\bookfoldsheets0АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ
Красько Микола Петрович
Удк 616.379-008.64-092.9;615.244
Лікувальна ефективність холецистокініну октапептиду (26-33) при
цукровому діабеті (експериментальне дослідження)
14.03.05 – фармакологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Київ – 2006
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана на кафедрі фармакології та медичної рецептури
Запорізького державного медичного університету МОЗ України.
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Крайдашенко Олег
Вікторович, Запорізький державний медичний університет МОЗ України,
завідувач кафедри клінічної фармакології, фармації та фармакотерапії.
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор Войтенко Георгій Миколайович, Київська
медична академія післядипломної освіти ім. Шупика МОЗ України, завідувач
секції клінічної фармації кафедри технології ліків та клінічної
фармації;
кандидат медичних наук, старший науковий співробітник Ховака Віталій
Васильович, Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П.
Комісаренка АМН України, провідний науковий співробітник.
Провідна установа
Харківський державний медичний університет МОЗ України, кафедра
фармакології та медичної рецептури.
Захист відбудеться “15” _березня_2006 р. о 15 годині на засіданні
Спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Інституті фармакології та
токсикології АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє,
14.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та
токсикології АМН України за адресою: 03057, м Київ, вул. Ежена Потьє,
14.
Автореферат розісланий “10” лютого 2006 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук ДАНОВА І.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Результатами багатьох досліджень показано, що
препарати, які застосовуються для лікування цукрового діабету I типу,
нездатні повністю попереджувати розвиток його ускладнень (J. Barry,
2005; E.Winifred, 2005). Замісна терапія інсуліном дозволяє
нормалізувати рівень глікемії (протягом доби при використанні
пролонгованих форм), відстрочити розвиток полінейро – та ангіопатій,
однак має певні недоліки (M.Anita, 2005; E. Steven, 2005).
Інсулінотерапія застосовується довічно (може змінюватись тільки вид
інсуліну) з урахуванням вікових особливостей, психоемоційного стану
хворого, дози, режиму призначень і не є ідеальною по відношенню до
розвитку ускладнень і прогнозу захворювання (WHO. Fact sheets, 2002).
Тому, окрім замісної терапії, при цукровому діабеті використовують
патогенетичні препарати та симптоматичні засоби (М.І. Балаболкін, 2000;
В.В. Ховака, 2005). Однак такий підхід не завжди є достатньо ефективним,
тому що при цьому відсутній захист в-клітин панкреатичних острівців від
ураження аутоантитілами, продуктами вільнорадикального окиснення та
прискорених процесів апоптозу (Т.В. Мохорт і ін., 2000).
В зв’язку з цим є актуальним пошук засобів з поліфармакологічною
активністю, які, з одного боку, підвищують активність інсуліну, а з
другого – нормалізують функції життєво-важливих органів і систем. Одним
із таких засобів може бути холецистокінін.
При вивченні цукрового діабету різними дослідниками (D. Saphier, 1986;
Yuan C.S., 2000; Ю.М. Колесник та ін., 2004) було звернуто увагу на те,
що метаболічні процеси призводять до змін вмісту пептидів в крові і
гіпоталамусі у експериментальних щурів, в тому числі і холецистокініну
(M.G. Butler 2000; Hosotani R. et al., 2004). Встановлено, що його
концентрація в паравентрикулярному ядрі гіпоталамусу змінюється в різні
фази травлення і корелює з рівнем глюкози та інсуліну в крові, а сам
пептид модулює активність нейронів вентромедіального ядра гіпоталамусу
(ВМЯГ) і чинить вплив на споживання їжі у якості анорексигенного агента.
В ряді робіт визначено роль ВМЯГ в механізмах центральної регуляції
секреції інсуліну (А.В. Абрамов, 1998; Z. Xu et al., 2001; М.О.
Орловський, 2004). Холецистокінін може синтезуватися в нейросекреторних
клітинах нервової системи і в І-клітинах шлунково-кишкового тракту.
