СЕВАСТОПОЛЬСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ ТЕХНІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ЕРНАНДЕС САНТЬЯГО Адріан Аполінар

УДК 577.113:541.49

Механізми взаємодії та конкурентного зв’язування з днк ароматичних
антипухлинних препаратів

03.00.02 – біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Севастополь – 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Севастопольському національному технічному
університеті Міністерства освіти і науки України.

доктор фізико-математичних наук,

професор Веселков Олексій Никонович,

Севастопольський національний технічний університет, завідувач кафедри
фізики.

Офіційні опоненти:

доктор фізико-математичних наук, професор Семенов Михайло Олексійович,
Інститут радіофізики та електроники НАН України, старший науковий
співробітник (м. Харьків);

кандидат біологічних наук, доцент Гаташ Сергій Васильович, Харківський
національний університет ім. В.Н. Каразіна МОН України, доцент кафедри
медичної та біологічної фізики, (м. Харьків).

Провідна установа

Київський національний університет ім. Т.Г. Шевченка, кафедра біофізики,
м. Київ.

Захист відбудеться 16.06.2006 р. о _15___ годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради К 50.052.05 у Севастопольському
національному технічному університеті, за адресою: 99053 м. Севастополь,
Студмістечко.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Севастопольського
національного технічного університету за адресою:

99053, м. Севастополь, Студмістечко.

Автореферат розісланий 14.05.2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Євстигнєєв М.П.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У цей час широке застосування в хіміотерапії ракових
захворювань одержали біологічно активні сполуки, які відносяться до
класу ароматичних молекул, загальною структурною особливістю яких є
наявність плоского гетероциклічного ароматичного хромофора. До
зазначеної групи антипухлинних препаратів належать такі високоефективні
ароматичні антибіотики як дауноміцин (DAU), актиноміцин D (AMD),
мітоксантрон (NOV), ногаламіцин (NOG) та ін., а також перспективна група
синтетичних препаратів, утворених сполученням двох однакових або різних
ароматичних хромофорів за допомогою линкера певної довжини.

Клінічне використання ароматичних антибіотиків у більшості випадків
супроводжується небажаними побічними ефектами, зокрема, високою
токсичністю. Одним з розповсюджених засобів зниження токсичності, або
посилення медико-біологічного ефекту є комбінація ароматичних препаратів
у дозі, що складає основу сучасної стратегії комбінованої хіміотерапії
ракових захворювань. Існує ряд свідчень про високу ефективність
комбінації DAU-AMD для лікування саркоми, DAU-NOV для лікування раку
груди та ін. Слід також зазначити позитивний ефект комбінованої терапії
для подолання деяких форм резистентності пухлин до дії монотерапії, які
розвиваються при тривалому введенні в організм одного типу антипухлиного
препарату.

У цей час не існує розуміння спостережуваного медико-біологічного
синергизму ароматичних антибіотиків, окрім спроб інтерпретації цих
ефектів або на молекулярному, або на клітинному рівнях. У той же час
відомо, що ароматичні антипухлинні препарати діють головним чином шляхом
комплексоутворення з ядерною ДНК. Також існує ряд свідчень того, що
різні ароматичні сполуки в суміші із ДНК, можуть утворювати комплекси
одна з другою у розчині (гетероасоціація) і конкурувати за місця посадки
на ДНК. Гетероасоціація й конкуренція за зв’язування із ДНК вважаються
базовими молекулярними механізмами зміни токсичності ароматичних
антибіотиків у присутності кофеїну й ароматичних вітамінів. Це дає
підставу припустити, що спостережуваний медико-біологічний синергизм
комбінації ароматичних антипухлинних препаратів може бути пов’язаним як
із процесами безпосередньої взаємодії між ними в розчині (асоціація),
так і з конкуренцією за біологічний рецептор. У зв’язку із цим
з’ясування механізмів асоціації ароматичних антипухлинних сполук різної
структурної організації (моно- і біс-інтеркаляторів у ДНК) та їхнього
спільного зв’язування із ДНК мають важливе значення для інтерпретації
синергетичних ефектів при комбінованому використанні антипухлинних
лікарських засобів, а також для розробки оптимальних режимів
комбінаційної хіміотерапії.

Зв’язок дисертації з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалася в рамках держбюджетної наукової теми “Нуклеотид”
Міністерства Освіти і науки України (№ держ.реєстр. 0104U000568):
“Гідротропний і синергетичний ефекти при утворенні гетерокомплексів
ароматичних біологічно активних молекул та їх взаємодії із ДНК у водному
розчині”, 2003-2006 р.; договору про науково-технічне співробітництво на
2003-2008 р. між Беркбек коледжем Лондонського університету
(Великобританія) і СевНТУ; договору про науково-технічне співробітництво
на 2002-2007 р. між Автономним університетом м.Пуебла (Мексика) і
СевНТУ.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було установлення основних
закономірностей процесів взаємодії ароматичних антипухлинних препаратів
різної структурної організації (моно- і біс-інтеркаляторів ДНК) у
водно-сольовому розчині й з’ясування механізмів спільного
(конкурентного) зв’язування цих сполук із ДНК.

Для досягнення поставленої мети вирішувалися задачі:

Аналіз характеру фізико-хімічних взаємодій, відповідальних за процеси
асоціації молекул у водно-сольовому розчині на основі даних ЯМР
спектроскопії.

Розробка моделі трикомпонентної рівноваги антибіотик-антибіотик-ДНК і
кількісний аналіз взаємовпливу на параметри зв’язування із ДНК різних
комбінацій антибіотиків у суміші.

