Київський національний університет

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

ЧАЙКА ВІРА ОЛЕКСАНДРІВНА

УДК 577.175.73

Механізми трансдукції сигналу в парієтальних клітинах слизової оболонки
шлунка щурів при експериментальній виразці

03.00.04 — біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі біохімії НДІ фізіології імені академіка Петра
Богача біологічного факультету Київського національного університету
імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Остапченко Людмила Іванівна,

Київський національний університет

імені Тараса Шевченка,

завідувач кафедри біохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Цудзевич Борис Олександрович,

Київський національний університет імені

Тараса Шевченка,

старший науковий співробітник кафедри біохімії

доктор медичних наук, професор

Скляров Олександр Якович,

Львівський державний медичний університет

імені Данила Галицького,

завідувач кафедри біологічної хімії

Провідна установа: Національний медичний університет імені О.О.
Богомольця МОН України, м.Київ

Захист відбудеться “ 28 ” листопада 2005 року о 1000 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного
університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, пр-т Глушкова,
2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64, біологічний
факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного
університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул.
Володимирська, 58

Автореферат розісланий “25” жовтня 2005 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради Т.Р. Андрійчук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Однією з найбільш розповсюджених патологій органів
травлення залишається виразкова хвороба. Виразкова хвороба шлунка –
хронічне рецидивуюче захворювання, що розвивається у результаті розладу
нейрогуморальної, ендокринної регуляції, порушення взаємовідносин між
факторами захисту та агресії у слизовій оболонці шлунка. Оскільки одним
з основних факторів „агресії” є гіперсекреція хлоридної кислоти,
вивчення механізмів регуляції функціонування парієтальних клітин
слизової оболонки шлунка є пріоритетним напрямком досліджень не лише для
розуміння процесів виразкоутворення, а і для розробки нових засобів
лікування даної патології [Ивашкин, 2001; Schubert, 2004].

Відомо, що функціональна діяльність парієтальних клітин регулюється
багатьма нейроендокрінними сигналами, серед яких особливе місце займає
вплив блукаючого нерва і місцевого підслизового плетива; паракрінна
стимуляція за участю гастріну, що вивільняється з G-клітин,
соматостатину, який виділяється D-клітинами, та гістаміну, що
вивільняється з ентерохромофіноподібних (ECL) клітин. Гістамін бере
участь у активації секреторної активності парієтальних клітин через
залучення системи рецепторів, які широко представлені в травному тракті.
Особливий інтерес викликають Н2- і Н3-гістамінові рецептори, що
локалізовані на мембранах різних клітин СОШ [Coruzzi, 2001; Fukushima,
2003 ].

На сьогодні визначена роль антагоністів Н2-рецептора, які здійснюють
інгібуючий вплив на кислото-видільну функцію шлунка [Kobayashi, 2000].
Проте недостатньо вивченим залишається питання впливу активації цих
рецепторів на структурно-функціональний стан плазматичних мембран
парієтальних клітин і розкриття механізмів, що залучені до процесів
передачі сигналу через Н2-рецептор при виразкових станах.

Існуючі на сьогодні дані про участь Н3-рецептора у регуляції секреції
хлоридної кислоти є досить суперечливими [Barocelli, 2001; Coruzzi,
2001]. Зазначений рецептор локалізується як на нейронах центральної та
ентеральної нервових систем, так і на мембранах D-, G- і ECL-клітин.
Однак немає однозначної відповіді як на питання наявності Н3-рецепторів
на плазматичних мембранах парієтальних клітин, так і участі Н3-рецептора
у регуляції функціональної відповіді цих клітин. Тому дослідження впливу
активації Н3-рецептора на процеси шлункової секреції та вивчення
механізму передачі сигналу у парієтальних клітинах має значення для
розкриття теоретичних аспектів гастроентерології та може бути
використаним з практичною метою.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана згідно з планом науково-дослідних робіт відділу біохімії
НДІ фізіології імені академіка Петра Богача біологічного факультету
Київського національного університету імені Тараса Шевченка у рамках
теми “Дослідження ролі нехолінергічних факторів у регуляції стану
кишково-шлункового тракту” (№ держ. реєстрації 0101U002485), підрозділ
“Дослідження механізмів трансдукції сигналу в клітинах за умов розвитку
патологічного стану”.

Мета і завдання дослідження. Метою дослідження було визначення ролі Н2-
та Н3-гістамінових рецепторів парієтальних клітин у процесах передачі
сигналу за умов експериментальної виразки шлунка.

Для досягнення поставленої мети були поставлені такі задачі:

Оцінити вплив активації гістамінових рецепторів на стан системи ПОЛ у
парієтальних клітинах слизової оболонки шлунка щурів при
експериментальній стресовій моделі виразки.

Дослідити вплив агоністів та антагоністів Н2- та Н3-рецепторів на
активність мембраннозв’язаних ферментів: 5’-нуклеотидази,
Са2+,Mg2+-АТФази та Na+,K+-АТФази плазматичних мембран парієтальних
клітин при експериментальній виразці шлунка.