Фізіологічну дію він здійснює опосередковано через рецептори типу I
(ХЦК-І) і типу ІI (ХЦК-ІІ) (A.Funakoshi, 1996; A.H. Meng, 2001). Основні
метаболічні ефекти ХЦК26-33 в організмі пов’язані з обміном вуглеводів і
жирів через вплив на рецептори, локалізовані на ендокринних клітинах
підшлункової залози.
Суттєвим недоліком проведених досліджень хцк26-33 було вибір-
кове вивчення його впливу тільки на жовчовиділення, секрецію травних
ферментів підшлунковою залозою, поведінкові реакції та протисудомну
активність. Досліди проводилися в основному в експериментах in vitro на
культурі в-клітин, ізольованих панкреатичних острівцях або перфузуємих
підшлункових залозах, та при одноразовому введенні ХЦК26-33 в умовах
нормоглікемії або гострої експериментальної гіперглікемії. Вивчення
тільки цих ефектів не могло дати повної картини впливу ХЦК26-33 на
процеси метаболізму в організмі тварин та стан в- і б-клітин при
цукровому діабеті. Крім того, ефекти пептиду, який вводили екзогенно,
залежали від рівня глікемії, що є особливо важливим в плані вивчення
його ролі при цій патології та створення пептидних препаратів із
панкреатопротекторною дією (Г.М. Войтенко, 2002).
Тому вивчення ефектів ХЦК26-33 є актуальним і визначає доцільність його
дослідження у якості потенціального засобу в складі комбінованої з
інсуліном патогенетичної терапії цукрового діабету.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження,
результати яких відображені в даній роботі, були фрагментом комплексної
науково-дослідної роботи кафедр патофізіології, госпітальної терапії-1,
Центральної науково-дослідної лабораторії Запорізького державного
медичного університету МОЗ України “Роль пептидергічної системи
гіпоталамусу в регуляції ендокринної функції підшлункової залози та
стану міокарду в нормі і при цукровому діабеті та обґрунтування засобів
корекції її порушень за допомогою синтетичних нейропептидів”
(експериментально-клінічне дослідження) (№ держреєстрації 0198U004224).
Мета дослідження: на основі експериментальних досліджень встановити
доцільність використання синтетичного ХЦК26-33 у якості лікувального
засобу при цукровому діабеті.
Для досягнення мети сформульовані такі задачі дослідження:
1. Вивчити морфометричні зміни еритроцитів, вміст у них інсуліну,
катехоламінів та стан б- і в- клітин панкреатичних острівців у щурів в
умовах норми та при стрептозотоциніндукованому діабеті;
2. Дослідити вплив ХЦК26-33, у щурів зі стрептозотоциніндукованим
діабетом в залежності від шляху введення (інтраперітонеально,
інтрацеребровентрикулярно, шляхом кон’юнктивальних інстиляцій):
а) на споживання їжі, води і динаміку маси тіла;
б) на стан б- і в-клітин панкреатичних острівців;
в) на еритроцити, вміст у них інсуліну та катехоламінів, активність
процесів вільнорадикального окиснення і антиоксидантного захисту;
3. Встановити лікувальну ефективність ХЦК26-33 у порівнянні з інсуліном
при цукровому діабеті у щурів в залежності від шляху введення пептиду;
4. Визначити ефективність комбінації ХЦК26-33 та інсуліну в умовах
експериментального діабету;
5. Встановити доцільність застосування ХЦК26-33 в комбінації з
інсуліном.
Об’єкт дослідження: білі щурі лінії Вістар зі стрептозотоциніндукованим
цукровим діабетом.
Предмет дослідження: лікувальні властивості ХЦК26-33 при
експериментальному цукровому діабеті у щурів.
Методи дослідження: у роботі були використані сучасні фармакологічні,
морфометричні, цитохімічні методи та методи непрямої імунофлюоресценції,
кількісного аналізу зображення в автоматичному та напівавтоматичному
режимах; біохімічні, радіоімунні та статистичні методи.
