) — за утворенням сульфоефіру
бета-нафтолу [Kempen G.M., Jansen G.S., 1971], глутатіон-S-трансферази
(КФ 2.5.1.18) — за утворенням кон’югатів глутатіону з
1-хлор-2,4-динітробензолом (альфа, мю та пі форми ферменту) [Habig W.H.,
Jacobi W.B., 1981]; з нітрогліцерином (мю форма) [Habig W.H., Jacobi
W.B., 1981;Nigam R, et al., 1996]; етакриновою кислотою (пі форма)
[Kashiwada M, et al., 1991].

В трихлороцтовому фільтраті органів визначали вміст відновленого
глутатiону та глутатіондисульфіду в глутатiонтрансферазнiй реакції
[Asaoka K., Takahashi K., 1981], цистеїн — за реакцією з нiнгiдрином
[Gaitonde M.K., 1967], глюкуронідів та сульфатів методами описаними
вище. Сумарний вміст КоА (КоА-SH та ацетил-КоА) в печінці визначали за
методом ацетилювання пара-амінобензойної кислоти [Островский Ю.М.,
1979].

Активність аланінамінотрансферази (КФ 2.6.1.2) та
аспартатамінотрансферази (КФ 2.6.1.1) визначали методом
Райтмана-Френкеля, активність гама-глутамілтрансферази (КФ 2.3.2.2) за
швидкістю вивільнення 4-нiтроанiлiну з гамма-глутамiлнiтроанiлiду, вміст
креатиніну за реакцією з пікриновою кислотою, сечовини —
диацетилмонооксимним методом [Меньшиков В.В., 1987]. Вміст малонового
диальдегіду визначали за реакцією з тіобарбітуровою кислотою [Владимиров
Ю.А., Арчаков А.А, 1972], фосфоліпідів — за утворенням гідрофобного
комплексу з феротіоціанатом амонію [А.А.Пентюк та співавт., 1987], білок
— мікробіуретовим методом [Кочетов Г.А.,1980]. Вміст кетонових тіл в
крові визначали мікродифузійним методом по реакції з саліциловим
альдегідом [Покровский А.А., 1969]. Неестерифіковані (вільні) жирні
кислоти визначали екстракційним методом за утворення мідних солей
[Меньшиков В.В., 1987]. Вміст глікогену визначали методом Зейфтера
[Асатиани В.С., 1957].

До мікросом печінки додавали інгібітори: P4502B — орфенадрін (0,2 мМ)
[Guo Z. et al., 1997], P4501A2 та P4502A6 — триптамін (0,05 мМ) [Zhang
W. et al., 2001 ], P4502В і 2С — хлорамфенікол (0,05 мМ) [He Y.Q. et al,
1995], Р4502С — диклофенак (0,1 мМ) Masubuchi Y. et al., 2001], P4502D —
хінідин (10 мкМ) [Bourrie M. et al., 1996], Р4503А — тролеандоміцін
(0,025-0,1 мМ) та кетоконазол (0,1 мМ) [Chang T.K. et al., 1994; Zhang
W. et al., 2002], Р4502Е1 — діетилдітіокарбамат (0,1 мМ) та
диметилсульфоксид (0,1%) [Bourrie M. et al., 1996; Hickman D. et al.,
1998; Busby W. et al., 1999].

Статистичну обробку результатів дослідів виконували методами біометрії
на основі комп’ютерної програми “Exel”. Для оцінки різниці між групами
застосовували t-критерій Ст’юдента, при визначенні зв’язків між
показниками – кореляційний аналіз [Гублер Е.В., 1978; Носков В.Н.,
1990].