Оцінити фосфоліпідний склад плазматичних мембран парієтальних клітин
слизової оболонки шлунка щурів при експериментальній моделі виразки за
умов активації Н2- та Н3-гістамінового рецепторів.

Дослідити участь Н2- та Н3-рецепторів у регулюванні рівня циклічних
нуклеотидів (цАМФ та цГМФ) та внутрішньоклітинного вмісту іонів кальцію
в парієтальних клітинах слизової оболонки шлунка щурів при
експериментальній виразці шлунка.

Визначити активність Н+,K+-АТФази парієтальних клітин шлунка щурів при
експериментальній виразці шлунка та під дією лігандів, що впливають на
активність Н2- та Н3-рецепторів.

Об’єкт дослідження – гуморальні механізми регуляції шлункової секреції
щурів при експериментальній виразці шлунка.

Предмет дослідження – сигнальні шляхи від Н2- та Н3-гістамінових
рецепторів у парієтальних клітинах слизової оболонки шлунка щурів при
експериментальній виразці шлунка.

Методи дослідження – ультрацентрифугування (виділення клітинних
фракцій), біохімічні (визначення активності мембраннозв’язаних
ферментів), радіоізотопні (визначення вмісту циклічних нуклеотидів),
флуоресцентні (визначення вмісту кальцію та вмісту шиффових основ),
спектрофотометричні (визначення вмісту продуктів перекисного окиснення
ліпідів), хроматографічні методи (визначення вмісту фосфоліпідів
мембран) та методи математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено дослідження
основних ланок у механізмі передачі сигналу Н3-гістамінових рецепторів
слизової оболонки шлунка у парієтальних клітинах при експериментальній
виразці шлунка. Встановлено підвищення вмісту продуктів ПОЛ у
парієтальних клітинах після активації Н3-рецепторів за умов розвитку
виразкової патології. Показано вплив агоністів та антагоністів
Н3-рецептора на фосфоліпідний склад мембран та активність
мембраннозв’язаних ферментів парієтальних клітин слизової оболонки
шлунка за вищевказаних умов. Встановлено вплив активації Н2-рецептора на
фосфоліпідний склад мембран парієтальних клітин при експериментальній
виразці шлунка. Вперше встановлено участь системи циклічних нуклеотидів
та іонів Са2+ у формуванні відповіді парієтальних клітин на активацію
Н3-рецепторів, що стало підгрунттям для розуміння можливих механізмів
регуляторних впливів на процеси шлункової секреції, які порушуються за
умов розвитку виразкової хвороби. Виявлено, що при введенні агоністів
Н3-рецептора знижується активність Н+,K+-АТФ-ази плазматичних мембран
парієтальних клітин при експериментальній виразці шлунка.

Практичне значення одержаних результатів. Результати по вивченню шляхів
передачі сигналу Н2- та Н3-гістамінових рецепторів у парієтальних
клітинах слизової оболонки шлунка щурів при експериментальній виразці
розширюють сучасні уявлення щодо механізмів регуляції кислотовиділення.
Беручи до уваги, що гіперсекреція соляної кислоти є одним з основних
факторів виразкоутворення, дослідження механізмів регулювання
функціонування парієтальних клітин має важливе значення для розробки
нових фармакологічних підходів до лікування виразкової хвороби шлунка.
Виявлене зниження активності Н+,K+-АТФази плазматичних мембран
парієтальних клітин шлунка щурів при введенні агоніста Н3-рецептора є
важливим для пошуку нових препаратів із антивиразковими властивостями.
Отримані дані можуть бути впроваджені у навчальний процес при розробці
лекційного курсу з вивчення механізмів регулювання функціонування
травного тракту.

Особистий внесок здобувача. Пошук та аналіз літературних джерел,
проведення експерименту, обробка та теоретичне обґрунтування результатів
досліджень виконані дисертантом особисто. Планування та розробка
методичних підходів, узагальнення результатів досліджень здійснені
спільно з науковим керівником. Науковим керівником здійснювались
перевірка та редагування матеріалів, підготовлених до друку, а також
розділів дисертації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи були
представлені та обговорені на наукових семінарах кафедри біохімії та на
Міжнародній конференції “Клітинні і субклітинні механізми функціонування
травної системи” (Львів, 2004), І Міжнародній конференції студентів та
аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, 2005), 5-th PARNAS
conference Molecular mechanisms of cellular signaling (Kyiv, 2005).

Публікації. За результатами роботи опубліковано 3 статті в наукових
фахових журналах та 3 тези у матеріалах і тезах вітчизняних та
міжнародних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із
вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів
роботи та їх обговорення, заключення, висновків, списку літератури, що
включає 271 джерело. Дисертація викладена на 136 сторінках, містить 20
рисунків та 6 таблиць.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

В дослідах використовували білих щурів лінії Вістар обох статей масою
180-220 г. Щурів утримували на стандартному раціоні віварію.
Нейродистрофічні ураження шлунка викликалась за методикою [Гройсман,
Каревина,1979].

