НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

БІЛАН ПАВЛО ВОЛОДИМИРОВИЧ

УДК 612.822:611.813.14

Механізми внутрішньоклітинної кальцієвої регуляції в екзокринних
клітинах

03.00.02 — біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в відділі загальної фізіології нервової системи
Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

Науковий консультант: академік НАН України, доктор біологічних наук,
професор

Костюк Платон Григорович,

директор Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: академік НАН України, доктор біологічних наук,
професор

Кришталь Олег Олександрович,

зав. відділом фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту
фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.

член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор

Костерін Сергій Олексійович,

заст. директора з наукової роботи та зав. відділом біохімії м’язів
Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України.

доктор біологічних наук,

Жолос Олександр Вікторович,

професор кафедри біофізики Київського Національного університету імені
Тараса Шевченка.

Провідна установа: Національний медичний університет імені
О.О.Богомольця.

Захист дисертації відбудеться “ 22 ” листопада 2005 року о “
14 ” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.198.01 при
Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024,
Київ, вул. акад. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. акад.
Богомольця, 4.

Автореферат розіслано “ 21 ” жовтня 2005 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ВСТУП

Актуальність проблеми.

Внутрішньоклітинний кальцій розглядається у сьогоденні як один з
найбільш універсальних вторинних посередників, що бере участь у передачі
сигналу від структур плазматичної мембрани до внутрішньоклітинних
елементів, які забезпечують відгук клітини на зовнішній стимул QUOTE
«(Petersen, Michalak et al. 2005)» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00 (Petersen, Michalak et al.
2005)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Ен\01 р\12\
00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\19\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwXоы\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwXоы\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwXоы\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwXоы\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\042679(Petersen, Michalak, et al. 2005
2679 /id\00(\00 (Petersen et al. 2005) . Зміни внутрішньоклітинної
концентрації іонів кальцію запускають цитоплазматичні процеси, що лежать
в основі клітинної збудливості, секреції, синаптичної передачі та
скорочення.

Підвищення цитоплазматичного кальцію в секреторних клітинах є
найважливішим кроком у процесі кальцій-залежного єкзоцитозу QUOTE
«(Petersen 1992;Yule, Essington et al. 1993;Petersen 2005)» ADDIN
REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\009(Petersen 1992;Yule, Essington et al.
1993;Petersen
2005)\01\0D\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00`w\16\02 р\1
2\00рTъ\01Н‹хwи\06\08\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\
00\00\00\00\003Dщw0e\08\02Н‹хwЁ\07\16\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ
хw|л\12\00\00\00\00\003DщwШw\16\02Н‹хwЁ\07\08\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwШw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwШw\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwШw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwШw\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\042678\16Petersen 2005 2678 /id\00\16\00
(Petersen 1992; Yule, et al. 1993; Petersen 2005) QUOTE «» ADDIN
REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03281\15Petersen 1992 281 /id\00\15\00
QUOTE «» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03351$Yule, Essington, et al. 1993 351
/id\00$\00 . Kasai й Augustine показали, що викликане агоністом
підвищення кальцію починається в апікальній частині секреторних клітин й
потім поширюється до базолатеральної частини QUOTE «(Kasai and
Augustine 1990)» ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1A(Kasai and
Augustine
1990)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\
00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\13\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03301\1EKasai & Augustine 1990 301
/id\00\1E\00 (Kasai and Augustine 1990) . Нещодавно було показано, що
протягом стимуляції низькими (фізіологічними) концентраціями агоністу,
це підвищення концентрації вільного цитозольного кальцію ([Ca2+]i) є
обмеженим тільки апікальною частиною клітини QUOTE «(Thorn P
1993;Kasai, Li et al. 1993)» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00$(Thorn P 1993;Kasai, Li et al.
1993)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00аv\16\02 р\1
2\00PЊы\01Н‹хwи\06\07\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwX7‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwX7‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwX7‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\00
\00\00\00\003DщwЂw\15\02Н‹хwЁ\07\10\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0267\1DKasai, Li, et al. 1993 67
/id\00\1D\00 (Thorn 1993; Kasai et al. 1993) QUOTE «» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03108\14Thorn P 1993 108 /id\00\14\00 .
Недавні експерименти продемонстрували, що короткі застосування високих
доз ацетилхоліну (АХ) також викликали подібні обмежені спайки кальцію,
які не в змозі вторгнутися в ядро. Така обмежена у просторі та часі
форма передачі кальцієвих сигналів вигідна фізіологічно, оскільки вона
допускає їх цільове виникнення і застосування, а також не призводить до
потенційно шкідливих зростань концентрації вільного кальцію в інших
частинах клітини.

Вважається загальносприйманим, що ендоплазматичний ретикулум є головною
кальцій-регулюючою структурою у незбудливих клітинах QUOTE «(Yano,
Petersen et al. 2004)» ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1C(Yano,
Petersen et al.
2004)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Ен\01 р\12\
00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\15\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\042681$Yano, Petersen, et al. 2004 2681
/id\00$\00 (Yano et al. 2004) . В той же час істотна частина
апікальної області поляризованих ацинарних секреторних клітин (де й має
місце головна частина всіх агоніст-залежних змін [Ca2+]i) зайнята
органелами екзоцитозно-ендоцитозного напрямку (секреторні везикули,
апарат Гольджі, ендосоми) і майже не містить ендоплазматичного
ретикулуму. Вміст вільного кальцію й механізми його регулювання в цих
органелах у значній мірі невідомі. Механізми контролю секреції рідини і
ферментів з ацинарних секреторних клітинах, що викликається
агоніст-залежними локальними цитозольними [Ca2+]i транзієнтами в
секреторному полюсі були, таким чином, неясними. На момент початку
дисертаційної роботи, органели, відповідальні за викид і відновлення
кальцію протягом цього процесу, також були невідомі, як і невідомий був
механізм перезавантаження запасів кальцію в апікальній частині
екзокринних клітин. Регуляція концентрації кальцію в ацинарному люмені
(біля апікальної мембрани) важлива для регулювання ендоцитозу QUOTE
«(Maruyama, Inooka et al. 1993)» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\1E(Maruyama, Inooka et al.
1993)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\
00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\17\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwHП\00\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwHП\00\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwHП\00\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwHП\00\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0266$Maruyama, Inooka, et al. 1993 66
/id\00$\00 (Maruyama et al. 1993) і ймовірно важлива для
перезавантаження запасів кальцію (особливо запасів, що беруть участь в
обмежених апікальним полюсом змінах концентрації цитозольного кальцію),
теж була невідома. Роль різних механізмів, які можуть брати участь у
регулюванні концентрації кальцію у зовнішньоклітинному люмені усе ще
залишається невстановленою. Інакше кажучи, є дві тісно зв’язані й
важливі області досліджень: органели й механізми, що залучені в змінах
цитозольної концентрації кальцію, та обіг кальцію в секреторній області
цих клітин.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Робота виконана в рамках наукових програм відділу загальної фізіології
нервової системи Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України:
„Розробка біофізичних методів та підходів для реєстрації вивільнення
іонів кальцію з поодиноких клітин”, „Вивчення локалізації вивільнення
іонів кальцію з поодиноких клітин”, „Моделювання дифузії кальцію в
зовнішньоклітинному середовищі”, „Дослідження механізмів синаптичної
передачі у центральній нервовій системі ссавців”.

Мета роботи.

Мета виконаної роботи полягала у дослідженні механізмів кальцієвої
регуляції в екзокринних секреторних клітинах.

Задачі дослідження.

Провести дослідження різноманітних клітинних механізмів, що приймають
участь у скоординованій регуляції іонів кальцію в екзокринних клітинах
під час секреції ними ферментів травлення.

Розробити біофізичні методи та підходи, які дозволять реєструвати
вивільнення іонів кальцію з окремих секреторних везикул та вимірювати
кількість іонів кальцію, звільнених окремими ізольованими клітинами або
кластерами секреторних клітин.

Розробити біофізичні методи та підходи для візуалізації місць
вивільнення або захоплення іонів кальцію на поверхні ізольованих клітин
або невеликих клітинних кластерів та математичну модель дифузії і
буферування іонів кальцію у навколоклітинному середовищі після їх
вивільнення з окремих клітин.

Оцінити можливості нових методів для оцінки малих кальцієвих вхідних
потоків, викликаних вивільненням іонів кальцію з внутрішньоклітинних
кальцієвих депо.

Дослідити, чи є окремі секреторні гранули кальцієвими
внутрішньоклітинними депо у екзокринних клітинах.

Вивчити локалізацію вивільнення іонів кальцію з ацинарних клітин та
визначити молекулярні системи, що можуть відповідати за це вивільнення.

Дослідити просторове розподілення кальцієвих насосів плазматичної
мембрани в ацинарних клітинах підшлункової залози на рівні поодиноких
клітин.

Знайти зв’язок між просторово-часовими змінами внутрішньоклітинної
концентрації іонів кальцію та змінами виходу іонів кальцію з
панкреатичних ацинарних клітин.

Оцінити на прикладі секреторних клітин слинних залоз вклад секреції, як
можливого основного механізму, у процес виведення кальцію з екзокринних
клітин.

Наукова новизна отриманих результатів.

У роботі вперше були розроблені нові біофізичні методи, які дозволяють
кількісно реєструвати вивільнення іонів кальцію з окремих секреторних
везикул, а також вимірювати кількість іонів кальцію, звільнених або
захоплених окремими ізольованими клітинами або невеликими клітинними
кластерами під час роботи різних кальцій-регулюючих систем плазматичної
мембрани. Нами також були розроблені нові біофізичні методи візуалізації
місць вивільнення іонів кальцію на поверхні поодиноких ізольованих
клітин або їх невеликих кластерів. У роботі вперше проведено дослідження
локалізації вивільнення іонів кальцію з панкреатичних ацинарних клітин і
ацинарних клітин слинних залоз та визначені молекулярні системи, що
відповідають за це вивільнення. Автором вперше показано, що окремі
секреторні гранули є кальцієвими внутрішньоклітинними депо. Дана робота
вперше характеризує як кількість, так і кінетику вивільнення кальцію
шляхом екзоцитозу на рівні одиночної клітини та у порівнянні із
вивільненням кальцію за допомогою мембранних кальцієвих насосів.
Встановлено, що вивільнення кальцію у екзокринних клітинах може мати
місце як шляхом екструзії, так і через екзоцитоз і, у деяких випадках,
основна частина кальцію вивільняється за допомогою останнього механізму.
Вперше показано зв’язок між просторово-часовими змінами
внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію та змінами виходу іонів
кальцію з панкреатичних ацинарних клітин. Розроблена математична модель
дифузії іонів кальцію у навколоклітинному середовищі після їх
вивільнення з окремих клітин.

Теоретичне та практичне значення роботи.

Результати, які отримані в роботі, мають як фундаментальне, так і
практичне значення. Дослідження механізмів кальцієвої регуляції
секреторних клітин істотно допомагають розумінню механізмів екзотитозу
як у різноманітних секреторних, так і в нервових клітинах. Вони
збагачують знання, що стосуються вивільнення іонів кальцію з окремих
секреторних везикул та різних внутрішньоклітинних кальцієвих депо.

Нові розроблені методи дозволяють вимірювати як кальцієві потоки з
поодиноких клітини (і навіть окремих секреторних гранул) так і
просторове розподілення цих потоків. Методи дозволяють легко вимірювати
просторові властивості кальцієвого потоку навіть настільки малого як
0.01-0.02 фентамоль/cек з просторовим розрізненням у декілька
мікрометрів. Таким чином, ці новітні методи можуть бути застосовані для
досліджень широкого спектру фізіологічних та патологічних явищ у різних
типах клітин. Наприклад, використовуючи нові методи, ми змогли
продемонструвати, що секреторний полюс секреторних клітин є головним
місцем для кальцієвого витоку під час дії агоністів. Практичне значення
отриманих результатів полягає в тому, що вони дозволяють зрозуміти, які
саме механізми внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу відіграють
головну роль у процесах секреції в тих чи інших клітинах, що пов’язано з
кращим розумінням етіології таких тяжких захворювань, як гострий та
хронічний панкреатити.

Отримані в роботі дані та їх інтерпретація можуть стати основою для
розробки високоселективних фармакологічних підходів до лікування
гострого та хронічного панкреатитів та різноманітних захворювань слинних
залоз.

Особистий внесок здобувача.

Автор поставив задачі досліджень і розробив нові методики реєстрації
вивільнення іонів кальцію з окремих секреторних везикул, а також
вивільнення або захоплення іонів кальцію окремими ізольованими клітинами
або кластерами секреторних клітин. Автор розробив нові методи
візуалізації місць вивільнення іонів кальцію на поверхні клітин, а також
самостійно виконував основну частину експериментів пов’язаних з
дослідженнями процесів секреції у ацинарних клітинах підшлункової та
слинних залоз, здійснював аналіз, статистичну обробку й узагальнення
результатів.

Деякі експерименти були проведені разом з іншими співавторами
опублікованих робіт, співробітниками Інституту фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України: академіком П.Г.Костюком, завідуючим відділом
Фізіології Ліверпульського університету (Велика Британія) професором
O.H. Петерсеном, завідуючим лабораторією кальцієвої сигналізації
Національного інституту здоров’я (США) доктором Д.В. Патні, професором
Ліверпульського університету О.В. Тепікіним, докторами цього ж
Університету О.В.Герасименко, Ю.В. Герасименко, Д. Гарднер, доктором Д.
Біордом та кандидатами біологічних наук О.Е. Сафтенку і В.В. Сницаревим.

Апробація результатів дисертації.

Усі матеріали дисертації докладено на семінарах Інституту фізіології ім.
О.О. Богомольця НАН України, а також на міжнародних симпозіумах і
з’їздах: щорічних конференціях Американського Товариства Нейронаук, США
(Новий Орлеан, 1997; Лос Анжелес, 1998; Майями, 1999; Сан Дієго, 2001;
Орландо, 2002; Новий Орлеан, 2003, Сан Дієго 2004); щорічних
конференціях Американського Біофізичного Товариства, США (Балтимор 1999;
Новий Орлеан, 2000;); Ювілейній школі IBRO (Ялта, Україна, 2004), а
також на засіданнях сектора молекулярної фізіології Інституту фізіології
ім. О.О. Богомольця НАН України, 2000, 2001, 2002, 2003 и 2004 років.

Публікації.

За результатами роботи опубліковано 24 стаття у провідних вітчизняних і
закордонних журналах і 12 тез доповідей.

Структура й обсяг дисертації.

Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів
досліджень, результатів досліджень, аналізу й узагальнення цих
результатів, висновків та списку використаних літературних джерел із 380
найменувань. Робота викладена на 322 сторінках, містить 4 таблиці та
проілюстрована 84 рисунками.

МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Ізоляція клітин, їх навантаження кальцієвими індикаторами та вимірювання
трансмембранних кальцієвих потоків за допомогою конфокальної мікроскопії

Шматочки підшлункової залози миші обробляли чистою колагеназою для того,
щоб отримати одиночні ацинарні клітини чи малі (по 2-10 клітин)
кластери, як це вже було описано раніше QUOTE «(Belan, Gerasimenko et
al. 1997)» ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00 (Belan, Gerasimenko et
al.
1997)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Ен\01 р\12\
00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\19\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwpnе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwpnе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwpnе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwpnе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03333’Belan, Gerasimenko, et al. 1997 333
/id\00’\00 (Belan et al. 1997) . Для деяких експериментів, які
безпосередньо описані у розділі “Результати”, клітини навантажували
флуоресцентним індикатором – Fura Red (Molecular Probes, США) протягом
30 хвилин при кімнатній температурі, як це вже було попередньо описано
щодо методики навантаження fura-2 QUOTE «(Belan, Gerasimenko et al.
1997)» ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00 (Belan, Gerasimenko et al.
1997)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\
00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\19\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03333’Belan, Gerasimenko, et al. 1997 333
/id\00’\00 (Belan et al. 1997) . Суспензії ізольованих клітин, як
навантажених Fura Red, так і не навантажених, або кластери клітин,
поміщали у маленьку експериментальну камеру (приблизно 200 мікролітрів),
яка в нормі містила безкальцієвий розчин із 1,5-5,0 мкM декстрану,
зв’язаного із Ca2+-чутливим барвником. В більшості дослідів
використовувався барвник Calcium Green-1, зв’язаний із декстраном
(молекулярна вага 500.000, Molecular Probes, США). Концентрація вільного
Ca2+ у зовнішньоклітинному розчині у таких умовах становила приблизно
0.2-0.4 мкM. Значна відмінність у спектрах емісії Calcium Green-1
декстрану та Fura Red дозволила нам спостерігати одночасно за змінами як
внутрішньоклітинної так зовнішньоклітинної концентрацій Ca2+.
Флуоресцентні сигнали від внутрішньоклітинного та зовнішньоклітинного
барвників реєстрували, використовуючи конфокальний мікроскоп Noran
Odyssey (Noran Instruments, США) із довжиною хвилі збудження 488 нм та
довжиною хвиль емісії 530 і 650 нм для Calcium Green-1 декстрану і Fura
Red відповідно. Одночасно із реєстрацією зображень, флуоресцентні
сигнали отримували у кількох місцях, які нас цікавили. Ці місця, бокси,
розміщували у різних зонах конфокальної площини та усереднені
флуоресцентні сигнали від цих боксів записували як функцію часу.

Всі зображення аналізували та обробляли за допомогою програмного
забезпечення 2D Intervision Analysis Software (Noran Instruments, США).

Аплікацію агоніста робили або шляхом додавання малої краплі
висококонцентрованого маточного розчину агоніста, або шляхом іонтофорезу
із мікроелектроду (у цьому випадку другий електрод поміщали у
експериментальну камеру). Тривалість іонофорезу становила від 5 до 50
сек. Струми іонофоретичної ін’єкції становили від 10 до 100 нА.

Зовнішньоклітинний розчин містив (у мМ): NaCl 140, MgCl2 0.66-1.13, KCl
4.7, Hepes 10, глюкоза 10; pH 7.2 із NaOH.

Для експериментів із фотолабільними хелаторами кальцію (NP-ЕGТА) клітини
навантажували шляхом їх інкубації із ацетоксіметильною формою цієї
речовини (концентрація NP-ЕGТА у розчині 5 мкM) протягом 30 хвилин при
кімнатній температурі. Як зазначалося вище, в інкубаційний розчин
додавали 1 мМ CaCl2. Після навантаження клітини двічі центрифугували та
ресуспендували у безкальцієвому розчині. Спалахи ультрафіолету (УФ) (1-4
сек) для виділення кальцію із зв’язаних фотолабільних хелаторів робили,
використовуючи УФ лазер конфокального мікроскопа. У цих експериментах
реєстрація флуоресценції переривалася на кілька секунд (на час,
необхідний для того, щоб відкрити та закрити шторку УФ лазеру) для того
щоб не пошкодити фото помножувачі конфокального мікроскопу.

Індикатори Ca2+ та NP-ЕГТА поставлялися фірмою Molecular Probes (Eugene,
США). Всі інші реактиви поставлялися фірмою Sigma (Dorset, Велика
Британія). Експерименти проводили при кімнатній температурі.

Приготування секреторних гранул, їх навантаження кальцієвими
індикаторами та вимірювання вивільнення з них за допомогою конфокальної
мікроскопії

Миші забивалися шляхом цервікальної дислокації та ізольована підшлункова
залоза із двохмісячних мишей промивалася холодним буфером А на льоду (10
мМ MOPS-Tris pH 6.8, 0.1 мМ МгSO4, 3 мМ АТФ, 250 мМ сахарози, 0.5 мг/мл
інгібітору трипсину, 1 мг/мл альбуміну із бичачої сироватки). Потім
підшлункову залозу обережно розсікали та гомогенізували у буфері А,
використовуючи тефлонові або скляні гомогенізатори. Секреторні гранули
отримували із гомогенізованої тканини, як це вже було описано (Rogers et
al. 1987), але із певними модифікаціями. Ядра та клітинні залишки
видаляли центрифугуванням при 1000 g протягом 10 хв.; супернатант
центрифугували при 2500g протягом 10 хв. Отриманий білий осад
ресуспендували у буфері B (135 мМ KC1, 10 мМ MOPS-Tris, pH 6.8, 0.1 мМ
МгSO4, 3 мМ АТФ, 1 мг/мл альбуміну із бичачої сироватки, 0.1 мг/мл
інгібітору трипсину). Для того, щоб пофарбувати фракцію секреторних
гранул, їх інкубували із 1 мкМ Mag-fura Red AM протягом 7 хвилин при
20oC. Після фарбування Mag-fura Red проводили два послідовні етапи
центрифугування у буфері B для того, щоб відмити залишки
зовнішньоклітинної Mag-fura Red. Всі етапи намагалися виконувати
якнайшвидше при температурі 0-4oC. Використовували ?-амілазу із
діагностичного набору Sigma; загальний білок визначали за методом Лоурі
при використанні альбуміну сироватки бика як стандарту.