Результати дослідження та їх обговорення. Голодування викликає значні
зміни вуглеводного та ліпідного обміну. На третій день голодування в
крові падає вміст глюкози (з 5,94(0,25 в контролі до 4,08(0,21 ммоль/л,
р< 0,001), зростає рівень кетонових тіл - до 2,03(0,10 ммоль/л (при 0,36(0,026 в контролі, р<0,001) та вільних жирних кислот - до 1,45(0,11 ммоль/л (при 0,70(0,07 в контролі, р< 0,001). В печінці зменшується вміст глікогену (до 48(4,1 при 135(12 мкмоль/г в контролі, р<0,001) і зростає активність глюкозо-6-фосфатази - до 0,98(0,06 нмоль/хв/мг білку (при 0,39(0,03 в контролі, р<0,001). Голодування суттєво впливає на активність цитохрому Р450 (табл. 1). На 2 та 3 дні досліду в печінці значно зростає активність маркерів Р4502Е1 - анілінгідроксилази (в 2,3 та 2,8 рази) і пара-нітрофенолгідроксилази (в 2,4 та 3,0 рази). Ці активності посилюються також в нирках та легенях. На 3-й день анілінгідроксилазна активність в нирках зросла до 0,62(0,044 при 0,26(0,017 нмоль/хв/мг в контролі, а пара-нітрофенолгідроксилазна - 0,30(0,027 при 0,10(0,007 нмоль/хв/мг в контролі. В легенях обидві активності зростали на 50 та 67%, відповідно. Дещо менше (на 29 та 40%) в печінці зростає еритроміцин-N-деметилазна активність (маркер Р4503А), а ацетанілідгідроксилазна (Р4501А2), метопролол-О-деметилазна (Р4502D), індометацин-О-деметилазна (P4502C) активності, навпаки, знижуються на 20-35%. При відновленні харчування реєструється тенденція до повної або часткової нормалізації цих активностей.Введення щурам ацетону викликає подібні зміни: зокрема в печінці зростає анілінгідроксилазна та пара-нітрофенолгідроксилазна активності (в 2,7 та 3,4 рази), еритроміцин-N-деметилазна активність (в 1,5 рази), але пригнічуються ферментативні активності каталізовані Р4501A2, Р4502C та Р4502D. Голодування впливає на активність ферментів кон’югації. На третій день досліду активності УДФ-глюкуронілтрансферази, фенолсульфотрансферази та глутатіон-S-трансферази виявились нижчими, ніж в контролі на 21, 23, 41 %, відповідно. В печінці падав вміст глюкуронідів на 28%, сульфатів – на 30%, Таблиця 1 Цитохром Р450-залежні монооксигеназні активності, ферменти та субстрати кон’югації в печінці тварин під час голодування, відновлення харчування та введення ацетону (M(m) Активність ферментів нмоль/хв/мг білка Контрольна група, n=10 Дні голодування Відновле-ння хар-чування, n=10 Ацетон, n=9 2 день, n=10 3 день, n=10 Монооксигеназні активності Цитохром Р450 0,80(0,04 0,71(0,05* 0,64(0,04* 0,77(0,06 1,13(0,05* Анілінгідроксилаза 0,80(0,07 1,82(0,07* 2,22(0,17* 1,27(0,09* 2,16(0,17* Пара-нітрофенолгідроксилаза 0,29(0,02 0,71(0,04* 0,86(0,07* 0,52(0,04* 1,05(0,09* Ацетанілідгідроксилаза 1,90(0,14 1,55(0,11 1,51(0,08* 1,82(0,12 1,58(0,10 Еритроміцин-N-деметилаза 1,03(0,06 1,33(0,06* 1,42(0,08* 1,16(0,09 1,58(0,09* Метопролол-О-деметилаза 0,80(0,06 0,67(0,03 0,64(0,02* 0,72(0,04 0,65(0,04* Індометацин-О-деметилаза 0,60(0,04 0,48(0,02* 0,39(0,03* 0,50(0,03 0,53(0,05* Ферменти і субстрати кон’югації УДФ-глюкуронілтрансфераза 2,94(0,23 2,50(0,20 2,33(0,15* 2,76(0,16 2,59(0,21 Глюкуроніди, мкмоль/г 92,2(7,8 74,1(4,6* 66,1(3,4* 81,8(3,97 78,1(4,23 Фенолсульфотрансфераза 0,35(0,02 0,30(0,02 0,27(0,02* 0,31(0,03 0,26(0,02* Сульфати, мкмоль/г 1,42(0,06 1,11(0,05* 0,99(0,05* 1,23(0,05* 1,13(0,05* N-ацетилтрансфераза 0,28(0,02 0,36(0,02* 0,38(0,02* 0,30(0,02 - КоА, нмоль/г 305(15 717(51* 925(57* 420(33* - Глутатіон-S-трансфераза, хлординітробензол 330(33 246(12* 226(15* 295(16 286(27 GSH, мкмоль/г 6,88(0,36 5,53(0,19* 4,96(0,19* 6,09(0,20 6,05(0,30 Примітка. “*” - вірогідні відмінності щодо контролю р<0,05. відновленого глутатіону – на 28%. Однак, голодування веде до зростання активності N-ацетилтрансферази (на 35%) та вмісту КоА в печінці (на 203%). Припинення голодування веде до часткової нормалізації цих показників. Введення ацетону знижує вміст глюкуронідів та активність УДФ-глюкуронілтрансферази в печінці (відповідно на 25 та 12%), зменшує активність сульфотрансферази та вміст сульфатів ( на 25 та 20%, відповідно) та викликає тенденцію до зниження рівня відновленого глутатіону і активності глутатіон-S-трансферази. Кореляційним аналізом виявлено, що у голодуючих щурів маркерні активності Р4502Е1 (анілін- та пара-нітрофенолгідроксилаза) тісно корелюють (r=0,59 -0,69) з активацією процесів кетогенезу (кетонові тіла), глюконеогенезу (активність глюкозо-6-фосфатази), ліполізу (вільні жирні кислоти) і глікогенолізу. Еритроміцин-N-деметилаза активність виявляла слабший зв’язок з цими показниками. Ацетанілідгідроксилазна, метопролол-О-деметилазна активності виявляли залежність лише від рівня кетонових тіл, а індометацин-О-деметилазна активність вірогідно корелювала з вмістом кетонових тіл, вільних жирних кислот та глікогену. Активність УДФ-глюкуронілтрансферази і фенолсульфотрансферази вірогідно корелює з рівнем кетонових тіл, а вміст глюкуронідів та сульфатів та активність N-ацетилтрансферази – крім того з рівнем жирних кислот, глікогену та активністю глюкозо-6-фосфатази. Активність глутатіон-S-трансферази та вміст глутатіону корелювали з рівнем жирних кислот, кетонових тіл та активністю глюкозо-6-фосфатази. < Oe O U th > j l v ae ae Ue

TH

th

`„

”y!

”y!

]„Cy^„Cy`„

ин-О-деметилазна активності під впливом фенобарбіталу зростали в межах
19-40%, а амідопірин-N-деметилазна та еритроміцин-N-деметилазна
активності — на 87 та 74%. INOD’AIL слабко впливав на зазначені
активності і вірогідно стимулював лише амідопірин- та
еритроміцин-N-деметилазні активності.

Під впливом фенобарбіталу та INOD’AIL в печінці в 1,6 та 1,7 рази
зростає активність УДФ-глюкуронілтрансферази, на 28 і 39% підвищується
активність фенолсульфотрансферази, на 37 та 54% зростає активність
глутатіон-S-трансферази. Фенобарбітал зменшує на 16% вміст відновленого
глутатіону в печінці, а INOD’AIL, навпаки підвищує його вміст на 14%.