Об’єкт дослідження – ароматичні молекули антипухлинних антибіотиків
(дауноміцин, ногаламіцин, мітоксантрон, актиноміцин D), фенантридиновий
барвник йодистий пропідій, біс-інтеркалятор гомодимер етидія й фрагмент
ДНК – дезокситетрануклеотид 5’-d(TpGpCpА).

Предмет дослідження – молекулярні механізми асоціації ароматичних
біологічно активних молекул і їхнього конкурентного зв’язування із ДНК у
водному розчині.

Методи дослідження: одномірна (аналіз концентраційних і температурних
залежностей протонних хімічних зсувів) і двомірна (2М-TOCSY, 2М-ROESY)
гомоядерна 1H-ЯМР спектроскопія (500 МГц) – для одержання структурних і
термодинамічних параметрів комплексоутворення молекул, побудови структур
комплексів ароматичних молекул, аналізу динамічної рівноваги
молекулярних асоціатів у розчині.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше методами 1М- і 2М-ЯМР
спектроскопії проведено дослідження гетероасоціації різних антипухлинних
антибіотиків: дауноміцина з ногаламіцином і мітоксантроном, ногаламіцина
з мітоксантроном і актиноміцином D, мітоксантрона з актиноміцином D.
Визначено просторові структури 1:1 гетерокомплексів молекул і
термодинамічні параметри реакцій асоціації (рівноважна константа,
ентальпія й ентропія). Показано, що гетерокомплекси ароматичних
антибіотиків можуть додатково стабілізуватися в розчині міжмолекулярним
водневим зв’язком. Вивчено самоасоціацію біс-інтеркалятора ДНК
гомодимера етидія та його гетероасоціація з йодистим пропідієм у
водно-сольовому розчині. Визначено рівноважні константи, ентальпію й
ентропію реакцій асоціації молекул. Вперше встановлено існування
складної динамічної рівноваги молекул гомодимеру у водному розчині, що
включає утворення відкритої й закритої форм гомодимеру,
взаємно-інтеркальованих димерів і тримерів. Проаналізовано
трикомпонентну рівновагу антибіотик-антибіотик-ДНК у водному розчині для
різних комбінацій антипухлинних антибіотиків. Показано, що в
трикомпонентній суміші антибіотик-антибіотик-ДНК існує потенційна
можливість регулювання біологічної активності комбінації антибіотиків і
запропоновано засіб кількісної оцінки ефекту витиснення антибіотиків із
ДНК.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані результати й висновки
роботи можуть бути використані в області біотехнології (розробка речовин
із заданими медико-біологічними властивостями), оцінки ефективності
лікарських препаратів при їхньому комбінованому використанні, при
розробці оптимальних режимів комбінованої хіміотерапії й для інших
застосувань, пов’язаних з необхідністю обліку спільної дії біологічно
активних ароматичних речовин.

Особистий внесок здобувача: в опублікованих з співавторами наукових
працях особистий внесок здобувача полягає в наступному: у роботах
[3-6,8] – участь у розробці фізичної моделі само- та гетероасоціації
біс-інтеркалятора, в обробці експериментальних даних, в проведенні
розрахунків і написання статей; у роботах [1,2,7,9,10] – розшифровка й
віднесення сигналів протонів у двомірних спектрах розчинів досліджуваних
молекул, участь у виборі й реалізації аналітичних і обчислювальних
методів, проведення обчислювального експерименту, обговорення
результатів; у роботах [11,12] — участь у розробці методики чисельного
аналізу трикомпонентної суміші молекул, проведення розрахунків,
інтерпретація результатів.

Апробація отриманих результатів. Основні результати досліджень, що
ввійшли в дисертацію, були представлені та обговорені на: 16-й
Міжнародній школі-семінарі “Спектроскопія молекул і кристалів”,
Севастополь, Україна, 2003; об’єднаній 17-ій Європейській конференціі по
експериментальній ЯМР-спектроскопії (EENC) та 32-ій Амперівській
конференції (AMPERE), Лілль, Франція, 2004 р., 3-ій Міжнародній
конференціі “Фізика рідких середовищ: сучасні проблеми”, Київ, Україна,
2005; 5-й Харківській конференції молодих учених “Радіофізика й СВЧ
електроніка” (секц. біофізики), Харків, Україна, 2005; Всеукраїнській
науково-технічній конференції студентів, аспірантів і молодих учених
“Фізика. Біофізика — 2005”, Севастополь, Україна, 2005.

Публікації. За результатами досліджень, що ввійшли в дисертацію,
опубліковано 12 наукових праць, у тому числі 7 статей у наукових
журналах і 5 тез доповідей на міжнародних та національних наукових
конференціях.

Структура дисертації. Дисертація складається із вступу, п’яти розділів,
висновків і додатка. Повний обсяг дисертації складається з 149 с., з них
додаток займає 16 с., список використаних джерел — 195 найменувань — 14
с. Дисертація містить 31 рис. і 10 табл., у тому числі на 9 окремих
сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтована актуальність теми, сформульовані мета й завдання
дослідження, показана новизна отриманих результатів, а також практичне
значення отриманих результатів і особистий внесок здобувача.

Розділ 1 присвячений огляду літератури по темі дисертації. Розглянуто
типові ДНК моноінтеркалюючі ароматичні антипухлинні антибіотики,
використовуємі в клінічній практиці: доксорубіцин (DOX), дауноміцин
(DAU), ногаламіцин (NOG), новатрон (NOV), актиноміцин D (AMD), а також
перспективний клас ДНК біс-інтеркалюючих ароматичних агентів, що
володіють підвищеною спорідненістю й специфічністю до послідовності
підстав ДНК. Розглянуто особливості структури цих молекул і їхньої
медико-біологічної дії. Показано, що більшість ароматичних антипухлинних
антибіотиків характеризуються побічною токсичністю, яка, проте, може
бути істотно знижена, або медико-біологічний ефект посилений при
комбінуванні цих антибіотиків з іншими препаратами в дозі, і зокрема, з
різними антипухлинними ароматичними антибіотиками. З урахуванням цього
проведено огляд наявних у літературі відомостей про медико-біологічний
синергизме ароматичних речовин. Показано, що на сьогоднішній день не
існує задовільного пояснення цьому ефекту як на клітинному, так і на
молекулярному рівні, разом з тим, існують підстави думати, що
спостережуваний синергизм може бути прямо або побічно пов’язаний з
безпосередньою взаємодією молекул лікарських засобів між собою (само- і
гетероасоціація) і з нуклеіновими кислотами у фізіологічному середовищі.
У зв’язку із цим зроблено висновок про те, що вивчення закономірностей і
кількісних параметрів само-, гетероасоціації й спільного зв’язування із
ДНК ароматичних антипухлинних речовин відіграє важливу роль для
усвідомлення молекулярних механізмів синергетичного біологічного ефекту
при їхньому одночасному використанні.

Проаналізовано рівень сучасних уявлень про процеси само-,
гетероасоціації й комплексоутворення ароматичних моно- та
біс-інтеркаляторів із ДНК. Зроблено висновок про те, що найбільш
ефективним експериментальним методом для вивчення механізмів асоціації й
комплексоутворення у водному середовищі є метод ядерного магнітного
резонансу.

У розділі 2 наведені загальні відомості про спектроскопію ядерного
магнітного резонансу (ЯМР), проаналізовані основні переваги методу ЯМР,
розглянута укрупнена функціональна схема ЯМР спектрометра. Розглянуто
фізичні основи одномірної (1М) і двомірної (2М) гомоядерної
ЯМР-спектроскопії, коротко описані використовані в даній роботі
експериментальні методики COSY (TOCSY) і NOESY (ROESY), що виявляють
кореляції протонів через хімічні зв’язки й простір відповідно. Дано опис
основних експериментальних параметрів ЯМР: хімічного зсуву, константи
спин-спінової взаємодії, часів поздовжньої й поперечної релаксації.
Наприкінці розділа наведені умови експерименту, виконаного в цій роботі:
умови розчинника, параметри реєстрації 1D- 2D- 1H-ЯМР спектрів. Коротко
описана методика готування зразків.

Розділ 3 присвячений дослідженню гетероасоціації молекул ароматичних
моно-інтеркаляторів ДНК, що володіють антипухлинною активністю:
дауноміцина, ногаламіцина, новатрона й актиноміцину D. Описана
використована в роботі загальна методика проведення обчислювального
експерименту, заснована на вимірі концентраційних і температурних
залежностей протонних хімічних зсувів взаємодіючих у розчині молекул.
Дано методику побудови найбільш імовірних просторових структур 1:1
гетерокомплексів взаємодіючих молекул у водному середовищі з
використанням пакета молекулярного моделювання X-PLOR і з обліком даних
ЯМР спектроскопії.

Для аналізу експериментальних даних ЯМР використана нескінченномірна
модель молекулярної гетероасоціації речовин X і Y, що враховує реакції
утворення агрегатів (Xi, Yj) і гетерокомплексів (XiYj, YjXiYl, YjXiYl)
молекул різних типів:

, (1)

де x0(y0) і x1(y1) – загальна й мономерна концентрації молекул у
розчині; (mХ((mY), (dХ((dY) – граничний хімічний зсув й хімічний зсув в
дімере, відомі з раніше проведених експериментів по самоасоціації
речовин X і Y; KX і KY – рівноважні константи самоасоціації, також
відомі з раніше проведених експериментів; (hX((hY) і Kh – хімічні зсуви
в гетерокомплексі й рівноважна константа гетероасоціації молекул, які є
шуканими параметрами при підгонці теоретичної кривої (X((Y) (1) під
експериментальну концентраційну залежність. Вираз для хімічного зсуву
протонів речовини Y може бути отриманий з (1) шляхом заміни всіх
індексів X на Y і навпаки.

Аналіз температурних залежностей протонних хімічних зсувів також
здійснювався на підставі виразу (1), але з урахуванням апроксимації
температурної залежності рівноважних констант асоціації співвідношенням
Вант-Гоффа K(T) = exp((S/R – (H/RT), де (H, (S – ентальпія й ентропія
реакції гетероасоціації, що є шуканими параметрами процедури підгонки
теоретичної кривої (X((Y) (1) під експериментальну температурну
залежність.

Вивчена гетероасоціація антипухлинних антибіотиків новатрона й
дауноміцина, використовуємих у комбінації для лікування раку груди.
Двомірний ROESY спектр змішаного розчину DAU-NOV містить набір
міжмолекулярних ROE контактів між протонами новатрона й дауноміцина.
Існування міжмолекулярних кросів-піків надає однозначну інформацію про
взаємну орієнтацію хромофорів DAU і NOV в 1:1 гетерокомплексі й дозволяє
надійно задати початкову орієнтацію хромофорів молекул для подальшої
мінімізації по енергії структури гетерокомплексу методом молекулярної
механіки. На підставі концентраційних і температурних залежностей
протонних хімічних зсувів (рис.1) і моделі молекулярної гетероасоціації
(1), отримані значення параметрів гетероасоціації молекул антибіотиків
(табл.1). Аналіз рівноважних параметрів гетероасоціації з урахуванням
даних 1D- і 2D-ЯМР спектрів дозволяє зробити висновок, по-перше, про
утворення комплексу молекул NOV-DAU у формі вертикального стекінгу
хромофорів (рис.2), по-друге, про переважну стабілізацію комплексу
дисперсійними й гідрофобними взаємодіями, і, по-третє, про додаткову
стабілізацію гетерокомплексу міжмолекулярним водневим зв’язком між 5NH і
8NH групами бічних ланцюгів NOV і 5O, 12O атомами DAU (див.рис.2). Ці
результати отримані вперше й можуть мати пряме відношення до зміни
медико-біологічної активності цих препаратів при одночасному введенні в
організм.