Ми поміщали 10 мікролітрів препарату секреторних гранул у
експериментальну камеру і добавляли до них калієві солі кальцієвих
індикаторів fluo-3 або indo-1 для того щоб отримати 100 мікромолярну
концентрацію цих флуоресцентних індикаторів і кальцієвих буферів для
вимірів концентрації кальцію у позагранулярному середовищі. Вторинні
кальцієві посередники IP3 та cADP рибоза добавлялися до гомогенату
гранул для отримання їх фінальної концентрації на рівні 5-25 мкМ. СаCl2
та EGTA добавлялись до гомогенату наприкінці кожного експерименту для
того, щоб відкалібрувати кальцієві відповіді у позагранулярному
середовищі. Гранули напружені Mag-fura Red були використані як у
експериментах з гранулярними суспензіями так і у експериментах з
поодинокими гранулами. Для експериментів з поодинокими гранулами 10
мікролітрів препарату секреторних гранул розбавлялися до 100 мкл з
використанням буферу В, що містив 100 мкМ EGTA і поміщали цей розчин у
експериментальну камеру. IP3 та cADP рибоза були добавлені або
ін’єковані іонофоретично у позагранулярне середовище у цьому наборі
експериментів. Іономіцін (20 мкМ) або А23187 (20 мкМ) з 1 мМ EGTA та 10
мМ СаCl2 були використані для калібрування внутрішньо гранулярних змін
концентрації кальцію наприкінці кожного експерименту. Всі виміри кальцію
виконувались при кімнатній температурі з використанням конфокальної
системи Noran Odyssey (Noran Instruments, США) об’єктивів x20 та x100
(Nikon, Японія). Режим сумації 128 окремих зображень був використаний у
експериментах з поодинокими гранулами для підвищення співвідношення
сигнал/шум.

Вимірювання вивільнення іонів кальцію із поодиноких клітин за допомогою
методу крапельки.

Головна ідея методу крапельки – це утримання клітини у дуже маленькій за
об’ємом крапельці зовнішньоклітинного розчину. Об’єм такої крапельки
повинен бути настільки малим, щоб кількість кальцію вивільненого із
ізольованої клітини була достатньою для того, щоб викликати такі за
величиною зміни зовнішньоклітинної концентрації кальцію, які можна було
б виміряти. Крапельку утворюють на поверхні силіконізованого покровного
скла та покривають мінеральною олією для того, щоб запобігти швидкому
випаровуванню. Клітину та зовнішньоклітинний розчин наповнюють
індикаторами кальцію різних типів. Оптичні характеристики цих
індикаторів підбирають таким чином, щоб надати можливість синхронних
вимірів внутрішньоклітинної та зовнішньоклітинної концентрацій кальцію.
Клітина у крапельці може при цьому стимулюватися агоністами, які
прикладають через мікропипетки, вставлені у крапельку. Оцінка об’єму
клітини та крапельки дозволяє експериментатору виміряти всі зміни
загальної концентрації кальцію як у клітині так і у крапельці.

Вимірювання вивільнення іонів кальцію із поодиноких клітин за допомогою
важких декстранів.

Експерименти по вимірюванню вивільнення Ca2+ за допомогою важких
декстранів є технічно набагато простішими, ніж вимірювання вивільнення
кальцію із використанням методу краплинки. Перевагою такого типу
експериментів є те, що на рівні одиночної клітини реєструється не тільки
загальна кількість виділення кальцію, але і її локальна інтенсивність.

Ми сповільнювали поширення кальцію із місця вивільнення за допомогою
кальцієвого буфера із великою молекулярною вагою (Calcium Green-1,
декстран, МW 500.000) який одночасно використовувався як кальцієвий
індикатор. Це створило необхідні умови для локалізації місць вивільнення
кальцію за допомогою конфокального мікроскопа.

Для експериментів готували зовнішньоклітинний розчин, який містив 30-100
мкМ кальцій-чутливого барвника, зв’язаного із декстраном. Для підвищення
чутливості методики із використанням Calcium Green-1 декстрана, цей
декстран був єдиним кальцієвим буфером у зовнішньоклітинному розчині.

Після цього ізольовані клітини відмивали у безкальцієвому розчині та
ресуспендували у безкальцієвому розчині, який містив Calcium Green-1
декстран. 200 мкл клітинної суспензії наливали у експериментальну камеру
і рзміщували камеру на столику конфокального мікроскопу. У разі
довготривалого експерименту (більше, ніж 10 хв.), розчин вкривали
мінеральною олією.

Для стимуляції клітин агоністами використовували локальну їх аплікацію.
Наприклад, мікроелектрод заповнювали розчином із 10 – 20 мМ АХ. При
цьому опір мікроелектрода становив 40 – 50 МОм при заповненні його 1М
КСl. В експериментальну камеру вносили інший електрод (срібну дротину,
вкриту AgCl). Прикладали постійний струм, що не дозволяв АХ виходити з
мікроелектрода (5 – 10 нА). Розміщували кінчик електрода на відстані 50
– 100 мкм від групи клітин, які планували стимулювати. Для стимуляції
клітин прикладали вхідний струм у зворотному напрямку (у наших
експериментах – 10 – 100 нА).

Аналіз даних. Аналіз даних та зображень виконували з використанням
аналітичних програмних продуктів: 2D Intervision Analysis Software,
Noran Instruments, США; QuantiCell, Applied Imaging, UK; Tida HEKA
Electronics, Germany; Origin 3.54, Microcal Software, США; Excel 2000,
Microsoft, США). Як що не вказано іншого, результати представлені як
середні значення ± середньоквадратична похибка при обсязі вибірки n.
Вірогідність розходжень між значеннями визначали за критерієм
t-Стьюдента. Різницю вважали достовірною при р < 0.05. Результати Досліджень Вивільнення Сa2+ із одиночних ізольованих панкреатичних зимогенних гранул, викликане інозитолом трифосфатом та циклічною АДФ-рибозою. Існує важливий клас викликаних агоністом цитозольних Ca2+ сигналів, причиною яких є стимульоване медіаторами вивільнення Ca2+ із депо всередині клітини. Найбільш важливим посередником вивільнення Ca2+ є IP3 і, виходячи із того, що вивільнення Ca2+ із ЕР спричинюється IP3 QUOTE "(Streb, Bayerdorffer et al. 1984)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00!(Streb, Bayerdorffer et al. 1984)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Ен\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\1A\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03327(Streb, Bayerdorffer, et al. 1984 327 /id\00(\00 (Streb et al. 1984) , загальноприйнятою стала та точка зору, що агоністи викликають Ca2+ сигнали у цитозолі через опосередковане IP3 вивільнення Ca2+ із ЕР QUOTE "(Berridge 1993;Clapham 1995)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1C(Berridge 1993;Clapham 1995)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\ 00рTъ\01Н‹хwи\06\08\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\00 \00\00\00\003DщwXоы\01Н‹хwЁ\07\07\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwXо\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003DщwXо\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwXо\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003DщwXо\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0227\14Berridge 1993 27 /id\00\14\00 (Berridge 1993; Clapham 1995) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\014\12Clapham 1995 4 /id\00\12\00 . На високополяризованих панкреатичних ацинарних клітинах було показано, що низькі (фізіологічні) концентрації пептидного гормону CCK, або нейропередатчика АХ викликають локальні спайки [Ca2+] у цитозолі апікального секреторного полюса (область секреторних гранул) QUOTE "(Tepikin, Voronina et al. 1992b)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00 (Tepikin, Voronina et al. 1992b)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00аv\16\02 р\ 12\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\18\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw8ћ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw8ћ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\05\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw8ћ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw8ћ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\013$Tepikin, Voronina, et al. 1992 3 /id\00$\00 (Tepikin et al. 1992b) . Ці спайки можуть виникати як одиночні, або повторюватися, і у деяких випадках вони можуть передувати довготривалим Ca2+ сигналам, які поширюються по клітині QUOTE "(Thorn, Lawrie et al. 1993;Kasai, Li et al. 1993)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\001(Thorn, Lawrie et al. 1993;Kasai, Li et al. 1993)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Ен\01 р\12\ 00PЊы\01Н‹хwи\06\14\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\ 00\00\00\00\003DщwШw\16\02Н‹хwЁ\07\10\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwШw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003DщwШw\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwШw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003DщwШw\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0267\1DKasai, Li, et al. 1993 67 /id\00\1D\00 (Thorn et al. 1993; Kasai et al. 1993) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03112"Thorn, Lawrie, et al. 1993 112 /id\00"\00 . Локальні спайки [Ca2+] у секреторному полюсі виникають не завдяки локалізації рецепторів для CCK чи АХ у апікальній частині клітини, оскільки внутрішньоклітинна інфузія IP3 (чи неметаболізуючихся аналогів IP3) спричинює спайки [Ca2+], які повторюються та або обмежуються секреторним полюсом, або виникають у цій частині клітини, а потім поширюються по ній QUOTE "(Thorn, Lawrie et al. 1993)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1B(Thorn, Lawrie et al. 1993)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\14\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03112"Thorn, Lawrie, et al. 1993 112 /id\00"\00 (Thorn et al. 1993) . Селективні мікроін’єкції IP3 у область секреторного полюса чи базальної частини клітини дозволяють встановити, що у секреторному полюсі існує механізм вивільнення Ca2+, чутливість якого до вторинних посередників є набагато вищою, ніж у базальній частині клітини QUOTE "(Kasai, Li et al. 1993)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\17(Kasai, Li et al. 1993)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00аv\16\02 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\10\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwЂw\15\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwЂw\15\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwЂw\15\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwЂw\15\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0267\1DKasai, Li, et al. 1993 67 /id\00\1D\00 (Kasai et al. 1993) . Також було показано, що фокальна аплікація АХ на базальну частину клітини може викликати підвищення цитозольного Ca2+ у секреторному полюсі на деякій відстані від місця генерації вторинного посередника QUOTE "(Thorn, Lawrie et al. 1993)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1B(Thorn, Lawrie et al. 1993)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\14\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03112"Thorn, Lawrie, et al. 1993 112 /id\00"\00 (Thorn et al. 1993) . Це відбувається, найвірогідніше, завдяки швидкій дифузії дуже мобільного посередника (IP3) до області секреторного полюсу, яка є надзвичайно високочутливою до IP3 QUOTE "(Kasai and Petersen 1994)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\19(Kasai and Petersen 1994)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00аv\16\02 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\12\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwHП\00\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwHП\00\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwHП\00\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwHП\00\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\016\1BKasai & Petersen 1994 6 /id\00\1B\00 (Kasai and Petersen 1994) . Всі ці дані вказують на те, що у панкреатичних ацинарних клітинах полюс секреції відіграє свою специфічну роль у Ca2+ сигнальних процесах внаслідок своєї високої чутливості до IP3, що відбувається, найімовірніше, завдяки як відносно високій концентрації IP3 рецепторів у цій області та/чи тому, що IP3 рецептори секреторного полюсу мають особливо високу афінність до IP3 QUOTE "(Petersen, Petersen et al. 1994)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00 (Petersen, Petersen et al. 1994)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\19\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwpnе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwpnе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwpnе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwpnе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03302'Petersen, Petersen, et al. 1994 302 /id\00'\00 (Petersen et al. 1994) . Імунохімічними дослідженнями було показано, що IP3 рецептори типу 3 специфічно локалізовані у секреторному полюсі панкреатичних ацинарних клітин QUOTE "(Nathanson, Fallon et al. 1994)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1F(Nathanson, Fallon et al. 1994)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00аv\16\02 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\18\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03323&Nathanson, Fallon, et al. 1994 323 /id\00&\00 (Nathanson et al. 1994) . Хочеться також відмітити, що локальні спайки [Ca2+]і у секреторному полюсі фізіологічно важливі, оскільки, як показали вимірювання ємності, вони є достатніми для того, щоб викликати секрецію (екзоцитоз) QUOTE "(Maruyama, Inooka et al. 1993;Maruyama and Petersen 1994)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\009(Maruyama, Inooka et al. 1993;Maruyama and Petersen 1994)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\ 00рTъ\01Н‹хwи\06\17\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwX7‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwX7‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwX7‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\00 \00\00\00\003Dщw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07\15\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw°Ћ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw°Ћ\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw°Ћ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw°Ћ\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0266$Maruyama, Inooka, et al. 1993 66 /id\00$\00 (Maruyama et al. 1993; Maruyama and Petersen 1994) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0225\1FMaruyama & Petersen 1994 25 /id\00\1F\00 . Добре відомо з результатів численних електронномікроскопічних досліджень, що у панкреатичних ацинарних клітинах в області секреторного полюсу знаходяться численні гранули зимогену (ЗГ), тоді як у базальній частині клітини знаходяться переважно ядро та ЕР QUOTE "(Kern 1986;Gorelick and Jamieson J D 1994)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00*(Kern 1986;Gorelick and Jamieson J D 1994)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Ен\01 р\12\ 00PЊы\01Н‹хwи\06\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw8ћ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw8ћ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw8ћ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\ 00\00\00\00\003DщwXоы\01Н‹хwЁ\07\19\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwXо\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003DщwXо\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwXо\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003DщwXо\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03253$Gorelick & Jamieson J D 1994 253 /id\00$\00 (Kern 1986; Gorelick and Jamieson 1994) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0214\10Kern 1986 14 /id\00\10\00 . Той факт, що фізіологічно важливі цитозольні [Ca2+] сигнали виникають у області, яка переважно містить ЗГ, але не у частині, у якій домінує ЕР, спонукав нас досліджувати можливості ЗГ, про які відомо те, що вони мають високий вміст кальцію QUOTE "(Clemente and Meldolesi 1975;Nakagaki, Sasaki et al. 1984;Nicaise, Maggio et al. 1992)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00V(Clemente and Meldolesi 1975;Nakagaki, Sasaki et al. 1984;Nicaise, Maggio et al. 1992)\01\0D\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\ 00рTъ\01Н‹хwи\06\16\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\ 00\00\00\00\003DщwШw\16\02Н‹хwЁ\07\17\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwШw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003DщwШw\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwШw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ хw|л\12\00\00\00\00\003Dщw0e\08\02Н‹хwЁ\07\16\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03317!Clemente & Meldolesi 1975 317 /id\00!\00 (Clemente and Meldolesi 1975; Nakagaki et al. 1984; Nicaise et al. 1992) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03322%Nakagaki, Sasaki, et al. 1984 322 /id\00%\00 QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0213#Nicaise, Maggio, et al. 1992 13 /id\00#\00 і можуть вивільняти частину цього кальцію у відповідь на стимуляцію IP3. Yoo та Albanesi QUOTE "(Yoo and Albanesi 1990)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\17(Yoo and Albanesi 1990)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00`w\16\02 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\10\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwЂw\15\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwЂw\15\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwЂw\15\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwЂw\15\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03305\1BYoo & Albanesi 1990 305 /id\00\1B\00 (Yoo and Albanesi 1990) описали експерименти, у яких IP3 викликав підвищення концентрації Ca2+ (час наростання до піку близько 1 хвилини) навколо популяції ізольованих адренальних хромафінних гранул, але це спостереження вважалося деякими дослідниками недостовірним QUOTE "(Kasai 1995)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\0C(Kasai 1995)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Ен\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\05\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03320\12Kasai 1995 320 /id\00\12\00 (Kasai 1995) . У цьому розділі дисертаційної роботи ми описуємо результати експериментів у яких, використовуючи конфокальну мікроскопію та новітні методи описані в попередніх розділах, нам пощастило провести вимірювання концентрації вільного Ca2+ всередині одиночних секреторних гранул і в екстрагранулярному просторі дуже близько до поодиноких ізольованих ЗГ. Далі ми покажемо, що IP3 та інший можливий посередник вивільнення Ca2+ - циклічна АДФ рибоза (cADPr) спричинює помітне зниження концентрації Ca2+ всередині одиночної ЗГ. Використовуючи новітню методику високої роздільної здатності ми також продемонстрували, що локальна іонофоретична аплікація IP3 призводить до швидкого та крутого наростання концентрації Ca2+ (час наростання до піка близько 5 сек.) назовні ЗГ. Ми вважаємо, що ці результати прямо показують, що внаслідок дії вторинних посередників може відбуватися вивільнення кальцію із секреторних гранул яке має часову розгортку відповідну до генерації спайків цитозольної [Ca2+]. Приготування препарату ЗГ Для того, щоб вивчати здатність IP3 та cADPr викликати вивільнення Ca2+ із ЗГ, нам було необхідно отримати їх високоочищену фракцію. Одночасно процедура ізоляції повинна була бути досить швидкою для того, щоб зберегти можливість гранул відповідати на дію посередників. Ми отримували переважно одиночні гранули, які виглядають, як чорні сфери (ЗГ ефективно абсорбують світло при довжинах хвиль близько 500 нм). Більшість ЗГ добре забарвлюються флуоресцентним кальцієвим барвником mag-Fura Red. Після того, як були отримані зображення, до експериментальної камери додавали специфічний барвник для кислотних органел Lizo Tracker. Флуоресцентне зображення від тієї самої області записували через 5 хв. (збудження - 488 нм, емісія - 515 - 560 нм). Більшість ЗГ яскраво забарвлюються цим барвником, що свідчить про те, що інтрагранулярний простір, має кислі властивості. У деяких експериментах для досягнення цієї ж мети використовували замість Lizo Tracker акридиновий помаранчевий і отримували подібні результати. Ми також перевіряли, чи не відбувається у наших експериментах забруднення препарату гранул компонентами ендоплазматичного ретикулуму. Одиночні гранули не виявляли ніякої помітної флуоресценції після фарбування ЕР за допомогою DiOC6(3), але вони яскраво флуоресцували при використанні Lizo Tracker. У паралельних експериментах, DiOC6(3) при подібних умовах яскраво забарвлював часточки панкреатичного гомогенату, який ми використовували для ізоляції секреторних везикул. У попередніх експериментах на ізольованому ядрі QUOTE "(Gerasimenko, Gerasimenko et al. 1995)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00&(Gerasimenko, Gerasimenko et al. 1995)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00`w\16\02 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\1F\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwHП\00\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwHП\00\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwHП\00\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwHП\00\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03299-Gerasimenko, Gerasimenko, et al. 1995 299 /id\00-\00 (Gerasimenko et al. 1995) ми також змогли продемонструвати яскраве забарвлення ядерної оболонки (зовнішня ядерна мембрана має властивості ЕР), використовуючи такі ж самі концентрації флуоресцентного маркера ЕР QUOTE "(Gerasimenko, Gerasimenko et al. 1995)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00&(Gerasimenko, Gerasimenko et al. 1995)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Ен\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\1F\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwpnе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwpnе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwpnе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwpnе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03299-Gerasimenko, Gerasimenko, et al. 1995 299 /id\00-\00 (Gerasimenko et al. 1995) . Таким чином, ми зробили висновок про те, що наш препарат зимогенних гранул практично вільний від забруднення ЕР. Цей висновок підкріплюється також тим, що Tg, специфічний інгібітор Ca2+-ATФаз в ЕР, був неспроможний викликати вивільнення Ca2+ із ЗГ (дивись нижче). Таблиця 1. Розподілення ?-амілази та білку у субклітинних фракціях, ізольованих із підшлункової залози миші. Фракції Об’єм, мл Білок ?-амілаза Збагачення (рази) мг/мл Вихід, % Од/мл Вихід, % Гомогенат 7 3,9 100 69,4 100 1 Гранули (ЗГ) 1 1 3,6 208 10,7 3 Активність ?-амілази та загальної концентрації білків були виміряні у фракції ЗГ та в клітинному гомогенаті. Як це показано у таблиці 1, фракція ЗГ містила в 3 рази вищу концентрацію ?-амілази ніж гомогенат, відповідно до тих значень, які вже наводилися раніше QUOTE "(Fuller, Deetjen et al. 1989)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1D(Fuller, Deetjen et al. 1989)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00`w\16\02 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\16\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03319$Fuller, Deetjen, et al. 1989 319 /id\00$\00 (Fuller et al. 1989) . Вивільнення Ca2+ в екстрагранулярне середовище Для вимірювання змін концентрації вільного Ca2+ у середовищі навколо ізольованих секреторних гранул ми поміщали 10 мкл концентрату ЗГ, які містили 100 мкМ fluo-3 або indo-1 (взяті із 2 мМ маточних розчинів) у експериментальну камеру на столику конфокального мікроскопа (Норан, США) із об’єктивом зі збільшенням 20 (Найкон, Японія). Вимірювання із fluo-3 проводили при довжині хвилі збудження 488 нм та довжинах хвиль випромінювання 510 - 560 нм. Для indo-1 ми використовували довжину хвилі збудження 363 нм та реєстрували співвідношення емісії при 405 нм та 495 нм. Концентрація вільного кальцію у екстрагранулярному середовищі становила 160 + 7 нм. Для вивчення впливу IP3 ми використовували як нормальний D-міо-інозитол 1,4,5 трифосфат, так і неметаболізуючийся аналог D-міо-інозитола 1,4,5 трифосфата, 3-деокси-3- флуoро IP3 QUOTE "(Parekh, Foguet et al. 1993;Wilcox, Challiss et al. 1994)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\009(Parekh, Foguet et al. 1993;Wilcox, Challiss et al. 1994)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Ен\01 р\12\ 00PЊы\01Н‹хwи\06\15\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\ 00\00\00\00\003DщwШa\1B\02Н‹хwЁ\07\17\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwШa\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003DщwШa\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwШa\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003DщwШa\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03325#Parekh, Foguet, et al. 1993 325 /id\00#\00 (Parekh et al. 1993; Wilcox et al. 1994) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03330%Wilcox, Challiss, et al. 1994 330 /id\00%\00 . Подібні результати були отримані для обох агентів і дані, таким чином, були об’єднані. Аплікація 5 мкМ IP3 (рис. 1А) спричинювала помітне зростання зовнішньогранулярної концентрації Ca2+ у 3 експериментах. IP3 у концентрації 25 мкМ викликав зростання екстрагранулярної концентрації вільного Ca2+ (рис. 1B) до 55 + 5 нм (n = 15). Це відповідає підвищенню загальної концентрації вільного кальцію у середовищі до величини приблизно 5 мкМ. І це одночасно відповідає спаданню до величини приблизно 0.5 мМ загальної концентрації кальцію у гранулах. Гепарин (0.2 мг/мл) знімав ефект IP3 (25 мкМ) у всіх 3 проведених експериментах такого типу. Аплікація cADPr (1 мМ маточний розчин, розведений до фінальної концентрації 25 мкМ) викликала підвищення [Ca2+] у екстрагранулярному середовищі на 49 + 7 нм (n = 6) (рис. 1C). Це відповідає зростанню загальної концентрації кальцію у середовищі до 4.3 мкМ, що відповідає зниженню до 0.43 мМ загальної концентрації кальцію у гранулах. Подібні результати були отримані для indo-1, коли його використовували замість fluo-3 (IP3: n = 20, cADPr: n = 7). Як IP3 , так і cADPr могли бути забруднені кальцієм. Для того, щоб це перевірити, ми проводили контрольні експерименти та знайшли, що обидві речовини - IP3 та cADPr (обидві по 25 мкМ), якщо їх додавати у подібне середовище без ЗГ, викликали зростання концентрації вільного кальцію менше, ніж на 5 нМ. Тапсігаргін (Tg) (10 мкМ), специфічний блокатор Ca2+ -АТФаз у ЕР QUOTE "(Thastrup, Cullen et al. 1990;Petersen, Petersen et al. 1994;Pozzan, Rizzuto et al. 1994;Clapham 1995)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00f(Thastrup, Cullen et al. 1990;Petersen, Petersen et al. 1994;Pozzan, Rizzuto et al. 1994;Clapham 1995)\01\11\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00аv\16\02 р\1 2\00рTъ\01Н‹хwи\06\17\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\00 \00\00\00\003Dщw8ћ\16\02Н‹хwЁ\07\19\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw8ћ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw8ћ\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw8ћ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ хw|л\12\00\00\00\00\003Dщwђ]й\01Н‹хwЁ\07\16\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщwђ]\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщwђ]\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщwђ]\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ хw|л\12\00\00\00\00\003Dщw8ћ\16\02Н‹хwЁ\07\07\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw8ћ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw8ћ\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw8ћ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw8ћ\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\014\12Clapham 1995 4 /id\00\12\00 (Thastrup et al. 1990) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03302'Petersen, Petersen, et al. 1994 302 /id\00'\00 QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0285#Pozzan, Rizzuto, et al. 1994 85 /id\00#\00 QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03328%Thastrup, Cullen, et al. 1990 328 /id\00%\00 не викликав ніяких помітних змін у флуоресценції fluo-3 (рис. 1D), але якщо після цього додавався IP3, то виникала така ж відповідь, як і раніше (n = 7). Для того, щоб оцінити максимальну кількість вивільненого із зимогенних гранул кальцію, у експериментальну камеру вміщували по 10 мкл зразків гранул. До камери додавали indo-1 (200 мкМ) та 1 мМ EGTA. Вивільнення кальцію спричиняли додаванням 20 мкМ іономіцину або 0.5% Тритона X 100. Кількість кальцію, вивільненого із гранул, оцінювали при додаванні кальцію у різних кількостях як після додавання агентів, так і у контрольних експериментах. Загальна концентрація вивільненого кальцію у об’ємі гранул становила 13 + 3 мМ (n = 4) Вимірювання змін інтрагранулярної концентрації вільного кальцію Для того, щоб вивчити зміни концентрації вільного Ca2+ всередині гранул, ми проводили їх інкубацію із mag-Fura Red AM, використовуючи загальний підхід, який розробили Хофер та Мачен QUOTE "(Hofer and Machen 1993)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\17(Hofer and Machen 1993)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Дн\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\10\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0286\1AHofer & Machen 1993 86 /id\00\1A\00 (Hofer and Machen 1993) . Вимірювання проводили при довжині хвилі збудження 488 нм та довжині хвилі випромінювання близько 590 нм. Оцінена таким чином концентрація вільного Ca2+ всередині гранул (припускаючи, що Kd для mag-Fura Red для Ca2+ становить 17 мкМ) була 55 + 4 мкМ (n = 25). IP3 (25 мкМ) викликав 30 + 3% (n = 8) зниження концентрації вільного Ca2+ всередині гранул у порівнянні із його рівнем перед стимуляцією. Таким чином, інтрагранулярна концентрація Ca2+ стабілізувалася на новому рівні. cADPr (25 мкМ) також спричинював зниження інтрагранулярної концентрації Ca2+ на 25 + 3% (n = 5) від його рівня перед аплікацією. Аплікація 10 мкМ Tg не змінювала концентрацію інтрагранулярного Ca2+, але знову ж, коли після цього додавали IP3, то спостерігалося його помітне зниження (n = 5). Вимірювання концентрації вільного Ca2+ всередині одиночної ЗГ Вимірювання на одиночних гранулах проводили на препаратах, навантажених mag-Fura Red (збудження 488 нм та випромінювання >590 нм). Області із
гранулами вибиралися при використанні режиму прохідного світла
конфокального мікроскопу. Для експериментів вибиралися ділянки, що мали
зображення темних круглих частинок із діаметром приблизно 1 мкм. На рис.
2 A-C показані результати експерименту, у якому одночасне вимірювання
флуоресценції проведене для шести ізольованих гранул у полі зору.
Вибрані для вимірювання флуоресценції ділянки співпадали із яскравими
часточками такого ж розміру, що і темні у прохідному світлі. Виміряна
концентрація вільного Ca2+ всередині одиночних гранул становила 50 + 1
мкМ (n = 70). IP3 інжектували у середовище поблизу гранул, які були
вибрані для експерименту, і це спричиняло зниження у них
інтрагранулярної концентрації вільного Ca2+ на 25 + 3% (n = 30) (рис.
2A). Подібні ж відповіді отримували, використовуючи ін’єкцію cADPr
(зниження на 30 + 5%, n = 24, рис. 2B). Додавання 10 мкМ Tg не викликало
ніяких змін (n = 24, рис. 2С).

