НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

ГАЛЬЧЕНКО СЕРГІЙ ЄВГЕНОВИЧ

УДК 615.361.014.41.451.16:57.043

Кріоконсервування фрагментів органів ссавців і біологічна дія одержаних
з них водно-сольових екстрактів

03.00.19- кріобіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Харків 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН
України.

Науковий консультант:

доктор медичних наук, професор, Заcлужений діяч науки і техніки України
Сандомирський Борис Петрович, Інститут проблем кріобіології і
кріомедицини НАН України, завідувач відділу експериментальної
кріомедицини.

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Розанов Леонід
Федорович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України,
провідний науковий співробітник відділу низькотемпературного
консервування, м. Харків;

Доктор біологічних наук, професор Перський Євген Ефроїмович, Харківський
національний університет ім. В.Н. Каразіна, завідувач кафедри біохімії
біологічного факультету, м. Харків.

Доктор медичних наук, професор, Заслужений діяч науки і техніки України
Турчин Іван Семенович, Український науково-практичний центр ендокринної
хірургії, трансплантації ендокринних органів і тканин МОЗ України,
завідувач відділу експериментальної і клінічної трансплантології, м.
Київ.

Провідна установа:

Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця МОЗ України,
Науково-дослідний лабораторний центр, м. Київ.

Захист відбудеться “ 22” травня 2007 року о 1330 годині на засіданні
спеціалізованої ради Д 64.242.01 при Інституті проблем кріобіології і
кріомедицини НАН України за адресою 61015, м. Харків, вул.
Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту проблем
кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою м. Харків, вул.
Переяславська, 23.

Автореферат розісланий “ 19 ” квітня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

член-кореспондент НАН України,

доктор медичних наук, професор
А.М. Гольцев

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Останнім часом в Україні та за її межами
проводяться широкі дослідження ефективності та механізмів дії препаратів
клітинної та тканинної терапії, в тому числі створених із ксеногенних
органів (И.П. Ашмарин и др., 2002; Т.П. Бондаренко, 2003; И.П. Кайдашев
и др., 2003; Б.П. Сандомирський и др., 2003; K. Edamura, 2003; А.М.
Гольцев та інш., 2004; И.С. Ролик, 2004; В.І. Грищенко, 2005; C.N.
Berger, 2005). Головним чином це пов’язано з тим, що при використанні
ксеногенного матеріалу не виникають морально-етичні проблеми, а також
відсутня небезпека інфікування на характерні для людини віруси (ВІЛ,
гепатит, тощо), яка має місце при використанні алогенного матеріалу
(О.И. Смыкодуб, 2002). Але залишається небезпека передачі загальних для
людини та тварин інфекцій. Тому в одержаному від тварин матеріалі
повинна бути відсутня бактеріологічна, вірусологічна та мікологічна
контамінація (Наказ МОЗ України № 96 від 4 травня 2000 р). Для
проведення аналізів на відсутність контамінації такого матеріалу
потрібен відповідний час, протягом якого його раціонально зберігати в
кріоконсервованому стані. Тканинні препарати використовують в клініці та
наукових дослідженнях у вигляді клітин, фрагментів органа, екстрактів
тканини відповідного органа та інш. Тому в своїй роботі ми вивчили вплив
умов кріоконсервування на збереження фрагментів органів свиней та
поросят, а також склад та біологічну активність водно-сольових
екстрактів, одержаних з деконсервованого матеріалу.

На теперішній час накопичено достатньо наукової інформації про вплив
швидкостей охолодження, різних кріопротекторів і їх концентрацій на
збереження біологічного матеріалу після кріоконсервування. Слід
зазначити, що вплив вищевказаних чинників на клітинні суспензії при їх
кріоконсервуванні вивчений досить повно, а вплив на збереження
фрагментів досліджено значно менше.

Практично не вивченим залишається питання щодо стану деконсервованих
фрагментів органів після відігріву та повернення в умови нормотермії. У
зв’язку з цим доцільно дослідити вплив різних швидкостей охолодження на
фрагменти тканин, в яких існують клітинне мікрооточення, міжклітинні
зв’язки та інш. Слід мати на увазі, що при кріоконсервуванні процеси
позаклітинної кристалізації, зневоднення клітин, їх взаємодія з
позаклітинними кристалами в суспензії клітин і тканині протікають
по-різному. Недостатньо вивченим залишається питання ефективності
кріопротекторів залежно від їх природи (спирт, оксид, полімер) при
кріоконсервуванні фрагментів тканин різних органів. Крім того,
кріостійкість тканини може також залежати від віку тварини. Одержані
дані можуть бути основою для теоретичного обґрунтування застосування тих
або інших швидкостей охолодження і кріопротекторів для кріоконсервування
тканинних препаратів. Вплив умов кріоконсервування на збереження
біоматеріалу доцільно вивчати на фрагментах органів з різною структурою
тканини (підшлункова залоза, печінка, селезінки) і одержаних від тварин
різного віку. Такий вибір об’єктів пов’язаний з тим, що препарати з цих
органів проявляють високу біологічну активність і знаходять досить
широке використання в наукових дослідженнях та клінічній практиці (В.И.
Зубков, 2000; т Н.А. Онищенко и др., 2000; T. Kin et. al., 2002; H.
Krook, 2002; О.П. Потіха, 2003).