Наукова новизна отриманих результатів. В роботі вперше наведено
теоретичне обґрунтування та експериментальне підтвердження доцільності
застосування нейропептиду кишково-мозкової групи – холецистокініну
октапептиду (26-33) при цукровому діабеті.
Вперше встановлено, що синтетичний сульфатований ХЦК26-33 в умовах
цукрового діабету впливає на продукцію інсуліну, а в комбінації з
інсуліном сприяє підвищенню рівня імунореактивного інсуліну в сироватці
крові, зниженню рівня глікемії при всіх шляхах його введення,
нормалізації морфометричних показників еритроцитів, вмісту в них
катехоламінів та інсуліну, а також активності вільнорадикального
окиснення і антиоксидантного захисту. При цьому знижувалась гіперфагія у
щурів.
Експериментально обґрунтовано перспективність застосування комбінації
ХЦК26-33 та інсуліну з метою лікування та профілактики ускладнень
цукрового діабету I типу.
Практичне значення отриманих результатів. Проведені експериментальні
дослідження обґрунтовують доцільність використання ХЦК26-33 для
підвищення ефективності фармакотерапії цукрового діабету I типу.
Отримані результати є актуальними для фармакології, оскільки виявлено
позитивний лікувальний ефект введення ХЦК26-33 і показано важливу роль
еритроцитів крові в регуляції вуглеводного гомеостазу.
Основні результати роботи використовуються в педагогічному процесі на
кафедрах гістології, патофізіології, фармакології, госпітальній терапії
Запорізького державного медичного університету МОЗ України, кафедри
терапії, клінічної фармакології і ендокринології Запорізької медичної
академії післядипломної освіти МОЗ України, кафедри факультетської
терапії та ендокринології Дніпропетровської державної медичної академії
МОЗ України.
Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведено
патентно-інформаційний пошук, аналіз наукової літератури за темою
дисертації, опрацьовані моделі, згідно з якими особисто виконано
експериментальні дослідження, здійснено статистичну обробку і аналіз
отриманих даних та оформлення їх у виді графіків і таблиць,
сформульовано висновки роботи, оформлено дисертаційну роботу,
автореферат та опубліковано основні положення дисертації.
Апробація результатів дисертації. Результати роботи були оприлюднені на
II Всеукраїнському з’їзді фармакологів України “фармакологія 2001 – крок
у майбутнє” (Дніпропетровськ, 2001), на 3-му національному конгресі
патофізіологів України (Одеса, 2000 р), на з’їзді фармацевтів (Харків,
2001), IV Українській науково-практичній конференції за міжнародною
участю по клінічній фармакології (Вінниця, 7-8 жовтня
2004 р).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 робіт, у тому
числі 3 – статті у фахових журналах, 3 – у збірнику наукових праць,
рекомендованих ВАК України, 4 – у збірниках матеріалів конгресів та
конференцій, в тому числі із міжнародною участю, оформлено 1
деклараційний патент України на дослідження.
Об’єм і структура дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 161
сторінках машинописного тексту. Дисертація складається зі вступу, огляду
літератури, матеріалів та методів досліджень, трьох розділів власних
досліджень, аналізу та обговорення результатів досліджень, висновків і
списку літературних джерел. Бібліографія містить 223 джерела, з яких 36
вітчизняних та 187 іноземних авторів. Дисертація ілюстрована 22
таблицями і 12 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи досліджень. Досліди виконувались на 180 щурах-самцях
лінії Вістар масою 250-300 г в осінньо-зимовий період, які були поділені
на експериментальні групи. 3 групи, по 10 тварин в кожній, були
контрольними. У всіх тварин вивчали зміни маси, кількість спожитої їжі і
води, концентрацію глюкози та інсуліну в крові.