Вимірювання змін концентрації вільного Ca2+ у середовищі навколо
одиночної секреторної гранули

Вимірювання вивільнення Ca2+ із одиночної ЗГ проводили, використовуючи
Calcium Green-1 декстран (збудження — 488 нм, випромінювання — 510-560
нм). Поля із одиночними гранулами вибирали, використовуючи можливості
конфокального мікроскопа для реєстрації у прохідному світлі (рис. 3).
Цікаві ділянки вибирали так, щоб одна із них знаходилася поблизу
секреторної гранули (контроль), а інша – на відстані 10-15 мкм від
гранули. Аплікацію IP3 виконували, використовуючи іонофоретичну ін’єкцію
(рис. 3). Записи інтенсивностей флуоресценції для випадку Calcium
Green-1 декстрану (70kD) показані на рис. 3 D. Верхній запис демонструє
сигнал, заміряний у боксі поблизу гранули (рис. 3 A,B,C), нижній запис
відповідає боксу, розміщеному на відстані 15 мкМ від гранули (поза полем
зору, зображеному на рис. 3 A,B,C). Ін’єкції IP3 викликали швидке
вивільнення Ca2+ із одиночних ЗГ (n=3) та із маленьких кластерів гранул
(n=6). Швидкоминаюче підвищення концентрації вільного Ca2+, яке можна
було зареєструвати за допомогою боксу, розміщеного поблизу гранули,
слабо реєструвалося вже на відстані кілька мікрон від гранули, і ніяких
змін не можна було зареєструвати вдалині, на відстані у 10 мкм.
Контрольна ін’єкція IP3 у те ж саме середовище, але без ЗГ не викликала
ніяких змін у інтенсивності флуоресценції.

Зміни у концентрації вільного цитозольного Ca2+ в інтактних клітинах
внаслідок дії ацетилхоліну або тапсігаргіну

У попередніх експериментах було багаторазово задокументовано, що AХ та
CCK викликають зміни у концентрації цитозольного вільного кальцію
([Ca2+]i), які або обмежуються областю секреторних гранул, або виникають
в цій області, а потім поширюються на інші частини клітини QUOTE
«(Thorn, Lawrie et al. 1993;Kasai and Augustine 1990;Toescu, Lawrie et
al. 1992;Kasai, Li et al. 1993)» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00e(Thorn, Lawrie et al. 1993;Kasai and Augustine
1990;Toescu, Lawrie et al. 1992;Kasai, Li et al.
1993)\01\11\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\
00PЊы\01Н‹хwи\06\14\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwpnе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwpnе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwpnе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\00
\00\00\00\003DщwHП\00\02Н‹хwЁ\07\13\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwHП\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwHП\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwHП\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ
хw|л\12\00\00\00\00\003Dщwpnе\01Н‹хwЁ\07\15\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщwpn\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003Dщwpn\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщwpn\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ
хw|л\12\00\00\00\00\003DщwHП\00\02Н‹хwЁ\07\10\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwHП\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwHП\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwHП\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwHП\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03301\1EKasai & Augustine 1990 301
/id\00\1E\00 (Thorn et al. 1993; Kasai et al. 1993) QUOTE «» ADDIN
REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0267\1DKasai, Li, et al. 1993 67
/id\00\1D\00 QUOTE «» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03112″Thorn, Lawrie, et al. 1993 112
/id\00″\00 QUOTE «» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0269″Toescu, Lawrie, et al. 1992 69
/id\00″\00 . Toeску та ін. QUOTE «(Toescu, Lawrie et al. 1992)»
ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1C(Toescu, Lawrie et al.
1992)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00аv\16\02 р\1
2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\15\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0269″Toescu, Lawrie, et al. 1992 69
/id\00″\00 (Toescu et al. 1992) показали, що на відміну від дії
стимуляторів секреції, специфічний інгібітор ЕР Ca2+-АТФаз, Tg, головним
чином викликає вивільнення Ca2+ із базолатеральних областей
панкреатичних ацинарних клітин QUOTE «(Thastrup, Cullen et al. 1990)»
ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1E(Thastrup, Cullen et al.
1990)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00`w\16\02 р\1
2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\17\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03328%Thastrup, Cullen, et al. 1990 328
/id\00%\00 (Thastrup et al. 1990) . Результатами своїх експериментів
Toeску та ін. показали, що коротка попередня стимуляція AХ викликала
помітне підвищення [Ca2+]і у області секреторних гранул, а після цього
клітина могла відновити концентрацію [Ca2+]i у області секреторних
гранул і повернутись до нормальних стану перед аплікацією Tg. Однак
можна було заперечити, що той факт, що у таких експериментах Tg не
викликав вивільнення Ca2+ із області секреторних гранул QUOTE
«(Toescu, Lawrie et al. 1992)» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\1C(Toescu, Lawrie et al.
1992)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00`w\16\02 р\1
2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\15\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0269″Toescu, Lawrie, et al. 1992 69
/id\00″\00 (Toescu et al. 1992) можна пояснити попереднім, викликаним
АХ, вивільненням Ca2+ у цій області. Виходячи із точки зору наведених
вище даних які вказують на те, що Tg не може вивільнювати Ca2+ із
ізольованих ЗГ, нам було цікаво протестувати інтактні клітини,
використовуючи конфокальний мікроскоп і з’ясувати, де все ж таки
відбувається первинне вивільнення Ca2+, викликане Tg. Підвищення Ca2+,
виклікане короткою іонофоретичною аплікацією AХ відбувалося дуже
специфічно у гранулярній секреторній області. Як і у попередньо
опублікованих даних, Tg викликав повільне зростання [Ca2+]i переважно у
базолатеральній області.

Таким чином у даній частині дисертаційної роботи ми визначали, чи є ЗГ
кальцієвими депо у секреторних клітинах і чи можуть вивільнювати Ca2+ із
ЗГ такі посередники, як IP3 та циклічна АДФ-рибоза. У експериментах на
одиночних ізольованих ЗГ із використанням конфокальної мікроскопії ми
показали, що IP3 та cADPr викликають помітне спадання концентрації
вільного інтрагранулярного Ca2+. Використовуючи новий метод, ми
вимірювали зміни у концентрації Ca2+ поблизу ізольованих ЗГ та показали,
що IP3 та cADPr викликають швидке вивільнення Ca2+ із гранул, чим можна
пояснити явище викликаного агоністом підвищення цитозольного Ca2+ у
секреторному полюсі ацинарних клітин.

Локалізація місць виділення Сa2+ в панкреатичних ацинарних клітинах

Еволюційним шляхом в клітинах утворилася складна система для підтримки
низьких концентрацій Ca2+ шляхом видалення Ca2+ із цитоплазми після
того, як він туди потрапив як шляхом вивільнення із внутрішньоклітинних
депо, так і внаслідок потрапляння Ca2+ через канали плазматичної
мембрани. Власне, Ca2+ може бути видалено із цитозолю різноманітними
системами плазматичної мембрани QUOTE «(Kessler, Bennardini et al.
1990;Tepikin, Voronina et al. 1992a;Ashley, Griffiths et al. 1993;Piper,
Siegmund et al. 1993)» ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00z(Kessler,
Bennardini et al. 1990;Tepikin, Voronina et al. 1992a;Ashley, Griffiths
et al. 1993;Piper, Siegmund et al.
1993)\01\11\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Ен\01 р\12\
00PЊы\01Н‹хwи\06\1A\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwЂw\15\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwЂw\15\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwЂw\15\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\
00\00\00\00\003Dщw0e\08\02Н‹хwЁ\07\18\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\05\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ
хw|л\12\00\00\00\00\003DщwЂw\15\02Н‹хwЁ\07\18\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ
хw|л\12\00\00\00\00\003Dщw0e\08\02Н‹хwЁ\07\16\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0236%Ashley, Griffiths, et al. 1993 36
/id\00%\00 (Ashley et al. 1993; Piper et al. 1993) QUOTE «» ADDIN
REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\019&Kessler, Bennardini, et al. 1990 9
/id\00&\00 QUOTE «» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0235#Piper, Siegmund, et al. 1993 35
/id\00#\00 QUOTE «» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\012$Tepikin, Voronina, et al. 1992 2
/id\00$\00 . Однак, не дослідженою до цього часу проблемою є
просторове розподілення вивільнення у позаклітинний простір на
клітинному рівні. Як правило, оцінки просторового розподілу активності
різних типів регуляторних систем плазматичної мембрани робляться на
основі вивчення змін у [Ca2+]і. Однак, інтерпретація результатів таких
вимірювань є неоднозначною внаслідок інтерференції із іншими кальцієвими
регуляторними системами (такими, як буфери Ca2+, механізми захвату Ca2+)
та неоднорідностями дифузії Ca2+ всередині клітин.

Розробивши теоретичне і практичне обґрунтування для застосування
розроблених нами новітніх методів вимірів просторово-часових
характеристик потоків іонів кальцію через плазматичну мембрану клітин,
ми розпочали серії дослідів, націлених на дослідження місць виділення
Ca2+ в панкреатичних ацинарних клітинах мишей.

Швидке зростання [Ca2+]i, спричинене аплікацією АХ, викликало зниження
інтенсивності флуоресценції Fura Red, за яким слідувало зростання
інтенсивності флуоресценції Calcium Green-1 декстрану, що означало
вивільнення Ca2+ із клітин у оточуюче середовище. Стимуляція цього типу
(за допомогою 10 мкМ АХ) завжди викликала зростання [Ca2+]i, яке
починалося у секреторному полюсі, а потім швидко (протягом кількох
секунд) поширювалося по всій ацинарній клітині QUOTE «» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0269″Toescu, Lawrie, et al. 1992 69
/id\00″\00 . Теоретично можливо, що нерівномірний внутрішньоклітинний
розподіл Fura Red може викликати подібні зміни у часі виділення Ca2+ у
різних частинах клітини, і тому більшість описаних експериментів ми
проробили на клітинах, які не були навантажені ніякими флуоресцентними
індикаторами. У цих експериментах для реєстрації вивільнення Ca2+ ми
використовували тільки зовнішньоклітинний індикатор.

На рис. 4 показані результати експериментів на кластері ацинарних
клітин, який знаходився у розчині із Calcium Green-1 декстраном.
Конфокальний мікроскоп був використаний у цьому досліді для того, щоб
зареєструвати місця виділення Ca2+ із стимульованих клітин. На рис. 4A
подано зображення клітинного кластера у прохідному світлі, із якого
видно, що секреторні гранули локалізовані у центрі зображення. На рис.
4B показане флуоресцентне зображення оптичної площини, яка проходить
через частину кластера із 4 клітинами, які оточують псевдолюмен. Три
бокси, які видно на зображенні, вказують місця, у яких велася реєстрація
Ca2+-залежної флуоресценції. Короткий, але інтенсивний період
іонофоретичної стимуляції АХ спричиняє зростання зовнішньоклітинної
концентрації Ca2+ у всіх 3 областях, де спостерігали флуоресценцію. Але,
як це видно із рис. 4C, найбільше посилення флуоресценції реєстрували у
боксі 1, розміщеному поблизу центра кластера біля псевдолюмена.

Можна заперечити, що результати, наведені на рис. 4, пояснюються тими
обмеженнями, яких зазнає дифузія Ca2+ із люмена. Тому ми вирішили
проробити експерименти, у яких оптична площина взагалі не проходить
через клітинний кластер. В наступних експериментах світловий потік
флуоресценції збирали із шару, який знаходиться як раз над верхньою
поверхнею кластера.

На рис. 5 показані результати таких експериментів на кластері із 4
ацинарних клітин, які омивалися розчином, який містив Calcium Green-1
декстран. На рис. 5a зображення кластера у прохідному світлі, яке
демонструє центральне розташування секреторних гранул. Всі інші
зображення із цього набору демонструють псевдокольорову інтенсивність
флуоресценції Calcium Green-1 декстрану у зовнішньоклітинному розчині.
Для зручності на всіх флуоресцентних зображеннях розмістили обриси
кластеру клітин, взяті із зображення, отриманого у прохідному світлі. На
рис. 5(b-h) подано зображення, зроблені із 10 секундним інтервалом
безпосередньо перед (b) та після стимуляції АХ (c-h) , тоді як на рис. 5
i показана картинка, зареєстрована більш ніж через 100 сек. після того,
як була досягнута максимальна концентрація зовнішньоклітинного Ca2+. Із
рис. 5 видно, що максимальну інтенсивність флуоресценції реєстрували
поблизу зони секреторних гранул. Підвищення інтенсивності флуоресценції
явище недовготривале, воно продовжується тільки 200 сек., і не залежить
від того чи продовжується стимуляція АХ. Цього можна очікувати, оскільки
зовнішньоклітинна концентрація Ca2+ у наших експериментах підтримувалася
достатньо низькою для того, щоб не допустити вхід Ca2+ у клітину після
того, як були вичерпані всі запаси мобілізованого Ca2+ як це було
показано раніше у роботах QUOTE «(Tepikin, Voronina et al.
1992a;Tepikin, Voronina et al. 1992b)» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00?(Tepikin, Voronina et al. 1992a;Tepikin,
Voronina et al.
1992b)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Дн\01 р\12
\00PЊы\01Н‹хwи\06\18\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\05\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\
00\00\00\00\003Dщw\18L‰\01Н‹хwЁ\07\18\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщw\18L\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourie
r New CYR\00\00\003Dщw\18L\01\00\00\00Е\00\14к\05\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщw\18L\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourie
r New CYR\00\00\003Dщw\18L\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\013$Tepikin, Voronina, et al. 1992 3
/id\00$\00 (Tepikin et al. 1992) QUOTE «» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\012$Tepikin, Voronina, et al. 1992 2
/id\00$\00 . Подібні результати були продемонстровані у 14
експериментах даної серії.