В дослідах з використанням специфічних інгібіторів (орфенадріну,
триптаміну, хлорамфеніколу, диклофенаку, хінідину, тролеандоміцину,
кетоконазолу, діетилдітіокарбамату та диметилсульфоксиду) показано, що в
умовах голодування та введення ацетону переважно індукувались
монооксигеназні активності залежні від P4502Е1 та P4503А, а в умовах
індукції фенобарбіталом – активності, пов’язані переважно з підродинами
Р4502В, P4503А та частково з Р4502С і Р4501А2. ССl4-залежна пероксидація
ліпідів мікросом виявляє найбільший зв’язок з Р4502Е1, індукція якого
обумовлює приріст ССl4-залежної пероксидації в умовах голодування та
введення ацетону, але не фенобарбіталу.

Вплив голодування проявляється також і змінами в біотрансформації
модельних речовин в цілісному організмі (табл. 2). Голодування стимулює
ацетилування сульфадимезину, що проявляється зростанням екскреції з
сечею ацетилсульфадимезину. Введення ацетону суттєво не впливає на
метаболізм сульфадимезину, а фенобарбітал та INOD’AIL посилюють його.
Голодування стимулює на 31% перетворення амідопірину в 4-аміноантипірин
і стимулює ацетилування останнього (на 47%).

Таблиця 2

Вплив голодування, ацетону, фенобарбіталу та INOD’AIL на екскрецію з
сечею щурів метаболітів сульфадимезину, амідопірину, ацетаніліду та
толуолу (M(m)