Цукровий діабет моделювали одноразовим внутрішньоочеревинним введенням
стрептозотоцину (Sigma-Aldrich, США) у дозі 50 мг/кг. Через 3 тижні,
тобто після розвитку стрептозотоциніндукованого діабету, у тварин
з’являлися характерні метаболічні порушення, зумовлені відносною
інсуліновою недостатністю. У цей період експериментальним тваринам щодня
протягом 10 днів вводили холецистокініну октапептид (хцк26-33)
(Peninsula Laboratories Inc., США) інтраперитонеально (і.п.) у дозі 18,4
мкг/кг, або інстиляції в кон’юнктивальну порожнину (к.і.) обох очей по
0,4 мкг/кг, або інтрацеребровентрикулярно (і.ц.в.) – 0,096 мкг/кг.
хцк26-33 комбінували також з інтраперитонеальними введеннями інсуліну в
дозі 3 Од/кг. Розраховуючи дозовий режим, брали до уваги, що рівень
октапептиду в плазмі інтактних щурів становить 2-4 пмоль/л, причому
максимальну біологічну дію спричиняє сульфатована форма пептиду. Вміст
інсуліну в сироватці крові визначали в пмоль/л радіоімунним методом за
допомогою набору РИО-ИНС-ПГ-125I (ИБОХ АН Беларуси), згідно доданого
протоколу визначення.
Імуноцитохімічне визначення вмісту інсуліну в в-клітинах та глюкагону в
(- клітинах підшлункової залози для вивчення їх функціональної
активності проводили на зрізах в ультрафіолетовому спектрі збудження за
допомогою автоматизованого комплексу, що складається з люмінесцентного
мікроскопу ЛЮМАМ-И2 (ЛОМО, Росія) з фотометричною насадкою ФМЭЛ-1А і
цифровим вольтметром В-7-16А, сполучених із ПК Atari-130ХЕ. автоматично
реєстрували кількість клітин у кожному острівці, вміст гормону в кожній
клітині (в умовних мікроодиницях).
Морфометричні показники еритроцитів досліджували в мазках крові,
кількісно визначали в еритроцитах катехоламіни (адреналін, норадреналін,
дофамін) цитохімічним методом за методикою Г.І. Мардар (1986), а також
використовували цитохімічний метод виявлення в еритроцитах інсуліну за
допомогою комп’ютерної системи цифрового аналізу зображення VIDAS-386
(Kontron Elektronik, Німеччина).
Математичну і статистичну обробку результатів досліджень проводили на
персональному компьютері з використанням програмних пакетів Excel XP
(Microsoft Corp., США). Для кожного параметру, що вивчався, перевіряли
відповідність закону нормального розподілу, після чого розраховували
значення середньої арифметичної (M), дисперсії (у2) і похибки середньої
(m). Перевірку вірогідності змін середніх здійснювали з використанням
t-критерію Стьюдента (t).
Результати дослідження та їх обговорення: Для визначення лікувальної
ефективності ХЦК26-33 при цукровому діабеті були досліджені його ефекти
у щурів при різних шляхах введення. Для цього дози синтетичного
сульфатованого ХЦК26-33 уводилися інтактних щурам та на фоні цукрового
діабету інтраперитонеально, інтрацеребровентрикулярно і шляхом
кон’юнктивальних інстиляцій. Використання декількох шляхів введення
обумовлене насамперед особливостями впливу ХЦК26-33 на структури ЦНС та
інші органи. Групи тварин нараховували по 10 щурів-самців лінії Вістар
для кожного шляху введення. Контрольним групам тварин уводили
еквівалентні дози фізіологічного розчину, а щурам на фоні цукрового
діабету – інсулін внутрішньоочеревинно.
Встановлено, що ХЦК26-33 у тварин без діабету спричинив зниження
споживання їжі, найбільш виражене при інтраперитонеальному введенні і
менш виражене при інтрацеребровентрикулянову та кон’юнктивальних
інстиляціях. Звертав на себе увагу стан “анорексії” у цих тварин, що
проявлялося також у зміні режиму їхнього харчування. При цьому не
відбувалося зниження маси піддослідних щурів і споживання ними води.