Для того, щоб покращити результати по розрізненню місць виділення Ca2+,
ми провели серію експериментів на ізольованих одиночних клітинах. У
цьому випадку одиночні ацинарні клітини стимулювали за допомогою 10 – 15
секундних імпульсів АХ, який іонофоретично аплікувався. У експериментах
із клітинами, навантаженими Fura Red, було показано, що такий протокол
призводив до значного підвищення [Ca2+]i QUOTE «(Kasai and Augustine
1990)» ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1A(Kasai and Augustine
1990)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\
00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\13\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03301\1EKasai & Augustine 1990 301
/id\00\1E\00 (Kasai and Augustine 1990) . Один із наших експериментів
наведено на рис. 6. Цей експеримент було проведено для того, щоб
візуалізувати місце більшого вивільнення Ca2+ із одиночної клітини при
цьому типі стимуляції АХ. Поляризацію одиночних клітин чітко видно із
рис. 6a. Конфокальна система реєструвала флуоресценцію із площини, що
проходила через клітину. Сама клітина показана, як чорна пляма на
кожному із флуоресцентних зображень (рис. 6b-i). Ці зображення
отримували через 3-х секундні інтервали після початку стимуляції АХ.
Інтенсивність флуоресценції Calcium Green-1 декстрану зростала значно
більше поблизу секреторного полюсу у порівнянні із полюсом базальним, і
це графічно проілюстровано на рис. 6B. У кожному із 6 експериментів
цього типу інтенсивність флуоресценції зростала помітно сильніше поблизу
секреторного полюсу у порівнянні із полюсом базальним, і не було
зареєстровано жодного випадку, щоби пік інтенсивності поблизу базального
полюсу перевищував 50% того значення, яке реєстрували поблизу
секреторного полюсу, незалежно від того, де знаходилася піпетка для
стимуляції АХ. Як це видно із рис. 6B, було зареєстровано зростання
Ca2+-залежної флуоресценції безпосередньо поблизу базального полюсу. Ми
намагалися з’ясувати, чи може це бути результатом дифузії Ca2+, який
перед тим виділився із апікального (секреторного) полюсу, чи також це
може бути і результатом дифузії Ca2+, який виділився із базальної
мембрани. Для цього ми порівнювали зростання Ca2+-залежної флуоресценції
за допомогою 3 боксів, розташованих на рівних відстанях на одній прямій.
Один бокс був розташований поблизу секреторного полюсу, а два інших
поблизу базального полюсу та на прямо протилежній від полюсу стороні
відповідно. У цих випадках підвищення інтенсивності флуоресценції
наступало раніше поблизу базального полюсу, завжди розвивалося там
швидше та досягало більших величин (принаймні, вдвічі), якщо порівняти
це із боксом із протилежної від базального полюсу сторони. Все це вказує
на те, що зростання концентрації Ca2+ поблизу базального полюсу
відбувається і завдяки вивільненню Ca2+ через базальний полюс, а не
тільки завдяки дифузії Ca2+, вивільненого через секреторний полюс.

Чи можна пояснити спостережуване вивільнення Ca2+ (рис. 4, 5, та 6)
тільки як результат вивільнення Ca2+ внаслідок екзоцитозу? Із
експериментів із використанням методики краплини, у яких вимірювалася
загальна кількість вивільненого Ca2+ при максимальній стимуляції
панкреатичних ацинарних клітин відомо, що вся кількість мобілізованого
Ca2+, яка відповідає приблизно 0.7 мM загальної концентрації кальцію у
клітині QUOTE «» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\012$Tepikin, Voronina, et al. 1992 2
/id\00$\00 , вивільняється приблизно за 200 сек. QUOTE «(Tepikin,
Voronina et al. 1992a)» ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00 (Tepikin,
Voronina et al.
1992a)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Дн\01 р\12
\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\18\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwX7‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwX7‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\05\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwX7‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwX7‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\012$Tepikin, Voronina, et al. 1992 2
/id\00$\00 (Tepikin et al. 1992) . Протягом цього відрізка часу ми не
спостерігали помітного зменшення запасів секреторних гранул у
панкреатичних ацинарних клітинах. Ми також не спостерігали ніякого
помітного зменшення флуоресценції квінакріна, накопиченого у секреторних
гранулах (квінакрін накопичується у кислотних гранулах і зменшення
квінакрінової флуоресценції використовується для вимірювань секреції
QUOTE «(Bokvist, Eliasson et al. 1995)» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\1F(Bokvist, Eliasson et al.
1995)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\
00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\18\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0210%Bokvist, Eliasson, et al. 1995 10
/id\00%\00 (Bokvist et al. 1995) ) після прикладення стандартного
імпульсу АХ протягом 10-15 сек. за наших експериментальних умов
(кімнатна температура, безкальцієвий розчин) (n=6). В присутності 1мM
зовнішньоклітинного Ca2+, постійної стимуляції АХ (10 мкМ) при 37oC, ми
спостерігали значне зменшення флуоресценції квінакріну, який виступав як
маркер секреції.

Таким чином застосувавши нову методику, ми безпосередньо показали, що
секреторний полюс (ділянка секреторних гранул) є головним місцем
вивільнення Ca2+ внаслідок стимуляції агоністом. Виявилося, що це
вивільнення Ca2+ не є наслідком єкзоцитозу — оцінки секреції в умовах
нашого експерименту (низька концентрація зовнішньоклітинного Ca2+ ,
кімнатна температура) із використанням методики реєстрації флуоресценції
квінакріну показують, що втрати секреторних гранул при цьому процесі
невеликі, не дивлячись на те, що процес вивільнення Ca2+ відбувається
постійно.

Розподіл ca2+-atфаз по поверхні ацинарної клітини підшлункової залози

Підвищення концентрації вільного внутрішньоклітинного кальцію у
панкреатичних ацинарних клітинах призводить до активації кальцієвих
насосів плазматичної мембрани та до вивільнення значної кількості
кальцієвих іонів QUOTE «(Zhang, Zhao et al. 1992;Tepikin, Voronina et
al. 1992a;Tepikin, Voronina et al. 1992b)» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00W(Zhang, Zhao et al. 1992;Tepikin, Voronina et
al. 1992a;Tepikin, Voronina et al.
1992b)\01\0D\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Дн\01 р\12
\00PЊы\01Н‹хwи\06\12\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\
00\00\00\00\003DщwXоы\01Н‹хwЁ\07\18\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwXо\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwXо\01\00\00\00Е\00\14к\05\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwXо\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ
хw|л\12\00\00\00\00\003Dщw0e\08\02Н‹хwЁ\07\18\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\05\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003Dщw0e\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\013$Tepikin, Voronina, et al. 1992 3
/id\00$\00 (Petersen 2003) QUOTE «» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\012$Tepikin, Voronina, et al. 1992 2
/id\00$\00 QUOTE «» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0212\1FZhang, Zhao, et al. 1992 12
/id\00\1F\00 . В природі це підвищення [Ca2+]i відбувається після
стимуляції клітини гормонами та нейропередатчиками QUOTE «(Zhang, Zhao
et al. 1992;Tepikin, Voronina et al. 1992b;Berridge 1993)» ADDIN
REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00F(Zhang, Zhao et al. 1992;Tepikin,
Voronina et al. 1992b;Berridge
1993)\01\0D\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00аv\16\02 р\1
2\00рTъ\01Н‹хwи\06\12\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwHП\00\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwHП\00\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwHП\00\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\
00\00\00\00\003Dщw(џ\16\02Н‹хwЁ\07\18\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщw(џ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003Dщw(џ\01\00\00\00Е\00\14к\05\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003Dщw(џ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ
хw|л\12\00\00\00\00\003DщwHП\00\02Н‹хwЁ\07\08\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwHП\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwHП\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwHП\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwHП\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0227\14Berridge 1993 27 /id\00\14\00
(Berridge 1993) QUOTE «» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\013$Tepikin, Voronina, et al. 1992 3
/id\00$\00 QUOTE «» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0212\1FZhang, Zhao, et al. 1992 12
/id\00\1F\00 . У попередніх експериментах ми показали, що тим місцем,
де переважно вивільняється кальцій при такій стимуляції є апікальна
частина клітин QUOTE «(Belan, Gerasimenko et al. 1996)» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00 (Belan, Gerasimenko et al.
1996)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Дн\01 р\12\
00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\19\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0264&Belan, Gerasimenko, et al. 1996 64
/id\00&\00 (Belan et al. 1996) . Також було показано, що апікальний
секреторний полюс панкреатичних ацинарних клітин особливо чутливий до
кальцій мобілізуючих посередників QUOTE «(Thorn P, Gerasimenko O et
al. 1994;Thorn, Lawrie et al. 1993;Kasai, Li et al. 1993)» ADDIN
REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00T(Thorn P, Gerasimenko O et al.
1994;Thorn, Lawrie et al. 1993;Kasai, Li et al.
1993)\01\0D\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\
00PЊы\01Н‹хwи\06\1D\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\
00\00\00\00\003DщwШw\16\02Н‹хwЁ\07\14\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwШw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwШw\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwШw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ
хw|л\12\00\00\00\00\003DщwШa\1B\02Н‹хwЁ\07\10\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwШa\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwШa\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwШa\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwШa\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0267\1DKasai, Li, et al. 1993 67
/id\00\1D\00 (Thorn P et al. 1994) QUOTE «» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03104+Thorn P, Gerasimenko O, et al. 1994
104 /id\00+\00 QUOTE «» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03112″Thorn, Lawrie, et al. 1993 112
/id\00″\00 . Ця чутливість призводить до того, що підвищення
концентрації [Ca2+]i відбувається у просторі клітини неоднорідно.
Підвищення концентрації Ca2+ починається у апікальній частині клітин
(або навіть відбувається тільки в цій частині), а потім поширюється із
цього місця по всьому цитозолю клітин QUOTE «(Thorn, Lawrie et al.
1993;Kasai, Li et al. 1993)» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\001(Thorn, Lawrie et al. 1993;Kasai, Li et al.
1993)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00аv\16\02 р\1
2\00рTъ\01Н‹хwи\06\14\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\
00\00\00\00\003DщwX7‡\01Н‹хwЁ\07\10\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwX7\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwX7\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00\00\003DщwX7\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier
New CYR\00\00\003DщwX7\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0267\1DKasai, Li, et al. 1993 67
/id\00\1D\00 (Thorn et al. 1993) QUOTE «» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03112″Thorn, Lawrie, et al. 1993 112
/id\00″\00 . Звичайно, що просторова неоднорідність підвищення [Ca2+]i
може спричинювати і неоднорідність паттерну вивільнення кальцію із
клітин.

Займаючись даним дослідженням, ми намагалися зрозуміти, як паттерн змін
концентрацій вільного внутрішньоклітинного кальцію може впливати на
просторову організацію потоків викидів кальцію, а також вивчити те, чи
може агоніст сам по собі або/та джерело кальцію, який вивільняється,
впливати на просторове розташування місць викидів кальцію.

Для вирішення цих питань ми проводили експерименти, у яких змінювали
концентрацію внутрішньоклітинного кальцію подібно до того, як це
відбувається при дії гормонів та нейропередатчиків, виходячи із термінів
амплітуди та кінетики, але відмінних з точки зору просторового розподілу
всередині клітини.

Раніше вже було показано, що стимуляція агоністом панкреатичних
ацинарних клітин викликає початкове підвищення кальцію в апікальній
частині клітини, яке потім поширюється у базальну частину QUOTE
«(Belan, Gerasimenko et al. 1996)» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00 (Belan, Gerasimenko et al.
1996)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Дн\01 р\12\
00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\19\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier
New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New
CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\0264&Belan, Gerasimenko, et al. 1996 64
/id\00&\00 (Belan et al. 1996) QUOTE «» ADDIN REFMAN
я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and
settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21
thesis\5Cpashadisserall\03\00\03112″Thorn, Lawrie, et al. 1993 112
/id\00″\00 . Це явище було повторене у специфічних умовах наших
експериментів. Просторовий паттерн змін інтенсивності флуоресценції,
отриманий за допомогою конфокального мікроскопу у площині одиночної
панкреатичної ацинарної клітини, представлено на рис. 7 (набір зображень
у верхній частині рис.). У наведеному прикладі підвищення [Ca2+]i
протягом іонофоретичної аплікації АХ було локалізовано виключно у
апікальній частині клітини. Аплікації, які тривали довше у часі (у цій
та іншіх клітинах), викликали хвилю змін [Ca2+]i, яка ініціалізувалася у
тій же самій апікальній частині клітини, а потім це підвищення
концентрації кальцію поширювалося по всій клітині (дані не показані).

Підвищення кальцію, яке відбувалося внаслідок вивільнення Ca2+ із
зв’язаної форми (NP-EGTA) за допомогою флеш фотолізу проходило інакше.
[Ca2+]i підвищувалася однорідно по всій конфокальній площині, що
проходила через клітину. Ця однорідність спостерігалася практично
протягом усього періоду підвищення концентрації кальцію. На рис. 7
наведено приклад такого експерименту (набір зображень у нижній частині
рисунку). Така різниця паттернів змін [Ca2+]i спонукала нас дослідити
можливу різницю у вивільненні кальцію у зовнішньоклітинне середовище,
яка була викликана цими змінами.

Ми провели серії експериментів по локалізації місць вивільнення кальцію
протягом іонофоретичної аплікації АХ. У цих експериментах ми вимірювали
як зовнішньоклітинну концентрацію кальцію поблизу плазматичної мембрани
(що відображає просторовий паттерн вивільнення кальцію), так і
концентрацію вільного кальцію всередині клітини. Кластер омивався
розчином, який містив у собі Calcium Green 1 декстран та був попередньо
навантажений Fura Red/АМ. Конфокальний мікроскоп застосовували для того,
щоб зареєструвати як місця вивільнення Ca2+ із клітин кластеру, так і
зміни [Ca2+]i у одній із клітин. Оптичну площину проводили через клітини
кластеру і, таким чином, флуоресценція у боксі 1 була, головним чином,
флуоресценцією Fura Red всередині клітини. Іонофоретична аплікація АХ
спричиняла як мобілізацію внутрішньоклітинного Ca2+ так і вивільнення
Ca2+. Зростання концентрації зовнішньоклітинного кальцію (що відображало
процес вивільнення Ca2+ ) відбувалося значно швидше біля апікального
полюсу клітини, ніж біля базального. Крім того, спостерігалася значна
різниця у часі між піками відповідей у апікального та базального полюсів
клітини, яка вказує на те, що значна частина підвищення кальцію
пояснюється дифузією Ca2+ із апікальної частини клітини. Амплітуда
відповідей біля апікального полюсу клітини була приблизно у 2.5 разів
вища за амплітуду відповідей біля базального.

В другої серії експериментів по локалізації місць вивільнення кальцію
одиночні панкреатичні ацинарні клітини навантажували NP-EGTA. Спалах УФ
світла посилався на клітину із УФ лазера конфокальної системи. Протягом
спалаху та відкритті та закритті шторки УФ лазера, вимірювання
флуоресценції припиняли для того, щоб не пошкодити фотопомножувач
реєстраційної системи. Після швидкого зростання [Ca2+]i внаслідок
спалаху УФ світла відбувається збільшення зовнішньоклітинної
концентрації кальцію, що свідчить про вивільнення Ca2+ із клітини у
оточуюче середовище. Головне джерело вивільненого кальцію було
локалізовано у апікальній частині клітини. Стимуляція такого типу (при
тривалості спалаху від 1 до 5 секунд) завжди викликала подібні
просторові паттерни вивільнення Ca2+ із клітин (n=8).

Ми провели кілька експериментів на ненавантажених клітинах, як для
випадку стимуляції за допомогою АХ, так і при стимуляції флеш фотолізом,
для того, щоб упевнитися, що барвник Fura Red сам по собі не впливав на
просторовий паттерн вивільнення кальцію. В цих експериментах для
реєстрації вивільнення Ca2+ використовувався тільки зовнішньоклітинний
індикатор. Ми не помітили ніякої різниці у просторовому паттерні змін
зовнішньоклітинної концентрації Ca2+ у порівнянні із клітинами,
навантаженими Fura Red (n=3 для стимуляції АХ; n=2 для стимуляції флеш
фотолізом).

Було цікаво порівняти просторові паттерни вивільнення кальцію, отримані
за допомогою стимуляції АХ та флеш стимуляції на одній і тій же клітині
або маленькому кластері клітин, оскільки паттерн вивільнення повинен
залежати від топологічної структури різних типів клітин. У цьому випадку
подібні просторові паттерни повинні також демонструвати подібність у
вивільненні кальцію при різних типах стимуляції. У попередніх
експериментах ми побачили, що спричинене спалахом підвищення [Ca2+]i у
деяких випадках може викликати мобілізацію кальцію із внутрішніх депо
(можливо, через механізм кальцій-залежного вивільнення кальцію). Для
того, щоб бути впевненим, що вивільнений при УФ спалаху кальцій є
“зв’язаним ”, а не кальцієм мобілізованим із внутрішніх депо, ми робили
спалах після попередньої аплікації АХ (що повинна була розрядити запаси
кальцію у внутрішньоклітинних депо).

На рис. 8A наведено флуоресцентне зображення кластера із двох клітин,
навантажених Fura Red та поміщених у розчин із Calcium Green 1
декстраном. Кластер добре видно у вигляді яскравої структури у центрі
зображення. Вимірювання флуоресценції кальцієвих барвників робили у
боксах, зображених на рис. 8A. На рис. 8B наведено приклад змін
внутрішньоклітинної та зовнішньоклітинної концентрацій іонів кальцію у
боксах 1 — 3 рис. 8А протягом стимуляції АХ та вивільнення Ca2+ із
NP-EGTA при спалаху УФ світла. Видно, що крива кінетики зміни [Ca2+]i
повертається до базової лінії після досягнення піка та, що амплітуди
відповідей на обидва стимули подібні між собою. На цьому рисунку також
видно, що в обох випадках величина зростання концентрації
зовнішньоклітинного кальцію (що відображає вивільнення Ca2+) є значно
вищою поблизу області секреторних гранул (яка розташована, головним
чином, у верхній центральній частині кластера). Оскільки експеримент
проводили на клітинах, які омивалися розчином із низькою концентрацією
кальцію ([Ca2+] =300 нM), то аплікація АХ, яка спричинювала вивільнення
Ca2+, повинна була викликати значне спустошення внутрішніх кальцієвих
депо. У цьому випадку, Ca2+ вивільнений із NP-EGTA усередині клітин,
повинен бути єдиним джерелом Ca2+, вивільненого внаслідок спалаху УФ
світла у позаклітинний простір (n=3).

?

E

?

3/4

?

?

