МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ ПІСЛЯДИПЛОМНОЇ

ОСВІТИ ім. П.Л.ШУПИКА

ІГРУНОВА КСЕНІЯ МИКОЛАЇВНА

УДК: 616.127-0058.001.6:616-097+615+009+557.8+616.155.1

Механізми розвитку пошкоджень серця при багаторазовому стресі та їх
корекція

14.03.04 – патологічна фізіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Центральній науково-дослідній лабораторії Національної
медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика Міністерства
охорони здоров’я України

Наукові консультанти:

член-кореспондент АМН України, доктор медичних наук, професор Губський
Ю.І.,

завідувач кафедри органічної, біологічної та фармацевтичної хімії
Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця МОЗ України.

доктор медичних наук, професор Зозуля І.С.,

завідувач кафедри медицини невідкладних станів, проректор з наукової
роботи, Національної медичної академії післядипломної освіти ім.
П.Л.Шупика МОЗ України.

Офіційні опоненти:

Гуляр С.О., доктор медичних наук, професор, провідний науковий
співробітник відділу експериментальної кардіології Інституту фізіології
ім. О.О.Богомольця НАН України;

Міхньов В.А., член-кореспондент АМН України, доктор медичних наук,
професор кафедри патологічної фізіології Національного медичного
університету ім. О.О.Богомольця, головний вчений секретар АМН України.

Великий М.М., професор, доктор біологічних наук, провідний науковий
співробітник відділу коферментів Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна

НАН України.

Провідна установа:

Національний науковий центр «Інститут кардіології ім. М.Д. Стражеска АМН
України

Захист дисертації відбудеться “ 27 ” березня 2007 року о 14 год.

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті
фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України (01024, м. Київ, вул.
Богомольця, 4)

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології

ім. О.О.Богомольця НАН України (01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4)

Автореферат розіслано “ 26 ” лютого 2007 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

АВТОРЕФЕРАТ

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Не зважаючи на значні досягнення в кардіології,
серцево-судинні захворювання залишаються ведучими серед загальної
кількості захворювань і серед основних причин летальності населення.
Рішення цієї багатофакторної проблеми потребує розробки нових концепцій
та підходів. Все частіше сучасні дослідження приводять до висновку про
важливість врахування вихідного метаболічного стану, енергообміну
міокарда без врахування яких значно знижується ефективність сучасних
лікувальних засобів та технологій (Литвицкий П.Ф., 2002; Мойбенко А.А. и
соавт., 2003).

Oсновним етіопатогенетичним фактором росту захворюваності і смертності
населення розвинутих країн від серцево-судинних захворювань є постійно
діючий стрес. Переважають у формуванні несприятливої статистики випадки
помірного але систематично діючого стресу на протязі життя, які
характерні для людини сучасної цивілізації. Емоційні реакції при стресі
супроводжуються змінами активності вегетативної та нейроендокринної
систем, які в першу чергу впливають на діяльність серцево-судинної
системи (Судаков К.В., 2003).

Активація гіпоталамо-гіпофізарно-наднирникової системи (ГГНС) та
ренін-ангіотензін-альдостеронової системи (РААС), що призводить до
гіперпродукції вільнорадикальних продуктів при стресі знайшла своє
відображення в нейро-ендокринній теорії розвитку серцевої патології:
гіпертонічної хвороби (ГХ) та ішемічної хвороби серця (ІХС). Але в
останні роки з’являється все більше фактів, які неможливо пояснити
тільки підвищеною активністю нейрогормонів. Блокада адренорецепторів та
активності РААС не дає 100% клінічного ефекту, не є фізіологічною, так
як порушує не тільки негативний, а і адаптаційний ефект гормонів (Визир
А.Д. и соавт., 2000). Новітні досягнення патофізіології як
фундаментальної медичної науки дозволяють прийти до висновку, що при
всьому розмаїтті етіологічних факторів, розвиток патології міокарда, в
остаточному підсумку визначається виснаженням захисних можливостей
єдиної генералізованої регуляторної інтегративної системи організму, що
включає в себе нервову, нейрогуморальну й імунну системи (Абрамов В.В.,
1999; Земсков А.М. и соавт., 2003; Цейликман О.Б. и соавт., 2004). Одним
з важливих досягнень медицини є визнання ролі імунної системи не лише як
фактора в розвитку інфекційної, запальної та аутоімунної патології
серцево-судинної системи, але і як регуляторної системи підтримання
своїми медіаторами – цитокінами гомеостазу разом з нейроендокринними
медіаторами (Крыжановский Г.Н., 1997; Korneva E., 1998). Дія ж
стресорного чинника на імунну систему через активацію цитокінів
традиційно розглядається з погляду порушення саме імунітету, а не
гомеостазу. А розвиток патологічних процесів при стресі пов’язують
переважно з нейроендокринною активністю. За сучасними уявленнями
поєднання нейрогормональної активації та імунної запальної реакції
лежить в основі розвитку атеросклерозу та серцевої недостатності (СН),
інфаркту міокарда (ІМ), ініціації некрозу та апоптозу клітин
серцево-судинної системи (Wood D., Backer G., 1998; Шляхто Е.В., 2002).

Класична діагностика ІМ та виявлення групи ризику базується на виявленні
зон та маркерів некрозу. Але за сучасними уявленнями розвиток патології
предує некротичним змінам. У випадках, коли некротичні вогнища ще не
сформовані, а порушення функції вже є, ці методи не можуть бути
інформативними. Крім того, вважається, що не стільки вогнища некрозу
можуть бути причиною скоротливої дисфункції серця, як процес
ремоделювання, формування якого зумовлюють зони гіпокінезії та апоптоз
клітин міокарда (Симоненко В.Б. и соавт., 2000; Фролов В.А. и соавт.,
2004).

За сучасними уявленнями апоптоз клітин серцево-судинної системи є одним
з основних фундаментальних механізмів розвитку патологічних процесів при
помірній, але тривалій дії патогенних чинників, або супутнім некрозу при
ІМ. Тому, прогноз перебігу до і післяінфарктного періоду захворювання
напряму залежить від формування гіпоксичного типу метаболізму,
інтенсивності апоптозу кардіоміоцитів та зниження функціонального
резерву міокарда. Розробка нових концептуальних підходів, доступних
методів діагностики та виявлення груп ризику, в основу яких покладено
визначення апоптозу клітин серцево-судинної системи та його чинників
дозволить не тільки виявити ранні етапи розвитку патології, у тому числі
ІМ, а і попередити її виникнення, так як перші стадії апоптозу на
відміну від некрозу є зворотніми і піддаються корекції. Цитокіни мають
специфічні рецептори та сигнальні шляхи апоптозу, безпосередній вплив на
апоптозні гени-регулятори, розташовані в мітохондріях, де зосереджені
основні ферменти енергообміну, ініціюють апоптоз кардіоміоцитів.
Визнано, що падіння мембранного потенціалу мітохондрій та дефіцит АТФ
викликають запуск апоптозу (Skulachov V.P., 1994; Лук’янова Л.Д., 2004).
Відомо, що саме клітинний енергодефіцит провокує компенсаторну активацію
нейроендокринних та імунних медіаторів, що з часом і призводить до
формування патологічних станів (Watchinger B. еt al., 1995; Литвицкий
П.Ф., 2002). Клінічний прояв захворювань, у тому числі і критичних
станів є результатом довгострокового накопичення побічних ефектів
попередніх процесів адаптації на різних системних рівнях. Апоптоз лежить
в основі ранніх етапів розвитку або загострення патологічних процесів,
які до часу клінічно та лабораторно не виявляються. При тому, всі ці
процеси носять індивідуальний характер у кожного хворого, мають сезонні
та інші біоритмічні коливання. Це передбачає необхідність оперувати не
тільки абсолютними значеннями різних показників, які прив’язані до
сталої абстрактної середньостатистичної норми, а орієнтуватися на
відносні, індивідуалізовані значення, такі як функціональний резерв,
метаболічний стан. Поглиблене знання розвитку механізмів пошкодження
міокарда дозволить не тільки виділити адекватні критерії діагностики
серцево-судинних захворювань, а і завчасно попередити їх подальше
прогресування, підібрати адекватні засоби корекції. Пошкодження
мітохондрій, порушення енергообміну, ініціація апоптозу та зниження
внаслідок цього функціонального резерву клітин є єдиним патобіохімічним
механізмом у розвитку патології міокарда, зниження його скоротливості.

Між тим, не встановлено зв’язку між психо-емоційним стресом та
активацією продукції цитокінів, як складових загальної
нейроендокринноімунної регуляторної системи, станом мембран і
енергообміну мітохондрій, ініціацією апоптозу та функціональним резервом
в клітинах серцево-судинної системи. Не вивчено ефективність впливу на
функціональний резерв та апоптоз клітин корекції стану та енергообміну
мітохондрій.

Виходячи із зазначеного, актуальним є комплексний підхід — дослідження
механізмів впливу стресу на метаболічний стан та життєздатність клітин
імунної системи, ролі цитокінів в пошкодженні енергообміну мітохондрій,
ініціації апоптозу кардіоміоцитів, визначення мембранопротекторної та
антиапоптозної ефективності корекції порушеного при стресі енергообміну
клітин міокарда.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами

Дисертаційна робота є самостійною науково-дослідною роботою, яка
виконана згідно з планом наукових досліджень НМАПО ім. П.Л.Шупика МОЗ
України, є фрагментом комплексних науково-дослідницьких робіт “Розробка
патогенетичнозумовлених методів діагностики, профілактики, лікування
гострої серцево-судинної недостатності” (державний реєстраційний №
0197И01И694) та “Раптова смерть. Вивчення нейроімунних механізмів
розвитку гострої серцево-судинної та цереброваскулярної патології.
Розробка комплексних діагностичних тест-систем для виявлення груп
ризику, засобів профілактики та лікування” (державний реєстраційний №
0199И000213).

Мета і завдання дослідження. Вивчення механізмів, які лежать в основі
розвитку пошкоджуючої дії стресу на енергообмін та морфо-функціональний
стан міокарда в експерименті та клініці, створення теоретичної бази для
розробки нових діагностичних підходів та засобів корекції при
серцево-судинній патології.

Для досягнення цієї мети були поставлені завдання.

1. Вивчити вплив стресу на стан специфічної (імунної) та неспецифічної
резистентності, продукцію прозапальних цитокінів, ініціацію спонтанного
та індукованого апоптозу мононуклеарних клітин крові в експерименті.

2. Дослідити енергообмін мітохондрій, апоптоз кардіоміоцитів,
морфологічний стан міокарда при експериментальному стресі.

3. Розробити на підставі одержаних експериментальних даних концептуальну
модель пошкодження міокарда при стресі. Обґрунтувати роль цитокінів у
зміні стану мітохондріальних мембран, розвитку енергодефіциту та
ініціації апоптозу як ключового механізму пошкодження міокарда при дії
стресу.

4. Вивчити ефективність використання антиоксиданта — мембранопротектора
та імуномодулятора за умов експериментального імобілізаційного стресу:
дослідити в експерименті дію редокс-системи поліфеноли-аскорбінова
кислота та імуномодулятора тімаліна на корекцію енергообміну,
морфологічного стану, ініціацію апоптозу кардіоміоцитів (КМЦ) при
моделюванні стресу.

5. Розробити комплекс діагностичних методик для вивчення
функціонального стану клітин крові за визначенням спонтанного та
індукованого апоптозу, індукторів апоптозу.

6. Провести апробацію запропонованих методик в кардіологічній клініці.

Наукова новизна отриманих результатів.

У результаті проведених досліджень вперше експериментально встановлено,
що через 14 днів імобілізаційного стресу мононуклеари дослідних тварин
починають виробляти прозапальні цитокіни: у відповідь на кардіальний
антиген – інтерлейкін-1, у відповідь на ендотоксин (ЛПС) – фактор
некрозу пухлин при незначній активації оксидантних процесів в крові.

Вперше визначено, що в нормі оптимальне співвідношення функціональної
активності – спонтанного апоптозу мононуклеарів (МНК)до функціонального
резерву – індукованого апоптозу мононуклеарів дорівнює фундаментальному
значенню золотого перетину. Відхилення від цього значення в сторону
збільшення означає незабезпеченість роботи клітини її функціональним
резервом і подальше виснаження. Відхилення в сторону зменшення свідчать
про порушення стимуляції функціональної активності і перевагу
синтетичних процесів — анаболізму над катаболізмом.

Показано, що імобілізаційний стрес призводить до активації апоптозу
мононуклеарних клітин крові через 14 днів і пригнічення через 28 днів,
відповідно до рівня фактору некрозу пухлин (ФНП).

Вперше встановлено, що імобілізаційний стрес призводить до прозапальних
змін мікроциркуляторного русла та сполучної тканини міокарда, набряку,
порушення інтактності мембран, зниження активності ферментів окисного
фосфорилювання мітохондрій кардіоміоцитів (КМЦ), компенсаторної
активації гліколізу, зниження вмісту АТФ та ініціації апоптозу клітин
міокарда. Застосовано в експерименті редокс-систему поліфеноли –
аскорбінова кислота для нормалізації показників імунної та неспецифічної
резистентності, покращення енергообміну міокарда та зниження рівня
апоптозу у міокарді.

Вперше клінічно показано збільшення рівнів прозапальних цитокінів та
експресії проапоптозного гену bax у крові хворих на ішемічну хворобу
серця (ІХС) та гіпертонічну хворобу (ГХ), у яких спостерігали зниження
загальної фракції викиду (ЗФВ) за рахунок виникнення зон гіпокінезії,
підвищення чутливості до дефіциту кисню – зниження скоротливості
міокарда на фоні гіпоксичного типу метаболізму.

Вперше застосовано новий комплекс діагностичних методик, які грунтуються
на за визначенні інтенсивності спонтанного та індукованого апоптозу
клітин крові, рівня їх індукторів. Було проведено визначення
функціональної активності і функціонального резерву в культурі
мононуклеарів крові пацієнтів за індукцією їх апоптозу та знайдено
характерні особливості цього процесу в залежності від форми хвороби.
Вперше знайдено зворотний зв’язок між апоптозом МНК та гіпертрофією
міокарда.

Вперше сформульована концепція розвитку стресогенної патології міокарда
за участю імунних механізмів. Мобілізаційні реакції при дії тривалого
невираженого стресу супроводжуються активацією клітин адаптаційної
імунної системи та продукції ними прозапальних медіаторів, що згодом
зменшує їх енергетичне забезпечення та рівень функціонального резерву.
Вже на етапі адаптації до дії стресорного чинника за рахунок
прозапальних цитокінів відбуваються зміни на мікроморфологічному рівні,
які при подальшому розвитку призводять до формування гіпоксичного типу
метаболізму, зниження інтактності та активності ферментів енергообміну
мембран мітохондрій. Компенсаторно активується енергозабезпечення через
гліколіз, виникає потреба структурної підтримки функції, активації
геному, що провокує зниження кількості функціонуючих кардіоміоцитів
шляхом апоптозу клітин з дефектними мітохондріями. За рахунок
перерозподілу внутрішньо-серцевих об’ємів здійснюється гемодинамічна
компенсація і зберігається загальна фракція викиду, тому перебіг цих
змін є безсимптомним. Вперше зроблено припущення, що зниження
функціонального резерву міокарда через дифузне зменшення кількості КМЦ
шляхом апоптозу може привести до виникнення критичних станів без
попередньої клінічної маніфестації.