Метаболіти в сечі за 12 годин, мкмоль/100 г маси щурів Контроль,

n=10 Голодуван-ня, 3 день,

n=10 Ацетон, 1000 мг/кг

n=10 Фенобарбітал, 70 мг/кг, n=8 INOD’AIL,

400 мг/кг,

n=9

Сульфадимезин ввели в дозі 36 мкмоль на 100 г маси щура

Вільний сульфадимезин 5,09(0,21 6,08(0,39 6,10(0,44 5,46(0,58 5,58(0,68

Ацетилсульфадимезин 3,69(0,16 7,56(0,65* 3,62(0,43 5,95(0,47* 6,24(0,70*

Загальний сульфадимезин 8,78(0,33 13,6(0,89* 9,72(0,84 11,4(1,02*
11,8(1,34*

Амідопірин ввели в дозі 12,8 мкмоль на 100г маси щура

Вільний 4-аміноантипірин 1,12(0,05 0,94(0,07 2,06(0,08* 1,36(0,05*
1,01(0,07

Ацетил-4-аміноантипірин 3,46(0,15 5,10(0,19* 4,36(0,26* 5,58(0,29*
4,96(0,17*

Загальний 4-аміноантипірин 4,58(0,15 6,04(0,24* 6,42(0,26* 6,93(0,29*
5,97(0,19*

Ацетанілід ввели в дозі 74 мкмоль на 100 г маси щура

Всі метаболіти ацетаніліду 58,5(2,27 53,0(1,29 56,3(1,39 65,9(1,32*
62,5(1,14*

Всі амінофеноли 41,7(1,50 32,0(0,88* 37,4(1,14* 52,3(1,28* 46,9(1,26*

Сума аніліну та ацетаніліду 16,8(1,16 21,2(1,22* 18,9(0,83 13,5(0,86*
15,6(1,01

Некон’юговані амінофеноли 2,48(0,13 6,76(0,34* 4,47(0,21*
3,53(0,16* 1,43(0,11*

Глюкуроніди амінофенолів 21,5(0,81 15,0(0,59* 17,0(0,82* 24,7(0,74*
27,6(0,99*

Сульфати амінофенолів 16,2(0,97 10,0(0,62* 12,2(0,65* 18,7(0,48*
18,8(0,83*

Меркаптуратні метаболіти 1,55(0,24 7,05(0,56* 7,92(0,56* 6,20(0,53*
1,05(0,15*

Толуол ввели в дозі 109 мкмоль на 100 г маси щура

Всі метаболіти 54,5(4,24 85,9(3,53* 97,1(2,85* 86,4(2,36* 50,0(1,98*

Гіпурова кислота 53,9(4,19 85,6(3,52* 96,6(2,83* 85,6(2,36* 49,2(1,95*

Крезоли 0,63(0,06 0,31(0,01* 0,49(0,03* 0,85(0,05* 0,77(0,04*

Примітка. “*” — вірогідні відмінності щодо контролю р<0,05. Ацетон посилював метаболізм амідопірину до 4-аміноантипірину (на 40%), хоча і не стимулює кон’югацію останнього з оцтовою кислотою. Фенобарбітал посилює метаболізм амідопірину (на 56%) і кон’югацію 4-аміноантипірину (на 38%) з оцтовою кислотою. Препарат INOD'AIL на 35% стимулює перетворення амідопірину до 4-аміноантипірину і посилює кон’югацію останнього з оцтовою кислотою (на 41%). Під впливом голодування падає інтенсивність ароматичного гідроксилювання ацетаніліду і знижується на 22% екскреція амінофенольних метаболітів і зростає частка неметаболізованого ацетаніліду. Голодування ослаблює кон’югацію з глюкуроновою кислотою і сульфатом, в наслідок чого є зростає екскреція вільних амінофенолів на 174% та падає виведення глюкуронідних та сульфатних метаболітів на 33 і 36%. Однак, активується залежне від Р4502Е1 утворення токсичного N-ацетил-пара-бензохіноніміну і екскреція меркаптурових кислот з сечею зростає в 4,27 рази. Вплив ацетону на метаболізм ацетаніліду подібний до голодування. Гальмується ароматичне гідроксилювання, але посилюється N-гідроксилювання, пригнічуються процеси кон’югації з глюкуроновою кислотою та сульфатом. Вплив фенобарбіталу на метаболізм ацетаніліду є подібним до такого у ацетону лише в частині активації утворення амінофенольних метаболітів та меркаптурових кислот, але на відміну від ацетону фенобарбітал дещо стимулював кон’югацію амінофенолів з сульфатом та глюкуроновою кислотою. Однак, ІNOD'AIL гальмував каталізоване Р450 2Е1 утворення токсичних метаболітів ацетаніліду і зменшував екскрецію меркаптурових кислот в 1,5 рази, дещо стимулював гідроксилювання ацетаніліду до амінофенольних метаболітів та кон`югацію останніх з глюкуроновою кислотою та сульфатом. Голодування активує метаболізм толуолу по шляху метилгідроксилювання (яке започатковується Р4502E1 і завершується утворенням гіпурової кислоти), але гальмує залежне від CYP2C гідроксилювання толуолу до крезолів. Це проявилось зростанням екскреції гіпурової кислоти на 57% і зменшенням виведення крезолів на 49%. Введення ацетону відтворює індуковані голодуванням зміни метаболізму толуолу, тоді як фенобарбітал стимулюючи на 59% утворення гіпурової кислоти, одночасно підвищує продукцію крезолів на 25%. Препарат ІNOD'AIL гальмує утворення гіпурової кислоти з толуолу, але стимулює гідроксилювання толуолу до крезольних метаболітів. Введення щурам субстратів кон’югації - сульфату натрію та особливо УДФ-глюкози зменшує викликані голодуванням зміни метаболізму сульфадимезину, амідопірину, ацетаніліду та толуолу, спрямовуючи їх метаболізм в сторону посилення утворення глюкуронідних та сульфатних кон’югатів. Голодування гальмує елімінацію з плазми крові щурів індометацину (метаболічний кліренс індометацину визначається каталізованою Р4502С реакцією О-деметилювання та кон’югацією з глюкуроновою кислотою). У голодуючих тварин період напіввиведення незміненої форми індометацину зростав на 89%, площа під фармакологічною кривою - на 36%, середній час утримання препарату в крові - на 78%, а кліренс індометацину падав на 26%. Введення УДФ- глюкози зменшувало виразність затримки елімінації індометацину. Знайдена тісна кореляційна залежність між активністю Р4502Е1 та токсичністю бромбензолу і CCl4. Здатність токсикантів пошкоджувати гепатоцити прямо корелює з маркерами Р4502E1 активністю анілінгідроксилази та пара-нітрофенолгідроксилази. Провідна роль Р450 підтверджується і в умовах цілісного організму. Так, щурі з високою здатністю до перетворення ацетаніліду до меркаптурових кислот (реакція започатковується Р4502Е1) виявились більш чутливими до гепатотоксичної дії