Рівень глюкози в крові цих тварин коливався в межах нормальних
показників при одночасному зниженні концентрації інсуліну в сироватці
крові. На нашу думку, це є результатом зменшення його продукції в
в-клітинах панкреатичних острівців при зниженні їхньої чутливості до
глюкози. Таким чином, отримані дані показали вплив ХЦК26-33 на
споживання їжі та основні ланки вуглеводного обміну.
Для вивчення еритроцитів (Ер), зміни яких можуть відображати
спрямованість і тяжкість стану у тварин, досліджували їх морфометричні
параметри та здатність включати інсулін (ІНС) і катехоламіни (КА) у
різних відділах судинного русла (в портальній, нижній порожнистій,
хвостовій венах та аорті). Ці дослідження проводилися у тварин без
патології (в умовах норми) з урахуванням активності процесів
вільнорадикального окиснення (ВРО) і антиоксидантної системи (АОС)
еритроцитів та у тварин із цукровим діабетом на різних стадіях його
розвитку (через 3 та 5 тижнів).
У інтактних тварин морфометричні параметри еритроцитів (площа, периметр
і середній діаметр, коефіцієнт форми) були відносно постійними (табл.1).
Таблиця 1
морфометричні показники еритроцитів
у тварин із цукровим діабетом (М±m)
Групи тварин Площа,
мкм2 Периметр,
мкм Середній діаметр,
мкм Мінімальний діаметр,
мкм Максимальний діаметр, мкм Коефіцієнт
форми
інтактні тварини 35,43±0,09 22,19±0,05 6,69±0,02 6,23±0,02 7,46±0,03
0,962±0,001
Щури з діабетом 3 тижня 36,58±0,08а 22,57±0,02а 6,81±0,01 а 6,35±0,01 а
7,57±0,01 а 0,963±0,002
5 тижнів (контроль) 34,32±0,11а 21,88±0,04 а 6,60±0,01 а 6,16±0,01 а
7,41±0,01 а 0,973±0,002 а
Інс і.п. 35,44+0,06b 22,61±0,06ab 6,82±0,02a 6,24±0,01b 7,48±0,01b
0,965±0,001b
ХЦК26-33
і.п без діабету 36,44+0,11аb 22,52+0,04ab 6,83±0,01 ab 6,33±0,01 ab
7,63±0,01 ab 0,961±0,001b
з діабетом 37,67±0,14abc 22,81±0,06abc 6,91±0,02abc 6,26±0,01ab
7,56±0,01abc 0,964±0,001b
КОМБІНАЦІЯ №1 36,04±0,06abcd 22,31±0,06abcd 6,72±0,02bcd 6,27±0,01ab
7,52±0,01b 0,964±0,001b
ХЦК26-33
і.ц.в без діабету 35,51±0,13 b 22,22±0,04 b 6,70±0,01 b 6,27±0,02b
7,57±0,02 b 0,962±0,001b
з діабетом 34,55±0,15ac 21,91±0,05ac 6,60±0,02c 6,14±0,01ac 7,41±0,02
0,962±0,001b
КОМБІНАЦІЯ №2 35,15±0,07abcd 22,12±0,05bcd 6,63±0,02c 6,23±0,01d
7,43±0,02 0,963±0,001b
ХЦК26-33 к .і без діабету 34,61±0,09 аb
21,95±0,03 аb 6,62±0,01 аb 6,33±0,03 аb 7,62±0,02 аb 0,968±0,005
з діабетом 34,99±0,09abc 22,09±0,03bc 6,66±0,01c 6,20±0,01 7,46±0,01
0,967±0,005
КОМБІНАЦІЯ №3 35,28±0,08bd 22,24±0,03bcd 6,71±0,01bc 6,22±0,01 7,48±0,01
0,966±0,005
Примітки: в цій та табл. 2 і 3: 1.a -рJ?3/4? 3/4 A ae , . ? "$3/4 A ae e >,?yyyyyyeaUUUUOUAEUUUUUUUU
??????
????????
??????
??????
??????
„
]„ath^„
Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter
