НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

Федірко Наталія Вікторівна

удк 612.014.42:612.31:591.431.2

Механізми підтримання кальцієвого гомеостазу в ацинарних клітинах
підщелепної слинної залози

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана
Франка Міністерства науки і освіти України та Інституті фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України

Наукові консультанти: академік НАН України, доктор біологічних наук

Костюк Платон Григорович,

директор Інституту фізіології

імені О.О. Богомольця НАН України,

завідувач відділом загальної фізіології нервової системи

доктор біологічних наук, професор

Клевець Мирон Юрійович,

завідувач кафедри фізіології людини і тварин

Львівського національного університету ім. Івана Франка

Офіційні опоненти: академік НАН України, доктор біологічних наук

Магура Ігор Сільвестрович,

Фізико-технічний навчально-науковий центр НАН України,

професор кафедри молекулярної фізіології та біофізики

член-кореспондент НАН України,

доктор біологічних наук, професор

Костерін Сергій Олексійович,

заст. директора з наукової роботи та зав. відділом біохімії м’язів

Інституту біохімії імені О.В.Палладіна НАН України

доктор біологічних наук, професор

Рибальченко Володимир Корнійович,

завідувач відділом цитофізіології науково-дослідного Інституту
фізіології імені Петра Богача Київського національного

університету імені Тараса Шевченка.

Провідна установа: Київський національний медичний університет імені
О.О.Богомольця

Захист дисертації відбудеться “25” квітня 2006 року о “14” годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.198.01 при Інституті
фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул.
акад. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім.
О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, Київ, вул. акад.
Богомольця, 4.

Автореферат розіслано “25” березня 2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Слина – важливий фактор підтримання здорового
стану органів ротової порожнини (Zachariasen, 1996). Вона
характеризується прямою бактерицидною, антивірусною та антигрибковою
активністю, що сприяє нормальному функціонуванню слизової оболонки
ротової порожнини, відіграє роль у формуванні смакових відчуттів,
жуванні та мовленні (Jensen et al., 2004). Зменшення слиновиділення та
зміни складу слини є причиною підвищення ймовірності карієсу,
периодонтологічних захворювань та патологій слизової оболонки ротової
порожнини (Porter et al., 2004). Відчуття сухості у роті (ксеростомія),
зумовлене пригніченням здатності клітин слинних залоз синтезувати та
виводити слину, є симптомом багатьох захворювань або побічним ефектом
дії лікарських препаратів. Ксеростомія супроводжує С’йогрен синдром,
цукровий діабет, радіаційне опромінення ділянок голови чи шиї,
хемотерапію та ін. (Porter et al., 2004). Однак, незважаючи на чисельні
клінічні дані, клітинні механізми розвитку ксеростомії залишаються
нез’ясованими. Враховуючи це, дослідження механізмів, що опосередковують
патологічні зміни функціонування слинних залоз є важливим завданням
сучасної фізіології.

У ссавців секреція рідкої слини (як базальна, так і стимульована) для
зволоження ротової порожнини здійснюється в основному підщелепною
слинною залозою (Foskett et al., 1989). Враховуючи це, виникненя
ксеростомії вірогідно пов’язане із порушенням функціонування ацинарних
клітин саме цієї залози. Також відомо, що синтез і секреція компонентів
слини є Са2+-залежними процесами, які регулюються змінами концентрації
вільного кальцію в цитоплазмі ([Са2+]i) та ендоплазматичному ретикулумі
([Са2+]ЕР) (Ambudkar, 2001). Виходячи з цього, порушення кальцієвого
гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози є вірогідною
причиною розвитку ксеростомії. Підтримання гомеостазу кальцію
досягається за рахунок узгодженого функціонування Са2+-транспортних
систем плазматичної мембрани та внутрішньоклітинних органел та їх
взаєморегуляції. Проте дані про зміни кальцієвого гомеостазу при
ксеростомії, а також навіть щодо механізмів взаємодії між
Са2+-транспортними системами ацинарних клітин за фізіологічних умов
практично відсутні, хоча очевидно, що вони відіграють ключову роль у
регуляції слиновиділення.

Таким чином, вивчення механізмів [Са2+]i та [Са2+]ЕР сигналізації,
вкладу у їх модуляцію інших внутрішньоклітинних органел, таких як
мітохондрії, та їх взаємодії між собою зробить вагомий крок до більш
детального визначення ролі кальцієвого гомеостазу та внутрішньоклітинних
регуляторних органел у процесах слиновиділення та дасть змогу підняти на
новий рівень методи терапії дисфункцій слинних залоз.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
в рамках наукової тематики кафедри фізіології людини і тварин
Львівського національного університету імені Івана Франка:
науково-дослідних тем БЛ-10Б “Кальцієвий гомеостаз і енергетичний
метаболізм секреторних клітин травних залоз та їх зміни під впливом
екстремальних факторів”, № держреєстрації 0100 O 001452, БЛ-114Б
“Механізми Са2+- і NO-залежної регуляції функціонування секреторних
клітин”, № держреєстрації 0103 U 001872, а також за сприяння
Західно-Українського центру біомедичних досліджень.

Об’єкт досліджень – кальцієвий гомеостаз в ацинарних клітинах
підщелепної слинної залози.

Предмет досліджень – механізми підтримання кальцієвого гомеостазу в
ацинарних клітинах підщелепної слинної залози щурів.

Методи досліджень – фізіологічні тести, біофізичні, біохімічні,
електронно-мікроскопічні та статистичні методи досліджень.

Мета роботи. Мета виконаної роботи полягала у вивченні механізмів
взаєморегулюючого функціонування Са2+-транспортних систем плазматичної
мембрани, ендоплазматичного ретикулуму та мітохондрій, а також їх вкладу
в підтримання кальцієвого гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної
слинної залози в нормі та за умов ксеростомії.

Завдання дослідження

Визначити особливості перебігу [Са2+]і сигналізації при холінергічній
стимуляції ацинарних клітинах підщелепної слинної залози та вклад різних
Са2+- транспортних систем у формування [Са2+]і сигналів.

Вивчити перебіг [Са2+]і сигналізації при активації пуринорецепторів в
ацинарних клітинах підщелепної слинної залози.

Розробити методичний підхід для прямої реєстрації концентрації
іонізованого Са2+ в ЕР на моделі хімічно пермеабілізованих ацинарних
клітин для дослідження кальцієвого гомеостазу всередині Са2+ депо.

Вивчити властивості ІnsР3-чутливого депо ЕР та механізми регуляції його
функціонування за участю інших Са2+-транспортних систем.

Визначити роль ріанодинових рецепторів у [Са2+]і сигналізації в
ацинарних клітинах та участь інших Са2+-транспортних систем в її
модуляції.

Дослідити механізм пасивного витоку кальцію з ЕР ацинарних клітин.

Визначити параметри депо-керованого входу Са2+ в ацинарні клітини та
фізіологічну роль інших Са2+-транспортних систем у його регулюванні.

Довести адекватність стрептозотоцин-індукованого цукрового діабету як
моделі ксеростомії шляхом визначення основних паметрів слиновиділення у
здорових щурів та тварин із експериментально викликаним діабетом.

Провести порівняльний аналіз перебігу [Са2+]і сигналізації при
холінергічній стимуляції ацинарних клітин підщелепної слинної залози
здорових щурів і тварин хворих на діабет.

Виявити зміни Са2+ сигналізації всередині ЕР та мітохондрій ацинарних
клітин при експериментально викликаному діабеті.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вперше проведено
комплексний аналіз перебігу [Са2+]і сигналізації в ацинарних клітинах
підщелепної слинної залози при активації холіно- та пуринорецепторів.
Доведено адекватність використання моделі хімічно пермеабілізованих
клітин для прямої реєстрації концентрації Са2+ в ЕР та вперше
зареєстровано [Ca2+]ЕР транзиєнти в ацинарних клітинах підщелепної
слинної залози. Вивчено характеристики InsP3-чутливого депо Са2+,
особливості модуляції його активності та гетерогенність в ацинарних
клітинах. Вперше доведено наявність функціонально-активних ріанодинових
рецепторів в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози, вклад яких у
[Са2+]і сигналізацію визначається функціонуванням мітохондрій та
Са2+-АТФаз. Вперше одержано фізіологічні та електронно-мікроскопічні
свідчення на користь колокалізації мітохондрій, Са2+-АТФаз та
ріанодинових рецепторів в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози.
Вперше показано, що в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози
транслоконовий комплекс ЕР є основним механізмом пасивного вивільнення
Са2+ з ЕР. Кількісно оцінено депо-керований вхід Са2+ та вперше доведено
фізіологічну роль мітохондрій у його підтриманні. Показано, що
трансмітохондріальне переміщення Са2+ є необхідним для перезаповнення
кальцієм депо ЕР.

У роботі вперше одержано докази на користь того, що в основі розвитку
ксеростомії при цукровому діабеті лежать зміни гомеостазу Са2+ в
ацинарних клітинах підщелепної слинної залози. Вперше показано зростання
базального рівня [Са2+]і та порушення перебігу [Са2+]і сигналізації при
холінергічній стимуляції ацинарних клітин за умов діабету. Виявлено, що
за умов діабету пригнічується функціонування Са2+-транспортних систем
ЕР, посилюється пасивний витік Са2+ через транслоконовий комплекс та
активується додатковий шлях вивільнення Са2+ із мітохондрій. Розроблено
гіпотезу, згідно якої посилення пасивного витоку Са2+ з ЕР та зменшення
активності Са2+-АТФаз лежать в основі зменшення в ЕР кількості Са2+,
здатного вивільнятися при стимуляції, що призводить до пригнічення
слиновиділення, а виявлене підвищення чутливості холінорецепторів та
споріденості Са2+-АТФази ЕР до ATP є природніми протекторними
механізмами для компенсування діабет-індукованих порушень у клітинах
слинних залоз.

Теоретичне та практичне значення роботи. Одержані результати мають як
фундаментальне, так і практичне значення. Комплексний аналіз механізмів
підтримання гомеостазу кальцію розширює розуміння шляхів регуляції
функціонування ацинарних клітин підщелепної слинної залози та є новим
кроком до з’ясування причин виникнення патологій слинних залоз.
Практична цінність одержаних результатів полягає в тому, що вони вперше
вказують на те, що порушення функціонування ацинарних клітин корелює із
змінами кальцієвого гомеостазу. Отримані в роботі дані та їх
інтерпретація можуть стати основою для теоретичних та практичних
рекомендацій при розробці методів терапії та фармакологічної корекції
порушення функціонування слинних залоз. На основі одержаних результатів
є підстави вважати, що потужні агоністи холінорецепторів та речовини,
які модулюють їх активність, можуть бути використані для корекції
ксеростомічних станів у хворих на діабет. Отримані дані використовуються
при викладанні загальних курсів „Фізіологія людини і тварин”,
„Біофізика” та спецкурсів „Фізіологія травлення”, „Клітинні механізми
регуляції обміну речовин” у Львівському національному університеті імені
Івана Франка.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно сформулювала мету та
завдання дослідження, розробила методики вимірювання сумарного вмісту
кальцію з одночасною реєстрацією рівня секреторної активності,
ізолювання ацинарних клітин, реєстрації концентрації Са2+ в цитоплазмі
та ЕР цих клітин. Дисертант самостійно виконувала основну частину
експериментів, здійснювала аналіз, статистичне опрацювання й
узагальнення результатів. Разом із к.б.н Вац Ю.О розробила методики
одержання фракції мембранних везикул клітин слинної залози та визначення
у ній активності Са2+-АТФаз ПМ та ЕР. Разом з к.б.н. Копач О.В.
налагодила методику хімічної пермеабілізації та прямої реєстрації
концентрації Са2+ в ЕР ацинарних клітин. Деякі експерименти були
проведені разом з іншими спіавторами опублікованих робіт – молодшим
науковим співробітником к.б.н. Кругликовим І.А., старшим науковим
співробітником к.б.н. Півневою Т.А., провідним науковим співробітником
Інституту фізіології ім. О. Богомольця д.б.н. Войтенко Н.В., к.б.н. Вац
Ю.О., к.б.н. Копач О.В.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень та основні
положення дисертації були представлені на: школі-семінарі “Мембрани і
сигнали” (Київ, 2000 р.), З’їзді Британського фізіологічного товариства
(Ліверпуль, 2001), 23му Міжнародному Конгресі фізіологічних наук
(Крайсчерч, 2001 р.), 4тій Конференції Чеського Нейрофізіологічного
товариства (Прага, 2001 р.), Міжнародному симпозіумі “Внутрішньоклітинна
сигналізація в рослинних та тваринних системах” (Київ, 2001 р.), 16му
З`їзді Українського фізіологічного товариства (Вінниця, 2002 р.), III
з’їзді Українського біофізичного товариства (Львів, 2002 р.), 47му
з’їзді Біофізичного товариства (Сан-Антоніо, 2003 р.), 33му з’їзді
Товариства Нейронаук (Новий Орлеан, 2003), 3му Конгресі FEPS (Ніцца,
2003 р.), науковій конференції “Сечєнов та Одеська школа фізіологів”
(Одеса, 2004 р.), Міжнародній школі-семінарі IBRO “Receptors, Channels,
Messengers” (Ялта, 2004 р.), І Українській конференції “Прoблеми
бiологiчної і медичної фізики” (Xapків, 2004 р.), регіональному
біофізичному з’їзді (Zrece, Словенія, 2005 р.), 25му Міжнародному
фізіологічному конгресі (Сан-Дієго, 2005 р.), XV Міжнародному
біофізичному конгресі (Монтпельєр, 2005 р.), семінарах кафедри
фізіології людини і тварин та звітних конференціях Львівського
національного університету імені Івана Франка (2002-2005 рр.), а також
на міжкафедральному семінарі біологічного факультету Львівського
національного університету імені Івана Франка та засіданні сектору
молекулярної фізіології Інституту фізіології ім.О.Богомольця у липні
2005 р.

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 24 статті у фахових
наукових журналах та 29 тез доповідей у матеріалах наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 381
сторінках друкованого тексту і складається з таких розділів: „Вступ”,
„Огляд літератури”, „Методи досліджень”, „Результати досліджень”,
„Обговорення результатів досліджень”, „Висновки” та „Список використаних
джерел”, який містить 510 посилань. Робота ілюстрована 118 рисунками та
8 таблицями.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Визначення показників слиновиділення підщелепною слинною залозою щурів.
Експерименти проводили на щурах-самцях лінії Вістар у віці 1–1,5 міс.
Відбір слини проводили за модифікованою методикою, запропонованою для
привушної слинної залози щурів (Kawaguchi еt al., 2000). Перед початком
експерименту тварину наркотизували внутрішньо-очеревною ін’єкцією
кетаміну та лістенону. Слину, яка виводилась протоками підщелепної
слинної залози, відбирали за допомогою мікроканюлі, впритул підведеної
до проток залози. Виділення слини оцінювали за швидкістю слиновиділення,
б-амілолітичною активністю слини, вмісту у ній загального білка.

Ізолювання ацинарних клітин підщелепної слинної залози. Перед початком
гострого експерименту тварину наркотизували ефіром і проводили швидку
декапітацію. Ацинарні клітини підщелепної слинної залози ізолювали
шляхом піпетування тканини залози після її ферментативної обробки у
базовому зовнішньоклітинному розчині, який містив колагеназу (тип І, 320
од/мг), протягом 25-30 хв (35 С). Базовий зовнішньоклітинний розчин
містив (у мМ): NaCl – 140; KCl – 4,7; CaCl2 – 1,3; MgCl2 – 1,0;
гідроксиетилпіперазин-N-2-етансульфонову кислоту (HEPES) – 10; глюкоза –
10; рН 7,4.

Визначення сумарного вмісту кальцію у клітинах та секреції ними білка.
Сумарний вміст кальцію в ацинарних клітинах визначали фотоколориметрично
з використанням металохромного барвника арсеназо ІІІ. Принцип методу
полягає у тому, що іони Са2+ утворюють з арсеназо III комплекс синього
кольору, інтенсивність забарвлення якого еквівалентна концентрації Са2+
у пробі. Вміст кальцію виражали в наномолях у перерахунку на 1 мкг
білка, який визначали за методом Лоурі (Lowry et al., 1951). Секрецію
загального білка ацинарними клітинами виражали у процентах від сумарного
вмісту білка у гомогенаті та супернатанті.

Реєстрація [Са2+]i в ацинарних клітинах. [Са2+]i в ацинарних клітинах
реєстрували з використанням високоафінного флуоресцентного Са2+ барвника
фура-2/АМ. Для завантаження барвника суспензію клітин інкубували у
базовому розчині, який містив 5 мкМ фура-2/АМ, протягом 30-40 хв при 35
С, після чого відмивали базовим розчином і додатково інкубували протягом
30 хв для повної деетерифікації барвника. Для розрахунку [Ca2+]i
використовували формулу Грінкевича (Grynkiewicz et al., 1985): [Ca2+]i =
Kd · B · (R – Rmin) / (Rmax – R).

Значення констант, одержані шляхом калібрування, становили: Rmin=0,9,
Rmax=19, В=26. Параметр Kd становив 224 нМ (Grynkiewicz et al., 1985).

Хімічна пермеабілізація ацинарних клітин. Для пермеабілізації ацинарних
клітин використовували детергенти дигітонін та (-есцин. Концентрацію
детергентів та час інкубування клітин з ними підбирали експериментально.
Детергенти вносили до розчину, складом наближеного до
внутрішньоклітинного (НДВ), який містив (у мМ): KCl – 120; NaCl – 20;
MgSO4 – 2; HEPES – 10; АТР – 3; EGTA – 1; CaCl2 – 0,75; рН 7,2.
Концентрація іонізованого Са2+, розрахована за допомогою програми
“WinMAXC v2.10” (Chris Patton, Stanford University), у такому розчині
НДВ становила ~100 нМ. Тривалість інкубування клітин з дигітоніном (20
мкг/мл) становила 2-5 хв у всіх експериментах за виключенням окремо
згадуваних з (-есцином (40 мкг/мл) – 3-6 хв. Пермеабілізацію клітин
контролювали візуально з використанням трипанового синього (0,4 %) під
світловим мікроскопом MP-3, а у випадку маг-фура-2/АМ-зафарбованих
клітин оцінювали за падінням флуоресцентного сигналу Са2+-барвника.

Реєстрація [Ca2+]ЕР в ацинарних клітинах. Для моніторингу концентрації
Са2+ в ЕР ацинарні клітини завантажували низькоафінним флуоресцентним
Са2+ барвником маг-фура-2/АМ. Фарбування клітин проводили протягом 45-60
хв при 37 С, що забезпечує компартменталізацію барвника у
внутрішньоклітинних органелах (Hofer & Machen, 1993). Для вимивання
цитоплазматичної частки барвника проводили хімічну пермеабілізацію
клітин. Зміни [Ca2+]ЕР виражали як співвідношення інтенсивності
флуоресцентного сигналу маг-фура-2/АМ на довжині хвилі збудження 360 нм
до такої на 390 нм (F360/F390), яке прямо пропорційне змінам [Ca2+]ЕР
(Hofer & Machen, 1994).

Одержання фракції мембранних везикул. Мембранні везикули підщелепної
слинної залози щурів одержували методом диференційного центрифугування.
Залозу гомогенізували у буферному розчині, який містив (мМ): сахароза –
250,0; ЕДТА – 1,0; трис-Сl – 10,0 (рН=7.1, t=4С); оуабаїн – 1,0; NaN3 –
1,0. Гомегенат відцентрифуговували (10 хв при 1600 g та 30 хв при 40000
g), кінцевий супернатант видаляли, а осад розводили буферним розчином та
зберігали при t=-40оС (Hurley & Martinez 1985). Топологію мембранних
фрагментів визначали після їх обробки розчином дигітоніну (0,1 %).
Електронно-мікроскопічно показано, що фракція мембранних фрагментів
підщелепної слинної залози представлена замкнутими в площині везикулами
діаметром 0,5±0,04 мкм (n=89).

Визначення активності Са2+-АТФаз. Аліквоти мембранних везикул переносили
у розчин НДВ, який містив в мМ: NaCl – 50,0; KCl – 100,0; трис-Сl – 20,0
(рН=7.4, t=37 С); MgCl2 – 3,0; CaCl2 – 0,01. АТФ-гідролазну реакцію
ініціювали додаванням 3 мМ АТФ і через 1,5 хв реакцію зупиняли
додаванням 200 мкл 20% трихлороцтової кислоти. Вміст пробірок
відцентрифуговували (10 хв, 1600 g) і в супернатанті фотоколориметрично
визначали концентрацію Рі (Nakamura et al., 2002). Вміст білка
мембранного препарату визначали за методом Лоурі (Lowry, 1951).
Активність Са2+-АТФаз розраховували як різницю між АТФазною активністю в
Са2+-вмістному та безкальцієвому середовищах. Сумарну Са2+-АТФазну
активність розділяли на тапсигаргін-нечутливу (Са2+-АТФаза ПМ) та
-чутливу (Са2+-АТФаза ЕР) складові. Активність АТФаз виражали у мкмоль
Рі/год·мг білка.

Метод індукції експериментального діабету. Діабет викликали
внутрішньоочеревинною ін’єкцією стрептозотоцину (СТЗ), розчиненого в
0,9% NaCl (80 мг/кг маси тіла тварини). СТЗ-ін’єктовані та контрольні
тварини того ж віку утримували на однаковій дієті. Тварин
використовували в експерименті через 3-5 тижнів після ін’єкції СТЗ.
Концентрація глюкози в плазмі крові здорових тварин становила 5-9 мМ, у
хворих на стрептозотоцин-індукований діабет – 14-28 мМ.

Метод електронної мікроскопії. Ізольовані ацинарні клітини фіксували (12
год, 20оС) у суміші глютаральдегіду (2%) та параформальдегіду (2%),
приготовлених на 0,1 М фосфатному буфері (рН=7,2-7,4). Дофіксацію
проводили в 1% OsO4 у фосфатному буфері (1 год, 20оС). Фіксовані
клітини тричі промивали буферним розчином по 10 хв. Зразки зневоднювали
у зростаючих концентраціях спиртів та заливали в епоксидну смолу
(аралдит) при поступовій заміні ацетону епоксидною смолою. Ультратонкі
зрізи (60-70 мкм) отримували за допомогою ультрамікротому ІІІ (LKB,
Швеція) і контрастували у розчині нітрату свинцю та уранілацетату.
Дослідження проводили на електронному мікроскопі JEM 100 (JEOL, Японія)
при 80 кВ із збільшенням 5000-40000.

Статистична обробка результатів. Оригінальні записи [Ca2+]і та [Ca2+]ЕР
опрацьовували за допомогою програм Tida 5.0 (Німеччина). Статистичне
опрацювання результатів здійснювали з використанням Microsoft Excel,
аналіз змін співвідношення F360/F390 проводили за допомогою Microcal
Origin. Достовірність змін встановлювали за t-критерієм Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

1. Са2+ сигналізація при активації холінорецепторів. Секреція рідинного
компоненту слини знаходиться під переважаючим парасимпатичним контролем,
який реалізується медіатором ацетилхоліном (АХ). Зв’язування АХ із
холінорецепторами ПМ призводить до підвищення [Са2+]і за рахунок
вивільнення Са2+ з депо та входу ззовні (Petersen et al., 2005). Однак,
незважаючи на інтенсивне дослідження окремих процесів, які
опосередковують [Ca2+]і сигналізацію в ацинарних клітинах, механізми їх
взаємодії залишаються нез’ясованими.

Характеристики АХ-індукованих [Ca2+]i транзиєнтів. В стані спокою
[Ca2+]i в ацинарних клітин підщелепної слинної залози становаить 95(4 нМ
(n=124). Аплікація (10 с) до клітин АХ (5 мкМ) викликала [Ca2+]i
транзиєнти з амплітудою 215±22 нМ (n=124, рис. 1А). Амплітуда другого
АХ-індукованого [Ca2+]i транзиєнту була меншою за першу на 15%, а при
наступних прикладаннях АХ — не змінювалась (n=8), що свідчить про
відсутність швидкої десинситизації холінорецепторів. Розрахована ЕС50
для АХ складала 0,83(0,06 мкМ (рис. 1В,Г), причому АХ викликав глобальне
підвищення [Ca2+]i незалежно від діючої концентрації (рис. 1В).
Аплікація АХ на фоні атропіну (10 мкМ) приводила до зменшення [Ca2+]i
транзиєнтів на 79±5% (n=8, p<0.001), що свідчить про основний вклад у їх формування мускаринових (М) холінорецепторів. При тривалій аплікації АХ (5 мкМ, 5 хв) виникав [Ca2+]i транзиєнт тієї ж амплітуди, що й при короткочасному прикладанні, однак не спостерігалось відновлення [Ca2+]i до вихідного рівня протягом дїї АХ (n=5, рис. 1Б). Новий стаціонарний рівень [Ca2+]i в присутності АХ може відображати надходження в Са2+ цитоплазму через депо-керовані Са2+ канали ПМ. Ряд ефективності агоністів М-холінорецепторів можна розташувати у наступній послідовності: АХ > карбахолін (КХ) > пілокарпін. Розрахована ЕС50 для
КХ (негідролізуємого аналогу АХ) складала 4,7(0,6 мкМ.

Механізми формування АХ-індукованих [Ca2+] транзиєнтів. Для багатьох
типів незбудливих клітин доведено, що при активації М-холінорецепторів
формування висхідної фази [Ca2+]і транзиєнтів забезпечується тільки за
рахунок вивільнення Са2+ із депо ЕР (Ambudkar, 2001; Clapham et al.,
2001). З метою вивчити вклад у формування амплітудно-часових параметрів
АХ-індукованих [Ca2+]і транзиєнтів саме процесу вивільнення Са2+ із депо
ЕР порівняно із входом Са2+ ззовні, ми прикладали до клітин АХ за умов
безкальцієвого середовища (1 мМ ЕГТА). З’ясувалось, що на відміну від
кальційвмісного середовища, внаслідок багаторазового прикладання АХ
відбувалось значне зменшення амплітуди АХ-індукованого [Ca2+]і
транзиєнтів та їх зникнення після 4-5 прикладань АХ (рис. 2А).
Довготривала аплікація АХ (5 мкМ, 5 хв) за умов безкальцієвого
середовища призводила до появи [Ca2+]і транзиєнту, проте на відміну від
такого у Са2+-вмісному розчині, спостерігалось відновлення початкового
рівня [Ca2+]і навіть у присутності АХ (рис. 2Б). Час напівспаду такого
[Ca2+]і транзиєнту складав 36±7 с (n=15). Таким чином, за умов
неможливості перезаповнення депо ЕР АХ здатний повністю спустошувати
доступний для вивільнення запас Са2+ в ЕР. Для оцінки вкладу
перезаповнення депо Са2+ у АХ-індуковані [Ca2+]і транзиєнти ми блокували
Са2+-АТФазу ЕР (SERCA), яка є єдиною системою транспорту Са2+ в ЕР
(Putney, 1985; Berridge, 2004). Для цього ми використовували блокатори
SERCА: реверсивний – циклопіазонова кислота (СРА) та незворотний –
тапсигаргін (TG). Ми виявили, що обидва блокатори викликали зростання
[Ca2+]i ~100 нМ (n=10), яке характеризувалось виходом на плато та
зберігалось протягом усього часу присутності блокатора. В присутності
СРА АХ-індуковані [Ca2+]i транзиєнти зменшувались: перший на 31±8%,
другий на 56±9%, а наступна дія АХ не викликала змін [Ca2+]і (n=8).
Після відмивання СРА АХ-індуковані [Ca2+]i транзиєнти відновлювались до
початкової амплітуди. При використанні незворотнього блокатора TG було
виявлено зміни аналогічного характеру, за виключенням більш вираженого
пригнічення амплітуди першого АХ-індукованого [Ca2+]і транзиєнту (на
75±8%, n=8, рис. 3Б). Отже, переважний внесок у формування
АХ-індукованих [Ca2+]і відповідей належить процесу вивільнення Са2+ з
ЕР.

За умови що вивільнення Са2+ з депо ЕР є єдиним механізмом формування
[Ca2+]і відповідей, не повинно було б спостерігатись відмінностей
абсолютної амплітуди та форми АХ-індукованих [Ca2+]і транзиєнтів,
викликаних у Са2+-вмісному та безкальцієвому середовищах.