бромбензолу та CCl4. Натомість висока активність УДФ-глюкуронілтрансферази та фенолсульфотрансферази в гепатоцитах, та більша здатність щурів до кон’югації амінофенольних метаболітів ацетаніліду з глюкуроновою кислотою та сульфатом, пов’язана зі зменшенням токсичної дії бромбензолу на печінку. Виявилось, що голодування, а особливо введення ацетону та фенобарбіталу, значно підсилює гепатотоксичну дію бромбензолу та CCl4, а введення щурам INOD'AIL, навпаки, зменшує її (табл. 3). В цих умовах значно зростала кількість клітин, які профарбовувались трипановим синім, різко зменшувалась концентрація глутатіону в гепатоцитах, зростав вихід внутрішньоклітинного ферменту лактатдегідрогенази в інкубаційне середовище Інгібітори цитохрому Р4502Е1 - діетилдітіокарбамат та диметилсульфоксид, при попередньому введенні щурам, суттєво зменшують пошкоджуючу дію бромбензолу та CCl4 щодо ізольованих гепатоцитів, тоді як інгібітори Р4502В та Р4503А, хлорамфенікол та кетоконазол мало впливають на геаптотоксичність бромбензолу і CCl4,. Отже саме активність цитохрому Р4502Е1 в найбільшій мірі є відповідальною за токсифікацію тетрахлоретану та бромбензолу. Ці висновки знайшли підтвердження in vivo (табл. 4). Голодування щурів значно підсилює токсичну дія бромбензолу щодо печінки, легень та нирок, яку оцінювали за зростанням активності аланінамінотрансферази (АлАТ) та аспартатамінотрансферази (АсАТ) в сироватці крові, падінням вмісту відновленого глутатіону (GSH) в печінці, за виходом в рідину бронхоальвеолярного лаважу глутатіон-S-трансферази (ГТФ) та гама-глутамілтрансферази (ГГТФ), за зростанням концентрації білку та активності гама-глутамілтрансферази ГГТФ) та підвищенням рівня креатиніну в сироватці крові. Ще більше токсичність бромбензолу підвищується під впливом ацетону та фенобарбіталу. Введення щурам препарату INOD'AIL суттєво зменшує гепато-, пульмо та нефротоксичні ефекти бромбензолу. Протекторною активністю володіє також діетилдітіокарбамат, який зменшує пошкоджуючу дію бромбензолу щодо печінки, легень та нирок, ще більше, ніж INOD'AIL. Введення УДФ-глюкози зменшувало токсичність бромбензолу в меншій мірі, ніж діетилдітіокарбамат та препарат INOD'AIL. Таблиця 3 Вплив голодування, ацетону, фенобарбіталу та препарату INOD'AIL на токсичність CCl4 та бромбензолу щодо ізольованих гепатоцитів (n=5, M(m) Умови досліду Контроль Голодування Ацетон Фенобарбітал INOD'AIL Кількість клітин профарбованих трипановим синім, % Інтактні клітини 19,6±1,5 26,0±2,8 31,6±2,4 29,8±1,7 16,2±1,5 Бромбензол, 0,6 мМ 38,7±2,7 100% 48,9±3,6* 126% 65,4±4,3* 169% 61,0±3,9* 158% 22,4±1,9* 61% CCl4, 0,6 мМ 43,9±3,2 100% 54,4±3,0* 124% 71,2±2,8* 162% 64,2±4,1* 146% 23,0±1,9* 50% Вихід лактатдегідрогенази в інкубаційне середовище, в % Інтактні клітини 138±3,2 140±6,4 150±7,9 147±5,2 139±6,6 Бромбензол 202±9,4 100% 250±12* 124% 272±15* 135% 243±11* 120% 140±6,9* 64% CCl4 210±12 100% 280±15* 133% 306±15* 146% 278±17* 132% 163±7,1* 69% Відновлений глутатіон, нмоль на 1 млн клітин Інтактні клітини 30,3±1,4 26,8±2,1 28,2±1,7 33,8±1,9 38,4±2,1 Бромбензол, 0,6 мМ 15,9±1,2 100% 12,0±0,86* 75% 9,6±0,64* 60% 12,6±0,86* 79% 31,2±1,2* 188% CCl4, 0,6 мМ 22,3±1,2 100% 17,6±1,1 79% 14,0±0,86 63% 17,8±1,1 80% 34,2±1,7* 155% Примітка. “*” - вірогідні відмінності щодо контролю р<0,05. Таблиця 4 Вплив голодування, ацетону, фенобарбіталу та препарату INOD'AIL на гепато-, пульмо- та нефротоксичність бромбензолу (n= 8-9, M(m) Показники Контроль Бромбен-зол Бромбензол + Голодуван-ня Ацетон Фенобарбі-тал INOD'AL Показники гепатотоксичності АлАТ сироватки, мкмоль/л/год 0,49±0,06 1,95±0,15 2,86±0,23* 3,42±0,20* 2,63±0,22* 0,97±0,08* АсАТ сироват-ки, мкмоль/л/год 0,56±0,07 2,28±0,19 3,24±0,25* 3,84±0,21* 2,96±0,23* 1,09±0,08* GSH печінки, мкмоль/г 6,65±0,40 2,20±0,20 1,37±0,13* 0,99±0,15* 1,52±0,18* 4,15±0,22* Показники пульмотоксичності (рідина бронхоальвеолярного лаважу) Білок, мг/л 6,79±0,45 13,3±0,61 16,7±0,75* 18,5±0,68* 15,3±0,69* 10,6±0,34* ГТФ, нмоль/хв 0,32±0,05 0,94±0,04 1,10±0,04* 1,24±0,05* 1,08±0,04* 0,62±0,04* ГГТФ, нмоль/хв/л 0,25±0,04 0,75±0,06 0,92±0,03* 1,08±0,05* 0,89±0,03* 0,51±0,03* Показники нефротоксичності Білок сечі, мг/мл 5,89±0,86 11,7±0,84 17,1±1,08* 18,9±1,03* 15,0±1,06* 8,80±0,60* ГГТФ сечі, нмоль/хв/мл 1,09±0,14 3,44±0,25 4,67±0,21* 5,03±0,25* 4,22±0,22* 1,93±0,15* Креатинін сироватки, мкмоль/л 72,0±4,57 107,8±2,8 116,8±3,9 119,8±4,4* 112,0±4,0 93,9±3,2* Примітка. “*” - вірогідні відмінності щодо групи “бромбензол” р<0,05. Таким чином, отримані нами дані свідчать, що голодування викликає у щурів активацію Р4502E1-залежних етапів біотрансформації ксенобіотиків, але обмежує здатність організму до кон’югації ксенобіотиків з глюкуроновою кислотою, сульфатом та глутатіоном, що веде до зростання токсичності ксенобіотиків, які утворюють токсичні метаболіти. Ці ефекти голодування тісно корелюють з посиленням у голодуючих тварин процесів глюконеогенезу та кетогенезу, а введення ацетону значною мірою імітує зміни в біотрансформації та токсичності ксенобіотиків, викликані голодуванням. Введення ацетону імітує ефекти голодування, а активності, що індукуються ацетоном та голодуванням, не відрізняються за відношенням до інгібіторів ізоферментів цитохрому Р450. Інгібітори Р4502Е1 зменшують, а індуктори посилюють токсичність бромбензолу