Структурні й термодинамічні параметри гетероасоціації антипухлинних
антибіотиків актиноміцину D і новатрону, як і для розглянутої вище
молекулярної системи NOV-DAU, визначалися шляхом аналізу залежностей
хімічних зсувів необмінюючихся протонів обох ароматичних речовин у
змішаних розчинах від концентрації й температури. З огляду на відомий з
літератури факт агрегації AMD не вище димерів, модель гетероасоціації
(1) була модифікована з урахуванням лише димерів AMD у всіх реакціях
асоціації. З використанням модифікованої моделі отримані рівноважні
параметри гетероасоціації молекул NOV-AMD (табл.2) і розрахована
найбільш імовірна структура 1:1 гетерокомплексу. Аналіз результатів
також свідчить про утворення комплексу антибіотиків у розчині,
стабілізованого стекінгом хромофорів, однак, на відміну від попередньої
системи NOV-DAU, утворення міжмолекулярного H-зв’язку в такому комплексі
малоймовірно.

Відповідно до методики аналізу гетероасоціації антипухлинних ароматичних
антибіотиків, докладно розглянутої на прикладі взаємодії в системах
DAU-NOV і NOV-AMD, була вивчена гетероасоціація антибіотика ногаламіцина
з антибіотиками DAU, NOV, AMD. Рівноважні параметри

Рис. 1. Залежність хімічних зсувів протонів DAU і NOV від: а)
концентрації DAU (T=318K, CNOV=0.68 mM); б) температури (CDAU=2.01 mM,
CNOV=0.48 mM) у водному розчині, 0.1M Na-фосфатний буфер, pD 7.1.

Таблиця 1

Розрахункові параметри гетероасоціації антибіотик-антибіотик в 0.1М
Na-фосфатному буфері, pD 7.1

система Т, К Kh,·103

M-1 -(Hh,

кДж/моль -(Sh,

Дж/моль(К

NOV-DAU 318 3.33(0.35 59.5(6.2 95(10

NOV-AMD 312 1.5(0.6 28.2(7.1 31.1(8.1

NOG-DAU 303 2.7 ( 1.2 33 ( 4 40 ( 8

NOG-NOV 318 5.2 ( 2.5 34 ( 4 36 ( 7

NOG-AMD 303 3.6 ( 0.6 35 ( 6 47 ( 15

Рис. 2. Розрахункова структура 1:1 гетерокомплексу NOV-DAU.
Міжмолекулярни водневі зв’язки зазначені стрілками.

гетероасоціації й розрахункові структури 1:1 гетерокомплексів наведені в
табл.1. Порівняльний аналіз термодинамічних параметрів і індукованих
хімічних зсувів молекул у складі комплексів дозволив зробити висновок
про специфічні структурні особливості гетероасоціації NOG з ароматичними
антибіотиками й внеску різних фізичних взаємодій у стабілізацію
гетерокомплексів.

У цілому проведений структурний і термодинамічний аналіз гетероасоціації
різних ароматичних антибіотиків один з одним показав, що ароматичні
антибіотики взаємодіють у водному розчині з утворенням досить міцних
гетероасоціатів. У деяких випадках гетероасоціація може мати домінуючий
характер у розчині в порівнянні з іншими типами комплексів за рахунок
утворення міжмолекулярного водневого зв’язку. Ці факти необхідно
враховувати при розробці оптимальних режимів хіміотерапії ракових
захворювань, основу яких можуть становити розглянуті комбінації
антибіотиків.

У розділі 4 розглянута само- і гетероасоціація за участю ароматичного
біс-інтеркалятора гомодимера етидія (EBH), що володіє антипухлинною
активністю. Запропоновано фізичну модель динамічної рівноваги
гомодимера, що включає утворення відкритої (U), закритої (F) форми
молекули, взаємно інтеркальованого димера (F2) і тримера (F3) (рис. 3).
На підставі запропонованої моделі виведене рівняння для опису
експериментального протонного хімічного зсуву:

(2)

де h1 і h0 – мономерна й загальна молярні концентрації EBH; (U і (F –
хімічні зсуві в U- і F-формі EBH відповідно; Kh – рівноважна константи
реакції U?F (рис. 3а); K2, (2 і K3, (3 – рівноважна константа й хімічний
зсув в димері й у тримері EBH, відповідно.

Рис. 3. Схематичне зображення реакцій самоасоціації гомодимеру етидію.

Таблиця 2.

Термодинамічні параметри реакцій самоасоціації EBH і гетероасоціації
EBH-PI у водному розчині

Реакция K298,

л/моль -(H(,

кДж/моль -(S(,

Дж/моль(К

U ( F 25 ( 5 9 ( 3 4 ( 2

F + F ( F2 730 ( 100 23 ( 3 22 ( 5

F + F2 ( F3 1400 ( 200 26 ( 3 27 ( 5

F + PI ( FPI 30 ( 10 11 ( 2 9 ( 4

F2 + PI ( F2PI 160(40 17 ( 3 15 ( 5

Рис. 4. Експериментальні залежності хімічних зсувів протонів гомодимеру
етидія (EBH) у водно-сольовому розчині (0.1M NaCl): а) від концентрації
EBH при T=298K; б) від температури при h0=0.36 mM.

I

?

o

E

I

?

4 ? -

???

»

H

&

??

????????

1/4•?•TH•i•?•aOO’«kdX

J

$

J

v O

v O

v O

v O

v O

v O

?????? зсувів EBH у водно-сольовому розчині (рис. 4) і моделі (2)
отримані параметри самоасоціації біс-інтеркалятора (табл. 2).
Порівняльний аналіз індукованих хімічних зсувів і рівноважних констант
комплексоутворення, дозволяє зробити висновок, що протони молекули EBH
екрановані в димері (F2) і деекрановані в тримері (F3) у порівнянні з U
і F формами гомодимеру етидія. Останнє дає можливість якісно пояснити
хід експериментальних кривих (=((h0) і (=((T) (рис. 4) як конкуренції
димерів і тримерів.

Розглянута вище модель самоасоціації гомодимеру етидія припускає
утворення в розчині частково інтеркальованого димеру (F2) і тримеру
(F3), іншими словами ароматичний фенантридиновий хромофор може
вбудовуватися усередину F-форми біс-інтеркалятора. Це дає підставу
припустити, що існує досить висока ймовірність утворення
гетерокомплексів між EBH і ароматичними молекулами моноінтеркаляторів у
водно-сольовому розчині. Для перевірки цього припущення була досліджена
гетероасоціація гомодимеру етидія з фенантридиновим барвником йодистим
пропідіем (PI) у водному розчині.

і отримані відповідні вирази для опису протонного хімічного зсуву
взаємодіючих молекул:

(3)

Аналіз розрахункових параметрів гетероасоціації EBH-PI (табл.2) дозволив
запропонувати якісну структуру утворених гетерокомплексів у розчині
(рис.5).

У цілому проведений термодинамічний аналіз само- і гетероасоціації
типового ароматичного біс-інтеркалятора гомодимеру етидія свідчить про
існування значно більш складної динамічної рівноваги таких молекул у
розчині, ніж передбачалося раніше. Показано, що гомодимер етидія створює
у розчині різні за структурою агрегати, що включають частково
інтеркальовані димери (F2) і тримери (F3), а також утворює комплекси із
простими ароматичними моноінтеркаляторами. Ефективна само- і
гетероасоціація ароматичних біс-інтеркаляторів повинна бути врахована в
будь-яких біофізичних дослідженнях, які використовують дані сполуки.

У розділі 5 проведений аналіз спільного зв’язування різних комбінацій
ароматичних антипухлинних антибіотиків DAU, NOG, NOV, AMD із ДНК. Як
модель ДНК використан тетрамірний фрагмент 5′-d(TpGpCpА), що відповідає
вільним від гистонів ділянкам клітинної ДНК.

Кількісний аналіз трикомпонентної рівноваги двох ароматичних лигандів X
і Y і тетрамеру ДНК N2 у водному розчині повинен ураховувати всі можливі
види взаємодій, а саме, самоасоціацію X і Y, їх гетероасоціацію X-Y і
комплексоутворення з дуплексом TGCA X-N2 і Y-N2.

Для аналізу трикомпонентної рівноваги використовувалася система рівнянь
закону збереження маси для кожної із взаємодіючих речовин

, (4)

де KX(KY), Kh, K2X(K2Y) – рівноважні константи самоасоціації,
гетероасоціації й комплексоутворення з d(TGCA)2, відповідно, відомі з
експериментів, проведених раніше, або в дійсній роботі
(гетероасоціація), в однакових умовах розчинника; N2 – концентрація
незв’язаного лигандом тетрамеру. Кожний додаток в (4) відповідає своєму
типу комплексу в розчині й, отже, дозволяє розрахувати мольну частку f
даного комплексу шляхом розподілу на x0, y0 або N0.

Для кількісного аналізу спільного зв’язування двох антибіотиків із ДНК
запропонована методика, застосовуєвана зараз для вивчення рівноваги
лиганд-ДНК у присутності кофеїну або ароматичного вітаміну що
використовує поняття інтерцепторної й протекторної дії. Під
інтерцепторною дією антибіотик-перехоплювача (Y) на антибиотик-лиганд
(X) розуміється гетероасоціація X-Y, що зменшує число вільних для
зв’язування із ДНК молекул речовини X. Під протекторною дією розуміється
комплексоутворення перехоплювача Y із ДНК, що блокує місця посадки
лиганда X на нуклеотидну послідовність. В обох випадках частка
комплексів X-ДНК у присутності речовини Y знижується, що приводить до
зміни біологічного ефекту, обумовленого комплексоутворенням
(інтеркаляціею) X у ДНК.