Теоретичне та практичне значення отриманих результатів

Робота відноситься до фундаментальних досліджень, оскільки на основі
вивчення рівнів цитокінів та апоптозу в патогенезі пошкоджуючої дії
стресу на стан клітин серця, розроблено нові концептуальні підходи до
діагностики та корекції патології клітин серцево-судинної системи.
Результати дисертаційної роботи мають значення для патологічної
фізіології, медичної біохімії, імунології, кардіології, неврології,
онкології; поглиблюють і розширюють існуючі уявлення про механізми
ушкодження енергообміну та ініціацію апоптозу, дають змогу запропонувати
препарат поліфенолів з аскорбіновою кислотою з метою корекції
енергообміну в мітохондріях міокарда та протекції апоптозу КМЦ. Завдяки
комплексному клініко-експериментальному дослідженню були виявлені
аналогічні зміни у розвитку апоптозу кардіоміоцитів та мононуклеарів
крові, що дозволило запропонувати новий комплекс діагностичних методик
для виявлення осіб групи ризику з загостреннями перебігу захворювання,
концептуально відмінний від традиційних лабораторних методів
діагностики, спрямованих на визначення маркерів некрозу міокарда.

Особистий внесок здобувача

Автором даної роботи зроблено основний внесок у всі розділи роботи,
включаючи постановку завдань, розробку нових методів діагностики
патології серцево-судинної системи за визначенням спонтанного,
індукованого апоптозу мононуклеарних клітин та їх чинників; проведено
всі експерименти, сплановано та організовано проведення клінічних
досліджень Проведено аналіз отриманих результатів, написання статей,
патентів, тез доповідей.

Апробація результатів дослідження

Основні положення дисертаційного дослідження доповідались та
обговорювалися на міжнародній конференції „Нейроиммунология
(Санкт-Петербург, 2000)”; Установчому з’їзді Українського товариства
клітинної біології (Львів, 2004); Українському біохімічному з’їзді
(Київ, 2000); науково-практичній конференції, присвяченій 80-річчю КМАПО
ім. П. Л. Шупика (Київ, 1998); першій науково-практичній конференції
„Сучасні проблеми невідкладних станів” (Київ, 2000); на засіданні
товариства патофізіологів України (Київ, 2004); IV Національному
Конгресі патофізіологів України (Чернівці, 2004); науково-практичній
конференції „Медикаментозна та немедикаментозна профілактика та відновне
лікування в клінічній практиці” (Київ, 2001); конференції, присвяченій
160 річчю кафедри фізіології КНУ ім. Тараса Шевченко (Київ, 2003);
науково-практичній конференції з міжнародною участю „Генетика
мультифакторіальної патології” (Київ, 2004); міжнародній науковій
конференції “Еколого-фізіологічні проблеми адаптації” (Партеніт, 2003,
2006); Всеукраїнський науково-практичній конференції “Втілення досягнень
теоретичної медицини в практику охорони здоров’я” (Київ, 2004);
розшириних засіданнях ЦНДЛ та кафедр КМАПО ім. Шупика (Київ, 2003,
2005); сектору вісцеральних систем Інституту фізіології ім. О.О.
Богомольця НАН України (Київ, 2006), засіданні Комітету Верховної Ради
України з питань охорони здоров’я (Київ, 2006).

Публікації

За темою дисертації опубліковано 46 наукових робіт, в тому числі 20
статей у фахових наукових виданнях, 26 тез в матеріалах з’їздів та
конференцій, 3 статті написані автором одноосібно. Отримано 7
деклараційних патентів України на винахід, з них 2 одноосібно.
Надруковано 1 методрекомендації.

Обсяг і структура дисертації

Дисертація викладена українською мовою на 330 сторінках машино-писного
тексту і складається із вступу, огляду літератури, розділу присвяченого
опису об’єктів та методів дослідження, 8 розділів, в яких викладено
результати власних досліджень, розділу присвяченого аналізу і
узагальненню отриманих результатів, переліку використаних літературних
джерел, що включає 308 найменувань, з них 201 українською та російською
мовами, 107 іншими мовами та додатків.

Робота ілюстрована 74 таблицями, 69 малюнком та 2 схемами.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Об’єкт дослідження 157 білих щурів та 40 кролів породи
Шиншила, підданих дії імобілізаційного стресу; кров 45 хворих на ІХС, 94
хворих на ГХ, 37-и донорів.

Предмет дослідження. Механізми резистентності, цитокіновий
статус; апоптоз в клітинах крові дослідних тварин та в крові хворих на
ІХС і ГХ; енергообмін, стан мітохондрій та апоптоз кардіоміоцитів у
дослідних тварин; морфо-функціональний стан міокарда хворих на ІХС та
ГХ.

Методи дослідження. біохімічні, біофізичні, гематологічні,
цитологічні, імунологічні, радіологічні, генетичні, клінічні,
варіаційно-статистичні.

Матеріали та методи дослідження.

Експериментальні дослідження.

Для відтворення найбільш значущих етіопатогенетичних факторів розвитку
серцево-судинної патології — повсякденного невираженого стресу та
гіпокінезії, було обрано модель імобілізаційного стресу за Ф.З.Меєрсоном
(1984), яка признана класичною моделлю емоційного стресу і на якій можна
прослідкувати розвиток морфологічних змін, зокрема апоптозу. 14-денна
модель погодинного стресу характеризується перехідним зниженням
скоротливості міокарда, ригідністю серцевого м’яза, схильністю до
виникнення аритмій, підвищеною адренергічною активністю. Для дослідження
подовженої дії стресу основні показники імунного статусу, енергообміну
міокарда, морфологічні зміни внутрішніх органів, ефективність корекції
енергообміну та апоптозу кардіоміоцитів вивчали через 28 днів
погодинного імобілізаційного стресу.

Для корекції стресорних ушкоджень клітинного енергообміну
використовували редокс-систему поліфеноли-аскорбінова кислота (препарат
корекції — ПК) (5мг/кг) і для порівняння — імунокоректор препарат тімусу
– тімалін (стандартне дозування). Критерії та стадії стресу визначали за
Сель’є: абсолютні та відносні маси, клітинність селезінки та тимусу,
стан слизової оболонки шлунку з метою виявлення виразок та ерозій,
лейкограму крові, морфологію наднирників.

Вивчали вплив стресу на фактори імунної системи та неспецифічної
резистентності. Проводили: вивчення імунної відповіді на еритроцити
барана (ЕБ) за титрами гемолізінів та аглютинінів, розеткоутворюючих
клітин – В-РУК та І-РУК методом C. Bianco et al. (1970), факторів
клітинного і гуморального імунітету за визначенням сенсибілізованих
Т-лімфоцитів та титрів антитіл до серцевого антигену (Е. Кэбот, М.
Мейер, 1968), загальних циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) (V. Haskova
et. al., 1977), неспецифічної резистентності: активності природних
клітин кілерів (ПКК) (О.Ф. Мельников, Т.А. Заяц, 1999), фагоцитів (А.А.
Славинский, 1989), модуляторів апоптозу – активності оксидантної та
антиоксидантної систем за хемілюмінесценцією (ХЛ) плазми крові (М.Е.
Кучеренко, А.Н. Васильєв, 1985) вміст прозапальних цитокінів: LIF/LAF
інтерлейкіну 1 (ІЛ-1) (Д.К. Новиков, В.И. Новикова, 1979) інтерферону
IFN (ІФН), фактору некрозу пухлин TNF (ФНП) (Н.Я. Спивак и др., 1994).
Вивчали енергообмін клітин крові– активність лактатдегідрогенази (ЛДГ),
сукцинатдегідрогенази (СДГ), К-Na-АТФ-ази, в лімфоцитах та нейтрофілах
гістохімічним методом (V. Wachtain, E. Vasel, 1957).

Вивчення апоптозу мононуклеарів. Визначали функціональну активність та
функціональний резерв мононуклеарних клітин крові (МНК), як клітин,
чутливих до змін гомеостазу, дії нейроендокринних та імунних медіаторів.
Доведено, що характер фізіологічної відповіді клітин та систем
відображає їх потенційні – резервні можливості. Нами була розроблена
методика вивчення функціонального стану– життєздатності МНК за
визначенням в культурі їх спонтанного та індукованого з дексаметазоном
(ДМТ) in vitro апоптозу методом флуоресцентної мікроскопії з
ДНК-барвником Hoechst 33342 (Патенти України № 65147 А (2004 р.), №
65985 А (2004 р.), № 66076 А (2004 р.). Вивчали функціональний стан,
адренореактивність мембран: еритроцитів — за осморезистентністю,
тромбоцитів — за агрегацією і активністю аденілатциклази та
фосфодіестерази гістохімічним за Г. Гайер (1974) та
електрономікроскопічним методами.

Вивчення енергообміну міокарда. Проводили спектрофотометричне
дослідження показників енергообміну міокарда: K-Na-АТФ-ази (О.М.
Романова, 1966), ферментів мітохондрій: сукцинатдегідрогенази СДГ (J.
Nordman et al., 1951) цитохромоксидази ЦХО (W. Kerpolla, E. Pitkanen,
1960) АТФ+-синтетази (П.А. Калиман, 1974), пірідінових нуклеотидів (H.U.
Bergmeyer, 1963) за умов імобілізаційного стресу, введення адреналіну і
обзидану; вивчення стану мітохондріальних мембран міокарда, в яких
вбудовані ферменти енергообміну за їх активним набряком (B.K. Tam, P.B.
McCay, 1970). Хроматографічним методом вивчали вміст аденозинтрифосфату,
аденозиндифосфату, аденозинмонофосфату (АТФ, АДФ, АМФ) (В.Г.
Воскобойников, 1966).

Морфологічні дослідження. Морфологічну оцінку стану внутрішніх
органів проводили за результатами світлової та електронної мікроскопії,
гістохімії. Вивчали апоптоз кардіоміоцитів мікроскопічним та
електроно-мікроскопічним методом.

Клінічні дослідження.

Одним з найбільш серйозних ускладнень ішемічної хвороби серця (ІХС) є
розвиток порушень ритму і провідності, який збільшує розлад коронарного
кровообігу і серцеву недостатність, найчастіше стає ведучим, іноді
єдиним проявом захворювання, визначає його прогноз. Групу обстеження
склали 45 хворих, що лікувалися у відділенні аритмій серця НДІ
кардіології ім. М.Д.Стражеска АМНУ. Морфологічним субстратом для
виникнення порушення ритму в 40 хворих був ІХС, у 5-х – міокардитичний
кардіосклероз. Обстежено 94 хворих з гіпертонічною хворобою (ГХ), які
знаходились на лікуванні в відділі гіпертонічної хвороби інституту
кардіології. Відомо, що гіпертензія є найчастішим наслідком стресу (К.В.
Судаков, 2003). Контрольну групу склали 37 практично здорових осіб,
аналогічних за віком і статтю.

Клініко-інструментальні дослідження. У всіх обстежених за допомогою ЕКГ
вивчали аритмогенез, методом ехокардіографії встановлювали рівень
гіпертрофії міокарда. Радіонуклідна вентрикулографія (РНВГ) за методикою
D. Maddox et. al., (1978) проводилась усім хворим до початку
медикаментозного лікування в стаціонарі. Комплекс параметрів РНВГ
включав наступні показники скоротливості та гемодинаміки міокарда:
загальна фракція вигнання правого і лівого шлуночків серця, фракції
вигнання трьох зон шлуночків (переднє-перегородкова, верхівкова,
задньобокова), серцеві об’єми (КСО, КДО, УО), характеристики вигнання
(СНШСВ, ШВм, Т- ШВм, Vcf ) і наповнення (ШНм, Т-ШНм).

Вивчення стану адренореактиності. Вміст цАМФ і цГМФ у крові
досліджуваних хворих визначався радіоімунологічним методом реактивами
фірми Immunotech (Чехія). Агрегацію та активність аденілатциклази (АЦ)
тромбоцитів досліджували люмінісцентномікроскопічним,
електронномікроскопічним та цитохімічним методами.

Дослідження імунного статусу. Вивчали формулу крові, субпопуляції
лімфоцитів з моноклональними міченими антитілами до CD, імуноглобуліни,
ЦІК, фагоцитоз, активність природних клітин кілерів (ПКК).

Дослідження фізіологічних модуляторів апоптозу. Визначали рівень
перекисних сполук за хемілюмінесценцією плазми крові та рівень
прозапальних цитокінів: ФНП, ІФН. Методом ПЛР в клітинах крові вивчали
експресію проапоптозного гену bax сімейства bcl-2 – генів регуляторів
апоптозу (Sigma).

Вивчення апоптозу МНК. Досліджували інформативність розробленої нами
методики визначення функціонального резерву та метаболічного стану МНК
крові хворих за вивченням їх спонтанного та індукованого дексаметазоном
in vitro апоптозу, співпоставляли з імунним статусом, станом
скоротливості та гіпертрофії міокарда (патенти України № 63745 А (2004),
№ 63744 А (2004).

Статистичну обробку одержаних результатів проводили з використанням
непараметричних критеріїв U Вілкоксона-Манна-Уїтні а також
параметричного критерію t Стьюдента.

Результати дослідження та їх обговорення.

Вплив імобілізаційного стресу на резистентність організму.

Критерії стресу. У тварин, що зазнали впливу 14- денного
імобілізаційного стресу виявлена тенденція до зниження відносних та
абсолютних показників маси та клітинності лімфоїдних органів. Під дією
стресу колір слизової оболонки шлунка змінювався з рожевого до
червоного, складки ставали чіткими, з набряком, що притаманно запальній
реакції, з подовженням терміну дії стресу виявляли поодинокі зони ерозії
та язви на слизовій оболонці. В тканині наднирників за стресорної дії
виявляли витончення коркового шару з деліпоїдизацією клітин, в тканині
селезінки — ознаки гіпоплазії білої пульпи і повнокрів’я синусоїдів.
Подовження строків стресування поглиблювало вираженність змін
показників, що вивчалися. За визначеннями лейкоцитарної формули
спостерігали еозинопенію, лімфопенію та нейтрофільний лейкоцитоз, що
свідчить про стрес-реакцію у дослідних тварин.

Зміни показників формули залежали від їх вихідного стану і мали
біоритмічну залежність. Ці зміни ставали чіткішими за умови підсилення
стресорного впливу за рахунок або додаткової імунізації еритроцитами
барана (ЕБ), або подовження терміну стресування.

Імунний статус. При даних моделях стресу не виявлялося достовірного
підвищення титрів антитіл та сенсибілізованих Т-лімфоцитів до алогенної
серцевої тканини. Імунна відповідь на ЕБ стресованих щурів була зниженою
за титрами гемолізінів та гемаглютинінів, кількістю В-РУК і І-РУК.
Підвищувався вміст загальних ЦІК: у щурів на 58% і на 30% у крові
кролів.