та тетрахлорметану. Оптимальною протекторною дією володіє препарат часнику INOD'AIL, який гальмує залежну від Р4502Е1 токсифікацію ксенобіотиків, але посилює їх детоксикацію через кон’югаційні механізми. ВИСНОВКИ У дисертації узагальнено експериментальні дані, які свідчать про системний вплив голодування на процеси біотрансформації ксенобіотиків. Обґрунтовані нові підходи до підвищення опору організму до токсичної дії ксенобіотиків – субстратів цитохрому Р4502Е1 на основі використання препаратів, здатних впливати на активність метаболізуючих ферментів. Голодування посилює каталізовані цитохромом Р4502E1 анілін- та пара-нітрофенолгідроксилазні активності в печінці, нирках та легенях щурів, активує залежну від цитохрому Р4503А еритроміцин-N-деметилазну активність, але знижує метопролол-О- і індометацин-О-деметилазні та ацетанілідгідроксилазну активності, залежні, відповідно, від Р4502D, 2C, 1A2. Виразність цих змін корелює зі ступенем активації процесів глюконеогенезу, ліполізу і кетогенезу. Введення ацетону значною мірою імітує індуковані зміни в активності ферментів, а монооксигеназні активності, що індукуються голодуванням та ацетоном, не відрізняються між собою за відношенням до ізоферментних специфічних інгібіторів. Фенобарбітал менше, ніж ацетон чи голодування підвищує активність цитохрому Р4502Е1, але більше стимулює активності асоційовані з Р4503А, і не гальмує, а посилює активності ізоформ Р4501A2, 2С, 2D. Монооксигеназні активності індуковані фенобарбіталом, за чутливістю до специфічних інгібіторів значно відрізняються від таких, що індукуються голодуванням та ацетоном. Препарат INOD'AIL пригнічує активності каталізовані Р4502Е1 і мало впливає на інші ізоформи цитохрому Р450. Голодування обмежує здатність організму до кон’югації ксенобіотиків з глюкуроновою кислотою, сульфатом та глутатіоном, що є наслідком падіння активності УДФ-глюкуронілтрансферази, фенолсульфотрансферази, глутатіон-S-трансферази в печінці, але збільшує вміст КоА в печінці та посилює активність N-ацетилтрансферази. Введення ацетону пригнічує процеси кон’югації з глюкуроновою кислотою, сульфатом та глутатіоном і знижує активність УДФ-глюкуронілтрансферази, фенолсульфотрансферази, глутатіон-S-трансферази, тоді як фенобарбітал і особливо препарат часнику стимулює ферментні системи кон’югації. Голодування та введення ацетону активують Р4502E1-залежні етапи біотрансформації ацетаніліду, бромбензолу та толуолу, що проявляється посиленням екскреції з сечею меркаптурових кислот та гіпурової кислоти; гальмують Р4502С–залежне гідроксилювання толуолу, що проявляється зменшенням екскреції крезолів; посилюють Р4503А-залежний метаболізм амідопірину та екскрецію 4-аміноантипірину; гальмують залежне від Р4501A2 гідроксилювання ацетаніліду до парацетамолу. Фенобарбітал та препарат INOD'AIL посилюють процеси кон’югації з оцтовою кислотою, що супроводжується посиленням екскреції з сечею ацетильованих сульфадимезину та 4-аміноантипірину; стимулює реакції кон’югацію з глюкуроновою та сірчаною кислотами, що проявляється зростанням екскреції глюкуронідних та сульфатних метаболітів ацетаніліду та бромбензолу. Голодування, введення ацетону та фенобарбіталу посилює гепатотоксичність тетрахлорметану та токсичні ефекти бромбензолу щодо печінки, нирок і легенів, що є наслідком активації залежних від Р4502E1 реакцій утворення токсичних метаболітів та гальмування шляхів, пов’язаних з кон’югацією цих метаболітів з глюкуроновою кислотою та сульфатом. Зменшення токсичного впливу бромбензолу досягається шляхом профілактичного застосування інгібіторів Р4502Е1 (діетилдітіокарбамату та диметилсульфоксиду), субстратів кон’югації (УДФ-глюкози та сульфату натрію) та препарату часнику, які гальмують ССl4-залежну пероксидацію ліпідів мікросом, утворення токсичних метаболітів бромбензолу, а препарат часнику, крім того, ще і посилює кон’югацію токсичних метаболітів бромбензолу з глюкуроновою кислотою та сульфатом. ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Качула С.О. Вплив голодування та УДФ-глюкози на кінетику елімінації індометацину з плазми крові щурів та маркерні активності цитохрому Р450 2С і активність УДФ-глюкуронілтрансферази в печінці // Вісник Вінницького державного медичного університету.- 2003.- №2.2.- С.648-651. Качула С.О. Вплив ацетону, фенобарбіталу та препарату INOD'AIL на токсичність бромбензолу і тетрахлорметану та біотрансформацію бромбензолу у щурів // Медична хімія.- 2003.- Т.5. №4.- С.46-50. Качула С.О., Пентюк О.О. Вплив голодування щурів та ацетону на ферментні системи біотрансформації та токсичність ксенобіотиків - субстратів CYP2E1 //Укр. біохім. журн.- 2004.- Т.76.- № 1.- С.114- 123. [Здобувачем виконана експериментальна частина роботи]. Качула С.О., Герич О.Х., Пентюк О.О. Вплив інгібіторів на активність метаболізуючих ферментів і токсичність бромбензолу та тетрахлорметану у щурів // Медична хімія.- 2004.- Т.6.- №1.- С.14-19. [Здобувач дослідив вплив інгібіторів на моделях голодування та введення ацетону]. Качула С.А., Пентюк А.А., Тертышная Е.В., Вовк О.Г. Изучение взаимосвязи гепатотоксического действия бромбензола и маркерных активностей цитохрома P450 и ферментов конъюгации // Современные проблемы токсикологии.- 2002.- №2.- С.40-44. [Здобувачем виконана вся експериментальна частина роботи та взята участь в обговоренні]. Пентюк О.О., Андреев А.П., Блажієвська Г.Й., Качула С.А., Коваленко Є.М., Полеся Т.А., Паламарчук О.В., Сокур С.О., Григор’янц В.Г. Вплив гіперкетонемії на маркерні активності ізоформ цитохрому Р-450 та гепатотоксичність тетрахлорметану, парацетамолу та гідразину // Ліки.- 1999.- №2. - С. 72-75. [Здобувачем дослідив вплив гіперкетонемії на активність ізоформ цитохрому Р450 та токсичність тетрахлорметану]. Деклараційний патент на винахід № 64515 А, Україна, МПК 7 G01N30/22. Спосіб визначення концентрації індометацину в біологічних рідинах / Качула С.О., Пентюк О.О., Ільченко О.В., Волощук Н.І. - № заявки 2003065692; заявл. 19.06.2003; опубл. 16.02.2004; бюл.№2. [Здобувачем дана оцінка методу при вивченні фармакокінетики індометацину]. Вплив гіперкетонемії та фенобарбіталу на вміст відновленого глутатіону в ізольованих гепатоцитах щурів при їх інкубації з тетрахлорметаном, парацетамолом та гідразином / Григор’янц В.Г., Сокур С.О., Мороз Л.В., Качула С.А., Коваленко Є.М., Дмітрієва К.Ю., Істошин В.М., Пентюк О.О. // Українська наукова конф. з міжнародною участю “Актуальні проблеми клінічної фармакології”.- Вінниця,1998.- С.234-235. Вплив патологічних станів, що супроводжуються гіперкетонемією, на маркерну активність CYP2Е1, метаболізм та токсичність його субстратів / Качула С.О., Штатько О.І., Борисенко Б.О., Смірнова О.В., Сливка О.Я. // Матеріали VIII Українського біохімічного з’їзду, м.Чернівці, 2002.- Укр. біохім. журн. – 2002. – Т.74.- № 4а (додаток 1) - С.138. 10.Роль метаболізуючих ферментів у гепатотоксичності лікарських засобів та модельних ксенобіотиків / Пентюк О.О., Личик Г.З., Тертишна О.В., Паламарчук О.В., Качула С.О., Полеся Т.Л., Дудник В.М. // Матеріали ІІ Національного з'їзду Фармакологів України.- Дніпропетровськ, 2001.- С.189. АНОТАЦІЯ Качула С.О. Метаболізм ксенобіотиків- субстратів цитохрому Р450 в умовах голодування, введення індукторів та інгібіторів. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія.- Інститут геронтології АМН України, Київ, 2004 р. В роботі доведено, що під час голодування в печінці, легенях та нирках щурів зростають активності цитохромів Р4502Е1 та 3А, але знижуються активності цитохромів Р4502D, 2C, 1A2, УДФ-глюкуронілтрансферази, фенолсульфотрансферази і глутатіон-S-трансферази. Голодування посилює Р4502E1-залежні етапи метаболізму ацетаніліду, бромбензолу, толуолу, але гальмує залежні від Р4502С реакції метаболізму толуолу і індометацину. Ці зміни корелюють з активацією процесів глюконеогенезу, ліполізу та кетогенезу. Введення ацетону імітує ефекти голодування, а активності, що індукуються ацетоном та голодуванням, не відрізняються за відношенням до інгібіторів ізоферментів цитохрому Р450. Голодування, введення ацетону та фенобарбіталу посилюють гепато-, нефро- та пульмотоксичність бромбензолу і CCl4, а субстрати кон’югації (УДФ-глюкоза, сульфат натрію), інгібітори P4502E1 (діетилдітіокарбамат та диметилсульфоксид) - знижують. Препарат часнику INOD'AIL володіє протекторними властивостями, які обумовлені гальмуванням залежної від Р4502Е1 токсифікації ксенобіотиків та посиленням їх детоксикації через кон’югаційні механізми. Ключові слова: цитохром Р450, біотрансформація, токсичність, бромбензол, тетрахлорметан, фенобарбітал, препарат часнику INOD'AIL. Качула С.А. Метаболизм ксенобиотиков- субстратов цитохрома Р450 в условиях голодания, введения индукторов и ингибиторов.– Рукопись. Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.04 – биохимия.- Институт геронтологии АМН Украины, Киев, 2004 г. Диссертация посвящена изучению в эксперименте на крысах влияния голодания на систему биотрансформации ксенобиотиков, а также выяснению механизмов изменения метаболизма и токсичности ксенобиотиков при голодании, введении ингибиторов и индукторов метаболизирующих ферментов и разработке подходов к коррекции токсичности ксенобиотиков-субстратов цитохрома Р4502Е1. Голодание и введение ацетона стимулирует монооксигеназные активности, зависимые от цитохрома Р450 2E1 и 3А в печени, почках и легких крыс, но снижают активности, катализируемые P4502D, P4502C, P4501A2 и активность ферментов конъюгации (УДФ-глюкуронилтрансферазы, фенолсульфотрансферазы, глутатион-S-трансферазы). Голодание приводит к снижению в печени уровня субстратов конъюгации – глюкуронидов и сульфатов, но стимулирует накопление КоА и повышает активность N-ацетилтрансферазы в печени. Индуцированные голоданием изменения активности метаболизирующих ферментов тесно коррелируют со степенью активации процессов глюконеогенеза, липолиза и кетогенеза, а введенние животным ацетона имитирует изменения активности ферментов, вызванные голоданием. На основе использования ингибиторов специфичных к изоформам цитохрома Р450 (орфенандрин, триптамин, диклофенак, хинидин, тролеандомицин, кетоконазол, диэтилдитиокарбамат, диметилсульфоксид) установлено, что профиль монооксигеназных активностей индуцированных ацетоном практически идентичен таковому, который индуцируется при голодании, но сильно отличается от такового, возникающего под влиянием плейотропного индуктора фенобарбитала. Влияние препарата чеснока INOD'AIL отличается своеобразием. Препарат подавляет активность цитохрома P4502E1, но стимулирует активность цитохромов