Для кількісної оцінки протекторної й інтерцепторної дії
лиганда-перехоплювача Y стосовно лиганду X у системі
антибіотик-антибіотик-ДНК скористаємося критерієм RD:

, (5)

— мольна частка комплексів X-d(TGCA)2 при Kh=0, K2Y(0; при Kh(0, K2Y=0;
при Kh=0, K2Y=0, відповідно. Область RD>1 відповідає перевазі
комплексоутворення Y-TGCA над гетероасоціацією X-Y (тобто протекторна
дія Y); область RD<1 відповідає домінуванню гетероасоціації в розчині в сумарному ефекті витиснення молекул X із ДНК (інтерцепторна дія Y). Оцінка частки витиснутого із ДНК ліганду X при додаванні ліганду Y виробляється за допомогою фактора AD як , (6) ), фактор AD може в принципі служити кількісною мірою оцінки зміни біологічної активності ліганду X при додаванні ліганду Y у клітинній системі. На рис. 6 як приклад представлені фактори RD і AD для різних комбінацій DAU-AMD/NOV/NOG, при варіюванні концентрації DAU як антибіотик-перехоплювача. Судячи з фактора RD, при використаних у розрахунку фізіологічних (оцінних) концентрацій (N0=0.01mM, x0=0.01mM) у всіх системах домінує протекторний ефект (RD>1). Причина цьому полягає в
тім, що при концентраціях ДНК порівнянних з концентраціями X і Y,
олігонуклеотид практично насичений обома лігандами, у результаті чого
ефекти конкуренції за місця посадки проявляються набагато сильніше, ніж
ефекти гетероасоціації, тим більше що константи зв’язування X/Y-TGCA на
кілька порядків перевищують константу гетероасоціації X-Y.

Рис. 6. Фактори RD і AD у системі DAU-антибіотики-ДНК при N0=0.01mМ,
x0=0.01mМ.

Фактор AD (рис. 6) має характер насичення, що свідчить про поступове
витиснення молекул антибіотика-лиганду із ДНК у міру додавання
антибіотик-перехоплювача. Причому ефект витиснення молекул X при
додаванні молекул Y у концентрації 0.01mM, як видно з рисунків, має
порядок 20-40%. Можна припустити, що in vivo подібний експеримент
аналогічний “заміні” біологічного ефекту антибіотика X на біологічний
ефект антибіотика Y. Фактично це означає можливість спрямованого
маніпулювання біологічним ефектом у комбінації ароматичних антибіотиків.

Подальший аналіз RD/AD для розглянутих комбінацій антибіотиків дозволив
зробити висновок, що в діапазоні концентрацій антибіотик-перехоплювача
y0?0.01mM ці фактори не залежать від y0 і демонструють кореляцію з
константою гетероасоціації й комплексоутворення із ДНК, що задає в
емпіричній формі:

(7)

Вираз (7) дозволяють зрівняти частку витиснутого антибіотик-лиганду при
додаванні антибіотик-перехоплювача для різних комбінацій антибіотиків.
Потенційно це дає можливість передбачати зміну біологічного ефекту при
додаванні антибіотик-перехоплювача в заданій комбінації антибіотиків.

ВИСНОВКИ

Вивчена гетероасоціація ароматичних антипухлинних антибіотиків
дауноміцину (DAU), ногаламіцину (NOG), мітоксантрону (NOV) і
актиноміцину D (AMD) методом 1H ЯМР спектроскопії: системи DAU-NOV,
DAU-NOG, NOG-AMD, NOV-AMD, NOG-NOV. Визначено рівноважні константи,
ентальпія й ентропія реакцій гетероасоціації; побудовані найбільш
імовірні структури 1:1 комплексів молекул у розчині.

Показано, що ароматичні антипухлинні антибіотики утворять у водному
розчині стопки молекул, стабілізовані вертикальним стекингом хромофорів.
Основний внесок у стабілізацію комплексів молекул дають дисперсійні й
гідрофобні взаємодії.

Уперше показано, що гетерокомплекси ароматичних антибіотиків можуть
додатково стабілізуватися в розчині міжмолекулярним водневим зв’язком.
Виявлено водневий зв’язок у системі DAU-NOV.

Вивчено самоасоціацію біс-інтеркалятора гомодимера етидія (EBH) і його
гетероасоціацію з йодистим пропідієм (PI) у водному-сольовому розчині.
Визначені рівноважні константи, ентальпія й ентропія реакцій асоціації
молекул.

Вперше встановлено існування складної динамічної рівноваги молекул EBH у
водному розчині, що включає утворення відкритої й закритої форм
гомодимеру, взаємно-інтеркальованих димерів і тримерів.

На прикладі йодистого пропідія показано, що ароматичний біс-інтеркалятор
є комплексоутворювачем ароматичних моноінтеркаляторів, причому
зв’язування PI відбувається специфічно із закритою формою й з димером
EBH.

Проаналізовано трикомпонентну рівновагу антибіотик-антибіотик-ДНК у
водному розчині для комбінацій антипухлинних антибіотиків DAU-NOV,
DAU-AMD, DAU-NOG, NOG-AMD, NOV-AMD, NOG-NOV. Зроблено поділ
інтерцепторного й протекторного механізмів взаємної дії комбінації
антибіотиків на ДНК у суміші.

Установлено, що в приблизно фізіологічному діапазоні концентрацій
антибіотиків і ДНК домінуючим процесом є витиснення із ДНК одного
антибіотика іншим (протекторна дія).

Показано, що в трикомпонентній суміші антибіотик-антибіотик-ДНК існує
потенційна можливість регулювання біологічної активності комбінації
антибіотиків. Запропоновано засіб кількісної оцінки ефекту витиснення із
ДНК одного антибіотика іншим, що може мати кореляцію з очікуваним
біологічним ефектом при зміні концентрації компонент у суміші
антибіотиків.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Veselkov A.N., Evstigneev M.P., Rozvadovska A.O., Hernandez Santiago
A.A., Zubchenok O.V., Djimant L.N., Davies D.B. 1H NMR structural and
thermodynamical analysis of the hetero-association of daunomycin and
novatrone in aqueous solution // J.Mol.Struct. — 2004. – V.701. —
P.31-37.

Евстигнеев М.П., Розвадовская А.О., Кисуркин Д.В., Эрнандес Сантьяго
А.А., Дэвис Д.Б., Веселков А.Н. Анализ гетероассоциации антиопухолевых
антибиотиков новатрона и актиномицина D в водном растворе методом 1H ЯМР
спектроскопии // Доповiдi НАН України. — 2004. — №12. — С.168-174.

Evstigneev M.P., Hernandez Santiago A., Rogova O.V., Veselkov A.N.
Comparative analysis of the self-association of ethidium mono- and
bis-intercalators in aqueous solution using 1H NMR spectroscopy // Proc.
of SPIE. — 2004. — V.5507. — P.173-177.

Веселков А.Н., Евстигнеев М.П., Эрнандес Сантьяго А., Рогова О.В.,
Веселков Д.А., Дэвис Д.Б. Исследование равновесных ассоциированных форм
гомодимера этидия в водном растворе методом 1H ЯМР спектроскопии //
Физ.химия. — 2003. — Т.77. — С.2060-2067.

Veselkov A.N., Evstigneev M.P., Veselkov D.A., Hernandez Santiago A.A.,
Davies D.B. 1H NMR investigation of the self-association of ethidium
homodimer and its complexation with propidium iodide in aqueous solution
// J.Mol.Struct. — 2004. – V.690. — P.17-24.

Веселков А.Н., Евстигнеев М.П., Эрнандес Сантьяго А.А., Рогова О.В.,
Веселков Д.А., Дэвис Д.Б. Исследование гетероассоциации гомодимера
этидия и иодистого пропидия в водном растворе методом 1H ЯМР
спектроскопии // Журн.структур.химии. — 2004. — Т.45. — С.837-843.

Эрнандес Сантьяго А.А., Симонова С.Н., Розвадовская А.О.
Термодинамический анализ гетероассоциации антрациклиновых антибиотиков
методом 1H ЯМР спектроскопии // Вестник СевГТУ (серия Физика и
математика). – 2005. – Т.70. – C.40-48.

Rogova O.V., Hernandez Santiago A., Evstigneev M.P., Veselkov A.N.
Thermodynamical analysis of self-association of ethidium homodimer and
its complexation with phenanthridine dye in aqueous solution // Book of
abstracts. XVI International School-Seminar Spectroscopy of Molecules
and Crystals. — Sevastopol (Ukraine). – 2003. – P.233.

Evstigneev M.P., Rozvadovska A.O., Hernandez Santiago A., Veselkov A.N.,
Davies D.B. Analysis of the hetero-association of aromatic drug
molecules in aqueous solution by 1H NMR spectroscopy and molecular
mechanics calculations // Book of abstracts. The first EENC/AMPERE joint
meeting. — Lille (France). – 2004. – P.329.

Hernandez Santiago A.A., Rozvadovska A.O., Evstigneev M.P.
Hetero-association of antibiotic Nogalamycin with aromatic antitumour
antibiotics // Book of abstracts. 3rd International Conference ‘Physics
of Liquid Matter: Modern Problems’. — Kyiv (Ukraine). — 2005. – P.35.

Евстигнеев М.П., Эрнандес Сантьяго А.А., Мосунов А.А., Симонова С.Н.,
Розвадовская А.О. Влияние гетероассоциации на параметры связывания
антиопухолевых антибиотиков с олигомером ДНК // Труды V Харьковской
конф. молодых ученых “Радиофизика и СВЧ электроника” (секц.биофизики). –
Харьков (Украина). – 2005. – C.57.

Эрнандес Сантьяго А.А., Евстигнеев М.П. Анализ конкурентного связывания
различных комбинаций антиопухолевых антибиотиков с олигомером ДНК в
водном растворе // Труды Всеукраинской научно-технической конф.
студентов, аспирантов и молодых ученых “Физика. Биофизика — 2005”. –
Севастополь (Украина). – 2005. — С.50-52.

АНОТАЦІЯ

Ернандес Сантьяго А.А. Механізми взаємодії та конкурентного зв’язування
з ДНК ароматичних антипухлинних препаратів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття ученого ступеня кандидата фізико-математичних
наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Севастопольський
національний технічний університет, м. Севастополь, 2006.

Вивчено механізми гетероасоціації ароматичних антипухлинних препаратів:
антибіотиків дауноміцину, ногаламіцину, мітоксантрону, актиноміцину D, а
також біс-інтеркалятора гомодимера етидію. На підставі методів одно- і
двомірної 1H ЯМР спектроскопії (500 МГц) отримані структурні й
термодинамічні параметри реакцій асоціації молекул. Показано, що
ароматичні антипухлинні антибіотики утворять у водному розчині стопки
молекул, стабілізовані вертикальним стекингом хромофорів. Основний
внесок у стабілізацію комплексів молекул дають дисперсійні й гідрофобні
взаємодії, а також у деяких випадках міжмолекулярний водневий зв’язок.
Вперше встановлено існування складної динамічної рівноваги молекул EBH у
водному розчині, що включає утворення відкритої й закритої форм
гомодимеру, взаємно-інтеркальованих димерів і тримерів.

Проаналізовано трикомпонентну рівновагу антибіотик-антибіотик-ДНК у
водному розчині. Зроблено поділ інтерцепторного й протекторного
механізмів взаємної дії комбінації антибіотиків на ДНК у суміші й
показано, що в трикомпонентній суміші існує потенційна можливість
регулювання біологічної активності комбінації антибіотиків.

Ключові слова: ЯМР-спектроскопія, гетероасоціація, антибіотик,
біс-інтеркалятор, конкурентне зв’язування, ДНК, водневий зв’язок,
стекинг

АННОТАЦИЯ

Эрнандес Сантьяго А.А. Механизмы взаимодействия и конкурентного
связывания с ДНК ароматических антиопухолевых препаратов. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических
наук по специальности 03.00.02 – биофизика. – Севас-топольский
национальный технический университет, г.Севастополь, 2006.

Изучены механизмы гетероассоциации ароматических антиопухолевых
препаратов: антибиотиков дауномицина, ногаламицина, митоксантрона,
актиномицина D, а также бис-интеркалятора гомодимера этидия. На
основании методов одно- и двумерной 1H ЯМР спектроскопии (500 МГц)
получены структурные и термодинамические параметры реакций ассоциации
молекул. Показано, что ароматические антиопухолевые антибиотики образуют
в водном растворе стопки молекул, стабилизированные вертикальным
стэкингом хромофоров. Основной вклад в стабилизацию комплексов молекул
дают дисперсионные и гидрофобные взаимодействия, а также в некоторых
случаях межмолекулярная водородная связь. Впервые установлено
существование сложного динамического равновесия молекул EBH в водном
растворе, включающее образование открытой и закрытой форм гомодимера,
взаимно-интеркалированных димеров и тримеров.

Проанализировано трехкомпонентное равновесие антибиотик-антибиотик-ДНК в
водном растворе. Произведено разделение интерцепторного и протекторного
механизмов взаимного действия комбинации антибиотиков на ДНК в смеси и
показано, что в трехкомпонентной смеси существует потенциальная
возможность регулирования биологической активности комбинации
антибиотиков.

Ключевые слова: ЯМР-спектроскопия, гетероассоциация, антибиотик,
бис-интеркалятор, конкурентное связывание, ДНК, водородная связь,
стэкинг.

SUMMARY

Hernandez Santiago A.A. Mechanisms of interaction and competitive
binding with DNA of aromatic antitumour drugs – Manuscript.

Thesis for a Candidate’s degree of Physical and Mathematical Sciences in
Biophysics — Speciality 03.00.02, Sevastopol National Technical
University, Sevastopol, 2006.

The hetero-association of aromatic antitumour antibiotics Daunomycin
(DAU), Nogalamycin (NOG), Mitoxantrone (NOV), Actinomycin D (AMD) has
been studied in aqueous solution (0.1M Na-phosphate buffer, pD 7.1).
Using 1D and 2D 1H NMR spectroscopic data the structures of 1:1
hetero-complexes in solution and the thermodynamical parameters of
association reactions (equilibrium constants, enthalpy, entropy) have
been obtained. The structures of the hetero-complexes were calculated in
aqueous environment using X-PLOR software. Equilibrium parameters were
obtained from analysis of concentration and temperature dependences of
proton chemical shifts of interacting molecules. The results are
consistent with a sandwich-type arrangement of interacting molecules in
the hetero-complexes, stabilized by the vertical stacking of aromatic
chromophores. The main contributors to the energy of association
reactions were found to be a dispersive interactions of aromatic
chromophores and hydrophobic interactions. It was also shown that the
hetero-complexes of the antitumour antibiotics can be additionally
stabilized by intermolecular H-bond; the H-bonding was found in
Mitoxantrone-Daunomycin 1:1 hetero-complex. The results are of
particular importance for the rational development of the regimes of
combination chemotherapy based on these drugs.

Solution behaviour of ethidium homodimer (EBH) and its complexation with
phananthridine dye, propidium iodide (PI) are studied by NMR.
Equilibrium parameters of association have been obtained. A
non-monotonic concentration and temperature dependences of proton
chemical shifts was observed. The results were interpreted in terms of
formation of unfolded (U), folded (F) forms of the bis-intercalator,
partially-intercalated dimers (F2) and trimers (F3). A competition
between F2 and F3 complexes in solution is suggested as a main factor
which determines the curvature of experimental dependences. Analysis of
EBH hetero-association with PI enabled to conclude that homodimer is an
effective trapper of aromatic drug molecules. The complexation occurs
via association between PI and F or F2 forms of EBH and has to be taken
into consideration in the studies concerning aromatic bis-intercalators.

Analysis of three-component equilibrium in Antibiotic-Antibiotic-DNA
system has been made in terms of protector/interceptor action of one
antibiotic on another for all combinations of antitumour antibiotics
studied, viz. DAU-NOV, DAU-AMD, DAU-NOG, NOG-AMD, NOV-AMD, NOG-NOV.
Deoxytetranucleotide 5’-d(TpGpCpA) was used as a model DNA sequence,
representing free from proteins regions of cellular DNA, to study the
simultaneous binding of two drugs with nucleic acids. Discrimination
between protector and interceptor actions was made and a fraction of the
antibiotic removed from DNA upon addition of the other one was
estimated. Using guessed magnitudes of the concentrations of molecular
components under physiological conditions it was found the a dominating
process in solution is likely to be a displacement from DNA binding
sites of the antibiotics by each other (protector action). However, the
hetero-association still plays an important role in dynamic equilibrium
in the mixed solution and should necessarily be taken into consideration
when studying the simultaneous binding of aromatic drugs with DNA. It
has been shown that the three-component mixture
Antibiotic-Antibiotic-DNA allows for a directed regulation of the
biological activity of a combination of aromatic antitumour drugs. The
method for estimation of the quantity of the drug removed from DNA in
the presence of the other one is suggested which may have a correlation
with a biological response upon change of the concentration of molecular
components in the mixture of antibiotics.

Key words: NMR spectroscopy, hetero-association, antibiotic,
bis-intercalator, competitive binding, DNA, hydrogen bond, stacking.

PAGE 19

а)

а)

б)

Похожие записи