Енергетичний обмін у клітинах крові – лімфоцитах та нейтрофілах при
стресуванні змінювався. Активністі ЛДГ у лімфоцитах і нейтрофілах крові
підвищувалася майже вдвічі. Підвищення активності ЛДГ при стресі може
бути пов’язаним з переходом від аеробного до анаеробного окислення –
гліколізу і може відображати зниження енергозабезпечення клітин. Вивчали
активність К-Nа-АТФ-ази цитоплазматичної мембрани лімфоцитів та
нейтрофілів. Відомо, що цей фермент бере участь у формуванні
трансмембранного потенціалу клітинної мембрани, його активність залежить
від рівня АТФ та стану фосфоліпідного шару цитоплазматичної мембран і
тому зразу змінюється при різних метаболічних та структурних зрушеннях.
Активність ферменту в лімфоцитах стресованих тварин була зниженою у
порівнянні з контрольними значеннями на 35,7%, а в нейтрофілах –
підвищеною на 30%.

Рис. 1 Активність ЛДГ та СДГ в лімфоцитах щурів, які зазнали 14-денного
імобілізаційного стресу (у. о.), n= 20

Разом з даними про активність ферментів енергоутворення (ЛДГ та СДГ)
можна констатувати, що дана модель стресу стимулює енергообмін в
клітинах неспецифічного захисту та пригнічує його в лімфоцитах.

Механізми неспецифічної резистентності. Стрес, в даній моделі,
збільшував природну цитотоксичну активність ПКК, яка підвищувалася при
подовженні термінів стресування: у щурів через 14 днів на 7%
(неімунізовані), на 32% (імунізовані), у кролів через 14 днів на 31%,
через 28 днів – на 100%. При вивченні показників фагоцитозу було
знайдено невиражені зміни з тенденцією до активації через 14 днів
стресування та пригнічення через 28 днів стресу. Було відмічено
залежність змін показників фагоцитозу від вихідного рівня.

З метою визначення стадії стресу окрім гематологічних, можуть
використовуватись показники стану системи перекисного окислення ліпідів
(ПОЛ). Так первинний спалах ПОЛ можна розглядати як прояв стадії
тривоги, реактивне підвищення антиокислювального потенціалу живої
системи з пригніченням інтенсивності спонтанного ПОЛ варто розцінювати
як стадію резистентності, а вичерпання антиокислювальних ресурсів з
виникненням вторинного спалаху ПОЛ – як стадію виснаження (В.А..
Барабой, Д.А. Сутковой, 1997). Стресування імунізованих щурів не веде до
суттєвих зрушень процесів ПОЛ відносно контролю. Однак, сама по собі
імунізація призводить до зростання середніх значень (св. за 5 хв у
контрольних тварин, тобто до підсилення інтенсивності у них процесів ПОЛ
та збільшення антиперекисного потенціалу крові порівняно з
неімунізованими тваринами. Імобілізаційний стрес у імунізованих щурів
недостовірно зменшує інтенсивність ПОЛ при одночасному зниженні
антиперекисного потенціалу плазми крові. А такі зрушення є характерними
для стресу у стадії тривоги у фазі протишоку. Дослідження протягом трьох
років процесів ПОЛ у плазмі крові неімунізованих щурів, що зазнавали
імобілізаційного стресу показали, що стресування достовірно не змінює у
них інтенсивності ПОЛ відносно контролю. Про це свідчать середні
значення у них (св. за 5 хв. У кролів двотижневий імобілізаційний стрес
майже не впливає на показники ПОЛ у плазмі крові. Разом із цим,
подовження стресування до одного місяця веде до достовірного зростання
інтенсивності ПОЛ та недостовірного збільшення антиперекисного
потенціалу крові.

Рис. 2 Перекисна хемілюминесценція плазми крові кролів, що зазнали
імобілізаційного стресу протягом 14 та 28 днів у весняно-літній період
(травень 2000р.) Рис. 3 Перекисна хемілюминесценція плазми крові кролів,
що зазнали імобілізаційного стресу протягом 14 днів у весняно-літній
період (травень 2000 р.)

1 — (св. за 5 хв, мВ, 2 – I max/I min

Таким чином, інтенсивність ПОЛ є вираженою не через 14, а через 28 днів
стресу.

Вивчення системи цитокінів при імобілізаційному стресі. Відомо, що
прозапальні цитокіни, такі як інтерлейкін (IL-1) та фактор некрозу
пухлин (ФНП), відіграють важливу роль у патогенезі серцево-судинних
захворювань, в реалізації процесів гіперкоагуляції крові, порушенні
регулювання судинного тонусу, розвитку гострих коронарних синдромів і
ХСН (J. Oppenheim et. al., 1993; Е.Л. Насонов и др., 1999). Аналіз
результатів дослідження продукції IL-1 або лімфоцит-активуючого фактора
(ЛАФ) показав, що 14-ти денний імобілізаційний стрес призводив до
активації прозапальної цитокінової відповіді на кардіальний антиген,
спричинював зростання на 50% серед дослідних тварин таких, мононуклеари
яких стають чутливими до кардіального антигену і продукують ЛАФ замість
ЛІФ. Таким чином, стрес у щурів та кролів призводив до зміни продукції
цитокінів на кардіальний антиген, сприяючи підсиленій продукції ЛАФ
(ІЛ-1).

Табл. 1 Продукція цитокінів (ЛІФ/ЛАФ) клітиніми крові щурів, що зазнали
вплив експериментального стресу

Показник 1-а група

Інтактні 2-а група

Стрес

% співвідношення ЛІФ/ЛАФ у дослідних тварин 50/50 22/78

Також спостерігається тенденція визначати ФНП- ? як первинний аферентний
імпульс, що генерується організмом у відповідь на численні пошкоджуючі
фактори зовнішнього середовища. Встановлена провідна роль ФНП в індукції
апоптозу – запрограмованої загибелі клітин при серцево-судинній
патології.

Рис. 4 Динаміка змін концентрації фактору некроза пухлин при
багаторазовому стресі (пкг/мл).