P4501А2, P4502С, P4502D, УДФ-глюкуронилтрансферазы, фенолсульфотрансферазы, глутатион-S-трансферазы).. Голодание и введение ацетона усиливают зависимые от P4502Е1 реакции метаболизма ацетанилида и толуола, зависимую от Р4503А реакцию N-деметилирования амидопирина, но тормозят зависимые от P4502C биотрансформацию индометацина и образование крезольных метаболитов толуола, снижают катализированную P4501А2 реакцию гидроксилирования ацетанилида к пара-аминофенолу и конъюгацию последнего с глюкуроновой и серной кислотами. Голодание усиливает коньюгацию метаболитов сульфадимезина и амидопирина с уксусной кислотой, в то время как ацетон подавляет ее. Фенобарбитал активирует зависимые от P4502E1 реакции метаболизма толуола, ацетанилида, бромбензола, но в отличие от голодания или ацетона, не тормозит, а активирует зависимое от P4502С образование крезольных метаболитов толуола и катализированое P4501А2 гидроксилирование ацетанилида к пара-аминофенольным метаболитам и конъюгацию последних с глюкуроновой кислотой и сульфатом. Препарат INOD'AIL тормозит катализированное P4502E1 образование токсических метаболитов ацетанилида и толуола, стимулирует зависимую от P4503А реакцию образования 4-аминоантипирина и осуществляемую P4502С реакцию образования крезольных метаболитов толуола и значительно усиливает реакции коньюгации аминофенольных метаболитов ацетанилида с глюкуроновой и серной кислотами. Гепатотоксическое действие бромбензола и тетрахлорметана проявляется снижением жизнеспособности изолированных гепатоцитов (оцениваемую за поглощением клетками трипанового синего, снижением уровня восстановленного глутатиона, выходом лактатдегидрогеназы в инкубационную среду), увеличением активности трансаминаз в крови, уменьшением содержания восстановленного глутатиона в печени. Пульмотоксичность бромбензола проявляется увеличением содержания белка, активности глутатионтрансферазы и гамма-глутамилтрансферазы в жидкости лаваша легких, а его нефротоксичность - увеличением содержание белка и гамма-глутамилтрансферазы в моче и уровня креатинина в крови. Голодание, ацетон и фенобарбитал усиливают повреждающее действие тетрахлорметана и бромбензола в отношении изолированных гепатоцитов, усиливают гепато-, нефро- и пульмотоксичность бромбензола в опытах in vivo. Установлено, что механизм потенцирующего действия голодания и ацетона на токсичность ксенобиотиков, состоит в их способности индуцировать активность цитохрома Р4502E1, при одновременном угнетении активности процессов конъюгации с глюкуроновой кислотой и сульфатом. Это имеет следствием усиление образования токсичных метаболитов бромбензола и ослабление их детоксикации через механизмы конъюгации. Фенобарбитал повышает активность P4502E1, но, одновременно стимулирует активность ферментов конъюгации, поэтому по способности усиливать токсичность тетрахлорметана и бромбензола он уступает действию голодания и ацетона. Препарат INOD'AIL эффективно противодействует токсическим эффектам тетрахлорметана и бромбензола, что объясняется его способностью тормозить активность цитохрома Р4502Е1 и одновременно усиливать активность ферментов конъюгации. Существенные протекторные свойства выявлены у ингибиторов Р4502Е1 диэтилдитиокарбамата и диметилсульфоксида, субстратов конъюгации (УДФ-глюкозы и сульфата натрия). Эти вещества в значительной мере снижали гепатотоксичность тетрахлорметана и токсическое действие бромбензола на печень, легкие и почки. Eeth/aaua neiaa: oeeoio?ii ?450, aeio?ainoi?iaoeey, oiene/iinoue, a?iiaaicie, oao?aoei?iaoai, oaiiaa?aeoae, i?aia?ao /aniiea. Каchula S.О. The methabolism of xenobiotics - the substrates of cytochrome Р450 in conditions of starvation and administration of inductors and inhibitors. - Manuscript. Dissertation on the scientific degree of the candidate of medical sciences, speciality 03.00.04 - biochemistry.- Institute of Gerontology of Academy Medical Science of Ukraine, Kyiv, 2004. In this work is postulated, that activities of cytochromes Р4502Е1 and 3А, during a starvation in a liver, lungs and kidneys of rats increases, but the activity of cytochromes Р4502D, 2C, 1A2, UDP-glucuronosyltransferase, phenolsulfotransferase and glutathione-S-transferase are reduced. The starvation enhances Р4502E1-dependent stages of a methabolism of acetanilide, bromobenzene, toluene, but inhibits Р4502С- dependent reactions of a metabolism of toluene and indomethacin. These changes correlate with activation of gluconeogenesis, lipolysis and ketogenesis. The administration of acetone imitates the effects of a starvation, but activities, which are induced by acetone and starvation, do not differ from concerning inhibitors of cytochrome Р450 isoenzymes. Starvation, as well as the administration of acetone and phenobarbital enhance hepato-, nephro- and pulmotoxicity of bromobenzene and CCl4, but substrates of conjugation (UDP-glucosae, sodium sulfate) and the inhibitors P4502E1 (diethyldithiocarbamate and dimethyl sulfoxide) – decrease them. The drug of garlic - INOD'AIL has protective abilities, which are stipulated by inhibition Р4502Е1-dependent on amplification the toxicity of xenobiotics and their detoxication by means of conjugation. Key words: cytochrome Р450, biotransformation, toxicity, bromobenzene, carbon tetrachloride, phenobarbital, drug of a garlic INOD'AIL.

Похожие записи