Однак, виявлено: і) амплітуда АХ-індукованої [Ca2+]і відповіді в
безкальцієвому розчині зменшувалась на 36±9% (n=19; p<0,001, рис. 4А); іі) час напівзростання АХ-індукованого [Ca2+]і транзиєнту складав 1,6±0,2 с та 1,1±0,1 с в Са2+-вмісному та безкальцієвому середовищах відповідно (n=19; p<0,001); ііі) час напівспаду складав 12±1 с та 6,2±0,6 с відповідно (рис. 4Б). Виявлені відмінності можуть бути зумовлені тільки активацією входу Са2+ ззовні, єдиним механізмом якого є депо-керований вхід Са2+ (Putney, 1986). З метою візуалізувати такий вхід Са2+ ми прикладали АХ (5 мкМ) у безкальцієвому середовищі, а після завершення АХ-індукованої [Ca2+]і відповіді додавали до зовнішньоклітинного розчину Са2+ (2 мМ). При цьому відбувалось швидке зростання [Ca2+]і з амплітудою 97±13 нМ та часом напівзростання 19,7(4,2 с (n=12, рис.5). Підсумовуючи, ми вважаємо, що хоча ІnsP3-індуковане вивільнення Са2+ з ЕР є первинним процесом, який ініціює появу АХ-індукованого [Ca2+]i транзиєнту, однак, його амплітудно-часові параметри визначаються суперпозицією двох процесів: вивільнення Са2+ з ЕР та більш повільного депо-керованого надходження Са2+ ззовні, яке активується вже під час висхідної фази [Ca2+]i транзиєнту. Вклад мітохондрій у регулювання АХ-індукованої [Ca2+]і сигналізації. Відомо, що мітохондрії (МХ) також є депо Са2+, однак захоплення Са2+ низькоафінним Са2+-уніпортером ізольованих МХ активується лише при [Ca2+] ( 1 мкМ (Gunter et al., 2004). Враховуючи це, вклад МХ в АХ-індуковану [Ca2+]і сигналізацію та взаємодія МХ з іншими механізмами формування [Ca2+]і сигналів є незрозумілим. Для пригнічення захоплення Са2+ МХ ми використовували СCCP (10 мкМ) – протонофор, який порушує потенціал внутрішньої мембрани МХ, або ротенон (1 мкМ) – інгібітор комплексу І ланцюга транспорту електронів в комбінації з олігоміцином (1 мкМ) – інгібітором АТФ-синтази. Нами виявлено, що припинення Са2+-акумулюючої функції МХ призводить до зростання [Ca2+]і з амплітудою ~37 нМ, а блокування Na+/Ca2+-обмінника МХ за допомогою CGP 37157 (20 мкМ) на фоні СССР не призводить до змін [Ca2+]i. Отже, в стані спокою МХ містять певну кількість Са2+, єдиним механізмом вивільнення якого є Na+/Ca2+-обмінник. Аплікація АХ (5 мкМ) на фоні блокування захоплення Са2+ МХ призводить до зменшення амплітуди [Ca2+]i транзиєнтів на 34(6% (рис. 6А) та часу їх напівзростання на 59(12% (p<0,001; n=24). З метою з’ясувати, чи здійснюють МХ захоплення Са2+ під час висхідної фази АХ-індукованого [Ca2+]i транзиєнту ми прикладали СССР одразу після досягнення піку [Ca2+]i транзиєнту. Виявилось, що за таких умов виникає додаткове транзиєнтне підвищення [Ca2+]i з амплітудою 147(32 нМ (n=15, рис. 6Б) в Са2+-вмісному та 38(9,6 нМ (n=15, рис. 6В) в безкальцієвому середовищі. Таке підвищення [Ca2+]i свідчить про потужне захоплення Са2+ МХ вже під час висхідної фази [Ca2+]i. Менш виражене СССР-індуковане підвищення [Ca2+]i на спаді АХ-індукованого [Ca2+]i транзиєнту у безкальцієвому розчині ми пов’язуємо із відсутністю за цих умов входу Ca2+ ззовні. Оскільки АХ активує депо-керований вхід Са2+, ми припускаємо, що МХ розташовані близько до SOC каналів, що дає їм змогу захоплювати Са2+ безпосередньо з-під ПМ. З іншого боку, за умов відсутності захоплення Са2+ МХ порушується здатність АХ викликати [Ca2+]i транзиєнт. Отже, МХ відіграють важливу роль у формуванні амплітудно-часових характеристик АХ-індукованих [Ca2+]i відповідей, що обумовлено їх здатністю захоплювати як Са2+, що входить ззовні, так і регулювати InsP3-залежне вивільнення Са2+ із депо ЕР. 2. Роль пуринергічних рецепторів у [Ca2+]i сигналізації. Незважаючи на те, що секреція рідинного компоненту слини знаходиться під переважаючим парасимпатичним контролем, існують дані про ймовірну роль зовнішньоклітинних нуклеотидів у регулюванні функціонування ацинарних клітин слинних залоз (Soltoff et al. 1998; Turner et al. 1999). Вклад Р2Х та Р2Y рецепторів у формуванні АТФ-індукованих [Ca2+]i транзиєнтів. Доведено, що у клітинах підщелепної слинної залози експресуються іонотропні Р2Х та метаботропні Р2Y нуклеотидні рецептори (Park & Turner 1998, Bruce et al. 2005), проте їх вклад у [Ca2+]i сигналізацію залишається нез’ясованим. Ми показали, що аплікація (10 с) АТФ (100 мкМ) у Са2+-вмісному середовищі викликала [Са2+]i транзиєнти з амплітудою 115±20 нМ (n=18), які не десенситизувались при кількаразовій дії АТФ. Розраховане ЕС50 для АТФ становило 130±36 мкМ (рис. 7А,Б). Прикладання АТФ (100 мкМ) на фоні блокатора іонотропних Р2Х рецепторів РРАDS (50 мкМ) призводило до зменшення амплітуди [Ca2+]і транзиєнту на 72±7% (n=9; p<0,05; рис.7В). Аплікація АТФ у безкальцієвому середовищі та при блокуванні SERCA (за неможливості перезаповнення депо ЕР) призводила до появи [Ca2+]і транзиєнтів з амлітудою на 65±7 % (n=10, p<0,001) нижчою. Прикладання ж АТФ (100 мкМ) після попереднього спустошення Са2+-депо ЕР внаслідок 20-ти хв дії TG (3 мкМ) у безкальцієвому середовищі не супроводжувалось змінами [Ca2+]і (n=10). Одержані дані свідчать про вклад у формування АТФ-індукованих [Са2+]і сигналів як Р2Х, так і P2Y рецепторів. Активація кожного із цих рецепторів призводить до підвищення [Са2+]і, однак основний вклад у амплітуду АТФ-індукованих [Са2+]і сигналів вносять Р2Х рецептори, а P2Y-опосередковане підвищення [Са2+]і є менш вираженим і складає ~ 35 %. Вклад аденонозинових (Р1) рецепторів у [Ca2+]i сигналізацію. Лімітуючим фактором активності АТФ є її швидкий гідроліз, який здійснюється екто-АТФазою, ідентифікованою у ПМ клітин підщелепної слинної залози (Murphy et al., 1994). При гідролізі АТФ швидко розпадається до АДФ ? АМФ ? аденозину (Gordon, 1986). Аденозин активує окремий підтип пуринорецепторів – Р1, вклад яких у процеси [Ca2+]i сигналізації нез’ясований. Ми виявили, що аденозин (1 мкМ) не викликає достовірних змін [Ca2+]і (n=5), проте ефективно потенціює [Ca2+]і транзиєнти, викликані активацією М-холінорецепторів. Так, прикладання АХ (200 мкМ) разом з аденозином (1 мкМ) викликає зростання амплітуди [Ca2+]і транзиєнтів на 43±12% (n= 6; p<0,05) порівняно з дією лише АХ (рис. 8А). Прикладання АХ (500 нМ) разом з аденозином викликало потенціацію АХ-індукованого [Ca2+]і транзиєнту на 58±7% (n=9, p<0,05). Однак, ми не спостерігали потенціюючого ефекту аденозину на [Ca2+]і транзиєнти, викликані субмаксимальною концентрацією АХ (рис. 8А). Потенціюючий ефект аденозину не залежав від способу активації М-холінорецепторів, оскільки спостерігався також при дії КХ. Зокрема, амплітуда [Ca2+]і транзиєнту, викликаного КХ (5 мкМ) на фоні аденозину, зростала на 26±6% (n=7, p<0,001, рис. 8Б). Потенціюючий ефект аденозину відтворювався форсколіном (активатором аденілат циклази (АЦ)). Так, аплікація АХ (500 нМ) на фоні форсколіну (2 мкМ) призводила до збільшення амплітуди АХ-індукованого [Ca2+]і транзиєнту на 32±5% та маскувала ефект аденозину (n=5, p<0,001, рис. 8В). Отже, активація Р1 рецепторів ацинарних клітин підщелепної слинної залози призводить до модулювання PLC–InsP3 сигнального шляху, яке, найбільш ймовірно, опосередковане активацію АЦ. 3. Механізми функціонування внутрішньоклітинних депо Са2+. Механізми підтримання гомеостазу кальцію у внутрішньоклітинних депо остаточно нез’ясовано, що обумовлено складністю проведення таких досліджень через вибіркову проникність ПМ. З метою вивчити властивості та регуляцію функціонування Са2+ депо в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози ми розробили методику для прямої реєстрації амплітудно-часових параметрів змін концентрації іонізованого Са2+ в люмені ЕР ([Ca2+]ЕР) у хімічно пермеабілізованих клітинах, завантажених низькоафінним Са2+ індикатором маг-фура-2/АМ, який акумулюється у депо ЕР. Тапсигаргін-чутлива та -нечутлива складові Са2+ депо ЕР. Питання щодо функціональної організації депо Са2+ на сьогодні залишається відкритим. Для деяких типів клітин показано, що основне депо Са2+ в ЕР утворене просторово розмежованими одиницями (Golovina & Blaunstein, 1997). Для виявлення можливої гетерогенності депо Са2+ у ацинарних клітинах досліджуваної залози ми підібрали умови для максимального спустошення депо ЕР та АХ. При дослідженні динаміки зміни сумарного вмісту кальцію виявлено, що кількість кальцію, який вивільняється при блокуванні SERCA тапсигаргіном (3мкМ) протягом 20 хв, складає ~30% від загального його вмісту у депо. Для з’ясування чи мішенню дії TG і АХ є одне і те ж депо Са2+, ми спустошували депо TG, після чого інкубували клітини з АХ. Виявилось, що 10-ти хв дія АХ (5 мкМ) викликала додаткове зменшення сумарного вмісту кальцію на 27(7% (р<0,01; n=9), яке повністю елімінувалось блокатором ІnsР3-чутливого вивільнення Са2+ гепарином (300 мкг/мл). За допомогою флуоресцентної реєстрації [Ca2+]і нами також зареєстровано АХ-індуковані [Ca2+]і транзиєнти після 20-ти хв інкубації клітин з TG (рис. 4В). Останнє свідчить про те, що TG не повністю спустошує ІnsР3-чутливе депо Са2+, що підтверджується шляхом прямої реєстрації [Ca2+]ЕР. Зокрема, виявлено, що: і) інгібітор TG-нечутливої Са2+-АТФази – ванадат (Pinton et al., 1998) викликав додаткове зменшення [Ca2+]ЕР на фоні TG; іі) АХ (5 мкМ) також викликав додаткове зменшення [Ca2+]ЕР на фоні TG, яке не спостерігалось на фоні ванадату. Отже, в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози наявне TG-чутливе та -нечутливе Са2+ депо, обидва з яких є ІnsР3-залежні. Властивості ІnsР3-чутливого депо Са2+. Основний вклад у формування [Ca2+]і сигналів при активації М-холінорецепторів належить InsP3-індукованому вивільненню Ca2+ з ЕР (Petersen, 1996; Fedirko et al., 2001), проте супроводжуючі його процеси [Ca2+]ЕР сигналізації вивчені недостатньо. Для дослідження цього ми провели реєстрацію змін [Са2+]ЕР при активації М-холінорецепторів ПМ АХ та при дії екзогенного InsP3. Ми показали, що АХ (5 мкМ) викликав транзиєнтне вивільнення Са2+ з ЕР, що виражалось у зменшенні співвідношення F360/F390 на 0,1±0,02 (n=23). Екзогенний ІnsP3 також викликав транзиєнтне зменшення [Ca2+]ЕР з ЕС50=1,3(0,21 мкМ (n=23, рис. 9А,Б). Викликане АХ та InsP3 зменшення [Ca2+]ЕР повністю пригнічувалось гепарином (300 мкг/мл), а отже, опосередковане активацією тільки InsP3-рецепторів. Ми також показали, що InsP3-чутливе вивільнення Са2+ із ЕР потенціюється Са2+ в фізіологічних концентраціях (100-400 нМ) та модулюється АТФ. Зокрема, АТФ в низьких концентраціях (1 мМ) потенціював InsP3-індуковане зменшення [Ca2+]ЕР на 27± 4,6% (n=6, p<0,01), а у високих (20 мМ) – пригнічував на 15±2,6% (n=6, p<0,05). Ми також виявили, що сумісна дія InsP3 (2 та 20 мкМ) та кофеїну (4 мМ) призводила до потенціювання [Са2+]ЕР транзиєнтів на 65±12% (р<0,01; n=8) та 41±10% (n=7, р<0,05) відповідно (рис. 10). Ми вважаємо, що можливим механізмом такого потеціювання є активація кофеїном ріанодинових рецепторів (RYR) мембрани ЕР. Ідентифікація ріанодин-чутливого вивільнення Ca2+ з ЕР. У клітинах підщелепної слинної залози молекулярно-біологічними методами виявлено експресію RyR (Giannini et al., 1995; Lee et al., 1997), проте здатність ріанодинових рецепторів здійснювати вивільнення Са2+ із ЕР у досліджуваних клітинах не виявлено. Для індукування вивільнення Са2+ через канал RyR ми використовували кофеїн (Sitsapesan & Williams, 1990). Ми виявили здатність кофеїну викликати транзиєнтне зменшення [Ca2+]ЕР у пермеабілізованих клітинах з ЕС50 7,3(1 мМ (рис. 11А), яке було нечутливим до гепарину та дзвоноподібно регулювалось Са2+ (з максимумом при фізіологічних концентраціях 100-400 нМ). Ріанодин у високих концентраціях (100 мкМ, рис.11Б) блокував кофеїн-індуковане вивільнення Са2+, а в середніх (10 мкМ) – переводив канал RYR в напіввідкритий стан (n=6). Таким чином, шляхом прямої реєстрації [Ca2+]ЕР ми показали, що в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози функціонують RyR, активація яких призводить до вивільнення Ca2+ з ЕР. Цитоплазматична [Cа2+]і сигналізація при активації RYR. Виявлене нами на пермеабілізованих клітинах кофеїн-індуковане вивільнення Ca2+ із ЕР повинно супроводжуватись відповідним ростом [Cа2+]і. Однак нами, як і іншими авторами (Seo et al., 1997), не було виявлено достовірних змін [Ca2+]i в інтактних клітинах при аплікації 10-40 мМ кофеїну (рис. 12А). Відсутність [Ca2+]i відповіді на кофеїн не може бути зумовлена відсутністю в ЕР кальцію, здатного до вивільнення, оскільки наступна аплікація АХ викликала [Ca2+]i транзиєнт значної амплітуди (рис. 12А). Можливою причиною відсутності змін [Ca2+]i при кофеїн-індукованому вивільненні Са2+ з ЕР є його швидке захоплення внутрішньоклітинними органелами, розташованими безпосередньо біля RyR. Роль МХ та Са2+-АТФаз у кофеїн-індукованій [Ca2+]i сигналізації. Ми виявили, що аплікація кофеїну (30 мМ) на фоні припинення захоплення Са2+ МХ призводила до зростання [Ca2+]i на 48(4 нМ (n=8, p< 0.001, рис. 12Б). Однак таке зростання [Ca2+]i було нетранзиєнтним, на відміну від відповідного зменшення [Ca2+]ЕР, що свідчить про вклад додаткових систем в формування кофеїн-індукованого [Ca2+]i транзиєнту. Для виявлення вкладу Са2+-АТФази ПМ ми використовували блокатор широкого спектра Са2+-АТФаз – ванадат, який у низьких концентраціях (10 мкМ) эфективно блокує Са2+-АТФазу ПМ (Carafoli, 1991). Виявилось, що ванадат викликає нетранзиєнтне підвищення [Ca2+]i на 25(5 нМ (n=11), прикладання ж кофеїну на фоні ванадату не супроводжувалось подальшими змінами [Ca2+]i, проте наступна аплікація СССР (10 мкМ) викликала потужне транзиєнтне зростання [Ca2+]i на 184(39 нМ (n=5, p<0.001). Для дослідження вкладу SERCA, ми використовували її блокатор - TG (3 мкМ). Прикладання кофеїну на фоні TG не викликало достовірних змін [Ca2+]i, однак наступна аплікація СССР (10 мкМ) призводила (як і у випадку блокування Са2+-АТФази ПМ) до потужного транзиєнтного зростання [Ca2+]i на 191(49 нМ (n=5, p<0.01). Отже, блокування тільки Са2+-АТФази ПМ чи ЕР не відображається на процесі швидкого захоплення Са2+, а Са2+, який вивільняється із RyR захоплюється МХ. На основі цього ми припустили, що у визначенні кінетики кофеїн-індукованої [Ca2+]i відповіді беруть участь одночасно декілька Са2+-транспортних систем. Для перевірки цієї гіпотези ми аплікували до ацинарних клітин кофеїн на фоні попарного блокування МХ та Са2+-АТФази ПМ чи ЕР. Виявилось, що аплікація СССР (10 мкМ) на фоні блокування Са2+-АТФази ПМ ванадатом (10 мкМ) приводить до зростання [Ca2+]i на 79(19 нМ, а наступне прикладання кофеїну (30 мМ) супроводжується виникненням [Ca2+]i транзиєнта з амплітудою 176(68 нМ (n=6, p<0.001, рис. 13А). В свою чергу, прикладання СССР на фоні TG викликало зростання [Ca2+]i на 193(39 нМ, а наступна аплікація кофеїну (30 мМ) також викликала появу транзиєнтної [Ca2+]i відповіді з амплітудою 137(40 нМ (n=6, p<0.001, рис. 13Б). Отже, у ацинарних клітинах підщелепної слинної залози наявні функціонально активні RYR, причому Са2+, який вивільняється при їх активації захоплюється в основному МХ, тоді як Са2+-АТФази ПМ та ЕР відповідають за визначення форми [Ca2+]i сигналу. Механізм пасивного вивільнення Са2+ із ЕР. В стані спокою вміст Са2+ всередині депо ЕР визначається балансом між активним захопленням Са2+ SERCA та його пасивним вивільненням через “канали витоку” (Hofer et al., 1996). Наявність пасивного витоку можна візуалізувати шляхом блокування компенсаторного захоплення Са2+ SERCA. Пригнічення захоплення Са2+ SERCA можна досягнути за умов: i) перфузії клітин безкальцієвим НДВ-розчином для пригнічення прямого (але не реверсивного) режиму SERCA; ii) блокування обох режимів роботи SERCA тапсигаргіном. Найбільш виражене зменшення F360/F390 з амплітудою 0,113±0,036 (n=5) та лінійною швидкістю 0,68Ч10-2 хв-1 було зареєстроване при активації реверсивного режиму роботи SERCA шляхом перфузії клітин безкальцієвим розчином (рис. 14А). За умов блокування обох режимів роботи SERCA тапсигаргіном ми виявили залежність амплітуди та швидкості пасивного витоку від наявності Са2+ в омиваючому ЕР розчині. Зокрема, у Са2+-вмісному (100 нМ) розчині НДВ, який містило TG, [Ca2+]ЕР зменшувалась на 0,75±0,037 (n=8) зі швидкістю 0,4Ч10-2 хв–1 (n=8, рис. 14А). У безкальцієвому середовищі таке зменшення було більш вираженим (на 0,96±0,017) і швидким (0,84Ч10-2 хв–1; n=10, рис. 14А). Це свідчить про наявність SERCA-залежного (~35%) та -незалежного (~65%) компонентів пасивного витоку Са2+, причому SERCA-незалежний компонент пропорційний градієнту [Са2+]. Останнє може свідчити на користь того, що пасивний витік кальцію здійснюється через неселективну пору. Враховуючи, що SERCA-незалежне вивільнення Са2+ виявилось нечутливим до інгібіторів InsP3- та ріанодинових рецепторів - гепарину (300 мкг/мл) та рутенієвого червоного (10 мкМ), воно не опосередковується жодним із зазначених механізмів вивільнення Са2+ із ЕР. З іншого боку, пасивне вивільнення Са2+ індукувалось антибіотиком пуроміцином (0,1-1 мМ), який від’єднує новоутворені поліпептиди від рибосомально-ЕР транслоконового комплексу (Simon & Blobel, 1991). Таке пуроміцин-індуковане зменшення [Ca2+]ЕР було нечутливим до гепарину, рутенієвого червоного. Крім того, ефект пуроміцину не пов’язаний із зменшенням активності SERCA, оскільки він потенціює ефект тапсигаргіну, підвищуючи вдвічі швидкість тапсигаргін-індукованого витоку Са2+ із ЕР (n=5, рис. 14Б). Пуроміцин-індуковане зменшення [Ca2+]ЕР пригнічувалось анізоміцином (200 мкМ) – інгібітором пептидил трансферази та витоку Са2+ через транслоконовий комплекс (рис.14В). Таким чином, основним механізмом пасивного вивільнення Са2+ з ЕР є його витік через транслоконовий комплекс ЕР. 4. Депо-керований вхід Са2+ в ацинарні клітини. Депо-керований вхід Са2+, який активується при спустошенні ЕР, є основним шляхом перезаповнення депо, а також підвищення [Ca2+]і у незбудливих клітинах (Putney, 1986; Parekh & Penner, 1997), проте механізми такого входу остаточно нез’ясовані. Для візуалізації депо-керованого входу Са2+ ми стимулювали клітини агоністами у безкальцієвому розчині для спустошення Са2+ депо ЕР, після чого додавали до розчину Са2+ (2 мМ). В першу чергу, ми довели, що інкубування клітин у безкальцієвому середовищі pеr se незалежно від тривалості не призводить до активації входу Са2+. Спустошення депо ЕР внаслідок блокування SERCA тапсигаргіном (3 мкМ) викликає потужний вхід Са2+ у клітини (n=10, p<0,01; табл. 1, рис.15). Такий депо-керований [Ca2+]і транзиєнт на 69(12% (n=5, рис. 15) пригнічувався блокатором SOC-каналів ПМ - 2-АРВ (50 мкМ) (Bootman et al., 2002). Проте TG-індуковане спустошення Са2+-депо ЕР не є фізіологічним, оскільки за фізіологічних умов Са2+ вивільняється з ЕР за ІnsР3-чутливим механізмом або при активації CICR. Ми показали, що короткочасна дія АХ викликає спустошення ЕР до рівня достатнього для активації депо-керованого входу Са2+, але зареєстроване при цьому зростання [Ca2+]і кількісно було значно меншим, ніж TG-індуковане (табл. 1). Проте за умов збільшення рівня спустошення депо ЕР шляхом повторної стимуляції клітин АХ чи довготривалої дії АХ, відбувалось істотне зростання амплітуди депо-керованого входу Са2+ до рівня (або вище такого) викликаного TG (табл. 1). Спустошення ріанодинового депо ЕР кофеїном також активувало вхід Са2+ ззовні, хоча й найменшої із зареєстрованих амплітуд (табл. 1). Розрахований нами час напівзростання депо-керованих [Ca2+]i транзиєнтів, не залежав від способу спустошення депо ЕР (табл. 1). Отже, амплітуда депо-керованого входу Са2+ пропорційна мірі спустошення ЕР, а однакова кінетика розвитку депо-керованих [Ca2+]i транзиєнтів незалежно від способу спустошення депо свідчить про єдиний механізм їх виникнення. Регуляція мітохондріями депо-керованого входу Са2+ та перезаповнення депо ЕР. При вивченні ролі МХ у формуванні АХ-індукованих [Ca2+]i транзиєнтів нами одержано свідчення того, що МХ здійснюють захоплення як Са2+, що вивільняється із депо ЕР, так і Са2+, що входить у клітини ззовні (рис. 6). Для одержання прямого підтвердження здатності МХ захоплювати Са2+, що входить через SOC канали, ми вивчали параметри депо-керовані [Ca2+]i транзиєнтів за умов припинення захоплення Са2+ МХ за допомогою СССР (10 мкМ). З’ясувалось, що за таких умов відбувається виражене зменшення амплітуди та сповільнення розвитку депо-керованого входу Са2+ незалежно від способу спустошення ЕР (табл. 1). Зокрема, депо-керований [Ca2+]i транзиєнт викликаний спустошенням ЕР тапсигаргіном фоні СССР зменшувався на 51±15% (p<0,01; n=5, рис. 16А). Цікаво, що припинення захоплення Са2+ МХ викликало більш виражене пригнічення депо-керованого входу Са2+ після спустошення InsP3-чутливого депо АХ (на 73±12%, рис. 16В). Більш надійним показником максимальної кількості відкритих SOC-каналів є пік диферційованого [Ca2+]i сигналу, який в обох випадках драматично зменшувався в присутності СССР (рис. 16Б,Г). Для того, щоб переконатись, що виявлені ефекти не зумовлені зменшенням цитоплазматичного рівня АТФ, ми повторили експерименти в присутності суміші ротенону (1 мкМ) та олігоміцину (1 мкМ), які якісно підтвердили ефекти викликані СССР. Одержані дані доводять фундаментальну роль МХ у підтриманні депо-керованого входу Са2+ у ацинарні клітини підщелепної слинної залози. Ймовірно, що за фізіологічних умов МХ здійснють позитивний зворотній контроль за активністю SOC-каналів, попереджуючи їх Са2+-залежну інактивацію шляхом захоплення Са2+ з-під ПМ. Захоплення Са2+ МХ супроводжується його направленим вивільненням до ЕР чи в цитоплазму (Malli et al., 2003; 2005). З метою з’ясувати вклад транс-мітохондріального переміщення Са2+ у підтримання депо-керованого входу Са2+ ми використали СGP 37167 - специфічний інгібітор Na+/Ca2+-обмінника МХ, який є основним шляхом виведення Са2+ із МХ за фізіологічних умов (Cox et al., 1993; Pozzan, 2002). Припиненя вивільнення Са2+ із МХ викликало зменшення амплітуди депо-керованого [Ca2+]i транзиєнту на 53±11% (n=5; p<0,01), тоді як час його напівзростання достовірно не змінювався (табл. 1). Ми припускаємо, що ефект CGP опосередкований швидким накопиченням Са2+ в МХ з наступним припиненням його захоплення МХ, що, принаймі першопочатково, не опосередковано зменшенням кількості відкритих SOC-каналів. Оскільки вивільнення Са2+ із МХ регулює депо-керований вхід Са2+, ми припустили, що порушення трансмітохондріального переміщення МХ може призводити до пригнічення процесу перезаповнення депо ЕР. Для оцінки вкладу МХ у цей процес ми провели пряму реєстрацію [Ca2+]ЕР за умов блокування вивільнення Са2+ Na+/Ca2+-обмінником МХ. Виявилось, що при функціонуючих МХ спустошення депо ЕР, викликане короткочасною дією АХ та наступне додавання до розчину НДВ Са2+ (100 нМ) супроводжувалось швидким перезаповненням ЕР до початкового рівня, тоді як за наявності у розчині CGP 37157 цей процес сповільнювався, а [Ca2+]ЕР не відновлювалась до початкового рівня. Швидкість перезаповнення ЕР за таких умов зменшувалась на 46(16%, а кінцевий рівень [Ca2+]ЕР складав 70(8% від початкового (n=6; p<0,05). Таким чином, припинення трансмітохондріального транспорту, з одного боку, призводить до істотного зменшення депо-керованого [Ca2+]i транзиєнту, а з іншого, лише до часткового пригнічення перезаповнення ЕР. Останнє свідчить про те, що перезаповнення депо ЕР, спустошеного короткочасною дією АХ, здійснюється в значній мірі незалежно від трансмітохондріального перенесення Са2+. Для підтвердження такого міркування ми перевіряли здатність АХ викликати [Ca2+]i транзиєнти після перезаповнення депо в присутності CGP 37157. Для цього ми короткочасно стимулювали клітини АХ у безкальцієвому розчині, після чого перезаповнювали ЕР додаванням Са2+ до зовнішньоклітинного розчину за наявності чи відсутності CGP 37157 (рис. 17А,Б). Виявилось, що у присутності CGP 37157 амплітуда другого АХ-індукованого [Ca2+]i транзиєнту була на 40±10% меншою (n=5, p<0,01; рис. 17Б). Ці дані кількісно підтверджують висновок про те, що вклад трансмітохондріального переміщення Са2+ в перезаповнення депо ЕР складає порядка 30-40%, а решта опосередковується захопленням Са2+ SERCA безпосередньо з-під ПМ. Вклад мітохондрій у підтримання депо-керованого входу Са2+ та перезаповнення депо ЕР при довготривалій дії АХ. За фізіологічних умов підвищення тонусу нервових центрів парасимпатичної нервової системи супроводжується зростанням частоти нервових імпульсів, що призводить до довготривалого підвищення рівня АХ в області навколо ацинуса. Підтримання довготривалої секреції за таких умов потребує постійного перезаповнення депо ЕР та входу Са2+ ззовні, тому нас цікавило, чи змінюється перебіг цих процесів за умов тривалої стимуляції клітин. Як показано вище, довготривала стимуляція клітин АХ призводить до виникнення депо керованого [Ca2+]i транзиєнту значної амплітуди (табл. 1). Виявилось, що за умов постійної присутності АХ припинення захоплення Са2+ МХ за допомогою СССР (як і у випадку короткочасної дії АХ) призводило до вираженого пригнічення депо-керованого входу Са2+ (на 71±9%, n=5, p<0,01; табл. 1). Припинення трансмітохондрільного переміщення Са2+, викликане CGP 37157 за постійної присутності АХ, призводило до пригнічення депо-керованого входу Са2+ на 19±4%, що значно менше за таке при короткочасній дії АХ. Проте за даних умов спостерігалось сповільнення висхідної фази депо-керованого [Ca2+]і транзиєнту на 43±5% (n=7; p<0,05; рис 18А). Таке невелике пригнічення та істотне сповільнення депо-керованого входу Ca2+ може бути зумовлене накладанням процесу постійного InsP3-індукованого вивільнення Са2+ із частково перезаповненого ЕР за умов постійної наявності агоніста. З іншого боку, при одночасному блокуванні трансмітохондріального транспорту Са2+ та захоплення Са2+ SERCA відбувається практично повне (на 75±14%; n=6; рис. 18А) пригнічення депо-керованого [Ca2+]і транзиєнту. При цьому, дія тільки TG не призводила до змін депо-керованого входу Са2+ (рис. 18А). Ці дані свідчать про те, що в присутності АХ транспорт Са2+ через МХ прямо пов’язаний із здатністю ЕР до перезаповнення. Для кількісної оцінки цього ефекту ми провели реєстрацію [Ca2+]ЕР при перезаповненні ЕР за умов постійної дії АХ. З’ясувалось, що блокування як захоплення Са2+ МХ з використанням СССР, так і його вивільнення при дії CGP 37157, призводило до пригнічення процесу перезаповнення ЕР на 68±13% та 78±19% відповідно (n=5; рис.18Б). Одержані дані доводять, що за постійної присутності агоніста транспорт Са2+ через МХ відіграє переважаючу роль у процесі перезаповнення депо ЕР. 5. Електронно-мікроскопічний аналіз локалізації мітохондрій. Результати одержані із використанням Са2+-чутливих флуоресцентних зондів свідчать про взаємодію між МХ та SOC каналами, а також кальцій-транспортних структур ЕР, що можливо лише за умови близької просторової локалізації цих систем. Однак флуоресцентні методи не дають змогу дати відповідь про субклітинну організацію органел, що можливо з використанням методу електронної мікроскопії. Дослідження ультраструктури ацинарних клітин підщелепної слинної залози щурів виявило наявність двох груп МХ, локалізованих у безпосередній близькості до ЕР та ПМ (рис. 19А). Щільність МХ, розташованих поблизу ЕР є значно вищою, ніж в інших ділянках клітини, а форма МХ, оточених ламелами, – більш витягнутою, що, ймовірно, забезпечує більшу площу контакту між мембранами органел. Середня відстань між групою МХ, наближених до ЕР, та ламелами ЕР складає 16,5(0,8 нм (n=15), а в деяких випадках є меншою за 1 нм (рис. 19В). Виявлено також угрупування МХ у базальному полюсі клітини, які, з одного боку, щільно прилягають до ПМ, а з іншого – оточені ламелами ЕР, тоді як між ПМ та МХ нами не виявлено структур ЕР (рис. 19Б,В). Середня відстань між МХ та ПМ складає 18,2(2 нм (n=15), а в деяких випадках є меншою за 5 нм (рис. 19Б). З огляду на те, що МХ переважно локалізуються в областях підвищення [Ca2+]i, ми припускаємо, що група МХ між ПМ та ЕР, очевидно, відіграє роль регуляторів входу Ca2+ через депо-керовані Са2+-канали ПМ. Таким чином, виявлена локалізація МХ поблизу ПМ і ЕР підтверджує висловлену гіпотезу про функціональну колокалізацію МХ з Са2+-транспортними системами ПМ та ЕР. 6. Зміни функціонування ацинарних клітин та внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу за умов цукрового діабету. Згідно клінічних даних у більш ніж 50% хворих на цукровий діабет виявлено ксеростомію (відчуття сухості у роті), виникнення якої зумовлене різким зменшенням секреції слини, проте внутрішньоклітинні механізми таких змін залишаються невивченими (Zachariasen, 1996; Stegeman, 2005). Враховуючи, що секреція рідинного компоненту слини є [Са2+]i-залежним процесом (Bruce et al., 2005) ймовірно, що пригнічення функцій слинних залоз за умов цукрового діабету викликане порушенням внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу. Зміни слиновиділення за умов СТЗ-індукованого цукрового діабету. Для підтвердження адекватності використання експериментально-індукованого діабету як моделі ксеростомічних станів у тварин ми провели аналіз показників слиновиділення підщелепною слинною залозою in vivo у здорових щурів та хворих на СТЗ-індукований діабет. Нами виявлено, що після 6-7 тижнів перебігу захворювання виражено знижуються всі досліджувані параметри (швидкість слиновиділення, амілазна активність слини та вміст у ній білку) нестимульованого та стимульованого пілокарпіном слиновиділення підщелепною слинною залозою (табл. 2). Пілокарпін (2 мг/кг ваги) стимував секрецію слини як у здорових, так і у хворих тварин, проте його стимулюючий ефект був значно більш вираженим при діабеті (швидкість слиновиділення зростала у 7,8±1,1 разів (p<0,001)), при цьому у контрольних тварин лише на 75±9% (p<0,001). В той же час, загальна інтенсивність стимульованої пілокарпіном секреції слини у діабетичних щурів була все ж значно нижчою, ніж у здорових тварин (на 43±8%; p<0,001; табл. 2). Аналогічно після стимуляції вміст загального білка у слині діабетичних щурів зростав в 9,1±0,9 раз (p<0,001), а у контрольних тварин – на 47±6% (p<0,001), при цьому загальна кількість білка у слині після стимуляції пілокарпіном достовірно не відрізнялась у хворих та здорових тварин (табл. 2). Враховуючи, що синтез та секреція компонентів слини регулюється змінами [Ca2+]і, ми вивчали перебіг процесів [Ca2+]і сигналізації за умов СТЗ-індукованого діабету. Зміни Са2+-гомеостазу в ацинарних клітинах за умов цукрового діабету. Нами виявлено, що у тварин хворих на діабет [Ca2+]i в стані спокою на 60(4% (n=80; p<0,001) вища, ніж у здорових тварин. Крім того, у діабетичних тварин амплітуда [Ca2+]і транзиєнтів, викликаних АХ у кальцієвмісному розчині на 23±3% (n=75; рис. 20A,Б) перевищувала таку у здорових тварин, а стала часу фази їх спаду (() збільшувалась на 57(11% (p<0,01). При цьому крива концентраційної залежності АХ-індукованих [Ca2+]i транзиєнтів істотно зміщувалась вліво та мала вищий максимум (рис. 16В). Розрахована ЕС50 для АХ складала в 0,83(0,06 мкМ та 0,53(0,05 мкМ для клітин здорових та діабетичних тварин відповідно (рис. 20А,Б). ІnsР3-чутливий та нечутливий шляхи вивільнення Са2+ з ЕР за умов діабету. З метою з’ясувати, чи змінюється за умов діабету функціонування Са2+ депо ЕР, ми використовували агоністи М-холінорецепторів: АХ та КХ, які аплікували в безкальцієвому середовищі. Ми виявили, що за таких умов АХ (5 мкМ) викликав [Ca2+]i транзиєнти з амплітудою 135(11 нМ, що було на 14±4% (n=21; p<0,05) менше за таку у здорових тварин (рис. 21В,Г). Крім того, за умов діабету значно зменшується й амплітуда [Ca2+]і транзиєнтів, викликаних КХ (5 мкМ) у безкальцієвому середовищі (на 32±3%; p<0,001; рис. 21В,Г). Як і при дії АХ, нами виявлено сенситизацію [Ca2+]i транзиєнтів, викликаних КХ. Зокрема, ЕС50 для КХ складала 4,7(0,6 мкМ в контролі та 3,0(0,5 мкМ при діабеті. Виявлене зменшення ампілутди АХ- та КХ-індукованих [Ca2+]i транзиєнтів у безкальцієвому середовищі за умов діабету може бути викликане зменшенням вмісту Са2+ в ЕР. З метою перевірити це припущення ми використовували іономіцин – кальцієвий іонофор, який за відсутності зовнішньоклітинного Са2+ вивільняє Ca2+ з ЕР, незалежно від активації рецепторів (Albert, Tashjian, 1986). Виявилось, що іономіцин (500 нМ)-індуковане вивільнення Ca2+ із ЕР складало 95±12 нМ (n=10) в контролі та 47±7 нМ при діабеті (p<0,01; n=16; рис. 21А,Б). Зміни кальцієвого гомеостазу в ЕР за умов діабету. З метою вивчення внутрішньоретикулярного кальцієвого гомеостазу за умов діабету ми реєстрували [Ca2+]ЕР у пермеабілізованих клітинах при рецептор-опосередкованому та пасивному вивільненні Са2+. Ми показали, що за умов діабету виражено пригнічується як ІnsР3-, так і кофеїн-індуковане вивільнення Ca2+ із ЕР. Зокрема, ІnsР3 (3 мкМ) викликав зменшення [Ca2+]ЕР з амплітудою на 38±10% нижчою, ніж у клітинах контрольної групи тварин (n=20; рис. 22А). Кофеїн (10 та 20 мМ) викликав зменшенням [Ca2+]ЕР, яке на 35±5% та 53±14% було меншим за таке у клітинах здорових тварин відповідно. Крім того, пуроміцин-індуковане вивільнення Ca2+ за умов діабету зростало на 45±7% (n=6; рис. 22Б). Загалом одержані дані є свідченням того, що за умов діабету відбувається зменшення в ЕР кількості Са2+, здатного вивільнятись при стимуляції ацинарних клітин агоністами, а ймовірним механізмом цього є посилення пасивного вивільнення Са2+ через транслоконову пору. < t ?   th . 4 ? ? ? ? h h h h h h h h h h h h h $ t th 4 r 1/4 ? ? ????1/4 o ? ? ? ??????? h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h ?????????? ??????? h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h ???????????????? h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h -0@?thy h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h Ae oe?????ee???eeaaaaaaoeoeoeO?? h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h N R N R Ae h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h ±?±?z¦±¦ h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h  ? oioioi h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h ????? h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h h :ого у здорових тварин. Таким чином, ми не спостерігали змін здатності МХ акумулювати Ca2+ під час агоніст-індукованого вивільнення Ca2+ із ЕР при діабеті, тому зменшення [Ca2+]і транзиєнту викликаного АХ після на фоні СССР вірогідно зумовлене швидкою Са2+-залежною інактивацією ІnsР3 рецепторів ЕР (як наслідок потенціювання за умов діабету процесу вивільнення Са2+ із МХ). Зміни функціонування Са2+-АТФаз ПМ та ЕР за умов діабету. Виявлене нами за умов діабету підвищення рівня [Ca2+]і в стані спокою та сповільнення [Ca2+]і транзиєнтів, викликаних активацією М-холінорецепторів, може бути зумовлене порушенням роботи Са2+-АТФаз. Проте, відомості про зміни функціонування Са2+-AТФаз ПМ та ЕР клітин слинних залоз за умов діабету відсутні. Нами вперше показано, що при СТЗ-індукованому діабеті пригнічується робота обох Са2+-АТФаз. Зокрема, зменшення активності Са2+-AТФази ПМ та ЕР ацинарних клітин хворих тварин складала 88±3% та 53±6% (n=9; р<0,05) порівняно з їх величиною у здорових тварин (табл. 3). Виявлено, що за умов діабету знижується Рmax та V0 Са2+-залежного гідролізу АТФ на 52±6 % (n=9; p<0,05) та 50±7% (n=9; p<0,05) відповідно (табл. 3). Такі зміни прямо свідчать про зниження ефективності функціонування цих систем. Крім того, нами виявлено, що за умов діабету знижується Vmax високоаффінного центру зв’язування АТФ Са2+-АТФазами ПМ та ЕР на 22±2% та 48±7% (p<0,05), а низькоаффінного центру – на 45±7 % та 83±8% (p<0,05) відповідно (табл. 3). При цьому спостерігалось підвищення KАТФ високоафінного центру Са2+-АТФази ПМ на 74±7% (p<0,05). Не змінювалася nн обох центрів зв’язування АТФ для Са2+-АТФаз ПМ та ЕР, що свідчить про однакову кооперативність молекули ферменту до субстрату у хворих і здорових тварин. Показано також достовірне зменшення величин Vmax, KCa для Са2+-АТФаз ПМ та ЕР на 50±5%, 84±7% та 27±4%, 74±7% (n=6; р<0,05) відповідно та підвищення кооперативності низькоаффінного центру зв’язування Са2+ Са2+-АТФаз ПМ та ЕР в середньому на 63±6% та 58±5% (n=6; p<0,05; табл. 4) відповідно. Таким чином, нами виявлено, що за умов цукрового діабету змінюються параметри, які характеризують залежність Са2+-АТФаз ПМ та ЕР від субстрату ферментативної реакції та транспорту: підвищується спорідненість молекул Са2+-АТФаз ПМ та ЕР у низькоафінному центрі зв’язування для Са2+ і у високоафінному центрі зв’язування для АТФ. Виявлені зміни можуть бути фізіологічним механізмом компенсування пригніченої функції Са2+-АТФаз клітин слинних залоз за умов дібету. АНАЛІЗ ТА УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕНЬ Функціонування ацинарних клітин підщелепної слинної залози знаходиться під переважаючим парасимпатичним контролем, що за фізіологічних умов здійснюється медіатором АХ (Anderson et al., 1993; Liu et al., 2001). Регуляція секреції рідкого компоненту слини опосередковується АХ-індукованим підвищення [Ca2+]і, яке досягається за рахунок вивільнення Са2+ з внутрішньоклітинних депо та входу Са2+ ззовні (Ambudkar 2001). У даній роботі проведено комплексний аналіз механізмів перебігу [Ca2+]і сигналізації, опосередкованої активацією М-холіно- і пуринорецепорів, (як таких, що здатні викликати виражене підвищення [Ca2+]і, необхідне для підтримання довготривалої секреції) та вкладу інших Са2+-транспортних систем у їх регуляцію. Враховуючи, що Са2+-залежні К+- та Сl--канали, які відіграють ключову роль у здійсненні секреції рідкого компоненту слини, розташовані у діаметрально протилежних ділянках поляризованих ацинарних клітин, для їх активації необхідне глобальне підвищення [Ca2+]і у цитоплазмі. Однак питання щодо його виникнення тривалий час залишалось дискусійним. Ми виявили, що незалежно від концентрації АХ, а також інші агоністи М-холінорецепторів – КХ та пілокарпін, викликають глобальне транзиєнтне (неосциляторне) підвищення [Ca2+]i, яке ефективно пригнічується блокатором М-холінорецепторів атропіном. Таким чином, наші дані та результати інших авторів (Larina & Thorn, 2005) свідчать, що за фізіологічних умов АХ викликає глобальне підвищення [Ca2+]і, яке першопочатково виникає в апікальній області ацинарних клітин підщелепної слинної залози, проте швидко досягає базального полюсу. Відомо, що активація М-холінорецепторів призводить до вивільнення Са2+ з ІnsР3-чутливого депо (Ambudkar, 2001). Однак, якщо вивільнення Са2+ з депо ЕР є єдиним механізмом, що відповідає за формування [Ca2+]і відповідей, то не повинно спостерігатись відмінностей абсолютної амплітуди та форми АХ-індукованої [Ca2+]і відповіді при стимуляції клітин у Са2+-вмісному та безкальцієвому середовищах. Однак такі відмінності існують: 1) зменшується амплітуда АХ-індукованого [Ca2+]і транзиєнту у безкальцієвому середовищі; 2) прискорюється кінетика як висхідної, так і низхідної фази [Ca2+]і транзиєнтів, викликаних АХ у безкальцієвому середовищі; 3) довготривала стимуляція клітин АХ призводить до розвитку [Ca2+]i транзиєнта тієї ж амплітуди, що й при короткочасному прикладанні, однак при цьому не спостерігається відновлення [Ca2+]i до вихідного рівня протягом всього часу дїї АХ. Виявлені явища свідчать про накладання на швидке вивільнення Са2+ з ЕР більш повільного процесу – входу Са2+ ззовні. Проведена пряма реєстрація депо-керованого входу Са2+ в ацинарні клітини при спустошенні депо ЕР АХ показала, що його амплітуда є більшою за різницю між амплітудами АХ-індукованого [Ca2+]і транзиєнту у Са2+-вмісному та безкальцієвому середовищах, що свідчить про захоплення Са2+ Са2+-АТФазою ЕР вже під час висхідної фази АХ-індукованого [Ca2+]і транзиєнту. Отже, незважаючи на те, що ІnsP3-індуковане вивільнення Са2+ з ЕР є первинним процесом, що ініціює появу [Ca2+]i транзиєнту (Petersen, 1992), амплітудно-часові параметри [Ca2+]i відповідей при активації М-холінорецепторів визначаються суперпозицією процесів вивільнення Са2+ з депо ЕР, входу Са2+ ззовні та його зворотнього захоплення в ЕР Са2+-АТФазою. Незважаючи на те, що секреція рідкого компоненту слини знаходиться в основному під парасимпатичним контролем, наявні дані, які опосередковано свідчать про роль зовнішньоклітинних нуклеотидів у регулюванні функцій клітин слинних залоз (Soltoff et al., 1998; Turner et al., 1999). Нами вперше доведено наявність активних іонотропних Р2Х та метаботропних P2Y рецепторів в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози, що раніше було виявлено для клітин інших типів слинних залоз (Turner et al., 1999). Вклад Р2Х-рецепторів у амплітуду АТФ-індукованих [Ca2+]i транзиєнтів є переважним і складає 65 %. Фармакологічний аналіз природи [Ca2+]i транзиєнтів, викликаних активацією Р2Х рецепторів, відсутність їх десенситизації та значення ЕС50(АТФ) свідчить про переважний (72 %) вклад у [Ca2+]i сигналізацію Р2Х7 підтипу пуринорецепторів (Ralevic & Burnstock 1998; Turner et al. 1999). Виявлена нами метаботропна компонента АТФ-ідукованих [Ca2+]і транзиєнтів, ймовірно, опосередкована активацію P2Y2 рецепторів, оскільки у клітинах підщелепної слинної залози дорослих тварин експресується лише цей підтип рецепторів (Turner et al., 1999). За фізіологічних умов екзогенна АТФ швидко гідролізується екто-АТФазами (Murphy et al., 1994) відповідно до послідовності: АТФ?АДФ? АМФ?аденозин. Тому цілком доцільно припустити наявність клітинних ефектів є чутливими до кінцевого продукту гідролізу АТФ – аденозину, що для досліджуваних клітин невідомо. Аденозин активує Р1 рецептори, різні підтипи яких спряжені з ФЛЦ або аденілатциклазою (Ralevic & Burnstock, 1998). Ми не виявили функціонально активних Р1 рецепторів, спряжених із ФЛЦ, оскільки аденозин per se не викликав змін [Ca2+]і. Однак ми вперше виявили здатність аденозину модулювати [Ca2+]і відповіді, викликані активацією М-холінорецепторів. Аденозин потенціював [Ca2+]і транзиєнти, причому цей ефект маскувався прямою активацією аденілатциклази (АЦ) форсколіном. Отже, ефект аденозину опосередкований Р1 рецепторами, спряженими з АЦ, що може призводити до активації протеїнкіназ та фосфорилювання InsP3-рецепторів ЕР. У клітинах слинних залоз експресуються три підтипи InsP3-рецепторів, однак переважаючими є InsP3RII та InsP3RIIІ, фосфорилювання яких протеїнкіназою А може призводити до посилення вивільнення Са2+ через рецептор, як показано на інших об’єктах (Straub et al., 2004). Сумісна активація АЦ- та ФЛЦ-сигнальних шляхів дійсно є фізіологічним явищем для клітин слинних залоз, що спостерігається, наприклад, за умов одночасної симпатичної та парасимпатичної стимуляції клітин і призводить до посилення секреції слини. Однак ми вперше виявили наявність новітнього механізму синергічної регуляції секреції, не пов’язаного із симпатичною стимуляцією, який може відображати шлях ауторегуляції, оскільки АТФ (і як результат – аденозин) виводиться у міжклітинний простір із вмістом секреторних везикул (Burnstock, 2004). Останнім часом все більше уваги приділяється здатності МХ регулювати процеси перебігу [Ca2+]i сигналізації за фізіологічних умов, що зумовлено ефективним захопленням ними Са2+ у ділянках із локально високою концентрацією Са2+, зокрема, біля місць його входу у клітини або вивільнення з ЕР (Rizzuto & Pozzan, 2006). Наявність таких локальних мікродоменів високої [Са2+] (1-6 мкМ) показано для багатьох типів клітин (Berridge et al., 1996; Cancela et al., 2002) і забезпечує активацію низькоафінного Са2+-уніпортеру МХ. З використанням методу електронної мікроскопії нами виявлено наявність у досліджуваних клітинах двох угруповань МХ, локалізованих безпосередньо під ПМ та впритул оточених ламелами ЕР. Така локалізація може передбачати їх вклад у регулювання депо-керованого входу Са2+ та механізмів вивільнення Са2+ з ЕР, суперпозиція яких, як ми показали, визначає амплітудно-часові параметри Ca2+ сигналів у досліджуваних клітинах. При аналізі вкладу МХ у кальцієвий гомеостаз досліджуваних клітин ми виявили, що у стані спокою припинення їх Са2+-акумулюючої функції призводить до вивільнення у цитоплазму значної кількості Са2+, яке опосередковується тільки Na+/Ca2+-обмінником мембрани МХ, тоді як пора перемінного проникнення (PTP) за фізіологічних умов не бере участі у цьому процесі. Відсутність витоку Са2+ через PTР за фізіологічних умов показано і на інших об’єктах (Duchen, 2004). Крім того, нами виявлено здатність МХ безпосередньо захоплювати Са2+, який у певній кількості проникає ззовні в стані спокою клітини, що свідчить про активний вклад МХ у підтримання кальцієвого гомеостазу навіть за відсутності стимуляції. За умов стимуляції клітин АХ нами доведено вклад МХ у формування агоніст-індукованих [Ca2+]i сигналів. Припинення роботи МХ призводить до істотного зменшення амплітуди [Ca2+]i транзиєнту, що зумовлене локальним підвищенням [Ca2+]i поблизу вустя ІnsР3 рецептора, викликаним відсутністю його захоплення МХ, колокалізованими з ЕР, що викликає швидку Са2+-залежну інактивацію ІnsР3 рецептора. Ця гіпотеза підтверджується також результатами експериментів з прямою реєстрацією [Ca2+]ЕР, які виявили драматичне зменшення InsP3-індукованого вивільнення Са2+ з ЕР при припиненні захоплення Са2+ МХ. Явище Са2+-залежної інактивації ІnsР3-індукованого вивільнення Са2+ з ЕР при блокуванні захоплення Са2+ МХ було описане раніше для незбудливих клітин ендотелію судин (Malli et al., 2005) та епітеліальних клітин нирок (Landolfi et al., 1998). Підтримання внутрішньоретикулярного кальцієвого гомеостазу, яке досягається за рахунок узгодженого перебігу процесів вивільнення Са2+ та перезаповнення ЕР, є необхідним для нормального перебігу синтезу і дозрівання секреторних білків та здійснення секреції рідкої слини (Berridge, 2002). Однак ці механізми є остаточно нез’ясовано навіть за фізіологічних умов, що обумовлено складністю проведення таких досліджень через вибіркову проникність ПМ. Для цього ми проводили пряму реєстрацію [Ca2+]ЕР на пермеабілізованих ацинарних клітинах, завантажених низькоафінним Са2+ індикатором маг-фура-2/АМ. Використання такого підходу дало змогу: і) виявити наявність у досліджуваних клітинах тапсигаргін-чутливого та нечутливого депо Са2+, обидва з яких є InsР3-залежними; іі) охарактеризувати властивості та шляхи модуляції InsР3-індукованого вивільнення Са2+ цитоплазматичним Са2+ та АТФ; ііі) довести наявність активних ріанодинових рецепторів у досліджуваних клітинах. Наявність тапсигаргін-чутливого та нечутливого депо Са2+ у досліджуваних клітинах свідчить про гетерогенність InsР3-чутливого депо, що описано раніше для інших об’єктів (Blaustein & Golovina, 2002). Виявлена нами дзвоноподібна Са2+-залежність активності InsР3 рецептора з максимумом при фізіологічних концентраціях Са2+ також свідчить на користь висловленої гіпотези щодо необхідності захоплення Са2+ близько розташованими МХ для підтримання відносно низької [Са2+] біля вустя InsР3 рецептора. Крім того, виявлений біфазний вплив АТФ на функціонування ІnsР3 рецептора свідчить про здатність АТФ у високих концентраціях конкурентно інгібувати його ІnsР3-зв’язуючий центр (Bezprozvanny & Ehrlich, 1993). У даній роботі вперше доведено наявність функціонально-активних ріанодинових рецепторів (RyR), вклад яких у [Cа2+]і сигналізацію у клітинах слинних залоз залишався нез’ясованим (Melvin et al., 2005). На користь наявності RyR-чутливого депо ЕР свідчить виявлене: і) кофеїн-індуковане транзиєнтне зменшення [Ca2+]ЕР; іі) залежність його амплітуди від [Cа2+]і; ііі) здатність алкалоїду ріанодину у високих концентраціях блокувати, а у середніх – переводити канал у напівпровідний стан, що співпадає з характеристиками RyR, описаними раніше (Buck et al., 1992; Verkhratsky, 2005). Однак, потужне вивільнення Са2+ з ЕР при активації RyR не супроводжується глобальним підвищенням [Cа2+] у цитоплазмі. Ґрунтуючись на результатах кальційметричних експериментів та даних електронної мікроскопії, ми запропонували гіпотезу про колокалізацію МХ, Ca2+-ATФaз ПМ та ЕР і RyR, яка відображає їх скоординовану участь у формуванні кофеїн-індукованої [Cа2+]і відповіді (рис. 23). Внутрішньоклітинні події, пов’язані з активацією RyR, можна представити у наступній послідовності: Са2+, що вивільняється через RyR, захоплюється МХ, які колокалізовані з структурами ЕР ? захоплений Са2+ починає повільно вивільнятись через Na+/Са2+-обмінник МХ як у простір біля ЕР, так і до ПМ за рахунок трансмітохондріального транспорту ? вивільнений таким чином Са2+ виводиться з цитоплазми Са2+-АТФазами ПМ та ЕР. При припиненні захоплення Са2+ МХ відбувається перерозподіл Са2+, вивільненого при активації RyR, між Ca2+-ATФaзами ПМ та ЕР і підвищенням [Cа2+]і. При цьому Са2+-АТФази ПМ та ЕР визначають форму [Ca2+]i транзиєнту. Вважається, що фізіологічна роль RyR у різних типах клітин полягає у поширенні [Ca2+]i хвиль за механізмом Са2+-індукованого вивільнення Са2+ (Verkhratsky, 2005). Виявлене нами узгоджене функціонування RyR та Са2+-захоплюючих систем може відігравати важливу роль у глобалізації [Ca2+]і хвиль, що є необхідним для активації Са2+-залежних іонних провідностей апікального та базального полюсів та підтримання довготривалої секреції рідкої слини. Додатковим механізмом, що може впливати на кальцієвий гомеостаз в ЕР є постійне пасивне вивільнення Са2+ “каналами витоку”. Наявність потужного пасивного витоку, який можна візуалізувати шляхом блокування захоплення Са2+ Са2+-АТФазою ЕР (SERCA), вважається характерною особливістю клітин із добре розвиненим гранулярним ЕР: фібробластів (Hofer et al., 1996), панкреацитів (Mogami et al., 1998), клітин простати (Van Coppenolle, 2004). Нами вперше вивчено молекулярні механізми, які опосередковують функціонування таких “каналів пасивного витоку” Са2+ у досліджуваних клітинах. При вивченні пасивного витоку Са2+ з’ясувалось, що він виражено потенціювався пуроміцином (інгібітором трансляції, що від’єднує новоутворені поліпептиди від транслоконного комплексу (Pestova et al., 2001)) та пригнічувався анізоміцином (інгібітором пептидил трансферази). Ці дані свідчать, що пасивний витік Са2+ здійснюється через пору транслоконового комплексу, участь якої у забезпеченні витоку Са2+ з ЕР показана на панкреацитах (Lomax et al., 2000) та клітинах раку простати (Van Coppenolle et al., 2004). Таке пуроміцин-індуковане вивільнення поліпептидних ланцюгів із рибосомально-транслоконового комплексу спричинює спустошення ЕР за механізмом незалежним від InsP3 рецепторів, RуR та SERCA. Маскування ефекту пуроміцину за умов блокування пептидил трансферази (а, отже, порушення пептидного зв’язку між рибосомою та ЕР) свідчить про перехід транслоконового комплексу у непроникний для Са2+ стан (незважаючи на відсутність білків у каналі транслоконового комплексу). Таким чином, за фізіологічних умов механізм пасивного вивільнення Са2+ з ЕР полягає у вивільненні Са2+ через транслоконовий комплекс у період часу між завершенням трансляції (тобто після вивільнення новосинтезованих поліпепдидів всередину ЕР) та від’єднанням рибосоми від транслокону. На користь останнього свідчать дані Potter та Nicchitta (2002), які показали, що після завершення процесу трансляції деякий час зберігається зв’язок рибосоми з транслоконовим комплексом ЕР. Загалом, одержані дані є першим експериментальним підтвердженням гіпотези щодо ролі транслоконового комплексу у забезпеченні пасивного витоку Са2+ через мембрану ЕР клітин слинних залоз протягом білок-синтетичного циклу. Крім вивільнення Са2+ з депо ЕР, істотний вклад у підтримання внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу вносить депо-керований вхід Са2+, який є основним шляхом перезаповнення Са2+ депо ацинарних клітин (Putney, 1986; Shuttleworth, 2004). При вивченні механізмів такого входу ми показали, що його потужність визначається мірою спустошення депо ЕР (тапсигаргін>АХ>>кофеїн). Крім того, наявність депо-керованого входу
Са2+ при спустошенні ріанодин-чутливого депо підтверджує функціональну
роль RyR у кальцієвій сигналізації та свідчить про роль CICR в її
активації. Виходячи з аналізу кінетики депо-керованого підвищення
[Ca2+]i, механізм його активації не залежить від способу спустошення ЕР
(InsP3-залежного чи -незалежного). Це ймовірно зумовлене тим, що у
досліджуваних клітинах депо-керовані (SOC) канали є гетеромерами, які
сформовані декількома ізоформами TRPC білків, а саме TRPC3/TRPC6 в
апікальному полюсі та TRPC1/TRPC6 – у базолатеральному (Liu et al.,
2005). Як і вивільнення Са2+ з депо ЕР, депо-керований вхід Са2+ у
досліджувані клітини також виражено залежить від функціонального стану
МХ. Про це свідчить його драматичне зменшення та сповільнення при
блокуванні як захоплення, так і вивільнення Ca2+ МХ. Виявлені ефекти не
залежали від способу спустошення депо ЕР (InsP3-залежного чи
InsP3-незалежного), а, отже, відображають безпосередньо регуляцію МХ SOC
каналів. Враховуючи наявність у досліджуваних клітинах угрупування МХ,
розташованих на відстані порядка 10 нм від ПМ, ми вважаємо, що за
фізіологічних умов вони відіграють роль сенсорів мікродоменів високої
[Ca2+] біля вустя SOC каналів ПМ та здійснюють швидке захоплення Са2+
одразу після його входу у клітини. Оскільки припинення захоплення Са2+
МХ різко пригнічує депо-керований вхід Са2+, а не потенціює його (що
можна було б очікувати у випадку, якби МХ виконували роль бар’єру для
Са2+), ми вважаємо, що роль МХ полягає у забезпеченні позитивного
зворотнього контролю над функціонуванням SOC каналів шляхом попередження
їх Са2+-залежної інактивації. Все це забезпечує умови для повноцінного
перезаповнення депо ЕР після стимуляції. Загалом, одержані нами дані є
першим експериментальним свідченням того, що в ацинарних клітинах
підщелепної слинної залози МХ, локалізуючись безпосередньо під ПМ,
здійснюють захоплення Са2+ одразу після його надходження у клітини та
відіграють важливу фізіологічну роль у підтриманні депо-керованого входу
Са2+ (рис.24).

Динаміка зареєстрованого нами депо-керованого Са2+ транзиєнту та дані
високороздільної конфокальної мікроскопії для інших незбудливих клітин
(Malli et al., 2003) свідчать, що створені швидким захопленням Са2+ в МХ
мікродомени низької [Са2+] у субплазматичному просторі, існують
щонайменше кілька хвилин. Проте підвищення [Ca2+]МХ, викликане
захопленням Са2+ МХ при активації SOC каналів, має транзиєнтний
короткочасний характер (Glitsch et al., 2002; Malli et al., 2005), що
свідчить про транс-мітохондріальне переміщення захопленого Са2+ та його
вивільнення у більш віддалені ділянки цитоплазми. Ми виявили, що
припинення вивільнення Са2+ з МХ після активації депо-керованого [Ca2+]i
транзиєнту, призводило до істотного зменшення його амплітуди, що
зумовлено накопиченням Са2+ у МХ та наступним припиненням його
захоплення, що, у свою чергу, призводить до Са2+-залежної інактивації
SOC-каналів. Враховуючи виявлені тісні контакти між МХ та ЕР, а також
показану для інших об’єктів структурно-функціональну взаємозалежність
перебігу [Ca2+]і сигналізації в ЕР та МХ (Arnaudeau et al., 2001; Bowser
et al., 2002), фізіологічна роль транс-мітохондріального транспорту Са2+
полягає, ймовірно, у спрямуванні вхідного потоку Са2+ від ПМ до EР для
його перезаповнення. Шляхом прямої реєстрації [Ca2+]ЕР нами виявлено, що
блокування роботи Na+/Ca2+-обмінника дійсно призводило до часткового
пригнічення процесу перезаповнення ЕР. Крім того, при повторній
стимуляції клітин АХ за умов блокування Na+/Ca2+-обмінника вивільнення
Са2+ з ЕР складало ~70 %. Останнє може свідчити про те, що при
спустошеннні ЕР короткочасною дією АХ його перезаповнення здійснюється в
основному за рахунок роботи SERCA і додатково за рахунок
транс-мітохондріального транспорту Са2+. На основі цих результатів та
даних, одержаних на інших об’єктах (Malli et al., 2005), ми пропонуємо
гіпотезу, згідно якої при короткочасному процесі InsP3-індукованого
вивільнення Ca2+ домени ЕР, наближені до ПМ, імітують функцію МХ,
попереджуючи Са2+-залежну десенситизацію SOC-каналів шляхом прямого
захоплення Ca2+ в люмен EР (рис. 24). Завдяки наявності в ацинарних
клітинах потужного інтралюметального транспорту Са2+ (Tinel et al.,
1999; Petersen, 2005) фізіологічна роль такого захоплення Са2+ в ЕР може
полягати у транспорті Са2+ в більш віддалені від ПМ ділянки клітини.

За фізіологічних умов підвищення тонусу нервових центрів парасимпатичної
нервової системи супроводжується зростанням частоти нервових імпульсів,
що призводить до довготривалого підвищення рівня АХ в області навколо
ацинуса. Підтримання довготривалої секреції за таких умов потребує
постійного перезаповнення депо ЕР та входу Са2+ ззовні, тому нас
цікавило, чи змінюється перебіг цих процесів за умов тривалої стимуляції
клітин. Ми виявили, що за таких умов механізм перезаповнення депо ЕР
істотно відрізняється від такого при короткочасній стимуляції клітин: і)
припинення роботи SERCA за таких умов не викликало достовірних змін
депо-керованого [Ca2+]і транзиєнту; іі) блокування як захоплення, так і
вивільнення Са2+ МХ викликало значно більш виражене пригнічення процесу
перезаповнення депо ЕР; ііі) попарне пригнічення SERCA та
Na+/Ca2+-обмінника МХ призводило до практично повного зникнення
депо-керованого [Ca2+]і транзиєнту. Виявлені ефекти ми пов’язуємо з тим,
що за умов потужної стимуляції клітини у субплазматичному просторі між
ЕР та ПМ створюється високий градієнт Ca2+ за рахунок його вивільнення
через InsP3 рецептори, локалізовані у поверхневих доменах ЕР (Larina &
Thorn, 2005), що буде призводити до локальної Ca2+-залежної інактивації
SOC каналів. За цих умов депо-керований вхід Са2+ може здійснюватись
лише у ділянках колокалізації ПМ та МХ, які захоплюючи Са2+ з-під вустя
SOC каналів підтримують депо-керований вхід Са2+. Захоплений
мітохондріями Са2+ транс-мітохондріально переміщується та вивільняється
Na+/Ca2+-обмінником у напрямку до ділянок локалізації SERCA, що й
відображає єдиний механізм перезаповнення ЕР у присутності InsP3 (рис.
24). Таким чином, вклад МХ у процес перезаповнення депо ЕР у значній
мірі залежить від тривалості стимуляції клітин. Присутність InsP3 є
ключовим моментом, що визначає залежність чи, навпаки, відносну
автономність процесу перезаповнення депо ЕР від транс-мітохондріального
транспорту Са2+. Підсумовуючи, одержані дані доводять важливу
фізіологічну роль МХ у регуляції кожного з процесів, суперпозиція яких
визначає особливості формування агоніст-індукованих [Са2+]і транзиєнтів
в ацинарних клітинах.

Загалом, у роботі показано, що підтримання гомеостазу кальцію в
ацинарних клітинах підщелепної слинної залози забезпечується за рахунок
комплексної взаємодії між Са2+-регулюючими системами ПМ, ЕР та МХ.
Взаємодія між Са2+-регулюючими системами здійснюється за рахунок
процесів зворотної взаєморегуляції, можливих завдяки просторовій
колокалізації цих систем.

Са2+-залежні механізми порушення функціонування ацинарних клітин
підщелепної залози за умов цукрового діабету. Згідно клінічних даних
більш, ніж у 50% пацієнтів хворих на цукровий діабет, виявлено
ксеростомію (відчуття сухості у роті), виникнення якої зумовлене
зменшенням секреції слини (Zachariasen 1996; Stegeman, 2005). У стані
спокою (за відсутності стимуляції) основним джерелом слини для
зволоження ротової порожнини є її виведення підщелепною слинною залозою
(Ferguson, 1999). Виявлено, що як структура, так і функції підщелепної
слинної залози за умов діабету зазнають значно більш виражених змін, ніж
привушної та під’язикової залоз (Anderson, 1998). Крім того, згідно
клінічних даних у пацієнтів хворих на діабет ІІ типу виявлено порушення
функціонування саме підщелепної, а не привушної чи під’язикової слинних
залоз (Dodd et al., 2000). Виходячи з цього, вивчення функціонування
підщелепної слинної залози при діабеті може пояснити причини виникнення
симптомів ксеростомії. В експериментах на тваринах, хворих на цукровий
діабет, виявлено драматичне зниження величини основних параметрів як
нестимульованого слиновиділення, так і стимульованого агоністами
М-холінорецепторів. Крім того, ми виявили, що стимулюючий ефект
пілокарпіну на швидкість слиновиділення та вміст секретованого білка у
слині був більш вираженим за умов діабету, ніж у контролі. Це може бути
пов’язано з виникненням на даній стадії захворювання пристосувальних
механізмів, таких як, збільшення густини і/або чутливості
М-холінорецепторів. Незважаючи на те, що такий феномен не було виявлено
раніше для слинних залоз, він зареєстрований для ряду інших тканин,
зокрема, серця (Carrier & Aronstam, 1987), гладеньких м’язів клубової
кишки (Carrier & Aronstam, 1990), vas deferens (Kamai et al., 1994) та
сечового міхура (Kamata et al., 1992). Загалом дані, отримані в
експериментах in vivo, свідчать, що захворювання на діабет модулює
механізми, які опосередковують секрецію слини. Оскільки перебіг [Са2+]i
сигналізації у цитоплазмі та люмені ЕР забезпечує регуляцію секреції
компонентів слини та їх синтез (Lodish et al., 1990; Ambudkar, 2000), їх
зміни повинні відігравати важливу роль у виявлених порушеннях
слиновиділення за умов діабету.

Дійсно, проведені нами дослідження виявили наявність істотних змін
кальцієвого гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози
щурів за умов діабету. Зокрема, нами виявлено підвищення базального
рівня [Са2+]і та зміни перебігу [Са2+]і сигналізації, опосередкованої
дією АХ, а саме зростання за умов захворювання чутливості
М-холінорецепторів. Останнє підтверджує висловлену нами гіпотезу щодо
сенситизації холінорецепторів при діабеті. З іншого боку, ми виявили, що
за умов діабету зменшується амплітуда всіх [Ca2+]і відповідей,
опосередкованих вивільненням Ca2+ з депо ЕР, зокрема, [Ca2+]i
транзиєнтів, викликаних АХ, КХ чи іономіцином у безкальцієвому
середовищі. Загалом, виявлені нами зміни можуть бути зумовлені
накладанням декількох процесів: збільшенням чутливості/густини
М-холінорецепторів та зниженням вмісту Ca2+ всередині люмену ЕР. Останнє
підтверджується зменшенням за умов діабету InsP3- та кофеїн-індукованого
вивільнення Са2+, а також посиленням пасивного витоку Са2+ через
транслоконовий комплекс, що показано шляхом прямої реєстрації [Ca2+]ЕР.
На основі цих даних ми вважаємо, що за умов діабету зменшується
кількість Са2+ в ЕР, здатного вивільнятись при стимуляції клітин
агоністами, а одним із механізмів цього є посилення пасивного
вивільнення Са2+ через транслоконову пору. За умов діабету нами також
виявлено виражене пригнічення функціонування Ca2+-АТФаз ПМ та ЕР, а
також активацію пори перемінного проникнення МХ. Причиною пригнічення
активності Са2+-АТФаз при діабеті може бути зменшення кількості обертів
молекули ферменту у результаті посилення перекисного окислення ліпідів
(Pekiner et al., 2002) і/або зміни конформаційних переходів E1-E2
станів, викликані неферментативним глікозилюванням молекули ферменту
(Gonzalez-Flecha et al., 1999). Підсумовуючи, одержані дані свідчать, що
за умов діабету в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози
спостерігаються драматичні зміни процесів підтримання кальцієвого
гомеостазу. Зменшення активності обох Ca2+-ATPaз, посилення пасивного
витоку Са2+ з ЕР та активація РТР є причинами підвищення базального
рівня [Ca2+]i і, так званого, перевантаження клітини кальцієм. Таке
тривале перевантаження клітин Са2+ призводитиме до його акумуляції в МХ
(Campanella et al., 2004), виснаження клітинних запасів АТФ та
токсичного ефекту (Duchen, 2004). Зменшення активності SERCA та
посилення пасивного витоку Са2+ через транслоконовий комплекс
призводитиме до зменшення вмісту Са2+ у люмені ЕР та порушення [Ca2+]ЕР
гомеостазу. Останнє призводитиме до порушення посттрансляційного
формування білків в ЕР (Kuznetsov et al., 1992), їх дозрівання та
подальшого виведення і, як наслідок, пригнічення секреції слини, що
підтверджується нашими експериментами in vivo. Узагальнююча схема, яка
відображає порушення механізмів підтримання кальцієвого гомеостазу в
ацинарних клітинах підщелепної слинної залози для умов діабету,
представлена на рис. 25.

Загалом, проведені дослідження дають змогу розширити фундаментальне
розуміння механізмів підтримання кальцієвого гомеостазу в ацинарних
клітинах підщелепної слинної залози у нормі та їх зміни при патологічних
станах слинних залоз, а також може бути використане для розробки нових
клінічних методів їх корекції.

Висновки

У представленій роботі відповідно до поставленої мети та завдань
дослідження проведено комплексний аналіз механізмів підтримання
гомеостазу кальцію в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози у
нормі та при експериментально викликаному цукровому діабеті. З одержаних
результатів зроблено наступні висновки:

Природній медіатор парасимпатичної нервової системи АХ незалежно від
концентрації викликає глобальне транзиєнтне (неосциляторне) підвищення
[Ca2+]i, яке ефективно пригнічується блокатором М-холінорецепторів
атропіном. Амплітудно-часові параметри [Ca2+]i транзиєнтів, викликаних
активацією М-холінорецепторів, визначаються суперпозицією процесів
вивільнення Са2+ із внутрішньоклітинних депо, надходження Са2+ ззовні та
його зворотнього захоплення в ЕР Са2+-АТФазою вже під час висхідної фази
[Ca2+]і транзиєнту.

Важлива роль у регуляції процесу АХ-індукованого вивільнення Са2+ з ЕР
належить МХ, які попереджують Са2+-залежну інактивацію InsP3 рецепторів
за механізмом позитивного зворотного зв’язку, що можливо завдяки їх
просторовій колокалізації з ЕР, яку показано методом електронної
мікроскопії.

У ПМ ацинарних клітин підщелепної слинної залози наявні функціонально
активні пуринорецептори Р1 та Р2 типів. Активація Р1 рецепторів
аденозином не призводить до змін [Ca2+]і, проте супроводжується
потенціацією [Ca2+]і транзиєнтів, викликаних активацією
М-холінорецепторів, в основі якої лежить цАМФ-залежна модуляція
ФЛЦ–InsP3 сигнального шляху, оскільки цей ефект відтворюється за умов
прямої активації АЦ. Активація Р2 рецепторів АТФ викликає [Ca2+]і
транзиєнти з ЕС50=136(36 мкМ. Природа АТФ-індукованих [Ca2+]і
транзиєнтів переважно іонотропна, а вклад метаботропних Р2Y рецепторів
складає ~ 35%.

Шляхом прямої реєстрації амплітудно-часових змін концентрації
іонізованого Ca2+ всередині ЕР ацинарних клітин підщелепної слинної
залози вперше показано, що як АХ, так і екзогенний ІnsР3 викликають
транзиєнтне вивільнення Са2+ з ЕР, яке повністю пригнічується блокатором
ІnsР3 рецепторів – гепарином. ІnsР3-чутливе вивільнення Са2+ із ЕР
дзвоноподібно залежить від Са2+ з максимумом в межах його фізіологічних
концентрацій у цитоплазмі (100-400 нМ), потенціюється АТФ у низьких (<1 мМ) концентраціях і пригнічується – у високих. Кофеїн модулює ІnsР3-чутливе вивільнення Са2+ із ЕР шляхом конкуретної взаємодії з АТФ-зв’язуючим центром молекули рецептора. Вперше показано вклад ріанодинових рецепторів у [Ca2+]i сигналізацію в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози. Активація ріанодинових рецепторів кофеїном призводить до транзиєнтного зменшення [Ca2+]ЕР (ЕС50=7,3(1,1 мМ), яке блокується ріанодином, дзвоноподібно залежить від Са2+ (з максимумом при 100 нМ), однак не супроводжуться виникненням генералізованих [Ca2+]i транзиєнтів в інтактних клітинах. Це зумовлено швидким захопленням Са2+, який вивільняється із ріанодинових рецепторів, мітохондріями та частково Са2+-АТФазами EР чи ПМ. Шляхом прямої реєстрації [Ca2+]ЕР, [Ca2+]i та методом електронної мікроскопії одержано докази колокалізації ріанодинових рецепторів, мітохондрій та Са2+-АТФаз ПМ та ЕР. Вперше доведено наявність постійного пасивного витоку Са2+ із ЕР ацинарних клітин, який за фізіологічних умов компенсується рівноважним захопленням кальцію Са2+-АТФазою ЕР. Пасивне вивільнення Са2+ не опосередковується ІnsР3 та ріанодиновими рецепторами, або реверсивним режимом роботи Са2+-АТФази, а здійснюється через транслоконовий комплекс мембрани ЕР. Депо-керований вхід Са2+ є основним шляхом надходження Са2+ в ацинарні клітини підщелепної слинної залози, активація якого відбувається незалежно від способу спустошення депо ЕР (InsP3-залежного чи InsP3-незалежного). Амплітуда депо-керованого входу Са2+ пропорційна мірі спустошення ЕР, а однакова кінетика розвитку депо-керованих [Ca2+]i транзиєнтів незалежно від способу спустошення ЕР свідчить про єдиний механізм їх виникнення. Вперше показано, що МХ визначають амплітудно-часові параметри депо-керованого входу Са2+, здійснюючи контроль за станом депо-керованих каналів ПМ шляхом попередження їх Са2+-залежної інактивації за механізмом позитивного зворотного зв’язку. Блокування Са2+-уніпортеру мітохондрій призводить до пригнічення входу Са2+ як у випадку InsP3-незалежного, так і InsP3-чутливого способу спустошення депо. Блокування захоплення Са2+ мітохондріями при InsP3-чутливому спустошенні ЕР викликає більш виражене пригнічення депо-керованого входу Са2+, що відображає як регуляцію мітохондріями безпосередньо каналів ПМ, так і додатково InsP3 рецепторів. Така регуляція можлива завдяки просторовій локалізації мітохондрій безпосередньо під ПМ та оточених ламелами ЕР, що показано методом електронної мікроскопії. Вперше показано, що транс-мітохондріальне переміщення Са2+ є необхідним для підтримання депо-керованого входу Са2+ та процесу перезаповнення депо ЕР. Вклад МХ в перезаповнення депо ЕР залежить від тривалості стимуляції клітин. За умов спустошенння ЕР короткочасною дією АХ, його перезаповнення здійснюється, в основному, за рахунок прямого захоплення Ca2+ в EР і, додатково, за рахунок транс-мітохондріального транспорту Са2+. За умов тривалої стимуляції клітин, депо-керований вхід Са2+ здійснюється лише у ділянках колокалізації ПМ та МХ, які захоплюють Са2+ з-під вустя SOC каналів. Кальцій, захоплений МХ, після транс-мітохондріального переміщення вивільняється до ділянок його захоплення Са2+-АТФазою ЕР, що і відображає єдиний механізм перезаповнення ЕР у присутності InsP3. В експериментах по визначенню параметрів слиновиділення in vivo виявлено, що у щурів із СТЗ-індукованим діабетом істотно знижується швидкість слиновиділення, активність амілази та концентрація білка слини порівняно до таких у контрольних тварин. Вперше виявлено зміни гомеостазу кальцію у ацинарних клітинах підщелепної слинної залози за умов СТЗ-індукованого діабету. Показано зростання [Са2+]і в стані спокою, чутливості М-холінорецепторів до АХ та КХ та зниження активності Са2+-АТФаз ПМ та ЕР. Виявлені зміни є причиною розвитку цитоплазматичної кальцієвої перегрузки та сповільненої кінетики спаду [Са2+]і транзиєнтів, викликаних активацією М-холінорецепторів. Вперше виявлено, що за умов діабету порушується гомеостаз кальцію у Са2+ депо таких як ЕР та МХ. Показано зменшення вивільнення Са2+ із ЕР незалежно від механізму його активації (агоніст-, ІnsР3- чи кофеїн-індукованого, або рецептор-незалежного). Також виявлено зростання пасивного вивільнення кальцію через транслоконову пору ЕР. Виявлені зміни свідчать про зменшення кількості Са2+ в ЕР. За умов діабету виявлено відсутній у здорових тварин шлях пасивного вивільнення Са2+ із мітохондрій, опосередкований порою перемінного проникнення. Комплекс змін кальцієвого гомеостазу, виявлений нами в мітохондріях та ЕР, є найбільш ймовірною причиною пригнічення процесів синтезу та секреції компонентів слини при діабеті. Загалом, одержані дані свідчать про те, що підтримання гомеостазу кальцію в ацинарних клітин підщелепної слинної залози забезпечується за рахунок комплексної взаємодії між Са2+-регулюючими системами ПМ, ЕР та мітохондрій. Взаємодія між Са2+-регулюючими системами здійснюється за рахунок процесів зворотної взаєморегуляції, можливих завдяки їх просторової колокалізації. Порушення функціонування систем підтримання гомеостазу кальцію є ймовірною причиною розвитку патологічних станів слинних залоз. СПИСОК СТАТЕЙ ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Fedirko N.V., Kruglikov I.A., Kopach O.V., Vats Ju.O., Kostyuk P.G., Voitenko N.V. Сhanges in functioning of rat submandibular salivary gland under streptozotocin-induced diabetes are associated with alterations of calcium signaling and calcium transporting pumps // Biochem. Biophys. Acta. – 2006. – Vol. 1762, № 3. – Р.294-303. Копач О.В., Кругликов І.А., Костюк П.Г., Войтенко Н.В., Федірко Н.В. Властивості інозитолтрифосфат-чутливого депо Ca2+ в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози щурів // Фізіол. журнал. – 2006. – Т. 52, № 1. – С. 30-40. Федірко Н.В., Копач О.В., Войтенко Н.В., Костюк П.Г. АТФ-індукована кальцієва сигналізація в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози //Нейрофизиология/Neurophysiology. – 2005. – Т. 37, № 5/6. – С. 395-402. Федірко Н.В., Копач О.В., Войтенко Н.В., Костюк П.Г. Модулюючий вплив аденозинових Р1 пуринорецепторів на кальцієву сигналізацію, викликану активацією холінорецепторів в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози // Вісн. Харк. ун-ту ім. В.Н.Каразіна, № 716. Біофіз.вісник. – 2005. – Вип. 2 (16). – С. 75-79. Копач О.В., Кругликов И.А., Войтенко Н.В., Костюк П.Г., Федирко Н.В. Механизмы утечки кальция из эндоплазматического ретикулума экзокринных клеток // Нейрофизиология/Neurophysiology. – 2005. – Т. 37, № 4. – С. 339-346. Копач О.В., Кругликов І.А., Войтенко Н.В., Федірко Н.В. Тапсигаргінчутливе та нечутливе внутрішньоклітинне кальцієве депо в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози щурів // Фізіол. журнал. – 2005. – Т. 51, № 1. – С. 62 –70. Вац Ю.О., Клевець М.Ю., Федірко Н.В. Кінетичні характеристики Са2+, Mg2+-ATPаз клітин підщелепної слинної залози щурів // Укр. біохім. журнал. – 2004. – Т. 76, № 6. – С. 44-54. Копач О.В., Федірко Н.В., Кругликов І.А., Войтенко Н.В., Костюк П.Г. Зміни функціонування підщелепної слинної залози щурів за умов експериментально-індукованого діабету // Клінічна та експериментальна медицина. – 2004. – Т. 3, № 2. – С. 462-463. Пасович О.Б., Клевець М.Ю., Федірко Н.В. Зміни внутрішньоклітинного вмісту Са2+ в екзокринних клітинах підщелепної слинної залози щурів за гіперкалієвої деполяризації їх мембрани // Вісник Львів. ун-ту. Серія біологічна. – 2004. – Вип. 35. – С. 236-244. Пасович О.Б., Клевець М.Ю., Федірко Н.В. Адренергічна регуляція Са2+-гомеостазу та секреторної активності підщелепної слинної залози щурів // Вісник Львів. ун-ту. Серія Біологічна. – 2004. – Вип. 38. – С. 171-177. Копач О.В., Федірко Н.В. Кальцій-залежні зміни функціонування ацинарних клітин слинних залоз при дії агоністів холінергічної природи // Вісник Львівського ун-ту. Серія біологічна. – 2004. – Вип. 37. – С. 205-212. Копач О.В., Кругликов І.А., Войтенко Н.В., Костюк П.Г., Федірко Н.В. Пермеабілізовані клітини слинних залоз, як модель для вивчення кальцій-транспортних систем мембрани ендоплазматичного ретикулуму // Фізіол. журнал. – 2003. – Т. 49, № 5. – С. 31-42. Fedirko N., Kopach O., Kruglikov I., Kostyuk P., Voitenko N. Imaging of intrareticular calcium concentration in permeabilized cells // Neurophysiology. 2003. – Vol. 35, № 3/4. – P. 345-346. Пасович О.Б., Федірко Н.В., Клевець М.Ю. Стаціонарний та депо-керований вхід кальцію у секреторні клітини підщелепної слинної залози щурів // Вісник Львів. ун-ту. Серія біологічна. – 2003. – Вип. 32. – С. 195-202. Федирко Н.В., Вац Ю.А., Kригликов И.A., Войтенко Н.В. Изменения функционирования Са2+-АТФаз экзокринных клеток крыс при экспериментальном диабете // Нейрофизиология/Neurophysiology. – 2003. – Т. 35, № 5. – С. 355-360. Fedirko N., Vats Ju., Klevets M., Kruglikov I., Voitenko. N. Neuronal control of the exocytosis and calcium homeostasis // Neurophysiology. – 2002. – P. 144-147. Вац Ю., Федирко Н., Клевец М., Войтенко Н., Роль SH-групп в функционировании кальций-транспортных АТФаз, регулирующих кальциевый гомеостаз и экзоцитоз // Нейрофизиология/Neurophysiology.– 2002.– Т. 34, № 1. – С. 7-17. Федірко Н.В., Вац Ю.О., Клевець М.Ю. Ідентифікація Са2+-активованої, Mg2+-залежної АТФ-ази мікросомальної фракції мембран секреторних клітин ізольованих ацинусов підщелепної слинної залози щурів // Вісник Львів. ун-ту. Серія біологічна. – 2002. – Вип. 28. – С. 303-310. Petersen O.H., Fedirko N.V. Calcium signalling: store-operated channel found at last // Current Biology. – 2001. – Vol. 11, № 13. – P. 520-523. Федірко Н.В., Клевець М.Ю., Кругліков І.А., Вац Ю.О. Зміни концентрації катіонів кальцію у секреторних клітинах ізольованих ацинусов підщелепної слинної залози щурів під впливом ацетилхоліну та норадреналіну // Біофізичний вісник. – 2001. – Т. 1(8), № 525.– С. 54-57. Fedirko N., Klevetz M., Kruglikov I., Voitenko N. Mechanisms supporting calcium homeostasis in rat submandibular salivary gland acinar cells // Neurophysiology. – 2001. – Vol. 33, № 4. – Р. 252-259. Федірко Н.В., Клевець М.Ю. Вплив еозину Y і ортованадату на базальну секрецію та стаціонарний вхід Ca2+ у секреторні клітини екзокринних залоз // Фізіол. журнал. – 2000. – Т. 46, № 6. – С. 3-9. Fedirko N., Klevets M., Vats Ju. Isolated acini as an object for the investigation of the Ca2+-transporting system of the secretory cell membranes // Neurophysiology.– 2000.– Vol. 32, № 3 – P. 183-184. Федірко Н.В., Клевець М.Ю. Докази cтаціонарного входу Ca2+ у клітини слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. larvae та його роль у базальній секреції // Фізіол. журнал. – 1999. – Т. 45, № 4. – Р. 84-91. Матеріали доповідей на конференціях: Kopach О., Kruglikov І., Рivneva Т., Voitenko Н., FedirkoН. Role of mitocondria and Ca2+-ATPases in Ca2+ signalling induced by activation of ryanodine receptors in rat submandibular acinar cells // Biophysicаl J. – 2006. – Vol. 90 – P. 2552. Fedirko N.V., Kopach O.V., Kostyuk P.G., Voitenko N.V. Store-operated Ca2+ entry is regulated by mitochondria in acinar cells of rat submandibular salivary gland // 15-th IUPAB & 5-th EBSA International Biophysics Congress, August 27-Sept. 1 2005, Montpellier, France. – Europ. Biophys. J. – 2005. – Vol. 34, № 6. – Р. 544. Kopach O.V., Voitenko N.V., Fedirko N.V. Basal Ca2+ leak from endoplasmic reticulum of sub-mandibular acinar cells // 15-th IUPAB & 5-th EBSA International Biophysics Congress, August, 27 – Semp. 1 2005, Montpellier, France. – Europ. Biophys. J. – 2005. – Vol. 34, № 6. – Р. 803. Копач О.В., Войтенко Н.В., Федірко Н.В. Депо-керований вхід кальцію у секреторні клітин щурів // III конференція Українського товариства нейронаук, 22-25 травня 2005, м. Донецьк. – Донецьк. – 2005. – С. 58. Kopach O., Kruglikov I., Voitenko N., Fedirko N. Caffeine-induced changes of Ca2+ homeostasis in rat submandibular salivary cells // Regional Biophysics Meeting, 16-20 March 2005, Zrece, Slovenija. – 2005.– P. 42. Копач О.В., Федірко Н.В., Войтенко Н.В. Функціонування кофеїн-чутливого Са2+ депо ендоплазматичного ретикулуму у секреторних клітинах підщелепної слинної залози щурів // Матеріали міжнародної конференції “Клітинні та субклітинні механізми функціонування травної системи”, 7-9 жовтня 2004 р., м. Львів. – Львів. – 2004. – С. 37. Пасович О.В., Клевець М.Ю., Федірко Н.В. Дослідження ролі адренорецепторів в регуляції секреторної активності та Са2+-гомеостазу в клітинах підщелепної слинної залози щурів // Матеріали міжнародної конференції “Клітинні та субклітинні механізми функціонування травної системи”. – Львів, 7-9 жовтня, 2004. – С. 60. Копач О.В., Федірко Н.В. Тапсигаргін-індуковані зміни Са2+-гомеостазу у секреторних клітинах підщелепної слинної залози щурів // І Українська наукова конференція “Прoблеми бiологiчної і медичної фізики”, 20-22 вересня 2004 р., м. Харків. – Xapків. – 2004. – С. 143. Пасович О.В., Клевець М.Ю., Федірко Н.В. Вплив агоністів та антагоністів адренорецепторів на кальцієвий гомеостаз в ізольованих секреторних клітинах підщелепної слинної залози щурів // І Українська наукова конференція “Прoблеми бiологiчної і медичної фізики”. – 20-25 вересня, 2004. Харків. – Xapків. – 2004. – С. 116. Копач О., Федірко Н., Кругліков І., Войтенко Н., Костюк П. Пуринергічна внутрішньоклітинна Са2+-сигналізація у ацинарних клітинах слинних залоз щурів // Установчий з’їзд українського товариства клітинної біології, 25-28 квітня 2004 р., м. Львів. – Львів. – 2004. – С. 35. Пасович О.В., Клевець М.Ю., Федірко Н.В. Зміни внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу в клітинах підщелепної слинної залози щурів під впливом норадреналіну // Установчий з’їзд українського товариства клітинної біології. – 25 – 28 квітня, 2004, м.Львів. – Львів. – 2004. – С. 36. Kopach O.V., Kruglikov I.A., Kostyuk P.G., Fedirko N.V., Voitenko N.V.. Caffeine- induced changes of intrareticular Ca2+ homeostasis in rat submandibular salivary cells // IBRO advanced school of neuroscience “Receptors, Channels, Messengers”, September 16-28 2004. – Yalta (Ukraine). – Р. 17. Fedirko N.V., Vats Ju., Klevets M.Yu. Role of Endoplasmic Ca2+-stores in Cholinergic Ca2+ Signaling in Rat Salivary Acinar Cells // 47th Annual Meeting of the Biophysical Society, 2-7 March 2003, San-Antonio, Texas, USA. – Biophysical J. - 2003. – Vol. 84, № 2. – P. 228. Fedirko N., Vats J., Voitenko N. Effect of streptozotocin-induced diabetes on salivary secretory cells Ca2+-ATPase // 3rd FEPS Congress, 28 June-2 July, 2003, Nice, France. – Abstract book. – P. 16. Kопач O., Федірко Н. Пермеабілізовані ацинарні секреторні клітини слинних залоз як модель вивчення Са2+-транспортних систем мембрани внутрішньоклітинних структур // Збірник тез доповідей VII міжнародного медичного конгресу студентів та молодих учених, 21-23 травня 2003 р., м. Тернопіль. – Тернопіль. – 2003. – С. 202. Вац Ю.О., Федірко Н.В., Клевець М.Ю. Дослідження Ca2+-, Mg2+-ATФазних активностей плазматичної та ендоплазматичної мембран секреторних клітин підщелепної слинної залози щурів// 16-й з`їзд українського фізіологічного товариства. 28-30 травня, 2002 р., Вінниця. – Фізіол. журн. – 2002. – Т. 48, № 2. – С. 130-131. Федірко Н.В., Вац Ю.О., Пасович О.Б., Копач О.В., Клевець М.Ю. Дослідження механізмів підтримання Са2+-гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози щурів.// III з’їзд Українського біофізичного товариства. 8-11 жовтня 2002 р., Львів – Тези доповідей. – С. 68. Вац Ю.О., Федірко Н.В., Клевець М.Ю. Залежність функціональної активності Са2+-АТФаз мембран секреторних клітин слинних залоз від концентрації АТФ // Матеріали міжнародної конференції, присвяченої пам’яті професора Шостаковської І.В. 11-12 жовтня – 2002 – Львів – С. 14. Пасович О.В., Клевець М.Ю., Федірко Н.В. Депо-керований вхід Cа2+ в ацинарні клітини підщелепної слинної залози щурів // Матеріали міжнародної конференції присвяченої пам’яті професора І.В. Шостаковської. 11-12 жовтня – 2002 – Львів – С. 15. Fedirko N.V., Kruglikov I.A., Vats Ju.A., Klevets M.Yu. Possible mechanism of steady-state Ca2+ increase in the acinar secretory cells of rat submandibular salivary glands // Fourth Conference of the Czech Neuroscience Society, October 23-25, 2001, Prague. – Abstract. – 2001. – P. 68. Vats Ju., Klevets M., Fedirko N. Involvement of SH-groups in the regulation of PMCA and SERCA functional activity // Proceedings of the Physiological Society Meeting, Liverpool, July 8-12, 2002. – J. Physiol (Lond). – 2001. – Vol. 543. – P. 66. Fedirko N., Klevets M., Manko V. Role of Ca2+ cations in the plasma membrane functioning of the secretory cells of exocrine glands // Programme and abstract book European research meeting “Calcium as a molecule for cellular integration”, Wye College, Kent, 21-24 July, 2000: Abstract.: 34-5. Fedirko N., Manko V., Klevets M. Affinity of Na+-Ca2+-exchanger in secretory cell membrane to divalent cations // XIII International Biophysics Congress, September 19–24, 1999, New Delhi, India: Abstracts. – Journal of Biosciences. – 1999 – Vol. 24, № 1(131) – P. 281. анотаціЇ Федірко Н.В. Механізми підтримання кальцієвого гомеостазу в ацинарних клітинах підщелепної слинної залози. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 – фізіологія людини і тварин. Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, Київ, 2006. Дисертація присвячена аналізу механізмів підтримання гомеостазу Са2+ у клітинах підщелепної слинної залози в нормі та при патології. Виявлено, що параметри АХ-індукованого підвищення [Ca2+]i визначаються суперпозицією процесів вивільнення Са2+ з ЕР, входу Са2+ ззовні та його зворотнього захоплення в ЕР. Мітохондрії (МХ) регулюють АХ-індуковане вивільнення Са2+ з ЕР, попереджуючи Са2+-залежну інактивацію InsP3 рецепторів. Доведено наявність функціонально активних Р1 та Р2 пуринорецепторів. Активація Р1 рецепторів призводить до потенціації АХ-індукованих [Ca2+]і транзиєнтів за рахунок цАМФ-залежної модуляції ФЛЦ–InsP3 шляху. Вперше доведено наявність функціонально активних RyR, причому Са2+, який вивільняється з них, захоплюється в основному МХ, тоді як Са2+-АТФази ПМ та ЕР відповідають за форму [Ca2+]i сигналу. Виявлено пасивний витік Са2+ з ЕР через транслоконовий комплекс. Вперше виявлено, що МХ визначають амплітудно-часові параметри депо-керованого входу Са2+. Виявлено зміни гомеостазу Са2+ у клітинах підщелепної слинної залози за умов СТЗ-індукованого діабету: зростання [Са2+]і в стані спокою, чутливості М-холінорецепторів та зниження активності Са2+-АТФаз ПМ та ЕР. Вперше виявлено, що за умов діабету порушується гомеостаз Са2+ кальцію в ЕР та МХ ацинарних клітин. Загалом, підтримання Са2+ гомеостазу забезпечується взаємодією Са2+-регулюючих систем ПМ, ЕР та МХ, порушення роботи яких є причиною розвитку патологій слинних залоз. Ключові слова: підщелепна слинна залоза, ендоплазматичний ретикулум, М-холінорецептори, ІnsР3 рецептори, ріанодинові рецептори, мітохондрії, транслоконовий комплекс, депо-керований вхід Са2+, діабет. Федирко Н.В. Механизмы поддержания кальциевого гомеостаза в ацинарных клетках подчелюстной слюнной железы. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.13 – физиология человека и животных. – Институт физиологии им. О.О.Богомольца НАН Украини, Киев, 2006. Диссертация посвящена исследованию механизмов поддержания кальциевого гомеостаза в ацинарных клетках подчелюстной слюнной железы крыс в норме и при патологии. Обнаружено, что не зависимо от концентрации, природный агонист М-холинорецепторов ацетилхолин (АХ) вызывает глобальное повышение концентрации свободного цитоплазматического Са2+ ([Ca2+]i), которое необходимо для активации Cа2+-зависимых К+- и Сl--проводимостей расположенных соответственно в базальном и апикальном полюсах ацинарной клетки и, как следствие, инициации секреции жидкого компонента слюны. При анализе кинетики АХ-индуцированных [Ca2+]і транзиентов обнаружено замедление скорости их развития и спада, а также увеличение амплитуды в Са2+ содержащей среде, что свидетельствует о наложении на быстрое высвобождение Са2+ из эндоплазматического ретикулума (ЭР) более медленного процесса – входа Са2+ из внеклеточной среды. Путем прямой регистрации депо-управляемого входа Са2+, вызванного опустошением депо ЭР с помощью АХ, обнаружено, что его амплитуда больше чем разница между амплитудами АХ-индуцированного [Ca2+]і транзиента в Са2+-содержащей и бескальциевой средах, что свидетельствует о захвате кальция Са2+-АТФазой ЭР уже во время восходящей фазы АХ-индуцированного [Ca2+]і транзиента. Таким образом, несмотря на то, что ІnsP3-индуцированное высвобождение Са2+ из ЭР, является первичным процессом, инициирующим возникновение [Ca2+]і транзиента, мы показали, что амплитудно-временные параметры [Ca2+]i транзиентов, вызванных активацией М-холинорецепторов, определяются суперпозицией процессов высвобождения Са2+ из внутриклеточных депо, входа Са2+ в клетку, а также его обратного захвата в ЭР Са2+-АТФазой. Установлено, что митохондрии (МХ) модулируют АХ-индуцированные [Ca2+]i транзиенты путем предупреждения Са2+-зависимой инактивации ІnsP3-рецепторов по механизму положительной обратной связи, что возможно благодаря их пространственной локализации в непосредственной близости от ЭР, наличие которой показано методом электронной микроскопии. Нами обнаружено наличие активных ионотропных Р2Х и метаботропных P2Y рецепторов в ацинарных клетках подчелюстной слюнной железы. Преобладающий вклад в формирование АТФ-индуцированных [Ca2+]i транзиентов вносят Р2Х рецепторы представленые Р2Х7 подтипом, а метаботропная компонента представлена P2Y2 подтипом. Мы не обнаружили [Ca2+]і транзиентов, вызванных активацией аденозиновых рецепторов, но показали способность аденозина потенциировать [Ca2+]і ответы, вызванные активацией М-холинорецепторов. Путем прямой регистрации концентрации свободного Са2+ в ЭР ([Са2+]ЭР) показано, что АХ и экзогенный ІnsP3 вызывают транзиентное высвобождение Са2+ из ЭР, которое колоколообразно зависит от [Са2+] и модулируется АТФ. Впервые описано участие рианодиновых рецепторов (RyR) в Са2+ сигнализации в данном типе клеток. Показано, что активация RYR вызывает высвобождение Ca2+ из депо ЭР, но не приводит к глобальному повышению Ca2+ в цитоплазме. Это обусловлено быстрым захватом Са2+, высвобождаемого через RYR, митохондриями тогда как Са2+-АТФазы ПМ и ЕР отвечают за форму [Ca2+]i ответа, что возможно благодяря пространственной колокализации этих систем. Впервые установлено, что основным путем пассивного вытока Са2+ из ЭР исследуемых клеток является транслоконовый комплекс ЭР. Впервые показано, что МХ регулируют депо-управляемый вход Са2+ в клетки, предупреждая Са2+-зависимую инактивацию SOC каналов, что возможно благодаря локализации МХ непосредственно под ПМ. Впервые обнаружено, что транс-митохондриальный транспорт Са2+ играет существенную роль в поддержании депо-управляемого входа Са2+, а также процесса перезаполнения ЭР. Вклад МХ в перезаполнение ЭР определяется длительностью стимуляции клеток. Так, при опустошении ЭР кротковременной аппликацией АХ, его перезаполнение происходит в основном путем прямого захвата Ca2+ в ЭР и, дополнительно опосредовано МХ. При длительной стимуляции, депо-управляемый вход Са2+ осуществляется только в местах колокализации ПМ и МХ. После захвата МХ, кальций транс-митохондриально перемещается и высвобождается к учаскам его захвата Са2+-АТФазой ЭР, что является единственным механизмом перезаполнения ЭР в присутствии InsP3. Суммируя, полученные данные поддержание внутриклеточного кальциевого гомеостаза достигается за счет взаиморегуляции Са2+-транспортных систем ПМ, ЭР и МХ, что возможно благодаря их пространственной колокализации. Впервые показано, что уменьшения интенсивности секреции слюны и снижение ее белкового состава при сахарном диабете сопрождаются драматическими изменениями кальциевого гомеостаза в клетках подчелюстной железы. В частности обнаружено увеличение [Са2+]і в состоянии покоя, чувствительности М-холинорецепторов, а также угнетение активности Са2+-АТФаз ПМ та ЭР. Показано также уменьшение высвобождения Са2+ из ЭР (ІnsР3- и RyR-чувствительного, или рецептор-независимого); увеличение пассивного вытока Са2+ из ЭР, а также активацию высвобождения Са2+ из МХ через пору переменной проницаемости (отсутствуещее у здоровых животных). Выявленные изменения внутриклеточной Са2+ сигнализации в ацинарных клетках подчелюстной слюнной железы можно рассматривать как вероятный механизм нарушения процессов секреции при сахарном диабете. Проведенное исследование дает возможность расширить фундаментальное понимание механизмов поддержания кальциевого гомеостаза в ацинарных клетках подчелюстной слюнной железы в норме и их роль при патологических состояниях слюнных желез, а также может быть использовано для разработки новых клинических методов их коррекции. Ключевые слова: подчелюстная слюнная железа, эндоплазматический ретикулум, М-холинорецепторы, ІnsР3 рецепторы, рианодиновые рецепторы, митохондрии, транслоконовый комплекс, депо-управляемый вход Са2+, диабет. Fedirko N.V. Mechanisms maintaining the calcium homeostasis in acinar cells of submandibular salivary gland – Manuscript. Dissertation for doctor of science degree by specialty 03.00.13 – Нuman and аnimal physiology. A.A.Bogomoletz Institute of Physiology NAS of Ukraine, Kiev, 2006. The dissertation is devoted to studying the mechanisms of Ca2+ homeostasis in cells of rat submandibular gland in physiological and pathological conditions. It was shown that parameters of ACh-induced [Ca2+]i transient are determined by superposition of Ca2+ release from ER, Ca2+ influx and Ca2+ uptake into ER. Mitochondria (Mit) regulate ACh-induced Ca2+ release from ER by preventing Ca2+-dependent inactivation of InsP3 receptors. We also showed the availability of functionally active P1 and P2 purinoreceptors. Activation of P1 receptors leads to potentiation of ACh-induced [Ca2+]i transients via cAMP-dependent modulation of PLC-InsP3 pathway. We showed for the first time the presence of functionally active RyRs, whereas Ca2+ that is released from them is captured preferentially by Mit, while Ca2+-ATPases of ER and PM are responsible for the shape of the signal. We described the passive leak from ER that is mediated by a translocon complex. We showed for the first time that Mit define the amplitude-temporal parameters of store-operated Ca2+ influx. We found the changes of Ca2+ homeostasis in acinar cell under STZ-induced diabetes: rise in resting [Са2+]і, sensitivity of M-cholinoreceptors and decrease in the activity of Ca2+-ATPases of ER and PM. We found for the first time the impairement of Ca2+ homeostasis inside ER and Mit under experimental diabetes. In conclusion, the balance of Ca2+ homeostasis is maintained by coordinated activity of Ca2+-regulating systems of PM, ER amd Mit, while its impairement causes the development of salivary cells’ pathological state. Кey words: submandibular salivary gland, endoplasmic reticulum, ІnsР3-receptors, ryanodine receptors, mitochondria, store-operated Са2+entry, translocon complex, diabetes. Підп. до друку 21.03.06. Формат 60 х 84 / 16. Папір тип. Офс. друк. Фіз. друк. арк. 2,6. Ум. друк. арк.. 2,2. Тираж 100 пр. Зам. 81. ________________________________________________________________________ Інститут математики НАН України 01601, Київ 4, МСП, вул. Терещенківська, 3. PAGE 43 PAGE 1

Похожие записи