Після щоденного імобілізаційного стресу впродовж 14 днів виявлено
достовірне підвищення (P<0,5 та P<0,05) в 2,08-3,91 рази вмісту ФНП індукованого, та в 1,42-2,86 разів ФНП спонтанного, збільшення кількості ФНП в плазмі кролів в 1,42-3,91 рази. Чутливість клітин крові до індуктора ФНП – ліпополісахариду підвищувалась майже в 4 рази. А після продовження стресу іще впродовж 14 діб – клітини ставали практично не чутливими до дії ЛПС in vitro. Таким чином, імобілізаційний стрес призводив до підвищення рівня ФНП в крові дослідних тварин максимально через два тижні стресування через підвищення чутливості імуноцитів до дії ендотоксину. Через місяць дії стресу чутливість імунокомпетентних клітин до ЛПС падала і рівень ФНП в крові знижувався, що свідчить про виснаження мононуклеарів при тривалому стресі. Таким чином, можна стверджувати, що у тварин різних видів імобілізаційний стрес, відтворений за обраною нами схемою, переважно не спричинював появи гуморальної та клітинної відповіді на серцевий антиген, однак підвищував чутливість до нього мононуклеарів і продукцію ними прозапальних цитокінів. Також спостерігалася помірна активація системи неспецифічної резистентності. Вплив імобілізаційного стресу на стан мембран клітин крові. Моделювання стресу призводило до тенденції зниження осморезистентності еритроцитів та істотних змін показників морфофункціонального стану кров'яних платівок експериментальних тварин. Кількість неактивованих тромбоцитів знижувалася до 52,2%, зростало число зворотньо- та незворотньоактивованих, відповідно на 33,3 і 8,6 %, дегранульованих на 5,9 %, зворотньо- та незворотньоагрегованих кров'яних платівок на 13 та 8%. Ці зрушення свідчать про гіперреактивність кров'яних платівок в умовах експерименту. Перебудова глікокаліксу та плазмолеми тромбоцитів обумовлює зміну активності локалізованих в них ферментних систем, що знайшло своє підтвердження у вкрай низькій активності АЦ в плазматичній мембрані. Таким чином, дія імобілізаційного стресу за даною моделлю призводила до хронічного подразнення тромбоцитів та підвищення їх агрегаційної здатності, що може бути зумовленим зниженням активності аденілатциклази тромбоцитів внаслідок тривалого стресу і свідчити про порушення адренергічної регуляції. Вивчення функціонального стану клітин крові за індукцією їх апоптозу. Вивчення і розшифровка механізмів апоптозу є одним з найбільш актуальних напрямків сучасної медичної науки. Вивчення механізмів розвитку даного процесу дозволить певним чином впливати на його окремі етапи з метою їхньої регуляції і корекції. Вплив ендо-, та екзогенних факторів при стресі може прискорювати або затримувати апоптоз, регулюючи, таким чином, чисельність клітин серцево-судинної системи (G.Takemura et al., 1998; В.Б. Симоненко и др., 2000). Це обгрунтовує вивчення апоптичних індексів при хронічному стресі, серцево-судинних та інших захворюваннях. Нами проводились дослідження впливу імобілізаційного стресу на апоптоз мононуклеарних клітин крові (МНК) щурів та кролів. Глюкокортикоїдна модель індукції апоптоза через активацію НАДФ-Н-оксидази та факторів транскрипції є класичною (A.M. Katz et. al., 1985). В експериментальних умовах найбільш часто використовується дексаметазонова (ДМТ) модель індукції апоптозу тимоцитів, яка дозволяє виявити функціональний стан клітини по значенням спонтанного та індукованого апоптозу. Для визначення функціонального або метаболічного стану МНК як параметра гомеостазу нами була розроблена оригінальна методика визначення рівнів спонтанного та індукованого апоптозу, а також їх співвідношення. Виходячи з одержаних даних, ми можемо зробити висновок, що співвідношення спонтанного апоптозу, який відображає функціональну активність мононуклеарів, до індукованого, який відображає функціональний резерв, в нормі дорівнює значенню золотого перетину. Це значить, що оптимальне співвідношення функції і резерва становить 0,6. ДМТ на фоні 14-денного стресу зменшував кількість живих клітин за рахунок некрозу на 28,7% порівняно з контролем і на 300% збільшував рівень апоптозу. Це непрямо може свідчити про потенціювання дії ДМТ та невиражені зміни вмісту глюкокортикоїдів in vivo при 14-денному стресі. При цьому індекс індукції апоптозу, який у контролі дорівнював значенню золотого перетину, при стресі зменшувався з 0,607±0,06 до 0,497±0,06, що свідчить про активацію МНК у щурів при даній моделі стресу. Рис. 5. АІ у щурів після 14-денного стресу (в % відношенні до контролю) Рис. 6. Процеси апоптозу у кролів після 14- та 28 днів стресу (в % відношенню до контролю) В культурі МНК кролів 2-тижневий стрес викликав зростання АІ на 37,8% і зменшення кількості живих клітин за рахунок некрозу на 5%, і менше ніж у щурів впливав на відповідь МНК на індукцію апоптозу дексаметазоном – 173,7% порівняно з вихідними показниками, що свідчить про видову специфіку апоптозного процесу. Апоптозний індекс в культурі МНК тварин, що зазнали дії 4-тижневого стресу, становив 51,3%, рівень живих клітин – 87,6% від вихідних показників відповідно, кількість живих клітин при дії ДМТ на фоні стресу становила 77,8%, апоптозний індекс становив 56,4%, тобто дексаметазон практично не викликав індукції апоптозу. Таким чином, через 4 тижні стресу дія ДМТ in vitro не була вираженою, що опосередковано вказує на підвищення рівня глюкокортикоїдів in vivo та зниження чутливості до них МНК. Рівень метаболічного стану або життєздатності, який виявлявся в культурі МНК як співвідношення спонтанного до індукованого апоптозу можемо спостерігати в наступній таблиці. Табл. 2 Рівень метаболічного стану у культурі МНК (співвідношення спонтанного та індукованого апоптозу) у кролів Контроль Стрес 2 тижні Стрес 4 тижні Індекс індукції апоптозу 0,614±0,06 0,739±0,07 0,909±0,07 Таким чином, двотижневий стрес призводив в середньому до підвищення рівня апоптозу в МНК крові дослідних тварин, що співпадало з підвищенням у них в цей період стресу рівня ФНП. Через місяць стресування рівень апоптозу МНК і продукція ФНП мононуклеарами у крові знижувалися, що дає можливість пов’язати активність апоптозного процесу з продукцією прозапального цитокіну – ФНП. Адаптаційна модель стресу характеризувалася активацією неспецифічної резистентності організму переважно за рахунок підвищення рівня прозапальних цитокінів – ІЛ-1 та ФНП, ініціацією апоптозу імунокомпетентних клітин - МНК, що супроводжувалося зміною їх метаболічного стану та функціонального резерву. Вивчення енергообміну міокарда при імобілізаційному стресі. Відомо, що цитокіни безпосередньо впливають на функцію міокарда, рецепторний, трансдукторний та генетичний апарат кардіоміоцитів (КМЦ) (R. Bucala, 1996; В.Н. Федорич, А.В. Федорич, 2001). З іншого боку всі ці процеси є енергозалежними. Основними продуцентами енергії в КМЦ є мітохондрії (МХ). Тому вплив цитокінів на стан мітохондріальних мембран та ферментів, які в них вбудовані є тією патогенетичною ланкою розвитку стресорної патології, яка ще не вивчена і представляє науковий інтерес. Імобілізаційний стрес через 14 днів призводив до зниження активності ферментів мітохондріальної внутрішньої мембрани: – СДГ на 43%, ЦХО на 24,7%, а також АТФ-синтетази на 41,9%. Знижувався і рівень аденілових нуклеотидів, у тому числі АТФ на 11,4%. Через 28 днів стресування рівень АТФ в міокарді знижувався на 38,1%. При вивченні впливу на ці ферменти (-блокатора та адреноміметика було знайдено, що як обзидан так і адреналін призводили до зниження функціональної активності ферментів внутрішньої мембрани мітохондрій, як наведено на діаграмі. Рис. 7 Вміст аденілових нуклеотидів у міокарді щурів після 14-денного імобілізаційного стресу, після введення адреналіну та обзідану (мкМ/г сирої тканини) Рис. 8 Активність та концентрація цитохромів в мітохондріях міокарда щурів після імобілізаційного стресу та дії обзидану і адреналіну (мМ/г білка) Після 14-денного стресу та після 14-денного введення адреналіну активність АТФ-синтази зменшувалася аналогічно - на 41,9% та 40% відповідно. І стрес і агоністи адренорецепторів призводили до значного підвищення концентрації цитохромів а та С у мітохондріях міокарда, що може свідчити про компенсаторне підвищення синтезу цитохромів при стресі, пов’язане з порушенням адренергічної регуляції. Проведені дослідження показали, що в серцевому м’язі дослідних тварин підвищувався рівень лактату, що призводить до зниження співвідношення NAD(P)/NAD(P)H пар, характерного для підвищення відновних процесів в клітині. Рис. 9. Рівень лактату в міокарді дослідних тварин Співвідношення NAD/NADH в серці щурів при стресі знижувалися, в той час як співвідношення NADP/NADPH за цих умов, навпаки, зростали, що є свідченням переключення потоку вуглецю з гліколізу на глюконеогенез. Дослідження функціонування мітохондрій включає ряд параметрів, серед яких - вивчення стану мітохондріальних мембран, вимірюване спектрофотометрично як набрякання мітохондрій. При вивченні процесу активного енергозалежного набряку мітохондрій тварин після дії імобілізаційного стресу було знайдено, що стрес призводив до зниження властивості мітохондрій активно набрякати у порівнянні з інтактною групою на 45,7% через 30 хвилин інкубації, на 42%, 63,5%, 18,1% відповідно через 60, 90, 120 хвилин. Примітка: 1 - 30 хв // 2 - 60 хв // 3 - 90 хв // 4 - 120 хв Рис. 10 Процес активного енергозалежного набряку мітохондрій тварин після дії імобілізаційного стресу Додавання до середовища інкубації АТФ майже не призводило до збільшення оптичної щільності суспензії мітохондрій міокарда дослідних тварин, що є свідоцтвом порушення контрактильних властивостей мітохондріальних мембран, а отже вираженому, але зворотному порушенню їх проникненості (відкриттю пор) у частини мітохондріального пулу в міокардіоцитах. Таким чином, дія стресу призводила до зниження інтактності мітохондріальних мембран, зниженню активності ферментів окисного фосфорилювання та компенсаторної стимуляції гліколізу і синтезу мітохондріальних цитохромів в міокарді. Морфологічні зміни у міокарді експериментальних тварин при імобілізаційному стресі. Мікроскопічно при дослідженні міокарда після 14-денного стресу при забарвленні гематоксилін-еозином спостерігали запальну реакцію, помірне повнокрів’я капілярів, венул, місцями з явищами стазу та сладж-феномену, поодинокі крововиливи у оточуючу сполучну тканину, строма міокарда дещо набрякла, з дегрануляцією окремих базофілів, просвіти між КМЦ розширені, ядра КМЦ видовжені, заокруглені, в окремих клітинах пікнотичні. Гістохімічні дослідження підтвердили дані біохімічних. Активність ЛДГ була підвищеною, що виражалось у збільшенні кількості та розмірів гранул чорного кольору, що виявлялись в цитоплазмі. Вивчення активності СДГ у КМЦ щурів виявило значне зниження в деяких КМЦ активності ферменту – а в деяких КМЦ поява гранул ферменту з накопиченням у вигляді плям, тобто нерівномірність розподілу активності СДГ у міокардіоцитах. На електронограмі спостерігали порушення крист та вакуолізації мітохондрій у КМЦ і підвищення електронної густини смугастих структур щурів після 2-тижневого впливу експериментального стресу. Також на електронограмі було видно апоптоз ядра КМЦ. При гістологічному дослідженні міокарда після 28 днів стресу при забарвленні гематоксилін-еозином спостерігалося виражене розширення капілярів та венул із накопиченням в їх просвітах еритроцитів, місцями з утворенням стазів та сладжів. В окремих ділянках виявлялися діапедезні крововиливи, набряк строми міокарда. Активність СДГ була зниженою. На електронограмі Х13500 відмічали явища вираженого порушення чіткості контурів мітохондрій та розрихління цитоплазматичних структур у кардіоміоцитах. Також у міокарді спостерігались окремі КМЦ з ознаками апоптозу – ядра клітин зменшені, маргіналізація хроматину та його ущільнення, інколи його фрагментація, інвагінації ядерної оболонки. Таким чином, біохімічні та морфологічні дослідження показали, що дія стресу призводить до формування запальної реакції в міокарді, порушення мікроциркуляції. Ці процеси супроводжуються в деяких КМЦ порушенням інтактності клітинних мембран, набряком та деструкцією мітохондрій, в одних – зниженням, а в других підвищенням активності ферментів окисного фосфорилювання, залежної від мембранного потенціалу мітохондріальних мембран, енергодефіцитом, компенсаторною активацією гліколізу та синтетичних процесів, що ініціює апоптоз кардіоміоцитів. Подовження термінів стресування супроводжувалося збільшенням вираженості цих процесів. Корекція стресорних пошкоджень у дослідних тварин. Імунна та неспецифічна резистентність. Нами було показано, що імобілізаційний стрес призводив до активації системи прозапальних цитокінів, зміни в активності та індукцію апоптозу в клітинах імунної системи, зміни енергообміну і стану мітохондрій та індукцію апоптозу в КМЦ. Тому, для адекватної корекції стресорних порушень гомеостазу доцільно було використати імуномодулятор – тімалін, а також природні антиоксиданти з протизапальними властивостями, такі як поліфеноли або біофлавоноїди в сполученні з енергорегулятором, таким як аскорбат - препарат корекції (ПК). При вивченні імунної відповіді на ЕБ було знайдено, що рівень специфічних антитіл до ЕБ дещо підвищувався в групі корекції в порівнянні з показниками стресованих тварин і відмінності показників були статистично достовірні. Кількість клітин, що утворюють імунні розетки в групі з корекцією була вище. Отже, ми можемо зробити висновок, що використаний нами препарат корекції, який впливає на енергетичні процеси в організмі, має нормалізуючий ефект на імунологічну реактивність. Введення на фоні стресу тімаліна також призводить до відновлення кількісних показників імунної реактивності у стресованих тварин. Згідно отриманих даних, при введенні дослідним тваринам препарату корекції у них зростала антиперекисна активність крові. Лікувальна дія корегуючих препаратів у стресованих тварин чіткіше виявлялася за умови подовження дії стресорних чинників. Примітка: 1 — (св. за 5 хв, мВ 2 — I max / I min Рис. 18 Перекисна хемілюминесценція плазми крові кролів, що зазнали імобілізаційного стресу та її зміни під впливом корегуючих препаратів Стресування тварин сприяло збільшенню антигенного навантаження на їх організм. Застосування ПК приводило до зменшення цитотоксичної активності природних клітин-кілерів, зниження рівнів ЦІК, які були підвищені внаслідок дії імобілізаційного стресу, що зменшує ризик виникнення аутоімунної патології. Рис. 19. Функціональна активність ПКК кролів, які зазнали імобілізаційного стресу та її зміни під впливом корегуючих препаратів Рис. 20. Вміст ЦІК у крові неімунізованих щурів, що зазнали іммобілізаційного стресу та вплив на нього ПК Якщо імобілізаційний стрес у щурів в середньому спричинював зростання відсотку дослідних тварин, лімфоцити яких у відповідь на кардіальний антиген продукують IL-1, то застосування ПК справляло певний нормалізуючий вплив на даний показник. Аналогічні зміни спостерігалися і у кролів, однак дія ПК виявлялася лише у тварин, що зазнавали імобілізаційного стресу протягом місяця. Рис. 21. Функціональна активність ПКК кролів, які зазнали імобілізаційного стресу та її зміни під впливом корегуючих препаратів Цитокіни. Як показали проведені дослідження, після 14 денного стресу чутливість клітин крові до індуктора ФНП – ліпополісахариду підвищувалась майже в 4 рази, а після продовження стресу без корекції іще впродовж 14 діб – клітини ставали практично не чутливими до дії ЛПС in vitro. На противагу цьому, при корекції стресу ПК чутливість клітин до ЛПС зберігалась. Це свідчить, що механізм імунокорегуючої дії вказаних речовин проявляється на рівні продукції ФНП клітинами крові. Таким чином, якщо стрес призводив до зміни направленості продукції цитокінів лімфоцитами крові дослідних тварин у відповідь на кардіальний антиген, застосування ПК та тімаліну призводило до нормалізації цитокінової продукції. Апоптоз. При вивченні апоптозу МНК крові було знайдено, що ПК нормалізує їх функціональний стан. Табл. 3. Індекс індукції апоптозу у кролів та щурів Інтактні Стрес Дія ПК Щурі 0,607±0,06 0,497±0,06 0,514±0,06 Кролі 0,614±0,06 0,909±0,07 0,845±0,07 Енергообмін міокарда. Застосування препарату поліфенолів сприяло збільшенню рівня АТФ в міокарді тварин після 14-денного та 28- денного імобілізаційного стресу майже до контрольних значень. Активність ферментів внутрішньої мітохондріальної мембрани: СДГ та ЦХО через 14 днів стресу і корекції підвищувалася вище контрольних значень на 43% та 13,2% відповідно. Активність Н-АТФ-ази відновлювалася на 70,7% від рівня інтактних тварин. Рис. 22. Активність ферментів внутрішньої мембрани мітохондрій міокарда щурів після імобілізаційного стресу (M±m) (нМ/г білка) ПК відновлював амплітуду активного набряку мітохондрій, а також дію АТФ на контрактильні властивості мітохондріальної мембрани. Рис. 23. Вплив ПК на відновлення контрактильних властивостей мітохондрій міокарда дослідних тварин (через 90 хв) Таким чином, препарат корекції відновлював енергообмін міокарда за рахунок мембранопротекції МХ, що позначалося на активації ферментів окисного фосфорилювання, вбудованих у внутрішню мембрану мітохондрій, а також вміст макроергів. Морфологія. При морфологічному та гістохімічному дослідженнях була підтверджена ефективність корекції стану міокарда у стресованих тварин. Як показало електронномікроскопічне дослідження, при застосуванні ПК на фоні стресу відбувалося збільшення кількості мітохондрій з гарно контурованими кристами, в тому числі, з ущільненням їхнього матриксу. Одночасна поява вакуолізації у цитоплазмі може свідчити про посилення транспортного обміну речовин у міокарді дослідних тварин. Позитивний вплив ПК саме на мітохондрії підтверджувався і посиленням активності АТФ-ази та високою активністю СДГ. Недостатність енергетичного забезпечення та порушення інтактності клітинних мембран запускає процес апоптозу КМЦ. Використання ПК попереджує розвиток енергетичного дефіциту у міокарді та ініціацію апоптозу. Табл. 4. Апоптозний індекс в міокарді щурів після 14-денного імобілізаційного стресу Контроль Стрес Стрес та введення поліфенолів Стрес та введення тімаліну АІ n= 0,499±0,099 10 1,770±0,237 16 p<0,01 1,122±0,295 16 p<0,01 0,849±0,144 14 p<0,01 Кількість апоптозних клітин на 1000 кл. 5 18 11 8 Табл. 5. Апоптозний індекс в міокарді після 28 денного імобілізаційного стресу Контроль Стрес Стрес та введення поліфінолів АІ n= 0,642±0,273 16 2,064±0,519 16 p<0,01 1,338±0,438 16 p<0,01 кількість апоптозних клітин на 1000 кл. 6 20 13 Так, антиоксидантні та енергонормалізуючі властивості поліфенолів з аскорбіновою кислотою сприяють стабілізації мітохондрій та мають протекторну протиапоптозну дію на кардіоміоцити. Таким чином, як препарат поліфенолів, так і тімалін сприяли зменшенню вираженості реакції організму на імобілізаційний стрес, що може бути пов’язаним з антиоксидантними властивостями ПК і з імуномоделюючими властивостями препарату з тімусу. Ефект препаратів був пов’язаний із зменшенням запального процесу в міокарді, що позначалось на нормалізації стану мембран, енергообміну та апоптозу кардіоміоцитів. Вивчення резистентності організму, індексів індукції апоптозу мононуклеарів та цитокінів у хворих з серцево-судинною патологією В експерименті нами було показано, що дія стресу супроводжувалася підвищенням рівня прозапальних цитокінів, зокрема ФНП, збільшенням апоптичних клітин в міокарді та рівня апоптозу МНК. Клінічними та експериментальними дослідженнями доведено, що зміни в імунному та цитокіновому статусі є суттєвою патогенетичною ланкою розвитку ішемічної хвороби серця, атеросклерозу, гіпертонічної хвороби, серцевої недостатності та інших серцево-судинних захворювань (Дзяк Г.В., Коваль Е.А., 1996, Ross R., 1999, Заремба Є.Х. та ін., 2004). Продемонстрована важлива роль ФНП та ІЛ-1 у активації запальних реакцій, потенціюванні активності ренін-ангіотензинової системи та загостренні серцево-судинної патології (Дж. Пфейфер, 1999). Підвищення рівня ФНП відповідає за негативний інотропний ефект, кардіоміопатію, набряк легенів. З іншого боку, ФНП є класичним індуктором апоптоза. Тому, не можна виключити, що існує зв'язок між ФНП-індукованим апоптозом і дисфункцією міокарда, що викликана цим цитокіном (Watschinger B. et. al., 1995). Для клітин, що мають термінальне диференціювання, а до таких відносяться кардіоміоцити, апоптоз не є характерним. Однак, при кардіоміопатіях, гіпертрофії міокарда і хронічній серцевій недостатності часто відбувається прогресивне зниження скорочувальної здатності лівого шлуночка. Іноді цей процес протікає у відсутності будь-яких ознак ішемії міокарда. Тому, робоча гіпотеза, що пояснює механізм розвитку дизрегуляторної серцевої патології при стресі, передбачала розвиток апоптозу клітин серцево-судинної системи, як патогенетичного фактора внаслідок дії прозапальних цитокінів, як було показано нами на моделі експериментального імобілізаційного стресу. В клініці було проведено комплексне вивчення імунної та неспецифічної резистентності, редокс статусу крові, рівня ФНП, апоптозу МНК та експресії гену апоптозу bax в клітинах крові, у порівнянні із станом скоротливості, гемодинаміки, рівня гіпертрофії міокарда, які відображають його морфо-функціональний стан. З аналізу літератури було визначено, що основні компоненти серцевої патології це – аритмія, ішемія міокарда та зниження скоротливої функції серця, які залежать від балансу регуляції. Ці фактори ми вивчали у 45 хворих на ішемічну хворобу серця (ІХС) з аритміями, де вони найбільш виражені. Для порівняння, вивчали гіпертрофію міокарда та апоптоз МНК у 94 хворих на гіпертонічну хворобу (ГХ), оскільки тривалий вплив артеріальної гіпертензії створює умови для поступового розвитку гіпертрофії із збереженням гемодинамічної продуктивності міокарда лівого шлуночка, що дає можливість виділити саме кардіальні фактори розвитку патології. Фактори неспецифічної резистентності при ІХС.Згідно з одержаними нами даними, у всіх обстежених групах пацієнтів з різними класами серцево-судинної патології спостерігалися зміни лейкоцитарної формули крові з переважанням нейтрофільного лейкоцитозу. При вивченні перекисної хемілюмінесценції плазми крові було відмічено зростання відношення Imax/Imin у дослідних групах над контрольними значеннями, що може свідчити про певне зменшення у хворих на ІХС антиперекисної активності плазми крові. Так, на відміну від хворих ІІ функціонального класу захворювань, у яких мало місце навіть пригнічення ПОЛ відносно контролю, у хворих з ІІІ функціональним класом захворювань рівень ПОЛ знаходився в межах контрольних значень (РU > 0,05) за рахунок вторинного спалаху при
виснаженні антиперекисних систем.

Розвиток у людей сердцево-судинних захворювань супроводжувався певними
зрушеннями у них функціональної активності поліморфноядерних лейкоцитів
(ПЯЛ). У кардіальних хворих мало місце пригнічення бактерицидних
властивостей ПЯЛ внаслідок пригнічення кисневого вибуху, що може бути
пов’язано із зростанням активності антиперекисних систем організму. А
паралельно з цим зменшувалася й поглинальна активність ПЯЛ.

Фактори імунної системи при ІХС. Результати обстеження хворих 11ФК і
111 ФК показали, що у хворих на ІХС рівень ЦІК був нижчий ніж у здорових
осіб (45,0 ± 1,6 од. і 36,7 ± 10,0 од. відповідно в здорових 50,6 ± 8,8
од.). У хворих на ІХС П функціонального класу виявлено зменшення
кількості Т-хелперів і Т-супресорів. При цьому не спостерігалося змін з
боку В-клітин. Кількість рецепторів апоптозу — Fas або (CD 95) на
лімфоцитах відображає клітинну активацію, схильність до апоптозу. При
порівнянні результатів, одержаних при вивченні імунного статусу хворих
ІХС П ФК і Ш ФК статистично значимих відмінностей не виявлено. В хворих
відмічалися тенденції до зростання кількості природних клітин кілерів
(CD16, CD56); зменшення кількості активованих клітин (CD25 та CDHLA-DR);
підвищення рівня клітин, які приймають участь в ініціації апоптозу
(CD40), збільшення рецепторів апоптозу — CD95 у хворих ІІІ ФК.

2

^

`

a

a

b d ¬ Ue X

v

0

0

^

`

¬ ® Ue x

&

&

¬

3/4

ae

`„7a$

oooo†znnnb

`„7a$

`„7a$

ocOcCoo3/43/43/43/4µµµ°¤¤°µ

$

1$`„Aa$

j]

lcZRFFFZ

$

O

O

O

)татності в хворих з аритміями відзначені зміни насосної функції,
внутрісерцевої гемодинаміки, структури скорочення і розслаблення лівого
шлуночка. Статистично достовірними були зміни і показників діастоли.
Спостерігалося зниження швидкості наповнення лівого шлуночка і
подовження часу його досягнення. Зазначені зміни просліджувалися на тлі
збільшення КДО, що свідчить про підвищення діастолічної напруги стінки
лівого шлуночка, зниження ефективності його роботи і збільшення
енерговитрат. Тому ми проаналізували показники кардіодінаміки в
залежності від відсутності чи наявності гіпертрофії міокарда лівого
шлуночка. Порівнюючи показники скорочувальної функції міокарда лівого
шлуночка у двох групах, ми не встановили статистично достовірних
розходжень їхніх величин. Однак відзначена тенденція до збільшення
серцевих об’ємів у першій групі обстежених.

Встановлено, що в хворих зі зниженою фракцією викиду спостерігалося
істотне підвищення серцевих об»ємів і, що особливо важливо,
кінцево-систолічного об»єму. Ударний об»єм при цьому не змінювався.
Відзначалося також погіршення швидкісних і часових показників
систолічної і діастолічної фаз серцевого скорочення. Усе це свідчить про
порушення скорочувальної функції міокарда лівого шлуночка на тлі
достатньої гемодинамічної компенсації.

Визначення циклічихі нуклеотидів при ІХС. У групі хворих з ІХС із
шлуночковими порушеннями ритму визначалися рівні циклічних нуклеотидів
та їхнє співвідношення.

Рис. 27. Вміст циклічних нуклеотидів у хворих з шлуночковими порушеннями
ритму на тлі ІХС (пМ/мг білка)

Знайдено підвищення рівня цАМФ і зниження вмісту цГМФ. Показники
циклазної системи були проаналізовані й у хворих у групі зі зниженою
ЗФВ. Саме в цих хворих спостерігалося найбільш виражене підвищення рівня
цАМФ ( 38.1+2.4). У той же час спостерігалося найбільш виражене зниження
цГМФ (0.35+0.04).

Агрегація тромбоцитів при ІХС. Аналіз електронномікроскопічних
тромбоцитограм показав зниження у периферійній крові числа неактивованих
тромбоцитів на 56,1%, підвищення кількості зворотньо- та
незворотньоактивованих на 24,9% та 17,5%, дегранульованих на 9,8%,
зворотньо- та незворотньоагрегованих кров’яних платівок відповідно на
8,4% та 3,7% . Найбільш характерними змінами ультраструктури тромбоцитів
периферийної крові хворих була перебудова їх глікокаліксу та
плазматичної мембрани Перебудова глікокаліксу та плазмолеми
супроводжувалась суттєвими змінами її маркування при цитохімічному тесті
на АЦ. Було знайдено, що у групі хворих з II ФК рівень АЦ та ФДЕ майже
не відрізнявся від контрольних значень. А у групі хворих з III ФК рівень
АЦ у тромбоцитах був знижений на 50%, що значно підвищило їх здатність
до агрегації. Зміни неспецифічної резистентності та
морфо-функціонального стану міокарда відбувалися на фоні порушення
адренорегуляції про що свідчить збільшення циркулюючого в крові цАМФ та
зниження активності мембранної аденілатциклази тромбоцитів.

Дослідження цитокінів при ІХС. Середні титри індукованого ( та
(-інтерферону в основній та контрольній групі достовірно не
відрізнялись. Не відрізнялися ці проказники і в групах паціентів в
залежності від захворювання. Тобто здатність клітин крові до продукції (
і ( інтерферону in vitro у відповідь на індуктор не відрізнялась в усіх
досліджуваних групах. Проте аналізуючи індивідуальний розподіл титрів
інтерферону у 2 групах (донори та хворі) можна зробити висновок, що у
групі донорів частіше, ніж у групі хворих зустрічаються значні титри
(-інтерферону (16-64 од/мл) – відповідно 60 та 46,5% . У 39% пацієнтів з
серцево-судинною патологією була знижена продукція (- інтерферону. При
вивченні показників ендогенного або сироваткового інтерферону у хворих
було встановлено достовірне підвищення кількості циркулюючого в крові
інтерферону. Так, цей показник в групі донорів та хворих відповідно
дорівнював 2,9(0,2 та 3,8(0,1 Вивчали рівні активності фактору некрозу
пухлин в сироватці крові, а також спонтанну та індуковану продукцію
цього цитокіну мононуклеарами крові у відповідь на стимуляцію
ліпополісахаридом E.coli. Результати дослідження показали, що спонтанна
продукція ФНП ( функціональна активність) у групі хворих у 1,2 рази вища
у порівнянні з донорами. Продукція ФНП у відповідь на індукцію
(функціональний резерв) була знижена на 1,8 рази.

Рис. 28. Показники спонтанної та стимульованої продукції фактору некрозу
пухлин у хворих та донорів

В сироватці крові хворих знаходили підвищення рівня циркулюючого ФНП
майже у 1,5 рази, що свідчить про зміни в цитокіновому статусі хворих з
перевагою прозапальних реакцій, можливо за рахунок додаткової продукції
ФНП та ІФН неспецифічними клітинами-продуцентами.

Вивчення апотозу мононуклеарів при ІХС. Для апробації розробленої нами
нової методики також було проведено визначення спонтанного та
індукованого апоптозу мононуклеарних клітин та експресії генів апоптозу
bax в клітинах, виділених з крові кардіологічних хворих на ІХС,
стенокардію напруження, атеросклеротичний кардіосклероз та
міокардитичний кардіосклероз (МК).

Спостерігалося більше підвищення апоптозного індексу в культурі МНК всіх
груп хворих на ІХС вспонтанного і в умовах індукції in vitro
дексаметазоном порівняно з результатами, одержаними в групі донорів. В
групі хворих на МК також спостерігали підвищення апоптозних індексів,
але через малу кількість обстежених ці результати не достовірні.

Примітка: 1 — Донори // 2 — ІХС ІІ ФК // 3 — ІХС ІІІ ФК //

4 — МК

Рис. 29. Рівень спонтанного та індукованого апоптозу МНК у крові
кардіологічних хворих Рис. 30. Рівень спонтанного та індукованого
апоптозу МНК у крові кардіологічних хворих (% співвідношення відносно
контролю).

Індекс індукції апоптозу (ІІА), який відображає метаболічний стан
клітини, у хворих ІІ ФК був 0,75±0,06, у хворих ІІІ ФК ІІА – 0,78±0,07,
а у донорів — 0,61±0,06.

Вищі показники індексу індукції апоптозу, які відображають деструктивні
процеси та зниження рівня метаболізма характерні для групи хворих з 111
ФК ІХС, отже ми можемо відзначити, що підвищення апоптозних індексів та
ІІА відображають тяжкість захворювання.

Експресія проапоптозного гену bax в клітинах крові хворих на ІХС була
64,71%, а у донорів – 60%.

Таким чином, можна констатувати, що у хворих на ІХС відмічається
дисбаланс у редокс-системі крові, підвищення рівня прозапального
цитокіну – ФНП, що зумовлює активацію експресії проапоптозних генів та
апоптозу в МНК крові. Підвищення рівня ФНП є тим патогенетичним
фактором, який може безпосередньо впливати на морфо-функціональний стан
міокарда і зумовлювати розвиток його патології. При незмінених
гемодінамічних показниках у хворих на ІХС відмічалися зони зниження
скоротливості міокарда, збільшене енергоспоживання, що опосередковано
може свідчити про гіпоксичний метаболізм та енергодефіцит
кардіоміоцитів, що збігається з результатами визначення ІІА
мононуклеарів крові хворих.

Для визначення інформаційної достовірності розроблених діагностичних
методик нами були проведені аналогічні дослідження серед хворих на іншу
серцево-судинну патологію – гіпертонічну хворобу (ГХ).

Клініко-інструментальні дослідження при ГХ. Встановлено, що у хворих з
ІІ стадією ГХ загальна і регіонарна фракції викиду мали однонаправлену
тенденцію до зниження. Слід відмітити, що в структурі локальної
скоротливості прослідковувалась тенденція до зниження фракції викиду
верхівкової зони. Оцінка кількості зон з порушеною скоротливістю
виявилась можливою лише при співставленні індивідуальних величин. При
цьому, гіпокінетичні зони виявлялись навіть у хворих з нормальною ЗФВ.
Більш динамічними виявились серцеві об’єми. Так кінцево-діастолічний
об’єм зріс на 9,2 %, ще більш виражених змін зазнав кінцево-систолічний
об’єм, приріст якого дорівнював 31,1%. Саме останнє і зумовило суттєве
зниження ударного об’єму у цих хворих. У кількісному вираженні різниця
при порівнянні обох груп склала 13% і була достовірною.

За результатами дослідження систолічної і діастолічної функції лівого
шлуночка видно, що у хворих з ІІ ст. ГХ спостерігалося статистично
достовірне зниження всіх швидкостей вигнання. Суттєво зменшилися і такі
показники як середньонормалізована швидкість і швидкість вкорочення
кругових волокон. Такі зміни характеристик систоли при практично
незмінному часі вигнання свідчать не лише про погіршення систолічної
функції, але й про перебудову структури систоли. Враховуючи той факт, що
у хворих з ІІ ст. ГХ знижувався і ударний об’єм, можна зробити висновок
про погіршення скоротливої функції міокарда на стадії ще стійкої
кардіальної компенсації. Наші дані свідчать про порушення діастолічної
функції у хворих з ІІ ст. ГХ. Маючи на увазі, що у обстежених хворих
мали місце ознаки порушення структури систоли, ми проаналізували
динаміку параметрів структури діастоли. Одержані дані показують, що для
другої стадії ГХ характерні зміни, які свідчать про перерозподіл
наповнення лівого шлуночка в напрямку більш пізнього діастазису.
Зниження скоротливості міокарда компенсувалося розвитком гіпертрофії
лівого шлуночку.

Дослідження стану імунної та неспецифічної резистентності при ГХ. При
вивченні субпопуляцій лімфоцитів за CD відмічалося статистично вірогідне
підвищення активованих клітин (CDHLA-DR, у хворих — 25,0±1,44% при
18,9±1,49% у контролі; Р<0,01). Поряд з цим відмічали зниження експресії CD95 на лімфоцитах хворих на 16,8% порівняно з донорами. Отже, перебіг ГХ ?? ст. супроводжується збільшенням кількості маркерів активації лімфоцитів та значним зменшенням клітин, схильних до апоптозу. Захисні властивості нейтрофілів були пригніченими при незмінній їх кількості. Були знайдені сезонні коливання фагоцитарної активності з підвищенням значень у весняний період. Також відмічався підвищений рівень ПОЛ переважно у весняний період року. Рівень імуноглобулінів, ЦІК та активність природних кілерів були в межах контрольних значень. Вивчення цитокінів при ГХ. Проводився аналіз функціонування інтерферонової системи в залежності від віку. Вивчали рівні активності фактору некрозу пухлин в сироватці крові, а також спонтанну та індуковану продукцію цього цитокіну мононуклеарами крові у відповідь на стимуляцію ліпополісахаридом E.coli. Аналізуючи дані, отримані в роботі, доходимо висновку, що показники продукції (- та (- інтерферону клітинами крові хворих на ГХ достовірно не відрізняються від цих показників у донорів. Лише враховуючи віковий ценз, ми виявили зниження здатності клітин крові синтезувати імунний або (- інтерферон у осіб після 60 років. У всіх категорій хворих визначалися підвищені рівні ендогенного або циркулюючого інтерферону та фактора некрозу пухлин, що, можливо пов’язано з ендогенною інтоксикацією, або (та) продукцією цитокінів іншими клітинами додатково до МНК. Відомо, що ІФН та ФНП ініціюють активацію макрофагальних металопротеіназ, які приймають безпосередню участь у атерогенезі та руйнуванні атером. ФНП ініціює гіпертрофію та апоптоз міокарда та інтіми судин. Тобто, підвищені рівні цих цитокінів можуть провокувати загострення перебігу серцево-судинних захворювань та виникнення критичних станів. Дослідження апоптозу при ГХ. Були визначені показники спонтанного та індукованого апоптозу в культурі мононуклеарних клітин (МНК) крові донорів та хворих на гіпертонічну хворобу (ГХ) ІІ стадії. В культурі МНК, виділених з крові хворих на ГХ ІІ стадії, рівень спонтанного апоптозу був достовірно знижений приблизно на 33%, показник індукованого ДМТ апоптозу був на 25% знижений в порівнянні з показниками у донорів. Примітка: 1 - К - показник спонтанного апоптозу // 2 - ДМ - показник індукованого апоптозу (індукція дексаметозоном) Рис. 31. Показники спонтанного та індукованого апоптозу в культурі МНК крові, індекс маси міокарда у донорів та хворих на гіпертонічну хворобу ІІ ст. (%) Оскільки МНК крові відображають системні зміни гомеостазу, ІІА МНК є показником, що характеризує забезпеченість функціональним резервом активності клітин організму. В нормі цей показник становить число близьке до “золотого перетину”, а саме від 0,610 до 0,630. За нашими даними індекс індукції апоптозу в групі хворих на ГХ ІІ стадії становив 0,550. Зниження ІІА порівняно з групою донорів свідчить про зміну метаболічного обміну - збільшення синтетичної активності клітин серцево-судинної системи. За нашими дослідженнями за величиною ІІА при ГХ ІІ стадії можна судити про ступінь гіпертрофії міокарда (патент України). Примітка: 1 - ІІА - індекс індукції апоптозу // 2 — ІММ –індекс маси міокарда Рис. 32 Взаємозв’язок апоптозу МНК та гіпертрофії міокарда Чим менше було значення ІІА, тим більше була ступінь гіпертрофії міокарда, яку визначали за формулою по даним ЕхоКГ, r=0,90909. Індекси спонтанного та індукованого апоптозу, рецепторів апоптозу в МНК крові хворих на гіпертонію значно і вірогідно нижчі за відповідні у хворих на стенокардію. В культурі МНК, виділених з крові хворих на ГХ зменшується частка клітин, які гинуть від апоптозу, а в культурі МНК, виділених з крові хворих з стенокардією, вона зростає в порівнянні з відповідними показниками донорів. Виходячи з одержаних даних ми можемо зробити висновок, що індекс індукції апоптозу МНК крові відображає тяжкість і специфічність кардіологічного захворювання і може виступати прогностичним критерієм розвитку патології міокарда. Результати цих досліджень дали підставу для розробки нових діагностичних методик, відображених у методичній рекомендації та 7 патентах України. Рис. 33. Схема розвитку серцево-судинної патології при стресі. Рис. 34. Схема біохімічних механізмів розвитку апоптозу в клітинах міокарда при стресі. ВИСНОВКИ У дисертаційній роботі було проведено експериментальне дослідження ролі факторів імунної системи та неспецифічної резистентності, зокрема прозапальних цитокінів у змінах енергообміну та ініціації апоптозу імуноцитів та кардіоміоцитів при імобілізаційному стресі, корекція стресорних пошкоджень. Запропоновано концептуально новий підхід до діагностики пошкоджень міокарда. Розроблено і апробовано в клініці нову методику визначення функціонального стану клітин за процесами їх спонтанного та індукованого апоптозу. Встановлено, що імобілізаційний стрес не викликав гуморальної та клітинної відповіді на серцевий антиген, але імуноцити дослідних тварин через 14 днів стресу при інкубації з серцевим антигеном in vitro починали продукувати прозапальний цитокін інтерлейкін-1 (ІЛ-1). В контрольних тварин імуноцити не реагували на дію серцевого антигена секрецією прозапальних цитокінів. Через два тижні стресування зростав рівень фактору некрозу пухлин (ФНП) в крові дослідних тварин через підвищення чутливості імуноцитів до дії ендотоксину. Через місяць дії стресу чутливість імунокомпетентних клітин до ендотоксину падала і рівень фактору некрозу пухлин в крові знижувався, що свідчить про падіння функціональної активності та функціонального резерву мононуклеарів при тривалому стресі. В експериментальних та клінічних дослідженнях було встановлено, що в нормі оптимальне співвідношення функціональної активності (спонтанного апоптозу) до функціонального резерву (індукованого апоптозу), вираховане як індекс індукції апоптозу, дорівнює значенню золотого перетину. Відхилення від цього значення в сторону збільшення означає незабезпеченість функції резервом і подальше виснаження. Відхилення в сторону зменшення свідчить про порушення стимуляції функції і перевагу синтетичних процесів - анаболізму над катаболізмом. За допомогою імунологічних і цитологічних досліджень встановлено, що дія імобілізаційного стресу супроводжувалася ініціацією апоптозу імунокомпетентних клітин – мононуклеарів (МНК). Через 14 днів відбувалася активація клітин, що проявлялося підвищенням продукції прозапальних цитокінів – ІЛ-1 та ФНП та рівнів спонтанного і індукованого дексаметазоном апоптозу в культурі МНК. При цьому індекс індукції апоптозу зменшувався, а синтетична активність лімфоцитів була стимульована, що також свідчить про активацію МНК. Через 28 днів стресу спостерігалося виснаження МНК, що супроводжувалося зниженням рівня ФНП і зниженням індексів спонтанного та індукованого апоптозу в культурі МНК, які становили майже половину від вихідних показників. Індекс індукції апоптозу зростав, що свідчить про зниження функціонального резерву та життєздатності клітин крові, чутливості до дії глюкокортикоїдів. В результаті морфологічного та цитохімічного дослідження було знайдено, що при дії 14-денного стресу розвивалися прозапальні зміни мікроциркуляторного русла та сполучної тканини міокарда, набряк митохондрій, гіпертрофія ядер, ініціація апоптозу кардіоміоцитів, які набували хронічного характеру після 28 днів стресу. Рівень апоптозу кардіоміоцитів був вищий ніж у міокарді інтактних тварин. Формування запальної реакції в міокарді, порушення мікроциркуляції, сполучнотканинного матриксу при дії імобілізаційного стресу супроводжувалися в частині кардіоміоцитів порушенням інтактності клітинних мембран, набряком та деструкцією мітохондрій, зниженням активності ферментів окисного фосфорилювання, залежної від мембранного потенціалу мітохондріальних мембран – сукцинатдегідрогенази (СДГ), цитохромоксидази (ЦХО), протонної АТФ-ази (Н-АТФ-ази), енергодефіцитом, компенсаторною активацією гліколізу та синтетичних процесів, що ініціює апоптоз кардіоміоцитів. При подовженні термінів стресування вираженість морфологічних змін переважала над змінами біохімічних показників. Пошкодження міокарда, незалежно від етіологічного чинника формує гіпоксичний тип метаболізму міокарда, який є базисним біоенергетичним станом і першим пунктом патогенетичних методів корекції через покращення енергообміну. Імунологічними, гістохімічними, біохімічними та морфологічними дослідженнями було показано, що і препарат поліфенолів, і тімалін сприяли зменшенню вираженості реакції організму на імобілізаційний стрес, що може бути пов’язаним з антиоксидантними, енергонормалізуючими, імуномодулюючими властивостями препаратів. Ефект препаратів супроводжувався зниженням інтенсивності запального процесу в міокарді, що позначалось на покращенні стану мікроциркуляції та сполучної тканини міокарда, мембран, мітохондрій та зменшенні апоптозу кардіоміоцитів. Лікувальна дія корегуючих препаратів у дослідних тварин чіткіше виявлялася при подовженні дії стресорних чинників. Біохімічними, гістохімічними та морфологічними дослідженнями показано, що препарат корекції нормалізував енергообмін міокарда, що підтвердилося збільшенням кількості мітохондрій, відновленням стану мітохондріальних мембран, активацією ферментів окисного фосфорилювання, вбудованих у внутрішню мембрану мітохондрій, а також вміст макроергів. Мобілізаційні реакції при дії тривалого невираженого стресу супроводжувалися активацією клітин адаптаційних систем, у тому числі імуноцитів, що згодом зменшувало їх енергетичне забезпечення та рівень функціонального резерву. Компенсаторно, через активацію системи прозапальних цитокінів, пригнічення окисного фосфорилювання та активацію гліколізу, активувалася структурна підтримка функції, що призводило до ініціації апоптозу в імуноцитах і кардіоміоцитах. Таким чином, апоптоз МНК та рівень його індукторів відображають стан клітин організму і мають діагностичне та прогностичне значення. Клінічно при ішемічній хворобі серця у хворих в крові відмічали дисбаланс у редокс-системі, підвищення рівня прозапального цитокіну – ФНП, що зумовлює активацію експресії проапоптозних генів bax та апоптозу в мононуклеарах. Спонтанна продукція ФНП (функціональна активність) у групі хворих на ішемічну хворобу серця була вища у порівнянні з донорами. Продукція ФНП у відповідь на індукцію in vitro (функціональний резерв) була знижена. В сироватці крові хворих знаходили підвищення рівня циркулюючого ФНП, що свідчить про зміни в цитокіновому статусі хворих з перевагою прозапальних реакцій. Цитологічними та молекулярно-генетичними дослідженнями крові хворих була знайдена невідповідність функціональної активності (індексу спонтанного апоптозу) мононуклеарів їх функціональному резерву (індексу індукованого апоптозу) у хворих на ішемічну хворобу серця ІІІ ФК, в той час як у хворих ІІ ФК функціональна активність підвищувалася адекватно функціональному резерву, що показує індекс індукції апоптозу (ІІА), який відображає метаболічний стан клітин та тяжкість захворювання. Експресія проапоптозного гену bax та рецепторів апоптозу в клітинах крові всіх груп хворих на ІХС була підвищеною у порівнянні з донорами. За даними радіонуклідної вентрикулографії (РНВГ)при відсутності ознак серцевої недостатності в хворих на ішемічну хворобу серця з шлуночковими аритміями відмічалися при незмінених гемодінамічних показниках зони зниження скоротливості міокарда, збільшене енергоспоживання, яке опосередковано може свідчити про гіпоксичний тип метаболізму та енергодефіцит кардіоміоцитів, що співпадає зі змінами метаболічного статусу при визначенні індексу індукції апоптозу мононуклеарів крові хворих. Розвиток дифузних апоптотичних процесів у міокарді може бути безсимптомним за рахунок перерозподілу внутрішньо-серцевих об’ємів і здійснення гемодинамічної компенсації зон гіпокінезії, що зберігає загальну фракцію викиду міокарда. За даними РНВГ у хворих з ІІ стадією гіпертонічної хвороби гіпокінетичні зони виявлялись навіть у хворих з нормальною загальною фракцією викиду. Погіршення скоротливої функції міокарда відбувалося на стадії ще стійкої кардіальної компенсації і компенсувалося розвитком гіпертрофії лівого шлуночку. У всіх хворих на гіпертонічну хворобу визначалися підвищені рівні циркулюючого інтерферону та фактора некрозу пухлин, що свідчить про запальну реакцію в організмі. Рівень спонтанного та індукованого апоптозу мононуклеарів був знижений в порівнянні з показниками у донорів, що свідчить про зміну метаболічного обміну - збільшення синтетичної активності клітин серцево-судинної системи. Індекс індукції апоптозу мав зворотний зв’язок зі ступенню гіпертрофії міокарда. Індекс індукції апоптозу в культурі мононуклеарних клітин крові показує на відміну від абсолютних значень діагностичних показників індивідуальний вихідний стан клітинного метаболізму, що відображає тяжкість і специфічність захворювання, і може виступати діагностичним та прогностичним критерієм розвитку патології. ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Ігрунова К.М., Моторна М.М., Степачова Т.І. Апоптоз мононуклеарних клітин крові у хворих з патологією серцево-судинної системи //Лабораторна діагностика -2004. - № 1. -С.16-18. Особистий внесок дисертанта – розробка методики, організація та проведення клінічних досліджень, статистична обробка матеріалу, написання статті. Ігрунова К.М., Корчинська О.І., Мечев Д.С., Єпанчинцева О.А., Северин Ю.П. Радіонуклідна оцінка структурно-функціонального стану серця в хворих із шлуночковим порушенням ритму // Укр. радіол. журнал. -2003. -№3. -С. 282-285. Особистий внесок дисертанта – організація та проведення клінічних досліджень, статистична обробка матеріалу, написання статті. Игрунова К.Н. Участие факторов иммунной системы в механизмах адаптации миокарда при иммобилизационном стрессе // Таврич. медико-биологич. вестник. -2004. -т. 7.-№1. -С. 71-74. Корчинська О.І., Ігрунова К.М., Северин Ю.П., Лінник І.В. Радіонуклідна оцінка структурно-функціонального стану серця у хворих з шлуночковими порушеннями ритму // Променева діагностика, променева терапія, - Київ.2002., вип. 14. -С. 52-60. Особистий внесок дисертанта – організація та проведення клінічних досліджень, статистична обробка матеріалу, аналіз отриманих результатів, написання статті. Игрунова К.Н. Влияние хронического раздражения блуждающего нерва на митохондриальные цитохромы в клетках печени // Наук. вісник Ужгородського ун-ту, Серія Медицина. -1999. -вип. 10. -С. 85-86. Игрунова К.Н. Психоэмоциональная, нейроэндокринная, иммунная дизрегуляция в патогенезе стрессорного повреждения сердечно-сосудистой системы // Збірник наук. праць співроб. КМАПО ім. П.Л. Шупика. -Київ: КМАПО. -2004. -випуск 13, книга 3.-С. 50-62. Виконана самостійно. Ігрунова К.М., Ігрунов Л.П., Ветютнева Н.О. Корекція енергетичного обміну у м’язах поліфенолами вівса та аскорбіновою кислотою // Збірник наук. праць співробіт. КМАПО, присвячений 80-річному ювілею академії ім. П.Л. Шупика. -Київ. -1998., -С. 340-347. Особистий внесок дисертанта – проведення експерименту, приготування препарату поліфенолів, проведення біохімічних досліджень, статистична обробка матеріалу, написання статті. Ігрунова К.М. Нейроендокринні та імунні механізми у розвитку серцево-судинної патології // Збірник наук. праць співроб. КМАПО ім. П.Л. Шупика. -1999. -вип. 8. -С. 408-415. Виконана самостійно. Ігрунова К.М., Коруля В.О., Тимченко С.В., Карась О.Ф. Участь факторів імунної системи у пошкодженні міокарда при експериментальному стресі. //Збірник наукових праць співробітників КМАПО ім. П.Л. Шупика. -К. -2000. -Вип. 9. -книга 3. -С. 789-800. Особистий внесок дисертанта – проведення експерименту, проведення імунологічних досліджень, статистична обробка матеріалу, написання статті. Ігрунова К.М., Сільченко В.П., Коруля В.О., Степачова Т.І., Раслан Халіль. Морфологічні зміни печінки білих щурів при експериментальному стресі //Збірник наукових праць співробітників КМАПО ім. П.Л. Шупика. -К., 2000.-Вип. 9. -книга 4. -С. 907 -911. Особистий внесок дисертанта – проведення експерименту, набір матеріалу, статистична обробка та аналіз отриманих даних, написання статті. Харченко Н.В., Барчук М.А., Ігрунова К.М., Коруля В.О., Прилепова І.А. Деякі особливості апоптозу у хворих на виразкову хворобу // Збірник наукових праць співробітників КМАПО ім. П.Л. Шупика. -К., 2001. -Вип. 10. -книга 1.-С. 832-837. Особистий внесок дисертанта – розробка і виконання методики визначення апоптозного індексу, аналіз отриманого матеріалу, написання статті. Ігрунова К.М., Моторна М.М., Сільченко В.П., Карась А.Ф., Тимченко С.В., Тимченко М.Д., Прилепова І.А., Коруля В.О., Степачова Т.І. Морфологічні зміни міокарда щурів при експерементальному стресі та застосування препарата-коректора. // Збірник наукових праць співробітників КМАПО ім. П.Л. Шупика. -К., 2001. -Вип.10. –книга 3. -С. 1271-1276. Особистий внесок дисертанта – проведення експерименту, приготування препарату корекції, забір крові, набір матеріалу, статистична обробка та аналіз отриманого матеріалу, написання статті. Ігрунова К.М., Моторна М.М. Зміни гематологічних та біохімічних показників крові при експериментальному стресі, як моделі критичних станів //Збірник наук. праць співроб. КМАПО ім. П.Л. Шупика.- Київ:-2002. - випуск 11, книга 3. - С. 243-249. Особистий внесок дисертанта – проведення експерименту, проведення біохімічних досліджень, статистична обробка матеріалу, написання статті. Ігрунова К.М., Моторна М.М., Сільченко В.П., Тимченко С.В. Тимченко М.Д., Степачова Т.І., Коруля В.О., Прилепова І.А. Зміни гематологічних та біохімічних показників крові щурів та кролів, які зазнали впливу імобілізаційного стресу // Збірник наук. праць співроб. КМАПО ім. П.Л. Шупика. -Київ: КМАПО. 2002. - випуск 11, книга 1. -С. 727-733. Особистий внесок дисертанта – проведення експерименту, набір матеріалу, проведення біохімічних досліджень, аналіз отриманого матеріалу, написання статті. Горовенко Н.Г., Подольська С.В., Россоха З.І., Лисенко Г.І., Ященко О.Б., Ганджа І.М.. Ігрунова К.М. Виявлення ДНК інфекційних агентів у паціентів з ішемічною хворобою серця методом полімеразної ланцюгової реакції // Збірник наук. праць співроб. КМАПО ім. П.Л. Шупика. -Київ: КМАПО. -2003. - випуск 12, книга 1. -С. 437-441. Особистий внесок дисертанта – планування та проведення клінічних досліджень, набір матеріалу, проведення біохімічних досліджень, статистична обробка та аналіз отриманого матеріалу, написання статті. Антоненко В.Т., Королев Ю.Н., Мищенко Ю.Н., Игрунова К.Н. Новые представления о патогенезе повреждений миокарда иммунного генеза // Науч. труды III международного симпозиума: Системно-антисистемная регуляция в норме и патологии. -Киев. -1993. -С. 5-6. Особистий внесок дисертанта – моделювання імунної патології, набір матеріалу, проведення біохімічних досліджень, аналіз результатів, написання статті. Антоненко В.Т., Ковальчук В.К., Міщенко Ю.М., Ігрунова К.М. Енергопродукуючі системи мітохондрій при аутоімунній патології серця. //Збірник наукових праць співробітників КМАПО, присвячений 75-річному ювілею. -К. -1994. -С. 7-8. Особистий внесок дисертанта – проведення моделювання імунної патології, забір крові, набір матеріалу, виділення мітохондрій і проведення біохімічних досліджень активності мітохондріальних ферментів, статистична обробка матеріалу, написання статті. Ігрунова К.М., Зозуля І.С., Павлюк В.Д., Демидюк С.М. Роль факторів запалення у формуванні патології міокарда. //Буковинський мед. вісник.-2006. т.10, №3. С. 44-46. Особистий внесок дисертанта - розробка методичного підходу діагностики, організація та проведення методики в клініці, аналіз та інтерпретація отриманих результатів, написання статті. Ігрунова К.М., Губський Ю.І. Енергообмін та апоптоз клітин крові при імобілізаційному стресі. //Журнал “Медична хімія”. 2006.-Т.8,-№3. С.51-53. Особистий внесок дисертанта – виконання біохімічних та цитологічних досліджень., обробка та аналіз отриманих даних, написання статті. Ігрунова К.М., Чернявська Г.В. Стрес як основний екологічний фактор сучасної цивілізації, який потенціює дію фізичних та хімічних чинників навколишнього середовища.// Збірник “Гігієна населених міст”-20066. Вип. 48.-С. 495-500. Особистий внесок дисертанта – планування та проведення експериментального дослідження, обробка та аналіз отриманих результатів, підбір літератури, написання статті. Ігрунова К.М., Зозуля І.С., Моторна М.М., Степачова Т.І. Визначення спонтанного та індукованого апоптозу в культурі мононуклеарних клітин крові. Методичні рекомендації. Київ, 2004. Особистий внесок дисертанта – розробка методики, організація та проведення апробації методики в клініці, аналіз та інтерпретація отриманих результатів, написання метод-рекомендацій. Ігрунова К.М. Спосіб комплексної діагностики резистентності організму. Патент України № 66076 А (15.04.2004. Бюл. № 4). Особистий внесок дисертанта – виконана самостійно. Ігрунова К.М., Степачова Т.І., Моторна М.М. Спосіб забарвлення апоптичних клітин у суспензії. Патент України № 65147 А (15.03.2004. Бюл. № 3). Особистий внесок дисертанта – розробка способу, аналіз отриманих даних, опис винаходу. Ігрунова К.М. Спосіб оцінки функціонального резерву мононуклеарних клітин крові з використанням принципу "золотого перерізу". Патент України № 65985 А (15.04.2004. Бюл. № 4). Особистий внесок дисертанта – виконана самостійно. Ігрунова К.М., Ігрунов Л.П., Моторна М.М., Степачова Т.І.Спосіб виявлення гіпертрофічних або деструктивних процесів при кардіоваскулярних захворюваннях. Патент України № 63745 А (15.01.2004. Бюл. № 1. Особистий внесок дисертанта – опис винаходу, розробка способу, організація і проведення клінічних комплексних досліджень, вивчення апоптозу мононуклеарних клітин, статистичний аналіз отриманих результатів. Ігрунова К.М., Зозуля І.С., Моторна М.М., Степачова Т.І. Спосіб визначення ступеня гіпертрофії міокарда у хворих з гіпертонічною хворобою 2-го ступеня. Патент України № 63744 А (15.01.2004. Бюл. № 1). Особистий внесок дисертанта – опис винаходу, розробка способу, організація і проведення клінічних комплексних досліджень, вивчення апоптозу мононуклеарних клітин, статистичний аналіз отриманих результатів. Ігрунова К.М., Ігрунов Л.П. Спосіб отримання поліфенолів. Патент України № 9898 (17.10.2005. Бюл. №10). Особистий внесок дисертанта – опис винаходу, проведення виділення поліфенолів. Ігрунова К.М., Ігрунов Л.П., Зозуля І.С., Моторна М.М. Спосіб отримання флавоноїдів. Патент України № 10365 (15.11.2005. Бюл. № 11). Особистий внесок дисертанта – опис винаходу, розробка способу виділення флавоноїдів, розробка визначення якісних характеристик отриманого продукту. Игрунова К.Н., Зозуля И.С., Игрунов Л.П. Участие факторов иммунной системы в нейрорецепторной регуляции метаболизма миокарда при иммобилизационном стрессе // Мат. конф.: Итоги программы “ Десятилетие мозга” Нейроиммунология. -СПб. -2000. -С. 47-48. Особистий внесок дисертанта – проведення експерименту, забір крові, набір матеріалу, проведення біохімічних та імунологічних досліджень, аналіз отриманого матеріалу, написання статті. Игрунова К.Н., Корчинская О.И., Игрунов Л.П. Взаимодействие факторов иммунной и нервной систем в развитии гипертрофии и апоптоза клеток сердечно-сосудистой системы //Материали Х1 Всероссийской Конференции "Нейроиммунология", С-Пб - 2002, -С. 109-110. Особистий внесок дисертанта – організація та проведення клінічних досліджень, забір крові, проведення біохімічних та імунологічних досліджень, статистична обробка матеріалу, написання статті. Ігрунова К.М., Моторна М.М., Степачова Т.І. Апоптоз мононуклеарних клітин крові у хворих з патологією серцево-судинної системи // Матер. конфер. "Сучасні уявлення про причини виникнення, механізми розвитку та методи запобігання раптової смерті". -Краснодар. -2003. - С. 23. Особистий внесок дисертанта – планування та проведення клінічних досліджень, забір крові, проведення цитологічних досліджень, статистична обробка та аналіз отриманого матеріалу, написання статті. Игрунова К.Н., Корчинская О.И., Моторная М.М., Степачева Т.И Апоптический индекс мононуклеарных клеток крови у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями // Inter.J.on immunorehabilitation.-Физиол. и патол. иммун. сис-мы.- Москва. -2003. т. 5.-№2. -С. 259. Особистий внесок дисертанта – планування та проведення клінічних досліджень, забір крові, проведення цитологічних досліджень, статистична обробка та аналіз отриманого матеріалу, написання статті. Игрунова К.Н. Участие факторов иммунной системы в механизмах повреждения миокарда при иммобилизационном стрессе // Inter.J.on immunorehabilitation.-Физиол. и патол. иммун. сис-мы.- Москва. -2003. т.5. -№ 2. -С. 148. Виконана самостійно. Ігрунова К.М., Ігрунов Л.П. Корекція енергообміну при патології міокарда // Мат. конф. до 100-річчя Львівського мед. ун-ту: Експериментальна та клінічна терапія та ензимологія. -Львів. -1995.- С. 160-161. Особистий внесок дисертанта – проведення експерименту, забір крові, проведення біохімічних досліджень активності мітохондріальних ферментів, статистична обробка матеріалу, написання статті. Ігрунова К.М., Ігрунов Л.П. Енергообмін у міокарді при підвищенні симпатичного тонусу організму // Матеріали V конгресу кардіологів України.-Київ.-1996.-С. 141. Особистий внесок дисертанта – проведення експерименту, забір крові, проведення біохімічних досліджень активності мітохондріальних ферментів, статистична обробка матеріалу, написання статті. Ігрунова К.М., Зозуля І.С., Ігрунов Л.П. Пошкодження біомембран міокарда при стресі // Мат. пленуму Укр. товариства патофізіологів. -Чернівці. -1998. -С. 78-79.т Особистий внесок дисертанта – моделювання стресу в експерименті, забір крові, проведення біохімічних досліджень клітинних та мітохондріальних мембран, статистична обробка матеріалу, написання статті. Ігрунова К.М., Губський Ю.І., Ігрунов Л.П. Роль факторів імунітету в процесах гіпертрофії та проліферації клітин серцево-судинної системи // Фізіологічний журнал.- 2000. -Т.46. -№2. -С. 7. Особистий внесок дисертанта – проведення експерименту, забір крові, набір матеріалу, проведення імунологічних та біохімічних досліджень, статистична обробка матеріалу, написання статті. Ігрунова К.М., Моторна М.М., Степачова Т.І. Апоптичний індекс мононуклеарних клітин крові у щурів, які зазнали впливу імобілізаційного стресу // Фізіол. журн. -2002. –Т. 48. - № 4. -С. 106-107. Особистий внесок дисертанта – проведення експерименту, забір крові, набір матеріалу, проведення вивчення апоптозних індексів, статистична обробка та аналіз отриманого матеріалу, написання статті. Ігрунова К.М., Корчинська О.І., Степачова Т.І., Коруля В.О., Прилепова І.А. Роль факторів імунної системи у розвитку гіпертрофії та проліферації клітин серцево-судинної системи // Тези доп. Республіканської наук.-практич. конф. "Атеросклероз и атеротромбоз: новое в патогенезе, клинике, лечении" (15-16 ноября 2001г.).-Харьков. Особистий внесок дисертанта – організація та проведення клінічних досліджень, забір крові, проведення біохімічних та імунологічних досліджень, написання статті. Ігрунова К.М., Корчинська О.І., Моторна М.М., Степачова Т.І. Апоптичний індекс мононуклеарних клітин крові в осіб з гіпертонічною хворобою 2-го ступеня важкості // Тези доп. Всеукраїнської наук. конф., присвяченої 160 річчю кафедри фізіології людини і тварин КНУ ім. Т. Шевченка (3-4-жовтня 2002 р.), Київ. -С. 50. Особистий внесок дисертанта – організація та проведення клінічних досліджень, забір крові, проведення вивчення апоптозних індексів, статистична обробка та аналіз отриманого матеріалу, написання статті. Ігрунова К.М., Зозуля І.С., Моторна М.М., Степачова Т.І. Апоптичний індекс мононуклеарних клітин крові у хворих на ішемічну хворобу серця // Матеріали ІІІ Міжнародн. науково-практ. конф. "Наука і соціальні проблеми суспільства: Медицина, фармація і біотехнологія". -Харків. -2003.-С. 12. Особистий внесок дисертанта – організація та проведення досліджень хворих на ГХ, забір крові, проведення вивчення апоптозних індексів, статистична обробка матеріалу, написання статті. Игрунова К.Н., Игрунов Л.П., Карась А.Ф. Коррекция энергетического обмена десенситизированного сердца // Тез. докл. респ. науч.-практ. конф.: Фундаментальные и клинические аспекты современной реабилитации.-Полтава. -1995. -С. 25. Особистий внесок дисертанта – проведення експерименту, приготування препарату корекції, забір крові, набір матеріалу, проведення біохімічних досліджень ферментів мітохондрій, статистична обробка матеріалу, написання статті. Ігрунова К.М., Ігрунов Л.П. Молекулярні аспекти патології серця при хронічному подразнені вагусу та її корекція // Тез. доп. конф. наук. мед. товариства патофізіологів України: Фундаментальні механізми розвитку патологічних процесів.-Дніпропетровськ.-1990.-С. 49-50. Особистий внесок дисертанта – проведення експерименту, приготування препарату корекції, проведення біохімічних досліджень ферментів енергообміну, статистична обробка матеріалу, написання статті. Ігрунова К.М., Моторна М.М., Степачова Т.І. Апоптичний індекс мононуклеарних клітин крові щурів, які зазнали впливу імобілізаційного стресу у весняно-літній та осінньо-зимовий період //Тези доп. Установчого з’їзду Укр. тов. клітинної біології. -Львів. -2004. -С. 349. Особистий внесок дисертанта – проведення експерименту, розробка методики та проведення вивчення апоптозних індексів мононуклеарів, статистична обробка та аналіз отриманого матеріалу, написання статті. Ігрунова К.М., Моторна М.М., Коруля В.О., Степачова Т.І. Кореляція індексів спонтанного та індукованого апоптозу з субпопуляційним складом мононуклеарівв крові у хворих з хронічною ішемічною хворобою серця. //Clin. аnd experim. Pathol.- 2004.-Vol. 3. №2.-Р. 63. Особистий внесок дисертанта – розробка методики, організація та проведення апробації методики в клініці, аналіз та інтерпретація отриманих результатів, написання метод-рекомендацій. Горовенко Н.Г., Ігрунова К.М., Зозуля І.С. Метод комплексної діагностики для прогнозування можливих ускладнень у хворих з артеріальною гіпертензією. //Мат. Укр. наук.-практ. конф. “Первинна та вторинна профілактика церебро-васкулярних ускладнень артеріальної гіпертензії. Київ 2006. С.76. Особистий внесок дисертанта – розробка та апробація метода в клініці, написання тез. АНОТАЦІЯ Ігрунова К. М. Механізми розвитку пошкоджень серця при багаторазовому стресі та їх корекція. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук за спеціальністю 14.00.16 – патологічна фізіологія. – Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Київ, 2007. В дисертаційній роботі представлена нова концепція розвитку пошкоджень серця при стресі - активація неспецифічної запальної реакції в організмі через систему прозапальних цитокінів без специфічного імунного ураження міокарда. В експерименті при моделюванні імобілізаційного стресу було показано в культурі підвищення чутливості мононуклеарних клітин крові (МНК) до серцевого антигену і продукція ними інтерлейкіну-1. У відповідь на ендоксин МНК стресованих тварин починали активно виробляти фактор некрозу пухлин (ФНП). При тому, антитіл та сенсибілізованих лімфоцитів до серцевого антигену, тобто специфічного імунного пошкодження серця не було виявлено. При вивченні в клітинах крові ферментів енергообміну: анаеробного -лактатдегідрогенази, аеробного - сукцинатдегідрогенази та цитоплазматичної К-Na-АТФ-ази було виявлено пригнічення окисного фосфорилювання та активація гліколіза. Стрес ініціював підвищення рівнів ФНП та апоптозу МНК через 14 днів і пригнічення - через 28. В експерименті визначено, що в нормі співвідношення функціональної активності МНК(спонтанного апоптозу) до функціонального резерву МНК (індукованого апоптозу) відповідає значенню золотого перетину і відхилення від цього значення вказують на зміни функціонального стану клітин і метаболічні зрушення в організмі, так як стан МНК є відображенням дії нейрогенних, імунних та ендокринних медіаторів. За результатами досліджень була розроблена нова діагностична методика по вивченню в культурі МНК спонтанного та індукованого дексаметазоном апоптозу з допомогою ядерного флуоресцентного барвника Hoechst 44432. При морфологічному дослідженні показано розвиток запальної реакції в міокарді на рівні мікроциркуляторного русла та сполучної тканини при стресі. Спектрофотометричне та гістохімічне дослідження мембран та активності ферментів: сукцинатдегідрогенази, цитохромоксидази та АТФ-синтетази мітохондрій міокарда стресованих тварин показали зниження інтактності мітохондріальних мембран та активності ферментів окисного фосфорилювання. При вивченні в міокарді рівнів лактату, пірувату, аденілових та пірідінових нуклеотидів визначено активацію гліколізу та глюконеогенезу, що є характерним для стресу. Морфологічно ( світлова та електронна мікроскопія) показано, що дія стресу призводить до розвитку апоптозу кардіоміоцитів. Таким чином, сформульована нова концепція пошкодження серця при стресорній мобілізації - активація системи прозапальних цитокінів, розвиток неспецифічної запальної реакції в міокарді, порушення інтактності мітохондріальних мембран, перебудова енергообміну з активацією гліколізу, ініціація апоптозу кардіоміоцитів, поступове зниження функціонального резерву міокарда. Корекція енергообміну препаратом поліфенолів з аскорбіновою кислотою або запальної реакції тімаліном призводила до зниження кількості апоптозних клітин в міокарді, що підтверджує нову концепцію. Клінічно у хворих на ішемічну хворобу серця та гіпертонічну хворобу було проведено вивчення нової діагностичної методики верифіковане дослідженням морфо-функціонального стану міокарда методом радіонуклідної вентрикулографії. Показані особливості спонтанного та індукованого апоптозу МНК, характерні відхилення від значення золотого перетину при різних формах захворювання, що має діагностичну інформативність. На основі вивчення апоптозу клітин серцево-судинної системи в експерименті та клініці розроблено нові концептуальні підходи до діагностики та корекції пошкоджень серця. Ключові слова: апоптоз, стрес, цитокіни, мітохондрії, енергообмін, ішемічна хвороба серця, гіпертонічна хвороба, імунна система, міокард, поліфеноли. Summary. Igrunova K.M. Heart injuries development mechanisms induced by multiple stress and the mechanisms correction.- Manuscript Dissertation for Doctor’s degree in Medicine specialized in 14.03.04 - pathological physiology .- A.A. Bogomoletz Institute of Physiology, NAS of Ukraine, Kyiv, 2007. A new conception concerning the development of stress-induced cardiac injuries, viz. an activation of non-specific inflammatory response in the organism through the system of anti-inflammatory cytokines without a specific immune myocardial injury is presented in the thesis. An increase in the sensitivity of mononuclear blood cells (MNBC) to heart antigen as well as their producing interleukin -1 (IL-1) have been shown in the culture resulting from the experiment while modeling immobilization stress. The MNBC of the stress animals started to actively produced the tumor necrosis factor (TNF) in response to endotoxine. The also were no detected any antibodies and sensible lymphocytes to heart antigen, i.e. a specific immune heart damage. We detected oxidative phosphorylation inhibition and the activation of glycolysis when studying energy exchange enzymes in blood cells, viz. anaerobic–lactatedehydrogenase, aerobic – succinate dehydrogenase and cytoplasmic R-Na-ATP-ase. The stress initiated an increase in the levels of TNF and the apoptosis of MNBC after 14 days and the inhibition of them after 28 days. As a result it has been detected that in normal individuals the ratio of MNBC functional activity (spontaneous apoptosis) to MNBC functional reserve (induced apoptosis) meets the requirements of the Golden proportion; the deviation from the requirements points out the changes in the functional state of cells and metabolic disorders in the organism as the state of MNBC reflects the activity of neurogenic, immune and endocrine mediators. New diagnostic methods for studying spontaneous apoptosis and the apoptosis induced by dexamethasone in MNBC culture by means of nuclear fluorochrome Hoechst 44432 have been developed according to the investigations results. The development of myocardial inflammatory response at the level of microcirculatory bed and the connective tissue in case of stress has been shown in the morphological study. The spectrophotometric and histochemical analyses of the membranes and the activity of enzymes viz. succinate dehydrogenase, cytochromeoxidase and ATP-synthetase of myocardial mitochondria of the stressed animals have shown a decrease in the intact of mitochondrial membranes and the activity of oxidative phosphorylation enzymes. The activation of glycolysis and gluconeogenesis that is typical for stress has been determined as a result of studying the levels of lactate, pyruvate, adenylic and pyridine nucleotides in the myocardium. It has been morphologically (light and electronic microscopy) proved that stress activity causes cardiomyocytes apoptosis development. Thus, it has been formed a new conception of stress-induced cardiac injuries, viz. an activation of the system of anti-inflammatory cytokines, the development of non-specific inflammatory response in the myocardium, the disturbance of intact of mitochondrial membranes, the reconstructure of energy exchange of glycolysis activation, the initiation of cardiomyocytes apoptosis, the gradual decrease in the functional reserve of the myocardium. The correction of energy exchange by means of polyphenols with ascorbic acid or the correction of inflammatory response by means of thymalin causes a decrease in the number of apoptotic cells in the myocardium, this fact proves the conception. The study of new diagnostic methods that is verified to the investigations of morphofunctional state of the myocardium was fulfilled clinically in patients with CHD and essential hypertension by means of radionuclide ventriculography. The peculiarities of MNBC spontaneous and induced apoptosis, the typical deviations from the requirements of the Golden proportion in case of different forms of the disease are presented; that is diagnostically significant. The new conceptual approaches to diagnosing cardiac injuries and their correction have been clinically and experimentally developed on the basis of studying the apoptosis of cells of the cardiovascular system. Key words: apoptosis, stress, cytokines, mitochondria, energy exchange, CHD, essential hypertension, immune system, myocardium, polyphenols, Golden proportion. АННОТАЦИЯ Игрунова К.Н. Механизмы развития повреждений сердца при многократном стрессе и их коррекция. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 14.00.16 – патологическая физиология. – Институт физиологии им. О. О. Богомольца НАН Украины, Киев, 2006. В диссертационной работе представлено теоретическое обобщение и новое решение научной проблемы, которое заключается в раскрытии новых механизмов развития повреждений сердца при стрессе - активации неспецифической воспалительной реакции в организме посредством системы провоспалительних цитокинов без специфического иммунного поражения миокарда. Диссертация состоит из экспериментального и клиническогофрагментов. В эксперименте было воспроизведено психо-эмоциональное напряжение и гиподинамию, основные современные факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний, путем моделирования иммобилизационного 14 и 28- дневного стресса по Ф.З. Меерсону на 157 крысах и 40 кроликах. Критерии стресса определяли по Селье. Для коррекции стрессорных изменений енергообмена был использован препарат коррекции (ПК) - полифенолы с аскорбиновой кислотой, для контроля - иммуномодулятор тималин. Приоритетным в работе является комплексное изучение в эксперименте факторов иммунной и неспецифической резистентности, цитокинов, энергообмена и апоптоза иммуноцитов и кардиомиоцитов, морфологического состояния миокарда, которое позволило разработать новые концептуальные подходы диагностики и коррекции повреждения сердца при стрессе. Установлена фундаментальная закономерность - соотношение функциональной активности мононуклеаров их потенциальному резерву, в норме равно значению золотого сечения и отражает исходное функциональное состояние клетки. Отклонения от этого значения отражают направленность и выраженность изменения гомеостаза. В эксперименте при моделировании иммобилизационного стресса было показано в культуре повышение чувствительности мононуклеарных клеток крови (МНК) к сердечному антигену, что стимулировало продукцию интерлейкина-1 (ИЛ-1). В ответ на эндотоксин МНК стрессированных животных начинали активно вырабатывать фактор некроза опухоли (ФНО). При этом, антител и сенсибилизированных лимфоцитов к сердечному антигену, то есть специфического иммунного повреждения сердца не было выявлено. При изучении в клетках крови ферментов энергообмена: анаэробного -лактатдегидрогеназы, аэробного - сукцинатдегидрогеназы и цитоплазматической К-Nа-АТФ-азы было выявлено угнетение окислительного фосфорилирования и активация гликолиза. Иммунный ответ на гетероантиген (эритроциты барана) по титрам гемагглютининов и гемолизинов, количеству антигенпродуцирующих клеток был несколько снижен. Отмечали умеренную активацию факторов неспецифической резистентности: естественных клеток-киллеров, фагоцитов, перекисного окисления липидов. Стресс инициировал повышение уровней спонтанного и индуцированного эндотоксином ФНО через 14 дней и угнетение - через 28. Та же динамика наблюдалась в отношении апоптоза МНК. Были выявлены сезонные и годовые отклонения изучаемых показателей от среднестатистических норм. Отмечено, что эффект воздействия стресса на показатели иммунной и неспецифической резистентности, уровень оксидантов в крови зависел от исходного состояния клеток и систем организма подопытных животных. Разработана новая методика по изучению в культуре МНК спонтанного и индуцированного дексаметазоном апоптоза с помощью ядерного флуоресцентного красителя Hoechst 44432. В эксперименте определено, что в норме соотношение функциональной активности МНК(спонтанного апоптоза) к функциональному резерву МНК (индуцированного апоптоза) отвечает значению золотого сечения и отклонения от этого значения независимо от временных ритмов стабильно указывают на изменения функционального состояния клеток и метаболические сдвиги в организме, так как состояние МНК отображает регуляторные действия нейрогенных, иммунных и эндокринных медиаторов. На основании результатов эксперимента разработан и запатентован новый диагностический метод определения функционального состояния клетки - соответствие функциональной активности ее резерву. При морфологическом исследовании подопытных животных уже через 14 дней стресса показано развитие воспалительной реакции на уровне микроциркуляторного русла и соединительной ткани, набухание митохондрий миокарда, провоспалительные изменения внутренних органов. Через 28 дней воспалительная реакция принимала хронический характер. Спектрофотометрическое и гистохимическое исследования мембран и активности ферментов: сукцинатдегидрогеназы, цитохромоксидазы и АТФ-синтетазы митохондрий миокарда стрессированных животных показали снижение интактности митохондриальных мембран и активности ферментов окислительного фосфорилирования. При изучении в миокарде уровней лактата, пирувата, адениловых и пиридиновых нуклеотидов выявлена активация гликолиза и глюконеогенеза, что характерно для стресса. Было показано увеличение концентрации митохондриальных цитохромов - С и а при снижении активности цитохром С-оксидазы, что также свидетельствует об изменении интактности внутреннй митохондриальной мембраны, где расположен этот фермент. Морфологически (световая и электронная микроскопия) показано, что действие стресса приводит к развитию апоптоза кардиомиоцитов уже через 14 дней, через 28 дней количество апоптозных клеток в миокарде подопытных животных оставалось выше, чем в миокарде контрольных животных. Таким образом, была сформулирована новая концепция повреждения сердца при длительной стрессорной мобилизации - активация системы провоспалительных цитокинов, развитие неспецифической воспалительной реакции в миокарде, нарушение интактности митохондриальных мембран, перестройка энергообмена с активацией гликолиза, развитие гипоксического типа метаболизма, стимуляция синтеза митохондриальных цитохромов, инициация апоптоза кардиомиоцитов, постепенное снижение функционального резерва миокарда. Коррекция энергообмена препаратом полифенолов с аскорбиновой кислотой или воспалительной реакции тималином приводила к снижению количества апоптозных клеток в миокарде на фоне нормализации воспалительной реакции, стабилизации мембран митохондрий, что подтверждает новую концепцию. Было обследовано 45 больных ишемической болезнью сердца (ИБС) с тахиаритмиями, 94 больных гипертонической болезнью (ГБ), контрольную группу составили 37 доноров. Клинически у больных ИБС и ГБ было проведено изучение информативности новой диагностической методики на фоне иммунного статуса, факторов неспецифической резистентности. Изучали формулу крови, субпопуляции лимфоцитов с помощью моноклональных меченых антитил к CD, иммуноглобулины, циркулирующие иммунные комплексы, фагоцитоз, активность естественных клеток-киллеров (ЕКК). Определяли уровень перекисных соединений и антиоксидантный потенциал по хемилюминесценции плазмы крови и уровень провоспалительных цитокинов: ФНО, интерферона. Методом полимеразной цепной реакции в клетках крови изучали экспрессию проапоптозного гена bax семейства bcl-2 – генов регуляторов апоптоза (Sigma). У всех обследуемых методом ЭКГ изучали аритмогенез, методом эхокардиографии устанавливали уровень гипертрофии миокарда. Радионуклидная вентрикулография (РНВГ) проводилась всем больным до начала медикаментозного лечения в стационаре. Комплекс параметров РНВГ включал общие и регионарные показатели сократимости и гемодинамики миокарда. Показаны особенности спонтанного и индуцированного апоптоза МНК, характерные отклонения от значения золотого сечения при разных формах заболевания, которые имеют диагностическую информативность. Клинически при ИБС у больных в крови отмечали дисбаланс в редокс-системе, повышение уровня провоспалительного цитокина –фактора некроза опухоли (ФНО), увеличение экспрессии проапоптозного гена bax и апоптоза в мононуклеарах. Спонтанная продукция ФНО в групе больных ИБС была выше, а индуцированная ниже по сравнению с донорами. В сыворотке крови уровень циркулирующего ФНО был повышен, что свидетельствует об изменении цитокинового статуса больных с преобладанием провоспалительных реакций. Цитологическими и молекулярно-генетическими исследованиями крови больных было найдено несоотвествие функциональной активности (индекса спонтанного апоптоза) мононуклеаров их функциональному резерву (индексу индуцированного апоптоза) у больных ИБС ІІІ ФК, в то время как у больных ІІ ФК функциональная активность повышалась адекватно функциональному резерву согласно индекса индукции апоптоза (ИИА), который отражает функциональное состояние клеток и тяжесть заболевания. Индекс индукции апоптоза у больных ІІ ФК- 0,75±0,06; у больных ІІІ ФК – 0,78±0,07; а у доноров - 0,61±0,06. По данным РНВГ при отсутствии признаков сердечной недостаточности у больных ИБС с аритмиями отмечали при неизмененных гемодинамических показателях зоны снижения сократимости миокарда, увеличение энергопотребления, что указывает на гипоксический тип метаболизма и энергодефицит кардиомиоцитов и совпадает с результатами изучения ИИА мононуклеаров крови больных. При радиологическом исследовании сердца -РНВГ у больных с другой сердечно-сосудистой патологией - ГБ гипокинетические зоны миокарда выявлялись даже у больных с нормальной общей фракцией выброса левого желудочка на стадии кардиальной компенсации при развитии компенсаторной гипертрофии левого желудочка. У всех категорий больных ГБ отмечали повышенные уровни циркулирующего интерферона и ФНО, что свидетельствует о воспалительной реакции в организме. В культуре мононуклеаров, выделенных из крови больных ГБ, уровень спонтанного и индуцированного апоптоза был сниженным (0.55) по сравнению с показателями у доноров, что свидетельствует об изменении направленности у них метаболизма с преобладанием синтетической активности клеток сердечно-сосудистой системы. Индекс индукции апоптоза был обратно пропорционален степени гипертрофии миокарда , r=0,90909. Таким образом, индекс индукции апоптоза в культуре мононуклеарных клеток крови показывает в отличие от абсолютных значений диагностических показателей индивидуальное исходное состояние клеточного метаболизма, что отображает тяжесть и специфичность заболевания, и может выступать диагностическим и прогностическим критерием развития патологии. На основе изучения апоптоза клеток сердечно-сосудистой системы в эксперименте и клинике разработаны новые концептуальные подходы и методы диагностики и коррекции повреждений сердца. Ключевые слова: апоптоз, стресс, цитокины, митохондрии, энергообмен, ишемическая болезнь сердца, гипертоническая болезнь, иммунная система, миокард, полифенолы, золотое сечение. PAGE 53

Похожие записи