< r i ? ? Ae d?]„1`„ ????ц?????????????????? ?????? AbApA?A?AUeAeAIAUA\[email protected]?EtE®EEEoioaYaYaYoioaYaYOeYOYOeYOYIOYO eYIOYAYOYAYOYOeY3/4I·IYI·IOI°IOIOI°I·IYAYIOIO hMq• —F hMq• hMq•@?yyH* AE# @ hMq•@?thyH* oioieioiUeOUeoioiIiIioiUeOUeoioieiIiIiIiIioiUeOUeoioiIioiUeOUeoioieiIioi UeOUeoioiUeOUeoioiUeOUe hMq•@?thyH* hMq•@?thyH* hMq•@?thy $ AE# @ AE# @ $ AE# @ AE# @ AE# @ AE# @ AE# @ AE# @ AE# @ AE# @ AE# @ AE# @ Ekd hMq•@?thyH* @?thy ?y???x?x??? hMq•@?thyH* hMq•@?thy hMq•@?thyH* i o uouiuauOeIOeauauOeIOeauOeIOeauOeIOeauauOeIOeauauououauOeIOeauauouiuouiuo uauOeIOeauauouououououiu hMq•@?thyH* hMq•@?thy hMq•@?yyH* hMq•@?yyH* hMq•@?thy D H ? O ue/ueoueeueaeueUeeueUeueUeueeue/ue/ueoue/ue/ue/ue/ue/ueeue/ue/ue/ueoue/u eUueOEOA»???A»???A»??? TH ???????????ляції агоністом відбуваються значні (по кілька мМ на літр) зміни у концентрації вільного кальцію в люмені ацинусу. Ізопротеренол викликає зовнішньоклітинні Сa2+ спайки відповідно до актів секреції у клітинах слинної залози QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0273\13Douglas 1968 73 /id\00\13\00 QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0272\10Katz 1969 72 /id\00\10\00 QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03315)Muallem, Kwiatkowska, et al. 1995 315 /id\00)\00 QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0268\1ANeher & Zucker 1993 68 /id\00\1A\00 У екзокринних клітинах після дії агоніста відбувається зростання [Ca2+]i QUOTE "(Douglas 1968)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\0E(Douglas 1968)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00рі\0A\02 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\07\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0273\13Douglas 1968 73 /id\00\13\00 (Douglas 1968) , яке викликає екзоцитоз QUOTE "(Maruyama, Inooka et al. 1993)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1E(Maruyama, Inooka et al. 1993)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Гн\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\17\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0266$Maruyama, Inooka, et al. 1993 66 /id\00$\00 (Maruyama et al. 1993) . Кальцієві насоси були знайдені у різних областях плазматичної мембрани екзокринних ацинарних клітин QUOTE "(Lee, Xu et al. 1997)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\15(Lee, Xu et al. 1997)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00рі\0A\02 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\0E\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03313\1CLee, Xu, et al. 1997 313 /id\00\1C\00 (Lee et al. 1997) , і зростання [Ca2+]i також активує залежне від АТФаз вивільнення Ca2+ через плазматичну мембрану QUOTE "(Tepikin, Voronina et al. 1992a;Tepikin, Voronina et al. 1992b;Belan, Gerasimenko et al. 1996)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00^(Tepikin, Voronina et al. 1992a;Tepikin, Voronina et al. 1992b;Belan, Gerasimenko et al. 1996)\01\0D\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Гн\01 р\12\ 00PЊы\01Н‹хwи\06\18\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\05\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\ 00\00\00\00\003DщwX7‡\01Н‹хwЁ\07\18\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwX7\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003DщwX7\01\00\00\00Е\00\14к\05\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwX7\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ хw|л\12\00\00\00\00\003Dщw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07\19\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw°Ћ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw°Ћ\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw°Ћ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw°Ћ\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0264&Belan, Gerasimenko, et al. 1996 64 /id\00&\00 (Belan et al. 1996) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\013$Tepikin, Voronina, et al. 1992 3 /id\00$\00 QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\012$Tepikin, Voronina, et al. 1992 2 /id\00$\00 . Секреторні гранули містять Ca2+ у дуже високій концентрації QUOTE "(Nicaise, Maggio et al. 1992;Gerasimenko, Gerasimenko et al. 1996)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00B(Nicaise, Maggio et al. 1992;Gerasimenko, Gerasimenko et al. 1996)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\ 00рTъ\01Н‹хwи\06\16\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw8ћ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw8ћ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw8ћ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\ 00\00\00\00\003Dщwpnе\01Н‹хwЁ\07\1F\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщwpn\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщwpn\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщwpn\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщwpn\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0265,Gerasimenko, Gerasimenko, et al. 1996 65 /id\00,\00 (Gerasimenko et al. 1996) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0213#Nicaise, Maggio, et al. 1992 13 /id\00#\00 , і акт екзоцитозу сам по собі також повинен вивільнювати Ca2+. Однак під час наших попередніх досліджень на панкреатичних ацинарних клітинах QUOTE "(Belan, Gerasimenko et al. 1996)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00 (Belan, Gerasimenko et al. 1996)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00рі\0A\02 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\19\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw0e\08\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0264&Belan, Gerasimenko, et al. 1996 64 /id\00&\00 (Belan et al. 1996) , в яких викликана агоністом секреція є суттєво зниженою при низькій концентрації зовнішньоклітинного Ca2+, було показано, що головна частина Ca2+ вивільняється у відповідь на супрамаксимальну стимуляцію агоністом завдяки опосередкованому Ca2+ насосами потоку через плазматичну мембрану, а не завдяки екзоцитозу, QUOTE "(Tepikin, Voronina et al. 1992a;Tepikin, Voronina et al. 1992b;Belan, Gerasimenko et al. 1996)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00^(Tepikin, Voronina et al. 1992a;Tepikin, Voronina et al. 1992b;Belan, Gerasimenko et al. 1996)\01\0D\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\000Ен\01 р\12\ 00PЊы\01Н‹хwи\06\18\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\05\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\ 00\00\00\00\003DщwЂw\15\02Н‹хwЁ\07\18\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14к\05\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ хw|л\12\00\00\00\00\003Dщw\18L‰\01Н‹хwЁ\07\19\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw\18L\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourie r New CYR\00\00\003Dщw\18L\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw\18L\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourie r New CYR\00\00\003Dщw\18L\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0264&Belan, Gerasimenko, et al. 1996 64 /id\00&\00 (Tepikin et al. 1992; Belan et al. 1996) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\013$Tepikin, Voronina, et al. 1992 3 /id\00$\00 QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\012$Tepikin, Voronina, et al. 1992 2 /id\00$\00 . На відміну від загальноприйнятої ролі Ca2+ у регуляції екзоцитозу існують екзокринні секреторні клітини, наприклад, клітини слинних залоз, для яких головним внутрішньоклітинним сигналом, який викликає екзоцитоз є не підвищення [Ca2+]i, а зростання концентрації циклічного АМФ QUOTE "(Quissell and Tabak 1989;Spearman and Butcher 1989)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\003(Quissell and Tabak 1989;Spearman and Butcher 1989)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Гн\01 р\12\ 00рTъ\01Н‹хwи\06\12\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\00 \00\00\00\003Dщw(џ\16\02Н‹хwЁ\07\14\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw(џ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw(џ\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw(џ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw(џ\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0275\1CQuissell & Tabak 1989 75 /id\00\1C\00 (Quissell and Tabak 1989; Spearman and Butcher 1989) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0276\1ESpearman & Butcher 1989 76 /id\00\1E\00 . Збудження ?- адренергічних рецепторів стимулює секрецію білків із слинних залоз шляхом утворення циклічного АМФ без помітного зростання [Ca2+]i QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0276\1ESpearman & Butcher 1989 76 /id\00\1E\00 . У цих клітинах на секреторні відповіді важко вплинути шляхом відсутності чи присутності зовнішньоклітинного Ca2+ QUOTE "(Petersen, Ueda et al. 1977)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1C(Petersen, Ueda et al. 1977)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Гн\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\15\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0271"Petersen, Ueda, et al. 1977 71 /id\00"\00 (Petersen et al. 1977) . Оскільки слинні залози мають як холінергічні мускаринові і ?-адренергічні рецептори, які контролюють [Ca2+]i, так і ?-адренергічні рецептори, які регулюють утворення циклічного АМФ QUOTE "(Quissell and Tabak 1989;Spearman and Butcher 1989)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\003(Quissell and Tabak 1989;Spearman and Butcher 1989)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\ 00рTъ\01Н‹хwи\06\12\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwX7‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwX7‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwX7‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\00 \00\00\00\003Dщw°Ћ\10\02Н‹хwЁ\07\14\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw°Ћ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw°Ћ\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw°Ћ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw°Ћ\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0275\1CQuissell & Tabak 1989 75 /id\00\1C\00 (Quissell and Tabak 1989; Spearman and Butcher 1989) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0276\1ESpearman & Butcher 1989 76 /id\00\1E\00 , ми вирішили порівняти механізми вивільнення Ca2+ у зовнішньоклітинне середовище у відповідь на дію мускаринового агоніста АХ та ?-адренергічного агоніста ізопротеренола (ISP) в одиночних клітинах та маленьких кластерах клітин слинної залози. Вимірювання вивільнення Са2+, спричиненого ISP та АХ , які були проведені за допомогою методики краплини Для того, щоб кількісно охарактеризувати вивільнення кальцію із сабмандибулярних клітин, ми використовували методику краплини. Кластери сабмандибулярних клітин поміщали у маленькі краплини зовнішньоклітинного розчину із кальцій- чутливим барвником fluo-3. У цій серії експериментів клітини попередньо навантажували fura -2. Загальна кількість кальцію, вивільненого із кластерів, розраховувалася на основі вимірювання за допомогою fluo-3. Кластери, які поміщали у краплини, демонстрували значне базальне вивільнення кальцію відповідно до зниження загальної концентрації клітинного кальцію у 81 + 15 мкM за хвилину (n = 7) (сабмандибулярні клітини миші). Аплікація ISP у зовнішньоклітинний розчин призводила до значного зростання концентрації зовнішньоклітинного кальцію (рис. 9А). Одночасно, ми майже не спостерігали змін у [Ca2+]i у відповідь на аплікацію ISP (рис. 9А). Ця відсутність змін у [Ca2+]i дозволяє припустити, що основна частина Ca2+ протягом стимуляції ISP вивільняється внаслідок секреції. Похідна від змін [Ca2+]o, яка вказує на кількість Ca2+, вивільненого внаслідок екзоцитозу, показала, що існує початковий швидкий компонент секреції (максимальна величина екструзії становила при цьому 460 + 28 мкM/хв, n = 7, рис 9В) який зникав після, приблизно, 100 секунд. Вивільнення кальцію протягом цих перших 100 секунд стимуляції ISP відповідає зниженню загальної концентрації клітинного кальцію на 429 + 35 мкM (n = 7). За цим початковим швидким компонентом слідувало більш повільне вивільнення кальцію, яке продовжувалося довше, ніж тривали наші експерименти (більше, ніж 500 сек.). Величина екструзії протягом цієї більш повільної фази приблизно вдвічі перевищувала її рівень у спокої до стимуляції. Загальне вивільнення кальцію протягом перших 300 сек. стимуляції відповідає зниженню загальної концентрації кальцію у клітині на 930 + 40 мкM (n = 7). Інформація щодо здатності ISP вивільняти кальцій із внутрішньоклітинних депо у сабмандибулярних ацинарних клітинах є предметом наукових дискусій. У перших повідомленнях вказувалося, що ISP може вивільняти кальцій із кальцієвих депо в сабмандибулярних ацинарних клітинах QUOTE "(Helman, Ambudkar et al. 1987;Cook, Day et al. 1988)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\004(Helman, Ambudkar et al. 1987;Cook, Day et al. 1988)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00рі\0A\02 р\1 2\00PЊы\01Н‹хwи\06\17\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwXоы\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwXоы\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwXоы\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\00 \00\00\00\003Dщw8ћ\16\02Н‹хwЁ\07\10\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw8ћ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw8ћ\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw8ћ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw8ћ\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03309\1ECook, Day, et al. 1988 309 /id\00\1E\00 (Helman et al. 1987; Cook et al. 1988) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03312%Helman, Ambudkar, et al. 1987 312 /id\00%\00 . Однак, коли тестували очищені клітинні препарати, то було знайдено, що хоча ISP і міг значно підвищити концентрацію цитозольного Ca2+ у клітинах інтралобулярної (гранулярної) протоки, але він практично не впливав на ацинарні клітини QUOTE "(Dehaye, Valdez et al. 1993)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1C(Dehaye, Valdez et al. 1993)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\15\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw\18L‰\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03310#Dehaye, Valdez, et al. 1993 310 /id\00#\00 (Dehaye et al. 1993) . Оскільки точні знання про дію ISP на ацинарні клітини були надзвичайно важливими для інтерпретації результатів нашого дослідження, ми провели окремі експерименти, у яких вивчався ефект стимулюючої дії ISP на [Ca2+]i. Ці експерименти проводили на клітинах, навантажених fura-2 із використанням системи цифрових досліджень зображень (QuantiCell, Applied Imaging, UK). Клітини поміщали у відкриті камери для перфузії. Було протестовано 67 клітин. ISP аплікували за допомогою перфузії. Високі дози ISP (10 мкM) не викликали такі зміни у [Ca2+]i у всіх тестованих клітинах, які можна було б виміряти. Наступна за цим аплікація АХ викликала у тих самих клітинах значні зміни у [Ca2+]i (на 70 - 470 нМ). Можна припустити, що ISP може викликати таке повільне зростання кальцію у цитоплазмі, яке важко зареєструвати. Відомо, що лантан у високих концентраціях блокує кальцієві АТФ-ази у плазматичній мембрані QUOTE "(Kwan, Takemura et al. 1990;Toescu and Petersen 1995)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\005(Kwan, Takemura et al. 1990;Toescu and Petersen 1995)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Гн\01 р\12\ 00рTъ\01Н‹хwи\06\15\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw(џ\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\ 00\00\00\00\003DщwЂw\15\02Н‹хwЁ\07\13\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003DщwЂw\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03146#Kwan, Takemura, et al. 1990 146 /id\00#\00 (Kwan et al. 1990; Toescu and Petersen 1995) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\011\1CToescu & Petersen 1995 1 /id\00\1C\00 . Таким чином, лантан може потенціювати вказані гіпотетичні кальцієві сигнали завдяки блокуванню кальцієвих насосів у плазматичній мембрані. Однак у експериментах, в яких зовнішньоклітинний розчин містив лантан (2 мM), ми не змогли зареєструвати ніякого зростання [Ca2+]i у цитоплазмі клітин після аплікації ISP (n = 29). В усіх цих клітинах наступна аплікація АХ викликала значне зростання [Ca2+]i. Відсутність викликаних ISP змін у [Ca2+]i у цих двох наборах експериментів чітко вказує на те, що вивільнення кальцію, зареєстроване у експериментах за методом краплі не може відбуватися завдяки активації Ca2+ насосів у плазматичній мембрані. Ми також провели серію експериментів за методом краплі, в яких у зовнішньоклітинний розчин краплини додавався ?- адренергічний інгібітор фентоламін у високій концентрації (30 мкM). Це повинно було запобігти виникненню будь-яких кальцієвих сигналів від гіпотетично можливої викликаної ISP активації ?-адренергічних рецепторів. У цих експериментах (n = 8) ISP викликав значне вивільнення кальцію назовні клітин без будь-якого помітного зростання [Ca2+]i. Величина вивільнення кальцію була подібна до тієї, яка була зареєстрована без фентоламіну у зовнішньоклітинному розчині. Вивільнення кальцію протягом перших 100 секунд стимуляції ISP в присутності фентоламіну відповідає зниженню загальної концентрації кальцію у клітині на 477 + 35 мкM. Ці експерименти далі підтвердили те припущення, що вивільнення кальцію із клітин, викликане аплікацією ISP, не має відношення до вивільнення Ca2+, опосередкованого роботою Ca2+ насосів у плазматичній мембрані. Аплікації АХ на кластери, поміщені у краплини, також викликали значне вивільнення Ca2+ із клітин. Однак, на відміну від того, що відбувалося при аплікації ISP, аплікації АХ спричинювали значне зростання [Ca2+]i. Величина вивільненого кальцію градуально спадала та досягала рівня спокою приблизно через 100 - 300 сек. після початку стимуляції АХ. Максимальні величини АХ-викликаного вивільнення кальцію становили 430 + 70 мкM/хв (n=3). Загальне вивільнення кальцію протягом перших 300 сек. стимуляції відповідає зменшенню загальної концентрації кальцію у клітинах на 680 + 65 мкM (n = 3). Спайки вивільнення Ca2+ Вивільнення Ca2+ за допомогою Ca2+ насосів та вивільнення Ca2+ завдяки екзоцитозу повинно призводити до різних типів змін [Ca2+]o. Можна очікувати, що екзоцитоз викличе короткі спайки [Ca2+] у зовнішньоклітинному розчині тоді, коли окремі гранули переносять свій вантаж – іони кальцію – назовні клітин. В той же час насоси та обмінники повинні спричинять вивільнення кальцію, яке має “гладкий” вигляд. Ґрунтуючись на таких уявленнях, ми зробили спробу за допомогою конфокальної мікроскопії розрізнити механізми, які включені у вивільнення кальцію у випадках стимуляції клітин ISP та АХ. Для того, щоб виміряти зміни [Ca2+]o, ми додавали Calcium Green 1 декстран до практично безкальцієвого зовнішньоклітинного розчину. У більшості експериментів ми записували усереднені зміни флуоресценції у малих боксах, розміщених поблизу межі клітини (дивись рис. 10 та наступну главу). На рис. 10А наведено зображення маленького кластеру (5 клітин) у прохідному світі. Обстеження кластера показало, що було тільки одне місце на межі кластеру у даній конфокальної площини, де були зареєстровані значні зміни у флуоресценції у відповідь на стимуляцію ISP. Це було місце, відмічене боксом на рис. 10А, де, з великою ймовірністю, люмен був у контакті із зовнішньоклітинним розчином. Часовий паттерн змін [Ca2+]o у боксі показано на рис. 10В. Ми також проводили експерименти, під час яких ми робили “фільм” (швидку послідовність зображень) про зміни [Ca2+]o поблизу кластера клітин. На рис. 10С представлено експеримент цієї серії (n = 7). Фільм знімали протягом терміну, відміченого короткою рискою шкали на рис. 10В; він показаний на рис. 10С. Зростання флуоресценції розпочиналося у певній точці на краю кластера, а потім поширювалося у вигляді хвилі дифузіїї. Характер спайків, який носила зміна [Ca2+]o, дозволяє припустити, що ці зміни відбувалися завдяки екзоцитозу. Інформація про розподіл концентрації Ca2+ у зовнішньоклітинному розчині для послідовності точок у часі дозволила нам підрахувати кількість вивільненого Ca2+ у даній області та оцінити кількість Ca2+, який покинув цю область у результаті секреторного акту QUOTE "(Belan, Gerasimenko et al. 1996)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00 (Belan, Gerasimenko et al. 1996)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00рі\0A\02 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\19\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwђ]й\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0264&Belan, Gerasimenko, et al. 1996 64 /id\00&\00 (Belan et al. 1996) . Наприклад, під час другого спайку, показаного на рис. 10С, кількість секретованого кальцію становила приблизно 3.5 x 10-18 моль. Поділивши цю величину на приблизний об’єм сабмандибулярної клітини (5 x 10-13 літр) можна отримати величину приблизного зменшення загальної концентрації кальцію у клітині внаслідок одиночного акту екзоцитозу. Розраховане значення для цього окремого експерименту становило 7 мкM. В окремих експериментах протягом аплікації ISP концентрація [Ca2+]i замірялася для клітинних кластерів, навантажених Fura Red. В цих експериментах із використанням конфокального мікроскопа ми не зареєстрували змін у [Ca2+]i (n = 5). В цій же серії дослідів було показано, що елементарні акти секреції можуть мати місце у декількох просторово роздільних місцях на поверхні малих клітинних кластерів. Причому секреція спостерігалась у одних і тих же місцях кластерів, в той час як у інших вона була відсутня. Ми також спостерігали синхронне збільшення концентрації позаклітинного кальцію у декількох боксах, що знаходились поблизу секреторних полюсів поодиноких клітин або клітинних кластерів. Відмінність у відповідях із вивільненням Ca2+ на ізопротеренол та ацетилхолін У наступній серії експериментів ми, в основному, записували усереднені [Ca2+]o сигнали у тих областях, які нас цікавили. Сигнали, записані у таких експериментах, залежали від розмірів боксів, розташування боксів по відношенню до місць вивільнення кальцію, а також від кількості вивільненого кальцію. Типовий результат стимуляції ISP сабмандибулярних клітин наведено на рис. 11. Відповідь складається із паттерну спайкування [Ca2+]o. У деяких експериментах ми спостерігали суміш повільних підйомів на які накладалися швидкі спайки. Ми можемо уявити паттерн спайкування як послідовність секреторних актів, які відбувалися один за одним. Тому такі “змішані” паттерни можуть бути результатом суперпозиції численних актів секреції. Спонтанні спайки [Ca2+]o могли також виникати без будь-якої стимуляції агоністом. Можна припустити, що це явище відбувається внаслідок базального екзоцитозу. Іноді ми також спостерігали “згладжені” зміни [Ca2+]o. Можливо, “згладжені” зміни були записані від боксів, які знаходилися далеко від того місця, де відбулася секреція. Інше пояснення полягає у тому, що бокси були занадто великими для того, щоб реєструвати локалізовані секреторні акти. На рис. 12 наведено результати експериментів, у яких АХ викликав вивільнення Ca2+. У всіх експериментах цього типу перша аплікація АХ призводила до великого та широкого транзитивного зростання [Ca2+]o, яке тривало 70-300 сек. Такі зростання мали або загладжену форму, або загладжену форму на яку накладалися швидкі спайки [Ca2+]o (рис. 12). На відміну від стимуляції ISP, перша аплікація АХ ніколи не викликала чистого паттерну спайкування (відповідей без значного підвищення базової лінії між спайками), але друга аплікація АХ у двох випадках із шести викликала відповіді типу чистих спайків. Це відбувалося у експериментах, у яких протягом першої аплікації АХ спайки накладалися на загладжену форму змін концентрації кальцію. Нарешті в експериментах, у яких спайковий паттерн змін [Ca2+]o реєструвався в результаті другої стимуляції АХ, наступна стимуляція ISP також викликала відповідь зі спайками. Ці дані дають підставу припустити, що протягом початкової стимуляції АХ були записані два компоненти вивільнення кальцію: (i) перекачування кальцію із цитозолю у зовнішнє середовище за допомогою Са2+-АТФаз, що спричиняло загладжене зростання, зареєстроване у тих випадках, коли АХ аплікувався перший раз та (ii) вивільнення кальцію шляхом екзоцитозу, що призводило до генерації спайків [Ca2+]o. Для того, щоб зареєструвати загальну величину вивільненого кальцію із клітинних кластерів, ми усереднювали величини концентрації кальцію у великій області зовнішньоклітинного розчину навколо відносно великих клітинних кластерів (більше, ніж 10 клітин). Таким чином, вимірювані зміни концентрації кальцію відображають середню величину вивільнення кальцію із клітин. Хоча на клітинний кластер набагато простіше аплікувати агоністи, ніж робити це за допомогою методики краплі QUOTE "(Tepikin, Llopis et al. 1994)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1D(Tepikin, Llopis et al. 1994)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00°Дн\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\16\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwШa\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0240#Tepikin, Llopis, et al. 1994 40 /id\00#\00 (Tepikin, Llopis et al. 1994) , отримані результати носять скоріше якісний, аніж кількісний характер. При такій конфігурації експерименту, звичайно, неможливо розрізнити спайки [Ca2+]o, які виникли у результаті екзоцитозу. Такий протокол експерименту ми використовували тільки для того, щоб дослідити, чи є незалежними джерела кальцію для кальцієвих викидів, спричинених обома типами агоністів. У таких експериментах стимуляція АХ призводила до повільного поступового зростання [Ca2+]o. Стимуляція клітин за допомогою ISP після стимуляції АХ, досить довгої для того, щоб виснажити внутрішні запаси кальцію, викликала значне збільшення [Ca2+]o. Все це вказує на те, що стимуляція АХ не вичерпує ресурсів для викликаного ISP вивільнення кальцію (n = 8). У додаткових експериментах довготривала аплікація ISP (15 мкM, протягом 40 хвилин) не спустошувала внутрішньоклітинні запаси Ca2+, які могли бути вивільнені за допомогою АХ, і не запобігала АХ індукованому вивільненню кальцію у зовнішньоклітинний простір (n = 5). Таким чином за допомогою нової методики для вимірювання концентрації зовнішньоклітинного кальцію поблизу клітинної мембрани та методики краплини ми вивчали ступінь вивільнення кальцію із ацинарних клітин слинної залози. Ізопротеренол, що є ?-адренергічним агоністом та потужним секреторним агентом, не викликав змін у концентрації вільного Ca2+ у цитозолі, але спричинював помітні зміни у вигляді спайків [Ca2+]o. Відсутність зростання [Ca2+]i та пульсоподібна природа змін у [Ca2+]o вказують на те, що ці спайки з’являються, найвірогідніше, внаслідок вивільнення кальцію із секреторних гранул. Холінергічний агоніст АХ який викликає помірну секрецію у цих клітинах, також викликав значне зростання [Ca2+]i та ”гладке” за формою зростання [Ca2+]o, яке, найбільш можливо, було спричинені роботою кальцієвих насосів плазматичних мембран із накладанням коротких спайків [Ca2+]o, викликаних екзоцитозом. Величина викликаного ISP вивільнення кальцію була досить значною. Обчислена величина втрат кальцію протягом перших 100 секунд при супрамаксимальній стимуляції відповідає зменшенню загальної концентрації кальцію в клітині на 0.4 мМ. АНАЛІЗ І УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕНЬ У дисертаційній роботі наведені дослідження різноманітних клітинних механізмів, що приймають участь у скоординованій регуляції іонів кальцію у екзокринних клітинах. Порушення цих механізмів можуть лежати в основі розвитку певних патологічних станів, що призводять до тяжких захворювань у людини. Виконане дослідження спирається на розроблені авторами новітні підходи для кількісного та якісного вимірювання роботи кальцій-регулюючих клітинних механізмів, що дозволяють значно розширити наші знання про фізіологічні зміни, що відбуваються в екзокринних клітинах в нормі та патології, а також можуть бути застосовані для вивчення різних молекулярних механізмів у багатьох типах клітин. Крім того, дане дослідження може допомогти вирішити питання про походження таких складних захворювань як гострий і хронічний панкреатити, що дозволяє стверджувати про можливість клінічного застосування результатів, отриманих у цій роботі. Просторова локалізація систем викиду іонів кальцію на поверхні панкреатичних ацинарних клітинах Відносно високий процент Ca2+, вивільненого із секреторного полюсу, як це показано у наших експериментах (рис.6), може бути результатом відносно високої щільності Ca2+ насосів у цій ділянці та/чи може бути пояснений тим, що Ca2+ насоси у цій частині клітини мають характеристики, відмінні від характеристик насосів у базальній мембрані. Ці припущення мають сенс оскільки на даний момент описана велика кількість ізоформ Ca2+ АТФаз плазматичної мембрани QUOTE "(Carafoli 1992)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\0F(Carafoli 1992)\01\03\00\01\00\00\00\00\00\00wЁ\07Е\007ђхw\00\00\00\00x№†\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\0D\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwp№†\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwp№†\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03200\15Carafoli 1992 200 /id\00\15\00 (Carafoli 1992) . Крім того відомо, що афінність цих АТФаз може контролюватися альтернативним сплайсінгом, що призводить до змін у афінності АТФаз для кальмодуліна QUOTE "(Enyedi et al. 1994)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\14(Enyedi et al. 1994)\01\03\00\01\00\00\00\00\00\00wЁ\07Е\007ђхw\00\00\00\00(<‹\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\12\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw <‹\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw <‹\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03298"Enyedi, Verma, et al. 1994 298 /id\00"\00 (Enyedi et al. 1994) . Можливо також, що стимуляція агоністом може диференційовано регулювати Ca2+ насоси в люмінальній та базолатеральній мембранах. Більш детально ці припущення буде розглянуто у наступній главі цього розділу. Зареєстроване явище вивільнення Ca2+ через секреторний полюс, має багато переваг, якщо розглядати його із точки зору функцій ацинарних клітин. Ca2+ сигнали, викликані фізіологічними агоністами, дійсно пов’язані із ділянкою секреторних гранул QUOTE "(Thorn et al. 1993)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\13(Thorn et al. 1993)\01\03\00\01\00\00\00\00\00\00wЁ\07Е\007ђхw\00\00\00\00?5э\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\11\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwђ5э\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwђ5э\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03112"Thorn, Lawrie, et al. 1993 112 /id\00"\00 (Thorn et al. 1993) і селективна робота кальцієвих насосів на люмінальній мембрані дозволяє запобігти поширенню сигналу у базолатеральні області. Це може бути важливим для того, щоб запобігти Ca2+-викликаному вивільненню Ca2+ у ядрі через інозітол трифосфатні та руанодінові рецептори, які локалізовані на внутрішній нуклеарній мембрані QUOTE "(Gerasimenko et al. 1995)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\19(Gerasimenko et al. 1995)\01\03\00\01\00\00\00\00\00\00wЁ\07Е\007ђхw\00\00\00\00\10‚…\01 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\17\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw\08‚…\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw\08‚…\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03299-Gerasimenko, Gerasimenko, et al. 1995 299 /id\00-\00 (Gerasimenko et al. 1995) . В той час як Ca2+, вивільнений через базолатеральну мембрану, здається, не має спеціальних функцій, Ca2+ , який накачується в ацинарний (зовнішньоклітинний) люмен може підтримувати високу концентрацію Ca2+ у цьому зовнішньоклітинному компартменті. Це дуже важливо, оскільки відомо, що ендоцитоз у підшлунковій залозі не може відбуватися при відсутності зовнішнього Ca2+ QUOTE "(Maruyama et al. 1993)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\16(Maruyama et al. 1993)\01\03\00\01\00\00\00\00\00\00wЁ\07Е\007ђхw\00\00\00\00ЁЯ\0F\02 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\14\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw Я\0F\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw Я\0F\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0266$Maruyama, Inooka, et al. 1993 66 /id\00$\00 (Maruyama et al. 1993) . На основі вищесказаного ми можемо запропонувати для розгляду цікавий цикл Ca2+ у підшлунковій залозі, при якому стимуляція агоністом у першу чергу запускає вивільнення Ca2+ із депо у області секреторних гранул QUOTE "(Petersen et al. 1994)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\16(Petersen et al. 1994)\01\03\00\01\00\00\00\00\00\00wЁ\07Е\007ђхw\00\00\00\00аХы\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\14\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwШХы\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwШХы\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03302'Petersen, Petersen, et al. 1994 302 /id\00'\00 (Petersen et al. 1994) , вірогідніше, із самих гранул QUOTE "(Gerasimenko et al. 1996)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\19(Gerasimenko et al. 1996)\01\03\00\01\00\00\00\00\00\00wЁ\07Е\007ђхw\00\00\00\00аіѓ\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\17\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwШіѓ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwШіѓ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0265,Gerasimenko, Gerasimenko, et al. 1996 65 /id\00,\00 (Gerasimenko et al. 1996) . Ca2+, виділений у цитозоль, згодом транспортується через люмінальну мембрану у ацинарний люмен, де він стимулює ендоцитоз QUOTE "(Maruyama et al. 1993)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\16(Maruyama et al. 1993)\01\03\00\01\00\00\00\00\00\00wЁ\07Е\007ђхw\00\00\00\00 -\12\02 р\12\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\14\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw\18-\12\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw\18-\12\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0266$Maruyama, Inooka, et al. 1993 66 /id\00$\00 (Maruyama et al. 1993) , що слідує за екзоцитозом, викликаним стимулом, і може частково потрапляти назад у клітину завдяки процесу ендоцитозу або іншими шляхами входу Ca2+ і, таким чином, також може поступати назад у нові секреторні гранули. Розподіл Ca2+-ATФАЗ по поверхні ацинарної клітини. Із результатів наших досліджень стає ясно, що переважна локалізація місць вивільнення кальцію при стимуляції агоністом знаходиться у апікальній частині панкреатичної ацинарної клітини, і це відбувається не внаслідок специфічності просторового паттерну зростання [Ca2+]i та не внаслідок різної регуляції агоністами кальцієвих насосів у апікальній та базальній частинах клітин. Неоднорідність розподілу вивільнення кальцію також не залежить від джерела мобілізованих іонів кальцію: іони кальцію, які вивільнялися як із внутрішніх депо, так і із NP-EGTA також викидалися із клітин переважно у апікальній частині. Всі вищенаведені результати підвели нас до висновку про те, що кальцієві насоси розташовані на поверхні плазматичної мембрани та/чи регулюються (деякими дуже тісно розподіленими, немобільними системами регуляції кальцієвих насосів) таким чином, що головна частина викидів кальцію відбувається у апікальній області. Ми проводили наші експерименти на ізольованих клітинах. В інтактних ацинусах переважне вивільнення Ca2+ із апікального полюсу означатиме, що більша частина Ca2+ виділиться із клітин через люмінальну частину клітинної мембрани. Прийнявши до уваги об’єм люмена (кілька кубічних мікрон), кількість клітин у одному ацинусі (кілька десятків) QUOTE "(Kern 1986)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\0B(Kern 1986)\01\03\00\01\00\00\00\00\00\00wЁ\07Е\007ђхw\00\00\00\00шJ\12\02 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\09\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwрJ\12\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwрJ\12\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0214\10Kern 1986 14 /id\00\10\00 (Kern 1986) та кількість вивільненого кальцію у одній клітині (0.5-1.0 мM у об’ємі клітини за 100-300 сек QUOTE "(Tepikin et al. 1992)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\15(Tepikin et al. 1992)\01\03\00\01\00\00\00\00\00\00wЁ\07Е\007ђхw\00\00\00\00Xw„\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\13\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwPw„\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwPw„\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\012$Tepikin, Voronina, et al. 1992 2 /id\00$\00 (Tepikin et al. 1992) ) стає ясно, що стимуляція агоністом може викликати драматичне (від декількох мілимолей/літр до навіть декількох десятків мілимолей/літр) зростання кількості вільного кальцію у люмені. У попередній главі було зроблено припущення про те, що таке зростання може бути необхідним для ініціювання ендоцитозу QUOTE "(Maruyama et al. 1993)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\16(Maruyama et al. 1993)\01\03\00\01\00\00\00\00\00\00wЁ\07Е\007ђхw\00\00\00\00?d\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\14\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwЂd\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwЂd\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0266$Maruyama, Inooka, et al. 1993 66 /id\00$\00 (Maruyama et al. 1993) (услід за агоніст-залежним екзоцитозом), але справжнє розуміння цього важливого явища є предметом майбутніх досліджень. Вивільнення Ca2+ із одиночних ізольованих панкреатичних зимогенних гранул Одна із найважливіших частин даної роботи, присвячена механізмам регуляції іонів кальцію у поодиноких секреторних гранулах, стала можлива головним чином завдяки впровадженню новітніх методів вимірів, що були розроблені під час виконання роботи. Наші експерименти по дослідженню молекулярних механізмів регуляції кальцію, що розташовані в окремих гранулах вказують на те, що Ca2+ може вивільнятися із одиночних ізольованих ЗГ, коли вони стимулюються Ca2+ -вивільняючими вторинними посередниками IP3 або cADPr. Концентрація вільного кальцію всередині нестимульованої ізольованої ЗГ становить приблизно 50 мкМ, значення, яке близьке до величин, які попередньо публікувалися відносно IP3 –чутливих внутрішньоклітинних Ca2+ депо у інтактних клітинах QUOTE "(Tse et al. 1994)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\11(Tse et al. 1994)\01\03\00\01\00\00\00\00\00\00wЁ\07Е\007ђхw\00\00\00\00арЊ\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\0F\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwШрЊ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwШрЊ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0289\1CTse, Tse, et al. 1994 89 /id\00\1C\00 (Tse et al. 1994) . Таким чином ми довели можливість існування нового джерела Ca2+, який може швидко мобілізуватися, і це допомагає пояснити явище викликаних агоністом цитозольних транзієнтних змін [Ca2+]i локалізованих у секреторній гранулярній області – змін, які були зареєстровані раніше у експериментах на інтактних або перфузованих із середини панкреатичних ацинарних клітинах QUOTE "(Kasai et al. 1993)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\13(Kasai et al. 1993)\01\03\00\01\00\00\00\00\00\00wЁ\07Е\007ђхw\00\00\00\00(w„\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\11\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw w„\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw w„\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0267\1DKasai, Li, et al. 1993 67 /id\00\1D\00 (Kasai et al. 1993) . Гіпотези про те, що секреторні гранули можуть бути важливим джерелом мобілізованого Ca2+, і пояснення таким чином викликаних агоністом цитозольних Ca2+ сигналів не є новими QUOTE "(Blondel et al. 1995)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\15(Blondel et al. 1995)\01\03\00\01\00\00\00\00\00\00wЁ\07Е\007ђхw\00\00\00\[email protected]\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\13\00АА\00\00Courier New\00CYR\[email protected]\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\[email protected]\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03316"Blondel, Bell, et al. 1995 316 /id\00"\00 (Blondel et al. 1995) , але ця точка зору ніколи не була загальноприйнятою QUOTE "(Pozzan et al. 1994)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\14(Pozzan et al. 1994)\01\03\00\01\00\00\00\00\00\00wЁ\07Е\007ђхw\00\00\00\00?J\12\02 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\12\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwђJ\12\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwђJ\12\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0285#Pozzan, Rizzuto, et al. 1994 85 /id\00#\00 (Pozzan et al. 1994) . Yoo та Albanesi показали, що існує IP3 –викликане вивільнення Ca2+ із практично чистої фракції адренальних медулярних секреторних везикул бика QUOTE "(Yoo and Albanesi 1990)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\17(Yoo and Albanesi 1990)\01\03\00\01\00\00\00\00\00\00wЁ\07Е\007ђхw\00\00\00\00?л‡\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\15\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwЂл‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwЂл‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03305\1BYoo & Albanesi 1990 305 /id\00\1B\00 (Yoo and Albanesi 1990) . Це спостереження протирічить іншим даним, згідно яких відповіді на IP3 немає у гранулах із клітинної лінії феохромоцитоми (PC-12), яка походить від хромафінних клітин щура QUOTE "(Fasolato et al. 1991)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\16(Fasolato et al. 1991)\01\03\00\01\00\00\00\00\00\00wЁ\07Е\007ђхw\00\00\00\00(<‹\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\14\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw <‹\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw <‹\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03318&Fasolato, Zottini, et al. 1991 318 /id\00&\00 (Fasolato et al. 1991) . Крім того у іншій роботі повідомлялося про те, що дані Yoo та Albanesi QUOTE "(Yoo and Albanesi 1990)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\17(Yoo and Albanesi 1990)\01\03\00\01\00\00\00\00\00\00wЁ\07Е\007ђхw\00\00\00\00pc\1B\02 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\15\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwhc\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwhc\1B\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03305\1BYoo & Albanesi 1990 305 /id\00\1B\00 (Yoo and Albanesi 1990) неможливо підтвердити (див. обговорення у роботі Kasai QUOTE "(Kasai 1995)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\0C(Kasai 1995)\01\03\00\01\00\00\00\00\00\00wЁ\07Е\007ђхw\00\00\00\00\10‚…\01 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\0A\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw\08‚…\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw\08‚…\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03320\12Kasai 1995 320 /id\00\12\00 (Kasai 1995) . Наші дані отримані більш прямим шляхом, ніж дані Yoo та Albanesi QUOTE "(Yoo and Albanesi 1990)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\17(Yoo and Albanesi 1990)\01\03\00\01\00\00\00\00\00\00wЁ\07Е\007ђхw\00\00\00\00?5э\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\15\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwђ5э\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwђ5э\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03305\1BYoo & Albanesi 1990 305 /id\00\1B\00 (Yoo and Albanesi 1990) , оскільки ми змогли виміряти зміни концентрації внутрішньогранулярного Ca2+ для одиночної ізольованої ЗГ. Крім того, за допомогою вимірювань (з високою роздільною здатністю) процесів вивільнення Ca2+ із одиночних ізольованих ЗГ в результаті іонофоретичної аплікації IP3 ми показали, що IP3 може викликати швидкі та потужні викиди кальцію із гранул із розгорткою у часі, яка відповідає генерації Ca2+ спайка у інтактних екзокринних клітинах. Ми також вперше показали, що можливий посередник вивільнення Ca2+ - cADPr – може викликати вивільнення Ca2+ із цих гранул і пояснили, таким чином, раніше зареєстроване явище викликаних cADPr Ca2+ спайків у секреторному полюсі інтактних клітин QUOTE "(Thorn P et al. 1994)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\15(Thorn P et al. 1994)\01\03\00\01\00\00\00\00\00\00wЁ\07Е\007ђхw\00\00\00\00`У‡\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\13\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwXУ‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwXУ‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03104+Thorn P, Gerasimenko O, et al. 1994 104 /id\00+\00 (Thorn P et al. 1994) . Екзоцитоз як новітній механізм виведення кальцію із екзокринних клітин. Широке коло досліджень, що були проведені багатьма лабораторіями (дивись огляд літератури) включаючи нашу QUOTE "(Gerasimenko, Gerasimenko et al. 1996)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00&(Gerasimenko, Gerasimenko et al. 1996)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00Шх\07\02 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\1F\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwАbь\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwАbь\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwАbь\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwАbь\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0265,Gerasimenko, Gerasimenko, et al. 1996 65 /id\00,\00 (Gerasimenko et al. 1996) показали, що секреторні везикули та гранули містять кальцій у дуже високій концентрації, і акт екзоцитозу сам по собі повинен вивільнювати Ca2+ у зонішьоклітинне середовище. Таким чином екзоцитоз разом з ендоцитозом, що призводить до захвату у ендосоми зонішьоклітинного кальцію та переміщення його через плазматичну мембрану усередину клітин, можуть слугувати, як механізми, що опосередковують кальцієвий метаболізм у секреторних клітин. Однак це досить просте припущення не було не висловлено не досліджено, головним чином (як ми вважаємо) із-за браку необхідних експериментальних методів досліджень. З розробкою нових методів, запропонованих у даній роботі, ми попробували дослідити ймовірність даної гіпотези. Під час попередніх досліджень цієї гіпотези на панкреатичних ацинарних клітинах QUOTE "(Belan, Gerasimenko et al. 1996)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00 (Belan, Gerasimenko et al. 1996)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00\00Ю{\01 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\19\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwp\18щ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwp\18щ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwp\18щ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwp\18щ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0264&Belan, Gerasimenko, et al. 1996 64 /id\00&\00 (Belan et al. 1996) було показано, що викликана агоністом секреція завжди дуже суттєво знижувалася у цих клітинах при низькій концентрації зовнішньоклітинного Ca2+, яка була використана у наших дослідах. В цих експериментальних умовах ми визначили, що головна частина Ca2+, вивільненого із клітин під час стимуляції, з’являється у відповідь на аплікацію агоністом завдяки опосередкованому Ca2+ насосами потоку через плазматичну мембрану а не завдяки екзоцитозу QUOTE "(Tepikin, Voronina et al. 1992a;Tepikin, Voronina et al. 1992b;Belan, Gerasimenko et al. 1996)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00^(Tepikin, Voronina et al. 1992a;Tepikin, Voronina et al. 1992b;Belan, Gerasimenko et al. 1996)\01\0D\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00Шх\07\02 р\1 2\00\082‰\01Н‹хwи\06\18\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwачъ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwачъ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\05\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwачъ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\00 \00\00\00\003DщwАLз\01Н‹хwЁ\07\18\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwАL\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003DщwАL\01\00\00\00Е\00\14к\05\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwАL\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ хw|л\12\00\00\00\00\003Dщwачъ\01Н‹хwЁ\07\19\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщwач\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщwач\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщwач\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщwач\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0264&Belan, Gerasimenko, et al. 1996 64 /id\00&\00 (Tepikin et al. 1992; Belan et al. 1996) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\012$Tepikin, Voronina, et al. 1992 2 /id\00$\00 QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\013$Tepikin, Voronina, et al. 1992 3 /id\00$\00 . Подальші досліди проведені на ацинарних клітинах сабмандибулярних слинних залоз показали (дивись Результати), що спостерігається значне зростання вивільнення кальцію із цих секреторних клітин, викликане стимуляцією ISP, агоністом ?-адренергічних рецепторів, без помітного зростання внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію. Таким чином це зростання неможливо було пояснити роботою Ca2+-ATФаз плазматичної мембрани. Ми знову запропонували гіпотезу, згідно якій ISP-викликане вивільнення Ca2+ відбувається, як послідовність екзоцитозів. Основні аргументи, які підтримують наш висновок про те, що ISP спричинює вивільнення Ca2+ завдяки екзоцитозу, а не завдяки активації Ca2+ насосу наступні: 1) Спайковий характер вивільнення кальцію, викликаного ISP. 2) ISP не спричинює ніякого помітного зростання [Ca2+]i і, таким чином, немає причини пояснювати вивільнення Ca2+ активацією Ca2+ ATФ- ази. 3) Хоча ISP не підвищує [Ca2+]i, але вивільнення Ca2+ при його дії є більше за величиною, ніж те, яке спостерігається у відповідь на стимуляцію АХ, який суттєво підвищує значення [Ca2+]i. 4) ISP у слинних залозах є більш сильним стимулятором секреції, ніж АХ, оскільки він викликає більш значну і тривалу секрецію білку, ніж може бути досягнено при дії АХ QUOTE "(Petersen, Ueda et al. 1977;Iwatsuki and Petersen 1981;Quissell and Tabak 1989;Spearman and Butcher 1989;Mills, Dormer et al. 1991)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00ѓ(Petersen, Ueda et al. 1977;Iwatsuki and Petersen 1981;Quissell and Tabak 1989;Spearman and Butcher 1989;Mills, Dormer et al. 1991)\01\15\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00Ёйь\01 р\12\ 00\08\00‡\01Н‹хwи\06\15\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwh‡~\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwh‡~\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwh‡~\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\00 \00\00\00\003Dщw?Dѓ\01Н‹хwЁ\07\15\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw?D\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw?D\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw?D\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ хw|л\12\00\00\00\00\003Dщwh‡~\01Н‹хwЁ\07\12\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщwh‡\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщwh‡\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщwh‡\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ хw|л\12\00\00\00\00\003Dщw?Dѓ\01Н‹хwЁ\07\14\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw?D\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw?D\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw?D\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ хw|л\12\00\00\00\00\003Dщwh‡~\01Н‹хwЁ\07\14\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщwh‡\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщwh‡\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщwh‡\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщwh‡\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0271"Petersen, Ueda, et al. 1977 71 /id\00"\00 (Mills et al. 1991) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0275\1CQuissell & Tabak 1989 75 /id\00\1C\00 QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0276\1ESpearman & Butcher 1989 76 /id\00\1E\00 QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0278\1FIwatsuki & Petersen 1981 78 /id\00\1F\00 QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03115"Mills, Dormer, et al. 1991 115 /id\00"\00 . 5) Секреторні гранули у багатьох абсолютно різних типах секреторних клітин, включаючи сабмандибулярні клітини слинних залоз, містять високу концентрацію кальцію (близько 10 - 100 мM) QUOTE "(Nicaise, Maggio et al. 1992;Gerasimenko, Gerasimenko et al. 1996)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00B(Nicaise, Maggio et al. 1992;Gerasimenko, Gerasimenko et al. 1996)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00И9ы\01 р\12\ 00\082‰\01Н‹хwи\06\16\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwHg‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwHg‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwHg‡\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\00 \00\00\00\003DщwXЃе\01Н‹хwЁ\07\1F\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwXЃ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003DщwXЃ\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwXЃ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003DщwXЃ\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0213#Nicaise, Maggio, et al. 1992 13 /id\00#\00 (Gerasimenko et al. 1996) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0265,Gerasimenko, Gerasimenko, et al. 1996 65 /id\00,\00 . Таким чином, екзоцитоз повинен викликати підвищення [Ca2+]o. 6) Відповіді із вивільненням Ca2+, викликані ISP та АХ, найвірогідніше, мають різні джерела виникнення, оскільки ISP може викликати значне вивільнення Ca2+ услід за стимуляцією АХ, яка відбувалася досить довго для того, щоб спустошити внутрішні запаси Ca2+. У додаткових експериментах, не показаних у результатах, довгий термін інкубації з ISP не перешкоджав вивільненню кальцію, викликаному АХ. Використавши методики високого просторового роз рішення, що базуються на впровадженні конфокальної мікроскопії, ми змогли отримати короткотривалі спайки вивільнення Сa2+, особливо під час дії ISP, але також і при дії АХ. Хоча ISP відомий, як більш сильний стимулятор секреції, АХ також може викликати секрецію білку у цих клітинах. Таким чином, простіше пояснити спайки зовнішньоклітинного Ca2+ як послідовності одиночних актів екзоцитозу, які, проте, можуть включати у себе і по декілька гранул (складний екзоцитоз). Загальна величина відповіді із вивільненням кальцію внаслідок дії АХ, таким чином, є комбінацією вивільнення Ca2+ за допомогою кальцієвих насосів плазматичної мембрани, та вивільнення кальцію шляхом екзоцитозу. Важко оцінити відносний вклад цих двох компонентів у вивільнення кальцію внаслідок дії АХ, але мала кількість швидких (викликаних секрецією) кальцієвих транзієнтів, що реєструвались у при дії АХ у експериментах із Calcium Green-1 декстраном (рис. 12), дуже гарна кореляція між величиною вивільняємого кальцію та концентрацією внутрішньоклітинного Ca2+, що була зареєстрована у експериментах із методикою краплини і той факт, що вивільнення кальцію може бути спричинене АХ після довгої інкубації із ISP- все це дозволяє припустити, що кальцієві насоси роблять основний внесок у вивільнення кальцію під час дії АХ. В той же час можна вважати, що екзоцитоз є основним механізмом, який відповідає за вивільнення кальцію внаслідок дії ISP у ацинарних клітинах слинних залоз. Значна кількість кальцію може постійно вивільнятися із секреторних клітин внаслідок базальної (не викликаної дією агоністів) секреторної активності. Наші попередні результати показали, що в аналогічних умовах (кімнатна температура, низька зовнішньоклітинна концентрація кальцію) панкреатичні ацинарні клітини практично не секретують. У експериментах із панкреатичними ацинарними клітинами, поміщеними у розчин, який містив кальцієвий індикатор, зв’язаний з декстраном, ми не побачили швидких кальцієвих транзієнтів у областях поблизу клітин. У панкреатичних ацинарних клітинах вивільнення кальцію, виміряне у експериментах на краплині із використанням декстран – зв’язуючого кальцієвого індикатора відбувалося завдяки активності кальцієвих насосів плазматичної мембрани QUOTE "(Tepikin, Voronina et al. 1992b;Tepikin, Llopis et al. 1994;Belan, Gerasimenko et al. 1996)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00[(Tepikin, Voronina et al. 1992b;Tepikin, Llopis et al. 1994;Belan, Gerasimenko et al. 1996)\01\0D\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00Шх\07\02 р\1 2\00\08\00‡\01Н‹хwи\06\18\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwђ?ѓ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwђ?ѓ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\05\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwђ?ѓ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\00 \00\00\00\003Dщwp\18щ\01Н‹хwЁ\07\16\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщwp\18\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourie r New CYR\00\00\003Dщwp\18\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщwp\18\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя :Љхw|л\12\00\00\00\00\003Dщwђ?ѓ\01Н‹хwЁ\07\19\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщwђ?\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщwђ?\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщwђ?\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщwђ?\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\013$Tepikin, Voronina, et al. 1992 3 /id\00$\00 (Belan et al. 1996) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0240#Tepikin, Llopis, et al. 1994 40 /id\00#\00 QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0264&Belan, Gerasimenko, et al. 1996 64 /id\00&\00 . Для цих клітин величина базального вивільнення кальцію, виміряна за допомогою методики краплини становила приблизно 8 мікроM за хвилину, тоді як для сабмандибулярних клітин ця величина була приблизно у 10 разів вища (81 + 15 мкM на хвилину). Ми пояснюємо цю різницю більш високим рівнем базального екзоцитозу у сабмандибулярних клітинах у порівнянні із панкреатичними ацинарними клітинами. Це також може означати, що екзоцитоз може бути одним із основних механізмів, який регулює вміст внутрішньоклітинного кальцію у секреторних клітин. У багатьох типах клітин екзоцитоз є практично перманентним процесом протягом всього періоду життя клітини. Можна припустити, що клітини можуть накопичувати деякі речовини (наприклад, Ca2+) які повинні вивільнятися із них, і накопичувати такі речовини у секреторних гранулах, а потім секретувати їх разом із головними продуктами секреції, такими, як протеолітичні ферменти чи нейропередатчики. Такий механізм може мати певні переваги: (i) енергія, яка витрачається для секреції везикул (і яка у будь – якому випадку повинна витрачатися для секреції головних секреторних продуктів) буде витрачена для вивільнення інших речовин; (ii) більша частина іонів кальцію, яка надходить у цитозоль, у першу чергу запасається у внутрішньоклітинних депо QUOTE "(Pozzan, Rizzuto et al. 1994;Mogami, Nakano et al. 1997)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\008(Pozzan, Rizzuto et al. 1994;Mogami, Nakano et al. 1997)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00\00Ю{\01 р\1 2\00\082‰\01Н‹хwи\06\16\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwачъ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwачъ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwачъ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\00 \00\00\00\003Dщw ђы\01Н‹хwЁ\07\15\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw ђ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw ђ\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw ђ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw ђ\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0285#Pozzan, Rizzuto, et al. 1994 85 /id\00#\00 (Mogami et al. 1997) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03314#Mogami, Nakano, et al. 1997 314 /id\00#\00 . Для того, щоб вивільнити Ca2+ мембранними системами плазматичної мембрани, треба було б спершу вивільнити його у цитозоль, а потім із цитозолю - у зовнішньоклітинне середовище. Такий механізм потребував би повторного викачування Ca2+ проти високих електрохімічних градієнтів, що призвело б до перевитрат енергії; (iii) повна площа поверхні внутрішньоклітинних компартментів значно більша за площу плазматичної мембрани. Така площа дає можливість розмістити більше Ca2+ регулюючих систем (наприклад, Ca2+ насосів), що в свою чергу дозволяє закачувати Ca2+ всередину цих внутрішньоклітинних компартментів. А перехід цього кальцію у секреторні везикули рано чи пізно призводить до його секруції у зовнішньоклітинне середовище. Ca2+ може накопичуватися у секреторних гранулах як безпосередньо за допомогою АТФ-аз та/чи Ca2+/H+ обмінника QUOTE "(Gratzl and Kriegerbrauer 1981;von Grafenstein and Neumann 1983;Nicaise, Maggio et al. 1992)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\5C(Gratzl and Kriegerbrauer 1981;von Grafenstein and Neumann 1983;Nicaise, Maggio et al. 1992)\01\0D\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00(йь\01 р\12\ 00\08\00‡\01Н‹хwи\06\18\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwhк†\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwhк†\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwhк†\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\00 \00\00\00\003DщwА”ы\01Н‹хwЁ\07\1B\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwА”\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003DщwА”\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwА”\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ хw|л\12\00\00\00\00\003Dщwhк†\01Н‹хwЁ\07\16\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщwhк\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщwhк\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщwhк\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщwhк\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0213#Nicaise, Maggio, et al. 1992 13 /id\00#\00 (Nicaise et al. 1992) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0252%von Grafenstein & Neumann 1983 52 /id\00%\00 QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0261"Gratzl & Kriegerbrauer 1981 61 /id\00"\00 , так і непрямим шляхом, за допомогою захвату кальцію, який зберігається у внутрішньоклітинних депо QUOTE "(Pozzan, Rizzuto et al. 1994;Montero, Brini et al. 1995;Hofer and Schulz 1996)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00N(Pozzan, Rizzuto et al. 1994;Montero, Brini et al. 1995;Hofer and Schulz 1996)\01\0D\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00Шх\07\02 р\1 2\00\082‰\01Н‹хwи\06\16\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw?Dѓ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щw?Dѓ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щw?Dѓ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\00 \00\00\00\003Dщwh‡~\01Н‹хwЁ\07\15\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщwh‡\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщwh‡\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщwh‡\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љ хw|л\12\00\00\00\00\003Dщw?Dѓ\01Н‹хwЁ\07\10\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw?D\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw?D\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw?D\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw?D\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0285#Pozzan, Rizzuto, et al. 1994 85 /id\00#\00 (Hofer and Schulz 1996) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0297"Montero, Brini, et al. 1995 97 /id\00"\00 QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\03101\1BHofer & Schulz 1996 101 /id\00\1B\00 . Безвідносно до механізму, за допомогою якого Ca2+ накопичується у секреторних гранулах, вміст кальцію у них дуже високий і досягає у клітинах деяких типів 100 мM QUOTE "(Nicaise, Maggio et al. 1992)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1D(Nicaise, Maggio et al. 1992)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00(йь\01 р\12\ 00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\16\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwXЃе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwXЃе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwXЃе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwXЃе\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0213#Nicaise, Maggio, et al. 1992 13 /id\00#\00 (Nicaise et al. 1992) . Така висока загальна концентрація кальцію призводить до його суттєвого вивільнення навіть протягом одиночного акту секреції. Наприклад, екзоцитоз однієї секреторної гранули (припустимо, що об’єм гранули становить 10-4 від об’єму клітини) зменшить загальну концентрацію внутрішньоклітинного кальцію на 1-10 мкM, що є значною зміною у порівнянні із концентрацією вільного внутрішньоклітинного кальцію (0.1 мкM). Крім того було показано чи припущено, що висока інтрагранулярна концентрація кальцію є важливою для процесингу секреторних продуктів, упаковки білків та злиття гранул із плазматичною мембраною QUOTE "(Bajjalieh and Scheller 1995;Burgoyne and Morgan 1995)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\006(Bajjalieh and Scheller 1995;Burgoyne and Morgan 1995)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00(йь\01 р\12\ 00\08\00‡\01Н‹хwи\06\16\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwАbь\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwАbь\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwАbь\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\00 \00\00\00\003DщwHg‡\01Н‹хwЁ\07\13\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwHg\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003DщwHg\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003DщwHg\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003DщwHg\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\017\1CBurgoyne & Morgan 1995 7 /id\00\1C\00 Burgoyne and Morgan 1995) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0242 Bajjalieh & Scheller 1995 42 /id\00 \00 . Наші результати дають можливість припустити, що описаний вище механізм виведення кальцію може мати місце у багатьох типах клітин, для яких можливий екзоцитоз. Відомо, що екзоцитоз грає роль у експорту кальцію у адренальних медулярних клітинах бика QUOTE "(von Grafenstein and Powis 1989)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00 (von Grafenstein and Powis 1989)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00Шх\07\02 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\19\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwђ?ѓ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwђ?ѓ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwђ?ѓ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwђ?ѓ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0251#von Grafenstein & Powis 1989 51 /id\00#\00 (von Grafenstein and Powis 1989) , нервових закінченнях QUOTE "(Thirion, Stuenkel et al. 1995)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\1F(Thirion, Stuenkel et al. 1995)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00\00Ю{\01 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\18\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwp\18щ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwp\18щ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwp\18щ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwp\18щ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0250%Thirion, Stuenkel, et al. 1995 50 /id\00%\00 (Thirion et al. 1995) та яйцях морського їжака QUOTE "(Gillot, Ciapa et al. 1991;Kuhtreiber, Gillot et al. 1993)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00:(Gillot, Ciapa et al. 1991;Kuhtreiber, Gillot et al. 1993)\01\09\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00Шх\07\02 р\1 2\00\082‰\01Н‹хwи\06\14\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwачъ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwачъ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwачъ\01Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00wяяяя:Љхw|л\12\00 \00\00\00\003Dщw ђы\01Н‹хwЁ\07\19\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw ђ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw ђ\01\00\00\00Е\00\14к\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00\00\003Dщw ђ\01\00\00\00Е\00\14к\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00\00\003Dщw ђ\01\00\00\00Е\00\14кWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0280!Gillot, Ciapa, et al. 1991 80 /id\00!\00 Kuhtreiber et al. 1993) QUOTE "" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00\00\01\00\00We:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\0281&Kuhtreiber, Gillot, et al. 1993 81 /id\00&\00 . Дана робота вперше характеризує як кількість, так і кінетику вивільнення кальцію шляхом екзоцитозу на рівні одиночної клітини та у порівнянні із вивільненням кальцію за допомогою мембранних кальцієвих насосів. Ми встановили, що вивільнення кальцію шляхом екзоцитозу може бути важливим механізмом вивільнення кальцію із секреторних клітин і, у деяких випадках і типах клітин, основна частина кальцієвого вихідного потоку має місце завдяки роботі цьому механізму. Механізми кальцієвої регуляції в екзокринних клітинах. В даній главі ми коротко підсумуємо основні біофізичні знахідки, що стосуються механізмів кальцієвої регуляції в екзокринних клітинах, які було зроблено при виконанні дисертаційної роботи. Ацинарні секреторні клітини, що були об’єктом наших досліджень, є сильно поляризованими з чітко розрізняємими апікальним секреторним полюсом, де розташовані секреторні гранули та базальним полюсом, що домінується ендоплазматичним ретикулумом (рис. 13). В цій роботі ми вперше показали, що секреторний полюс є головним місцем вивільнення Ca2+ із ацинарних клітин внаслідок їх стимуляції як фізіологічними так патофізіологічними концентраціями агоністів. Це високополяризоване вивільнення Ca2+ при підвищенні його внутрішньоклітинної концентрації відбувається через відносно високу щільність розташування кальцієвих насосів у апікальній мембрані ацинарних клітин (рис. 13). Було також вперше показано, що секреторні гранули можуть слугувати як внутрішньоклітинні кальцієві депо і що головні вторинні посередники, що виробляються екзокринними клітинами у відповідь на дію агоністів - IP3 та cADPr - викликають швидке вивільнення Ca2+ із гранул. Таким чином, при дії агоністів секреторні гранули можуть вивільняти кальцій або безпосередньо, або через механізм CICR (рис. 13), чим частково або повністю можна пояснити явище викликаного агоністом підвищення цитозольної [Ca2+] в секреторному полюсі ацинарних клітин. Ми також довели, що екзокринні клітини можуть вивільняти суттєву кількість іонів кальцію шляхом екзоцитозу. Подальші роботи, проведені в цьому напрямку показали, що ендоцитоз (що слідує за агоніст-викликаним екзоцитозом) призводить до зворотного, вхідного потоку кальцію. Причому кальцій, що був захоплений у ендосоми, був швидко імпортованій із ендосом до інших клітинних органел і після цього міг бути використаний у багатьох кальцій-залежних клітинних процесах QUOTE "(Gerasimenko, Tepikin et al. 1998)" ADDIN REFMAN я\11\05‘\19\01\00\00\00"(Gerasimenko, Tepikin et al. 1998)\01\05\00\01\00\00\00\00\00\00w?\09Е\007ђхw\00\00\00\00рі\0A\02 р\1 2\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\00\1B\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\04\00АА\00\00Courier New\00CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђ\01\00\00\00\00\00\00ourier New CYR\00щwШw\16\02Н‹хwЁ\07Е\007ђWe:\5C_documents and settings\5Cnana\5Cdocuments\5Cdd\5Cmy thesis\5C2005.06.21 thesis\5Cpashadisserall\03\00\042687*Gerasimenko, Tepikin, et al. 1998 2687 /id\00*\00 (Gerasimenko, Tepikin et al. 1998) . Таким чином, вперше було показано, що екзоцитоз та ендоцитоз, а не тільки кальцієві насоси плазматичної мембрани і депо-залежний вхід Ca2+, можуть бути одними з головних механізмів, що балансують клітинний кальцієвий гомеостаз (рис. 13). ВИСНОВКИ У дисертаційній роботі наведені дослідження різноманітних клітинних механізмів, що приймають участь у скоординованій регуляції іонів кальцію у екзокринних клітинах. Розроблено новий метод - метод краплини – що є першим методом, який дозволив кількісно вимірювати кінетику виведення іонів кальцію із поодиноких клітин ссавців. Розроблено нову методику для просторового спостереження малих трансмембранних потоків іонів кальцію у секреторних гранулах, поодиноких клітинах та малих клітинних агрегатах, в основі якої лежить ідея використання флуоресцентного кальцієвого індикатору, зв'язаного із високомолекулярними декстранами для сповільнення дифузії іонів кальцію. Показано, що IP3 та cADPr викликають помітне спадання концентрації вільного інтрагранулярного Ca2+. Використовуючи новий метод просторового спостереження малих трансмембранних потоків іонів кальцію, вимірено зміни у концентрації Ca2+ поблизу ізольованих секреторних гранул та показано, що IP3 та cADPr викликають швидке вивільнення Ca2+ із гранул, чим можна пояснити явище викликаного агоністом підвищення цитозольної [Ca2+] в секреторному полюсі ацинарних клітин, яке необхідне для процесу секреції ферментів. Застосувавши нову методику, у якій висока ступінь роздільної здатності при локалізації місць вивільнення клітинного Ca2+ досягалася за допомогою конфокальної мікроскопії та Ca2+-чутливого флуоресцентного барвника, зв’язаного із важким декстраном, було показано, що секреторний полюс є головним місцем вивільнення Ca2+ із ацинарних клітин внаслідок стимуляції агоністом. Показано, що під час стимульованого агоністом підвищення кальцію або під час вивільнення кальцію із зв’язаного стану всередині клітини, Ca2+ виводиться із апікального секреторного полюсу клітини. Це найвірогідніше відбувається через відносно високу щільність розташування кальцієвих насосів у апікальній мембрані ацинарних клітин. Інтенсивність вивільнення Ca2+ із апікального секреторного полюсу є такою, що протягом часу стимуляції агоністом відбуваються значні (по кілька мілімолей на літр) зміни у концентрації вільного кальцію в люмені ацинуса, необхідні для стимуляції ендоцитозу, що слідує за секрецією. За допомогою нової методики для вимірювання концентрації зовнішньоклітинного кальцію поблизу клітинної мембрани та методики краплини було показано, що ізопротеренол, ?-адренергічний агоніст та потужний секреторний агент, не викликав змін у концентрації вільного Ca2+ у цитозолі, але спричиняв помітні зміни у вигляді спайків концентрації зовнішньоклітинного кальцію. Відсутність зростання [Ca2+]i та пульсоподібна природа змін у [Ca2+]o вказують на те, що ці спайки з’являються, найвірогідніше, внаслідок вивільнення кальцію із секреторних гранул. Холінергічний агоніст ацетилхолін викликав значне зростання [Ca2+]i та ”гладке” за формою зростання [Ca2+]o, які, були спричинені роботою кальцієвих насосів плазматичних мембран, із накладанням коротких спайків [Ca2+]o, що були викликані екзоцитом кальцію у зовнішньоклітинне середовище. Величина викликаного секрецією вивільнення кальцію була досить значною. Обчислена величина втрат кальцію протягом перших 100 секунд при супрамаксимальній стимуляції відповідає зменшенню загальної концентрації кальцію в клітині на 0.4 мМ. Зроблено висновок про те, що в екзокринних клітинах кальцій може вивільнюватися в люмен шляхом екзоцитозу, і що екзоцитоз (а не кальцієві АТФфази плазматичної мембрани) може бути основним механізмом вивільнення кальцію у навколоклітинний простір в екзокринних та інших типах секретуючих клітин. Список опублікованих прац за темою дисертації Belan P.V., Osipenko O. Blocking effect of La3+ ions on transmembrane ionic current evoked by intracellular cyclic AMP injection in identified Helix pomatia neurons // Neurosci Lett. - 1991. -V 124, № 1. - P. 137-139. Diatlov V.A., Belan P.V., Bakai E.A., Makovetskii V.P., Makovetskaia V.V. Tocopherol modulation of acetylcholine-induced current in mollusk neurons // Neirofiziologiia. - 1991. -V 23, №5.- P. 628-631. Gyori J., Kiss T., Shcherbatko A.D., Belan P.V., Tepikin A.V., Osipenko O.N., Salanki J. Effect of Ag+ on membrane permeability of perfused Helix pomatia neurons // J Physiol (Lond). - 1991. -V 442. - P. 1-13. Kostyuk P.G., Belan P.V., Tepikin A.V. Free calcium transients and oscillations in nerve cells. // Exp Brain Res. - 1991. -V 83, №2. - P. 459-464. Tepikin A.V., Kostyuk P.G., Snitsarev V.A., Belan P.V. Extrusion of calcium from a single isolated neuron of the snail Helix pomatia // J Membr Biol. - 1991. -V 123, №1. - P. 43-47. Belan P., Kostyuk P., Snitsarev V., Tepikin A. Calcium clamp in isolated neurones of the snail Helix pomatia // J Physiol (Lond). - 1993. -V 462. - P. 47-58. Belan P.V., Kostyuk P.G., Snitsarev V.A., Tepikin A.V. Calcium clamp in single nerve cells // Cell Calcium. - 1993. -V 14, №6. - P. 419-425. Belan P.V., Kiss T., Snitsarev V., Storozhuk M.V., Osipenko O.N. The effect of acetylcholine and serotonin on calcium transients and calcium currents in identified Helix pomatia L. neurons // Cell Signal. - 1994. -V 6, №5. - P. 551-559. Belan P.V., Gerasimenko O.V., Berry D., Saftenku E., Petersen O.H., Tepikin A.V. A new technique for assessing the microscopic distribution of cellular calcium exit sites // Pflugers Arch. - 1996. -V 433, №1-2. - P. 200-208. Belan P.V., Gerasimenko O.V., Tepikin A.V., Petersen O.H. Localization of Ca2+ extrusion sites in pancreatic acinar cells // J Biol Chem. - 1996. -V 271, №13. - P. 7615-7619. Belan P.V., Saftenku E. Mathematical model of Ca2+ diffusion and buffering in extracellular solution after Ca2+ extrusion from a spherical cell // Neurophysiology. - 1996. -V 28. - P. 187-193. Gerasimenko O.V., Gerasimenko J.V., Belan P.V., Petersen O.H. Inositol trisphosphate and cyclic ADP-ribose-mediated release of Ca2+ from single isolated pancreatic zymogen granules // Cell. - 1996. -V 84, №3. - P. 473-480. Belan P., Gerasimenko O., Petersen O.H., Tepikin A.V. Distribution of Ca2+ extrusion sites on the mouse pancreatic acinar cell surface // Cell Calcium. - 1997. -V 22, №1. - P. 5-10. Belan P.V., Saftenku E., Gerasimenko O.V., Pogorelaya N.Ch., Chvanov M.A., Teslenko V.I. Nonuniformity of calcium efflux from pancreatic acinar cells and its analysis by mathematical model of calcium diffusion and buffering in extracellular solution // Ibid. - 1997. -V 29. - P. 40-44. Belan P., Gardner J., Gerasimenko O., Gerasimenko J., Mills C.L., Petersen O.H., Tepikin A.V. Isoproterenol evokes extracellular Ca2+ spikes due to secretory events in salivary gland cells // J Biol Chem. - 1998. -V 273, №7. - P. 4106-4111. Melnick I.V., Chvanov M.A., Belan P.V. Rat hippocampal neurons maintain their own GABAergic synaptic transmission in culture // Neurosci Lett. - 1999. -V 262, №3. - P. 151-154. Belan PV. Petersen OH. Measuring Calcium and Calmoduline Inside and Outside Cells //Measuring Ca2+ extrusion from single cells. Heidelberg: Springer-Verlag, 2000. - P. 251-267. Chvanov M.A., Boychuk Ya.A., Melnick I.V., Belan P.V., Kostyuk P.G. Distributions of the inter-event intervals for miniature inhibitory and excitatory postsynaptic currents in cultured hippocampal neurons // Neurophysiology. - 2000. -V 32, №3. - P. 201-203. Storozhuk M.V., Melnick I.V., Kostyuk P.G., Belan P.V. Postsynaptic mechanism may contribute to inhibitory acetylcholine effect on GABAergic synaptic transmission in hippocampal cell cultures // Synapse. - 2001. -V 41, №1. - P. 65-70. Belan P.V., Kostyuk P.G. Glutamate-receptor-induced modulation of GABAergic synaptic transmission in the hippocampus // Pflugers Arch JID - 0154720. - 2002. -V 444, №1. - P. 26-37. Stepanyuk A., Chvanov M., Ivanov A., Boychuk Y., Pivneva T., Belan P. Prolonged Decay of Evoked Inhibitory Postsynaptic Currents in Hippocampal Neurons is not Shaped by Asynchronous Release // Neurophysiology. - 2002. -V 34, №2/3. - P. 249-252. Storozhuk M.V., Ivanova S.Y., Pivneva T.A., Melnick I.V., Skibo G.G., Belan P.V., Kostyuk P.G. Post-tetanic depression of GABAergic synaptic transmission in rat hippocampal cell cultures // Neurosci Lett. - 2002. -V 323, №1. - P. 5-8. Ivanova S.Y., Lushnikova I.V., Pivneva T.A., Belan P.V., Storozhuk M.V., Kostyuk P.G. Differential properties of GABAergic synaptic connections in rat hippocampal cell cultures // Synapse. - 2004. -V 53, №2. - P. 122-130. Stepanyuk A.R., Boychuk Y.A., Tsugorka T.N., Drebot Y.I., Lushnikova I.V., Pivneva T.A., Belan P.V. Estimating transmitter release rates and quantal amplitudes in central synapses from postsynaptic current fluctuations // Fiziol. Zh. - 2004. -V 50, №4. - P. 22-32. Тези доповідей (за останні 5 років) Chvanov M.A., Kostyuk P.G., Belan P.V. Changes in patterns of mIPSC activity due to glutamate receptor activation // Bogomoletz-Nencki Symposium on Molecular and Physiological Approaches to Neuronal Plasticity, Sulejow (Poland), 2001. Belan P., Stepanyuk A., Chvanov M., et al. Mechanisms underlying decay of evoked GABAergic IPSC in hippocampal cultured neurons // American Society for Neuroscience 31st Annual Meeting, San Diego (USA), 2001. Belan P.V., Chvanov M.A., Kostyuk P.G. Peaked distributions of inter-event intervals of miniature inhibitory and excitatory postsynaptic currents in hippocampal culture // 34th International Congress of Physiological Sciences. St Petersburg (Russia), 2001. Chvanov M., Melnick I., Kostyuk P., et al. Different disposition of postsynaptic glutamate and GABA A receptors causes different patterns of glutamate-induced modulation of inhibitory postsynaptic currents in hippocampal culture // X International Neurobiological Symposium „Mechanisms of Learning and Memory”, Magdeburg (Germany), 2000. Chvanov M.A., Belan P.V. GABAAergic synaptic transmission modulation in the hippocampus by low glutamate concentration // X International Neurobiological Symposium: Mechanisms of Learning and Memory Magdeburg (Germany), 2000. Chvanov M.A., Melnick I.V., Belan P.V., et al. Low Concentrations of Glutamate Cause a Decrease in Frequency and Coefficient of Variation of Miniature GABAA Synaptic Currents in Cultured Hippocampal Neurones // 44th Annual Meeting of Biophysical Society, New Orleans (USA) 2001. Belan P., Stepanyuk A., Boychuk Y., et al. Mechanisms underlying decay of prolonged GABAergic IPSC in hippocampal cultured neurons // American Society for Neuroscience 32d Annual Meeting, Orlando (USA), 2002. Belan P., Chvanov M., Stepanyuk A., et al. Sources of quantal variability in GABAergic synapses of hippocampal neurons // American Society for Neuroscience 33d Annual Meeting, New Orleans (USA), 2003. .Tsugorka T., Stepanyuk A., Drebot Y., Markova O., Cherkas V., Belan P. Relationship between neuronal morphology and inhibitory synaptic transmission // IBRO Advanced School of Neuroscience “Receptors, Channels, Messengers”, Yalta (Ukraine), 2004. Belan P., Stepanyuk A, Tsugorka T. Estimation of transmitter release rates and quantal sizes from current fluctuations // American Society for Neuroscience 34th Annual Meeting, San Diego (USA), 2004. Belan P., Markova O., Fitzgerald D. et al. Hippocalcin as a possible messenger in site specific short-term signal transduction in the hippocampus // American Society for Neuroscience 35th Annual Meeting, Washington (USA), 2005. T.Tsugorka, A.Stepanyuk, Y.Drebot, O.Markova, V.Cherkas, A.Dovgan, P.Belan. Dependence of delayed inhibitory synaptic currents on neuronal morphology and dendritic synaptic localization // IBRO CEERC Summer School: "Research strategies for the study of complex neural networks: From synaptic transmission to seeing the brain in action", Debrecen (Hungary), 2005. Анотації. Білан П.В. Механізми внутрішньоклітинної кальцієвої регуляції в екзокринних клітинах. Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, Київ, 2005. Дисертація присвячена дослідженню різноманітних клітинних механізмів, що приймають участь у скоординованій регуляції іонів кальцію у екзокринних клітинах. У роботі було досліджено зміни у концентрації Ca2+ поблизу ізольованих секреторних гранул та показано, що відомі вторінні посередники IP3 та cADPr викликають швидке вивільнення Ca2+ із гранул, чим можна пояснити явище викликаного агоністом підвищення цитозольної [Ca2+] в секреторному полюсі ацинарних клітин. Було також показано, що секреторний полюс є головним місцем вивільнення Ca2+ із ацинарних клітин внаслідок стимуляції агоністом; це має місце завдяки відносно високу щільність розташування кальцієвих насосів у апікальній мембрані ацинарних клітин. За допомогою новітніх методів досліджень, розроблених під час виконання роботи, було встановлено, що ізопротеренол спричиняв помітні зміни у вигляді спайків концентрації зовнішньоклітинного кальцію. Відсутність зростання [Ca2+]i та пульсоподібна природа змін у зовнішньоклітинної [Ca2+] вказують на те, що ці спайки з’являються, найвірогідніше, внаслідок вивільнення кальцію із секреторних гранул. Величина викликаного ізопротеренолом вивільнення кальцію була досить значною. Зроблено висновок про те, що у секреторних клітинах кальцій вивільняється у люмен шляхом екзоцитозу, і що екзоцитоз може бути основним механізмом вивільнення кальцію у позаклітинний простір із екзокринних та інших типів секреторних клітин. Ключові слова: екзокринні клітини, кальцієва сигналізація, секреторна гранула, екзоцитоз, IP3. Белан П.В. Механизмы внутриклеточной кальциевой регуляции в экзокринных клетках. Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. Институт физиологии им. А. А. Богомольца НАН Украины, Киев, 2004. Диссертация посвящена исследованию различных клеточных механизмов, принимающих участие в скоординированной регуляции концентрации ионов кальция в экзокринных клетках. Для достижения поставленной цели был разработан “метод капельки”, который является новым инновационным подходом, позволяющим количественно оценивать кинетику выведения ионов кальция из одиночных клеток млекопитающих. Так же была разработана новая методика для пространственной визуализации малых трансмембранных потоков ионов кальция в секреторных гранулах, отдельных клетках и малых клеточных агрегатах, в основе которой лежала идея использования флуоресцентного кальциевого индикатора, связанного с высокомолекулярными декстранами для замедления диффузии ионов кальция. Показано, что известные вторичные посредники IP3 и cADPr, вызывают заметное снижение концентрации свободного интрагранулярного Ca2+. Используя новый метод пространственной визуализации малых трансмембранных потоков ионов кальция, измерены изменения концентрации Ca2+ вблизи изолированных секреторных гранул и показано, что IP3 и cADPr вызывают быстрое высвобождение Ca2+ из гранул, чем можно объяснить явление вызванного агонистом повышения цитозольной [Ca2+] в секреторном полюсе ацинарных клеток. Используя новую методику, в которой высокая степень разрешения при визуализации мест высвобождения клеточного Ca2+ достигалась с помощью конфокальной микроскопии и Ca2+-чувствительного флуоресцентного красителя, связанного с тяжёлым декстраном, было продемонстрировано, что секреторный полюс является основным местом высвобождения Ca2+ из ацинарных клеток вследствие стимуляции агонистом. Показано, что во время стимулированного агонистом повышения кальция или при высвобождении кальция из связанного состояния внутри клетки, Ca2+ выводится из апикального секреторного полюса клетки. Это, скорее всего, происходит из-за относительно высокой плотности расположения кальциевых насосов в апикальной мембране ацинарных клеток. Интенсивность высвобождения Ca2+ из апикального секреторного полюса такова, что на протяжении стимуляции агонистом происходят значительные (до нескольких миллимолей на литр) изменения в концентрации свободного кальция в люмене ацинуса. С помощью новой методики для измерения концентрации внеклеточного кальция вблизи клеточной мембраны и методики капли было показано, что изопротеренол, ?-адренергический агонист и мощный секреторный агент, не вызывал изменений в концентрации свободного Ca2+ в цитозоле, но вызывал заметные изменения в виде спайков концентрации внеклеточного кальция. Отсутствие возрастания [Ca2+]i и пульсоподобная природа изменений внеклеточной [Ca2+] указывают на то, что эти спайки появляются, по видимому, вследствие высвобождения кальция из секреторных гранул. Холинергический агонист ацетилхолин вызывал значительное повышение [Ca2+]i и “гладкое” по форме повышение [Ca2+]o, которые были вызваны работой кальциевых насосов плазматических мембран, с наложением коротких спайков [Ca2+]o, вызванных экзоцитозом кальция во внеклеточную среду. Величина вызванного изопротенолом высвобождения кальция была довольно значительной. Вычисленная величина потерь кальция за первые 100 секунд при супрамаксимальной стимуляции соответствует уменьшению общей концентрации кальция в клетке до примерно 0.4 ммоль/л. Сделан вывод о том, что в ацинарных клетках слюнных желез кальций высвобождается в люмен путём экзоцитоза, и что именно экзоцитоз (а не кальциевые АТФазы плазматической мембраны) может быть основным механизмом высвобождения кальция в околоклеточное пространство из экзокринных и других типов секреторных клеток. Данное исследование опирается на разработанные авторами новые подходы для качественного и количественного описания работы кальций-регулирующих клеточных механизмов. Данные методики позволили значительно расширить наши знания о функционировании экзокринных клеток в норме и патологии. Разработанные авторами новые методы могут быть использованы для изучения различных молекулярных механизмов во многих типах клеток. Кроме того, данное исследование может помочь решить вопрос происхождении таких сложных заболеваний как острый и хронический панкреатиты, что позволяет говорить о возможности клинического использования результатов, полученных в данной работе. Ключевые слова: экзокринные клетки, кальциевая сигнализация, секреторная гранула, экзоцитоз, IP3. Belan P.V. Mechanisms of intracellular calcium regulation in exocrine cells. Manuscript. Dissertation for doctor of science degree by specialty 03.00.02 – biophysics. A.A.Bogomoletz Institute of Physiology, NAS of Ukraine, Kiev, 2004. This work is devoted to studies of different cellular mechanisms taking part in coordinated regulation of calcium ion concentration in exocrine cells. It has been shown that known second messengers, IP3 and cADPr, evoke a marked decrease in the free intragranular calcium concentration. Using a novel high resolution method developed in the work, we have also measured changes in the free calcium concentration ([Ca2+]) in the vicinity of an isolated zymogen granules and show that IP3 and cADPr cause rapid calcium release from the granule, explaining the agonist-evoked cytosolic [Ca2+] rise in the secretory pole. We have also found that Ca2+ is primarily extruded by calcium pumps from the secretory pole and propose that this process is useful for maintaining a high Ca2+ concentration in the acinar lumen, which is necessary for promotion of endocytosis. It has been shown that this spatial pattern of extrusion is most likely due to a relatively high density of calcium pumps in the secretory granule region, Isoproterenol (ISP), a ?-adrenergic agonist and powerful secretogogue, evoked no change in the cytosolic free calcium concentration but induced vigorous extracellular Ca2+ concentration spiking, most likely due to calcium release from secretory granules. The rate of ISP-induced calcium efflux was very substantial. We conclude that in salivary glands, calcium release via exocytosis is one of the main mechanisms extruding calcium from cells to the extracellular milieu. Key words: exocrine cells, calcium signaling, secretory vesicle, exocytose, IP3. PAGE 1 30 нМ

Похожие записи