Для активування або інгібування Н2- і Н3-рецепторів використовували
специфічні агоністи і антагоністи. Оскільки відомо, що Н2-гістамінові
рецептори знаходяться на поверхні парієтальних клітин слизової оболонки
шлунка і тому безпосередньо впливають на внутрішньоклітинні процеси,
дослідження впливу лігандів Н2-рецептора на сигнальні шляхи у
парієтальних клітинах ми проводили in vitro. Гістамін і ранітидин
(агоніст і антагоніст Н2-рецептора, відповідно) вводили in vitro у
середовище, що містило 15-20 ·106 парієтальних клітин в дозах 100 мкM і
10 мкМ (у 100 мкл середовища) відповідно, і інкубували протягом 10
хв при температурі 370.

Оскільки показана відсутність Н3-гістамінового рецептора безпосередньо
на мембранах парієтальних клітин слизової оболонки шлунка щурів
[Barocelli, 2001; Coruzzi, 2001], вплив активації Н3-рецептора на
функції парієтальних клітин може опосередковуватись через регуляцію
виділення нейропептидів та гастроінтерстицінальних гормонів. Тому участь
Н3-рецепторів слизової оболонки шлунка в передачі сигналу у парієтальних
клітинах ми вивчали in vivo. R-альфа-метилгістамін і тіоперамід (агоніст
і антагоніст Н3-рецептора, відповідно) вводились внутрішньочеревно в
дозах 0,5 і 1,0 мг/кг відповідно на другий день формування
експериментальної виразки.

Парієтальні клітини виділяли та підраховували за модифікованою методикою
[Thompson, 1981]. Отримання фракцій мембран та цитозолю проводили за
рекомендаціями [Рыбальченко, 1988].

Вміст дієнових кон’югатів визначали спектрофотометричним, а шифових
основ – флюориметричним методами [Костюк, 1984]. Вміст МДА визначали за
реакцією з тіобарбітуровою кислотою [Гаврилов, 1987]. Усі показники
перераховано на 1 мг білка. Для вивчення кількісного і якісного складу
фосфоліпідів застосовували метод тонкошарової хроматографії на
пластинках „Silica gel 60” (Merk, Germany). Ідентифікацію індивідуальних
ФЛ проводили за допомогою відповідних стандартів і високоспецифічного
для ФЛ реактиву Васьковського-Кострецького [Kates, 1986]. Активність
мембранозв’язаних ферментів (5/-нуклеотидази, Ca2+,Mg2+-АТФ-ази,
Na+,К+-АТФ-ази та Н+,K+-ATФ-ази) визначали спектрофотометрично [Fiske,
1925; Древаль, 1990; Asano, 1996].

Вміст іонів кальцію визначали за методом [Tsukuda, 1987] з використанням
флуоресцентного зонду Індо-1 і виражали в нмоль ? 10-6 клітин. Вміст
циклічних нуклеотидів визначали згідно з методичними рекомендаціями
[Steiner, 1972]. У роботі використовували стандартні набори для
визначення вмісту цАМФ і цГМФ фірми “Amercham” (Великобританія), рівень
циклічних нуклеотидів виражали у пмоль?мг-1 білка. Експериментальні дані
оброблялись загальноприйнятими методами варіаційної статистики
[Кучеренко, 2001].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Оскільки структурною основою клітинних мембран є ліпідний бішар,
перекисне окиснення ліпідів, опосередковане вільними радикалами, є
однією з важливих причин деструкції мембрани клітин і подальшого їх
ушкодження. Відомо, що пероксидація ліпідів є залученою у патогенез
виразок різного походження [Ковальова, 2003; Tandon, 2004]. Тому першим
етапом наших досліджень було встановити участь Н2- та Н3-рецепторів у
регулюванні процесів ПОЛ.

У ході досліджень впливу активації Н2-рецептора на вміст продуктів ПОЛ
нами було встановлено підвищення вмісту МДА (спонтанного накопичення
МДА, Fe2+-аскорбат-залежного накопичення та HAДH+-залежного накопичення)
при преінкубації ізольованих парієтальних клітин з гістаміном.
Ранітидин, на відміну від гістаміну, викликав зниження вмісту
спонтанного та Fe2+-аскорбат-залежного накопичення МДА (табл. 1).
Отримані нами результати щодо впливу гістаміну на процеси ПОЛ
узгоджуються з даними літератури [Hung, 2000].

Таблиця1

Вплив агоніста і антагоніста Н2-рецептора на вміст продуктів ПОЛ в
парієтальних клітинах шлунка щурів за умов експериментальної виразки

Вміст МДА, нмоль/мг білка Спонтанне накопичення МДА,

нмоль/мг білка Fe2+-аскорбат- залежне накопичення МДА,

нмоль/мг білка HAДH+-залежне накопичення МДА,

нмоль/мг білка

к о н т р о л ь

33,29±1,66 51,20±2,56 165,80±8,29 445,30±22,27

г і с т а м і н

46,40±1,82* 59,00±2,95* 219,00±10,95* 494,30±24,72*

р а н і т и д и н

31,40±1,57 45,20±2,26* 145,60±7,18* 428,40±21,42

*р?0,05 в порівнянні з контролем

При дослідженні впливу активації Н3-рецептора нами було встановлено, що
введення R-альфа-метилгістаміна приводило до зростання вмісту МДА та
вмісту дієнових кон’югатів. За умов дії тіопераміду спостерігалось
зниження вмісту МДА (спонтанного та HAДH+-залежного накопичення МДА) та
вмісту дієнових кон’югатів (табл.2).

Таблиця 2

Вплив агоніста і антагоніста Н3-рецептора на вміст продуктів ПОЛ в
парієтальних клітинах шлунка щурів за умов експериментальної виразки

Вміст МДА, нмоль/мг білка Спонтанне накопичення

МДА, нмоль/мг білка Fe2+-аскорбат-залежне накопичення МДА, нмоль/мг
білка HAДH+-залежне накопичення МДА, нмоль/мг білка Дієнові кон’югати,
нмоль/мг білка

к о н т р о л ь

33,29±1,66 51,20±2,56 165,80±8,29 445,30±22,27 42,10±2,10

R–а л ь ф а — м е т и л г і с т а м і н

35,40±1,57 50,20±2,51 224,20±11,21* 530,80±26,54* 55,40±2,77*

Т і о п е р а м і д

32,80±1,14 43,90±2,20* 152,00±7,60 390,50±19,52* 35,40±1,67*

*р?0,05 по відношенню до контролю

Оскільки відомо, що продукти ПОЛ впливають на структурно-функціональний
стан мембран, було досліджено вплив активації Н2- та Н3-рецепторів на
ліпідний склад плазматичних мембран парієтальних клітин слизової
оболонки шлунка щурів при експериментальній виразці. У якості показника,
що характеризує стан ліпідного матриксу, нами було обрано дослідження
вмісту основних фосфоліпідів мембран – фосфатидилетаноламіну (ФЕА),
фосфатидилхоліну (ФХ) і фосфатидилінозитолу (ФІ), що складають 80 %
загального вмісту полярних ліпідів мембран клітин слизової оболонки
шлунка.

Було встановлено, що преінкубація парієтальних клітин з гістаміном
(агоністом Н2-рецептора) призвела до зростання вмісту усіх досліджуваних
фосфоліпідів у плазматичних мембранах парієтальних клітин слизової
оболонки шлунка при експериментальній стресовій виразці шлунка, у той
час як преінкубація парієтальних клітин з ранітидином (антагоністом
Н2-рецептора) призвела до зростання вмісту ФХ та зниження вмісту ФІ
(рис. 1 А).

Введення R-альфа-метилгістаміна, специфічного агоніста Н3-рецептора,
привело до зростання вмісту фосфатидилетаноламіну, фосфатидилхоліну та
зниження вмісту фосфотидилінозитолу у плазматичних мембранах
парієтальних клітин слизової оболонки шлунка при експериментальній
стресовій виразці шлунка. Після введення тіопераміда, що є специфічним
антагоністом Н3-рецептора, спостерігалось зростання вмісту
фосфатидилінозитолу та незначне зростання вмісту фосфатидилхоліну, тоді
як вміст ФЕА був у межах контрольних значень (рис. 1 Б).

Зростання вмісту основних структурних фосфоліпідів при введенні
R-альфа-метилгістаміна чи преінкубації з гістаміном можна пояснити
підвищенням вмісту продуктів ПОЛ при дії як гістаміна, так і
R-альфа-метилгістаміна, внаслідок компенсаторного підвищення швидкості
оновлення мембран активними формами кисню [Кулинский, 1999].

Відомо, що як продукти ПОЛ, так і фосфоліпідний склад впливають на
структуру і функції плазматичних мембран, що приводить до порушення
функціонування мембраннозв’язаних ферментів [Sprong, 2001; Крутецкая,
2003]. Тому вивчення їх активності є актуальним для оцінки
структурно-функціонального стану мембран, оскільки це пов’язано з
функціонуванням рецепторів, які на них локалізовані.

В результаті проведених досліджень нами було встановлено, що активація
Н2-рецептора гістаміном приводить до підвищення активності
мембраннозв’язаних ферментів (5′-нуклеотидази, Na+,K+-АТФази,
Са2+,Mg2+-АТФази). Преінкубація парієтальних клітин слизової шлунка з
антагоністом Н2-рецептора ранітидином приводила до зростання активності
Na+,K+-АТФази, зниження активності Са2+,Mg2+-АТФази (рис. 2).

1/4 3/4 D j ° e ?

A

EHuy

???e 0

`

?

?

4 P

4 P

4 P

•uoeuoeuoeuoeuoeuoeuoeioeioeuoeuoeeoeaeoeaeoeaeoeuoeuoeuoesseOeoeuoeuoee
oeeoeeoeaeoeuoesseOeoeuoeuoeeoeeoeeoeaeoeaeoeaeoeaeoeaeoeaeoeaeoeu

4 P

4 P

Zя тіопераміда спостерігалось зростання активності зазначених
мембраннозв’язаних ферментів (рис. 3).

Виявлені нами різнонаправлені зміни активності мембраннозв’язаних
ферментів після активації Н2- (зростання) та Н3-рецептора (зниження)
можна пояснити, з одного боку, зміною ліпідного оточення досліджуваних
білків, а з іншого — накопиченням активних радикалів, що пов’язано із
інтенсифікацією процесів ПОЛ. Визначені нами зміни активності
Са2+,Mg2+-АТФази вказують на можливе залучення до механізмів проходження
сигналів обох гістамінових рецепторів такого важливого вторинного
посередника як кальцій.

Результати експериментальної роботи показали різноспрямованість змін
вмісту кальцію у відповідь на дію агоністів Н2- і Н3-рецепторів за умов
досліджуваної патології. Було встановлено, що преінкубація ізольованих
парієтальних клітин з гістаміном викликала зростання вмісту [Са]і2+, у
той час як ранітидин викликав незначне зниження вмісту [Са]і2+ у
порівнянні з контролем (рис. 4).

Дослідження впливу активації Н3-рецептора на вміст внутрішньоклітинного
кальцію у парієтальних клітинах слизової оболонки шлунка показало, що
введення R-альфа-метилгістаміна приводило до зниження вмісту [Са]і2+. За
умов дії тіопераміду встановлено незначне зростання вмісту
досліджуваного катіона.

Різна відповідь парієтальних клітин на активацію Н2- і Н3-рецепторів по
відношенню до вмісту кальцію може бути пояснена з позицій різної
локалізації цих рецепторів у клітинах травного тракту. Встановлений нами
вплив Н3-рецептора на вміст внутрішньоклітинного кальцію потенційно може
бути зумовлений багатьма механізмами, головним чином тим, що активація
цього рецептора приводить до інгібування вивільнення гістаміну і
ацетилхоліну. На підставі попередньо отриманих нами результатів можна
припустити існування залежності між зміною вмісту [Са]і2+ і зміною
активності Ca2+,Mg2+-АТФази у парієтальних клітинах за дії різноманітних
регуляторів функціонування Н3- та Н2-гістамінових рецепторів. Згідно з
літературними даними відносно шляхів надходження кальцію у парієтальну
клітину [Athmann, 2000; Ashby, 2002; Caroppo, 2004], зростання
активності зазначеного іонного транспортеру, найімовірніше, відбувається
у результаті виходу кальцію з апікальної частини плазматичної мембрани.

Відомо, що окрім кальцію важливими внутрішньоклітинними посередниками,
залученими до передачі сигналу за участю гістамінових рецепторів у
парієтальних клітинах, є циклічні нуклеотиди. Активація Н2-рецептора
гістаміном приводить до зростання вмісту цАМФ і цГМФ у цитоплазмі
парієтальних клітин. Преінкубація парієтальних клітин слизової оболонки
шлунка з антагоністом Н2-рецептора ранітидином приводила до зменшення
вмісту цАМФ та зростання вмісту цГМФ (рис. 5).

Введення R-альфа-метилгістаміна приводило до незначного підвищення
вмісту цАМФ та зниження вмісту цГМФ. Після введення тіопераміда
спостерігалось підвищення вмісту внутрішньоклітинного кальцію та цГМФ і
зниження вмісту цАМФ (рис. 5).

Отримані нами дані свідчать про те, що за умов уражень слизової оболонки
шлунка Н2-рецептори залучені у регулювання вмісту обох циклічних
нуклеотидів. Показаний нами вплив гістаміну на вміст цАМФ узгоджується з
літературними даними, що активація Н2-рецептора приводить до
стимулювання аденілатциклази через G-білок — залежний механізм. Зміни
вмісту цГМФ при активуванні Н2-рецептора можуть бути пов’язаними із
змінами активності гуанілатциклази внаслідок як впливу продуктів ПОЛ,
так і активування фосфоінозитидної системи [Shayo, 2001; Крутецкая,
2003].

Згідно з нашими даними, спостерігається відповідність між змінами вмісту
фосфатидилінозитолу та [Са]і2+ і рівнем цГМФ після активації Н2- та
Н3-рецепторів. Внаслідок дії антагоніста Н3-рецептора активується
фосфоінозитольний каскад, а дія агоніста приводить до протилежного
ефекту. Зростання вмісту цАМФ при введенні R-альфа-метилгістаміна поряд
із зменшенням його після введення тіопераміду може свідчити про участь
аденілатциклазної системи парієтальних клітин у реалізації ефектів,
пов’язаних з функціонуванням Н3-рецептора.

Оскільки основною функцією парієтальних клітин у відповідь на численні
позаклітинні стимули є секреція хлоридної кислоти у просвіт шлунка, що і
є одним з вирішальних факторів виразкоутворення, метою наших подальших
досліджень було встановити вплив агоністів та антагоністів Н2- та
Н3-гістамінових рецепторів на активність Н+,К+-АТФази.

Нами було встановлено, що Н2- та Н3-рецептори по-різному залучені у
регулювання активності H+,K+-ATФази. У той час як активування
Н2-рецептора приводить до зростання активності H+,K+-ATФази, активування
Н3-рецептора, навпаки, інгібує зазначений фермент (рис.7 ).

Відомо, що розвиток виразкового захворювання приводить до зростання
рівня шлункової кислотності, а, отже, і активності H+,K+-ATФази [Akibal,
1999]. Сьогодні вважається, що, на відміну від багатьох інших ферментів,
активність H+,K+-ATФази регулюється опосередковано, через контроль
синтезу її субодиниць і подальшого вбудовування ферменту у мембрану. У
експериментах на щурах було показано, що гени, які відповідають за
синтез субодиниць H+,K+-ATФази, включають цАМФ- і кальцій-залежні
елементи [Hersey, 1995], тому зростання внутрішньоклітинного вмісту
зазначених месенжерів здатне приводити до підвищення активності ферменту
внаслідок збільшення синтезу його субодиниць із їх подальшим
вбудовуванням у плазматичну мембрану. З іншого боку, оскільки
H+,K+-ATФаза є мембранним ферментом, її активність може також залежати
від структурно-функціонального стану мембран [Swarts, 1998]. Активація
Н2-рецептора, можливо, приводить до зростання активності H+,K+-ATФази як
через зростання синтезу мРНК ?-субодиниці H+,K+-ATФази, так і через
регулювання вбудовування тубуловезикул у секреторні канальці.

Існуючі на сьогодні літературні дані про вплив активації Н3-рецепторів
на регуляцію кислотної секреції досить суперечливі. Переважна кількість
літературних джерел вказує на інгібуючий ефект активованого
Н3-гістамінового рецептора [Barocelli, 2001; Yokotani, 2000; Ballabeni,
2002]. З іншого боку, у дослідженнях Coruzzi показано відсутність
інгібіторних ефектів агоністів H3-рецептора при різноманітних моделях
кислотної секреції [Coruzzi, 1992]. Vuyyuru (1997) у експериментах на
ізольованому шлунку мишей показав, що R-альфа-метилгістамін cтимулює
кислотну секрецію. Нами було встановлено, що введення агоніста
Н3-рецептора R-альфа-метилгістаміна приводило до зростання вмісту
продуктів ПОЛ, а також зниження вмісту внутрішньоклітинного кальцію.
Тому, можливо, зниження активності зазначеного ферменту внаслідок
активації Н3-рецептора відбувається внаслідок зниження синтезу мРНК його
субодиниць, а також порушення їх вбудовування і функціонування внаслідок
змін структурно-функціонального стану мембрани.

Отже, агоніст Н3 рецептора R-альфа-метилгістамін, як і антагоністи
Н2-рецептора, знижує рівень кислотної секреції у шлунку щурів з
експериментальною стресовою виразкою, що дозволяє припустити можливість
його терапевтичного застосування при лікуванні зазначеного захворювання.
Дія агоністів і антагоністів Н3-рецептора слизової оболонки шлунка щурів
проявляється опосередковано, через регуляцію виділення інших гормонів
травного тракту — в основному, соматостатину з D- клітин та гістаміну з
ECL-клітин.

ВИСНОВКИ

Гістамінові Н2- та Н3-рецептори є залученими у регулювання
функціонування парієтальних клітин слизової оболонки шлунка щурів при
експериментальній виразці шлунка. Активація Н2-рецептора безпосередньо,
а Н3-рецептора опосередковано впливає на стан плазматичних мембран,
активність мембранозв’язаних ферментів та секреторну функцію
парієтальних клітин за умов розвитку виразки шлунка.

Гістамінові Н2- та Н3-рецептори беруть участь у регулюванні процесів
вільнорадикального окислення. Активування як Н2- так і Н3-гістамінових
рецепторів приводить до зростання вмісту продуктів пероксидного
окислення ліпідів у парієтальних клітинах слизової оболонки шлунка щурів
за умов експериментальної стресової виразки шлунка.

Агоністи та антагоністи Н2- та Н3-рецепторів впливають на стан ліпідної
та білкової складових мембран парієтальних клітин слизової оболонки
шлунка: активування Н2-рецептора приводить до збільшення вмісту основних
фосфоліпідів плазматичних мембран (ФЕА, ФХ та ФІ) та підвищення
активності мембранозв’язаних ферментів (Na+,K+-АТФази, Са2+,Mg2+-АТФази
і 5′-нуклеотидази), тоді як активування Н3-рецептора приводить до
зниження вмісту фосфотидилінозитолу, зростання вмісту структурних
фосфоліпідів (ФХ та ФЕА) та зниження активності мембранозв’язаних
ферментів плазматичних мембран парієтальних клітинах слизової оболонки
шлунка щурів за умов експериментальної стресової виразки шлунка.

Показано залучення вторинних посередників — кальцію та циклічних
нуклеотидів, до процесів передачі сигналів гістаміновими Н2- та
Н3-рецепторами. Активування Н2-рецептора приводить до зростання вмісту
[Са]і2+, цАМФ і цГМФ у цитоплазмі парієтальних клітин, у той час як
активування Н3-рецептора – до зменшення вмісту [Са]і2+, незначного
підвищення вмісту цАМФ та зниження вмісту цГМФ у цитоплазмі парієтальних
клітинах слизової оболонки шлунка щурів за умов експериментальної
стресової виразки шлунка.

За умов розвитку експериментальної виразки шлунка преінкубація
парієтальних клітин слизової оболонки шлунка з агоністом Н2-рецептора
приводила до зростання активності Н+,K+-АТФази їх плазматичних мембран.
Активування Н3-рецепторів спричиняло зниження активності Н+,K+-АТФази
плазматичних мембран парієтальних клітин слизової оболонки шлунка при
експериментальній виразці шлунка.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Хілько Т.Д.. Проценко Т.Л., Якубцова І.В., Чайка В.О. Вплив меланіну та
ульцерогенних речовин на фосфоліпідний склад слизової оболонки шлунка у
щурів // Вісник Київського національного університету імені Тараса
Шевченка. Серія Біологія. – 2003. – № 41. – С. 120-122. (Особистий
внесок здобувача – опрацювання літератури за темою досліджень,
визначення вмісту фосфоліпідів).

Проценко Т.Л., Якубцова І.В., Чайка В.О., Стасенко А.А. Вивчення
захисних факторів слизової оболонки шлунка при експериментальному
ульцерогенезі в щурів // Вісник Київського національного університету
імені Тараса Шевченка. Серія Біологія. – 2004. – № 42-43. – С. 19-20.
(Особистий внесок здобувача – опрацювання літератури за темою
досліджень, визначення вмісту глікопротеїнів, математична обробка
результатів).

Чайка В.О., Гавриш Л.І., Хілько Т.Д., Остапченко Л.І. Участь циклічних
нуклеотидів і фосфоліпідів у передачі сигналу Н3 гістамінового рецептора
у парієтальних клітинах слизової оболонки шлунку щурів за умов
експериментальної виразки // Укр. біохім. журн. – 2005р. – т.77, №2. –
С.118-122. (Особистий внесок здобувача – опрацювання літературних джерел
з висвітленого питання, визначення вмісту циклічних нуклеотидів,
підготування матеріалів до друку).

Чайка В. О., Гавриш Л.І. Дослідження активності мембранозв’язаних
ферментів парієтальних клітин при дії агоністів і антагоністів Н2
рецепторів за умов експериментальної виразки шлунку // Матеріали
Міжнародної конференції “Клітинні і субклітинні механізми функціонування
травної системи” (7-9 жовтня 2004 р.).- Львів, 2004.-С.76.

Чайка В.О., Гавриш Л.І., Строцька С.А. Вплив активації Н3 гістамінових
рецепторів на вміст циклічних нуклеотидів у парієтальних клітинах
слизової оболонки шлунку щурів при експериментальній моделі виразки //
Тези доповідей І Міжнародної конференції студентів та аспірантів “Молодь
і поступ біології” (11-14 квітня 2005 р.). – Львів, 2005. – С. 12-13.

Chayka V.O., Gavrish L.I. The investigation of signal transudation
mechanisms from histamine H3 receptors stomach mucous parietal cells
under the experimental stress ulcer formation // Український біохімічний
журнал –2005. – т. 77, № 2. 5-th PARNAS conference Molecular mechanisms
of cellular signaling (April 26-29, 2005). –Kyiv, 2005.- С. 50.

АНОТАЦІЯ

Чайка В. О. Механізми трансдукції сигналу в парієтальних клітинах
слизової оболонки шлунку щурів при експериментальній виразці.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.04 – біохімія. — Київський національний університет
імені Тараса Шевченка, Київ, 2005.

Досліджено шляхи проходження сигналу від гістамінових Н2-рецепторів
парієтальних клітин та Н3-рецепторів слизової оболонки шлунка у
парієтальних клітинах слизової оболонки шлунка щурів при
експериментальній виразці шлунка. Встановлено зростання вмісту продуктів
ПОЛ при активації обох досліджуваних рецепторів. Виявлено, що
преінкубація парієтальних клітин з агоністом Н2- рецептора гістаміном
приводила до зростання вмісту ФЕА, ФХ, ФІ та зростання активності
5′-нуклеотидази, Na+,K+-АТФази та Са2+,Mg2+-АТФази у плазматичних
мембранах парієтальних клітин слизової оболонки шлунка при
експериментальній стресовій виразці шлунка. Введення агоніста
Н3-рецептора R-альфа-метилгістаміна приводило до зростання вмісту ФЕА і
ФХ, зниження вмісту ФІ та зниження активності зазначених ферментів.

Встановлено, що активація Н2-рецептора приводила до зростання вмісту
[Са]і2+, цАМФ та цГМФ, тоді як активація Н3-рецептора – до зниження
вмісту [Са]і2+ і цГМФ та зростання вмісту цАМФ. Виявлено, що активація
Н3-рецепторів, на відміну від Н2-рецептора, приводить до зниження
активності Н+,K+-АТФази у плазматичних мембранах.

Ключові слова: гістамінові Н2-рецептори, гістамінові Н3-рецептори,
парієтальні клітини, виразка шлунка.

АННОТАЦИЯ

Чайка В.О. Механизмы трансдукции сигнала в париетальных клетках
слизистой оболочки желудка крыс при экспериментальной язве. — Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.04 – биохимия. – Киевский национальный университет
имени Тараса Шевченко, Киев, 2005.

Исследованы пути прохождения сигнала от гистаминовых Н2-рецепторов
париетальных клеток и Н3-рецепторов слизистой оболочки желудка в
париетальных клетках слизистой оболочки желудка крыс при
экспериментальной язве желудка. Установлено, что активация как Н2-, так
и Н3-рецепторов приводила к повышению содержания МДА. Ранитидин и
тиоперамид, специфические антагонисты Н2- и Н3-рецептора,
соответственно, вызывали снижение содержания МДА. Также при действии
агониста Н3-рецептора R-?-метилгистамина наблюдалось увеличение
содержания диеновых конъюгатов. При определении влияния активации Н2- и
Н3-рецепторов на структурно-функциональное состояние плазматических
мембран париетальных клеток нами было установлено, что преинкубация
исследуемых клеток с гистамином приводила к росту содержания
фосфатидилэтаноламина (ФЕА), фосфатидилхолина (ФХ), фосфатидилинозитола
(ФИ) и росту активности 5′-нуклеотидазы, Na+,K+-АТФазы и
Са2+,Mg2+-АТФазы в плазматических мембранах париетальных клеток
слизистой оболочки желудка при экспериментальной стрессовой язве
желудка. При действии ранитидина наблюдалось повышение содержания ФЕА,
снижение содержания ФИ, тогда как содержание ФХ существенно не менялось;
отмечалось снижение активности 5′-нуклеотидазы, Na+,K+-АТФазы и
Са2+,Mg2+-АТФазы. Введение R-?-метилгистамина приводило к повышению
содержания ФЕА и ФХ, снижению ФИ и активности указаных ферментов в
плазматических мембранах париетальных клеток. После введения тиоперамида
наблюдалось повышение содержания ФИ, ФХ и активности отмеченных
ферментов по сравнению с контрольной группой животных.

При исследовании влияния лигандов Н2- и Н3-гистаминовых рецепторов на
содержание вторичных мессенжеров при указанной патологии было
установлено, что активация Н2-рецептора вызывала повышение содержания
[Са]і2+, цАМФ и цГМФ, тогда как активация Н3-рецептора — снижение
содержания [Са]і2+ и цГМФ и увеличение содержания цАМФ. При влиянии
агонистов и антагонистов Н2- и Н3-гистаминовых рецепторов на активность
Н+,К+-АТФазы нами было установлено, что активация Н2-рецепторов приводит
к повышению активности Н+,K+-АТФазы в плазматических мембранах. Введение
R-?-метилгистамина приводило к резкому снижению активности Н+,K+-АТФазы.

Следовательно, вследствие активации Н2-гистаминового рецептора
париетальных клеток слизистой оболочки желудка крыс при
экспериментальной язве активируются как аденилатциклазный, так и
фосфоинозитидный каскад исследуемых клеток. В итоге происходит рост
активности H+,K+-ATФазы, приводящее к увеличению уровня кислотной
секреции, что содействует последующему развитию язвенного заболевания.
Антагонисты Н2-рецептора, ингибируя активность H+,K+-ATФазы, снижают
уровень желудочной кислотности и предотвращают развитие язвенного
заболевания. Таким образом, нами было продемонстрированы возможные пути
трансдукции сигнала париетальных Н2-рецепторов и Н3-рецепторов слизистой
оболочки желудка в париетальных клетках слизистой оболочки желудка крыс
при экспериментальной стрессовой язве.

Ключевые слова: гистаминовые Н2-рецепторы, гистаминовые Н3-рецепторы,
париетальные клетки, язва желудка.

ANNOTATION

Chayka V.O. Signal transduction mechanism in the rat gastric mucosal
parietal cells under the experimental stress ulcer formation.–
Manuscript.

Dissertation for the PhD degree in speciality 03.00.04 – biochemistry. –
National Taras Shevchenko University of Kyiv, Kyiv, 2005.

It was studied signal transduction pathway from histamine Н2-receptors
of parietal cells and stomach mucosal Н3-receptors in rat gastric
mucosal parietal cells under experimental stomach ulcer formation. It
fixed rising the lipid peroxidatoin products contents at an activation
of both researched receptors. Preincubation researched cells with
histamine Н2-receptor agonist histamine results to increase of
phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, phosphatidylinositol
content and membranes enzymes activities. Intraperitoneal injection of
histamine H3-receptor agonist (R)-alpha-methylhistamine results to
increase the phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine level and
decreases the phoshatidylinocitole level and enzymes activities in
plasma membrane of rat gastric parietal cells.

Install, increasing intracellular calcium, cGMP and cAMP contents under
H2-receptor activation, whereas H3-receptor activation led to downstroke
of intracellular calcium and cGMP contents and to rising of the cAMP
content. Н3-receptor activation, as against Н2-receptor, results
decrease of activity Н+,K+-АТPase in plasma membranes above-stated
cells.

Key words: histamine H3-receptor, histamine H2-receptor, parietal
cells, stomach ulcer.

PAGE \* Arabic 1

Похожие записи