У всьому світі, зокрема і в Україні, зростає кількість хворих на
цукровий діабет (Ю.І. Караченцев, 2002), який призводить до багатьох
порушень в організмі та ускладнень. Наприклад, складним є хірургічне
лікування даної категорії хворих у зв’язку з уповільненням репараційних
процесів і небезпекою розвитку гнійних ускладнень. Будь-яке оперативне
втручання призводить до дестабілізації вуглеводного обміну і вимагає
значного підвищення дози екзогенного інсуліну. При трансплантація
острівців підшлункової залози спостерігається часткова компенсація
діабету, стабілізація перебігу хвороби, перехід до більш легкої форми, а
найголовніше — стабілізація, а у ряді випадків — і зворотній розвиток
судинних і неврологічних ускладнень, перш за все мікроангіопатій, чого
практично неможливо досягти іншими шляхами (І.С. Турчин, 2003). Проте
широке впровадження даного методу лікування в клінічну практику
ускладнено труднощами при отриманні і збереженні запасів гормонально
активної тканини в кількості, здатній задовольнити запити клініки.
Рішенням цієї проблеми може бути отримання біоматеріалу в
спеціалізованій лабораторії і створення низькотемпературного банку для
його довготермінового зберігання.

Для компенсації септичних і токсичних станів використовують методи,
засновані на екстракорпоральному очищенні і модуляції складу крові
контурами для гемоперфузії, що включають функціонально активні клітини
або тканинні фрагменти ксеногенних органів (Н.А. Онищенко, 1999; В.Е.
Рябинин, 2002). Ксеногенні органи знаходять також використання при
одержанні різноманітних тканинних препаратів, в тому числі і екстратів,
які містять регуляторні пептиди (В.Х. Хавинсон, 2005).

Отже, кріобіологічні підходи при довготерміновому зберіганні
біологічного матеріалу є перспективними, а вивчення впливу режимів
кріоконсервування фрагментів органів на їх збереження, склад одержуваних
з них екстрактів і їх біологічної дії має науковий та практичний
інтерес.

Зв’язок роботи з науковими програмами. Робота виконувалась в рамках
науково-дослідних тем Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН
України: “Розробка технології кріоконсервування фрагментів деяких
ксеноорганів для клінічного застосування” (шифр-2.2.6.75, №
держреєстрації 0100U004240) і “Дослідження впливу та механізму дії
кріоконсервованих тканинних препаратів з ксеногенних органів на перебіг
ряду патологічних процесів в організмі” (шифр-2.2.6.05, № держреєстрації
0102U002027).

Мета і задачі дослідження. Визначити вплив умов кріоконсервування на
збереження фрагментів печінки і підшлункової залози свиней та
новонароджених поросят і селезінки свиней, а також на склад одержуваних
з них водно-сольових екстрактів і їх біологічну дію при
експериментальних патологічних станах.

Відповідно до поставленої мети передбачалося вирішити такі задачі:

Вивчити збереження в часі фрагментів печінки і селезінки свиней, а також
печінки і підшлункової залози новонароджених поросят залежно від природи
кріопротектора, його концентрації і швидкості охолодження.

Визначити кількісний склад водно-сольових екстрактів фрагментів печінки
та підшлункової залози новонароджених поросят і підшлункової залози,
печінки та селезінки свиней залежно від умов одержання.

Визначити молекулярно-масовий розподіл речовин пептидної природи в
екстрактах кріоконсервованих фрагментів ксеноорганів.

Провести дослідження взаємодії компонентів екстрактів з альбуміном.

Визначити біологічну дію екстрактів кріоконсервованих фрагментів органів
при експериментальному цукровому діабеті, токсичному гепатиті, цирозі
печінки, опіковій травмі.

Дослідити вплив екстрактів кріоконсервованих фрагментів органів на
тварин різного віку.

Провести експериментальне вивчення впливу суміші екстрактів
кріоконсервованих фрагментів органів свиней на ріст пухлини Герена.

Об’єкт дослідження — процес низькотемпературного кріоконсервування
фрагментів органів та одержання з них екстрактів, а також їх біологічна
дія при експериментальних патологіях.

Предмет дослідження — фрагменти печінки, селезінки, підшлункової залози
свиней, а також печінки і підшлункової залози новонароджених поросят;
екстракти кріоконсервованих фрагментів органів.

Методи дослідження: полярографічний, спектрофотометричний,
спектрофлуориметричний, гель-проникаючої хроматографії, диференціальної
скануючої калориметрії, радіоімунологічний, хемілюмінесцентний,
гістологічний, світлової мікроскопії, прижиттєвої мікроскопії
мікрогемоциркуляторного русла печінки, а також математичні методи
статистичної обробки.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше було проведено комплексне
вивчення впливу кріопротекторів різної хімічної природи та швидкостей
охолодження на збереження протягом деякого часу після відігріву
фрагментів різних органів свиней та поросят.

При вивченні впливу режимів заморожування на збереження фрагментів
підшлункової залози поросят встановлено, що кращий захист матеріалу
забезпечують ДМСО та ПЕО-1500, в порівнянні з гліцерином та ПЕО-400, за
показниками інтенсивності ендогенного дихання та перекисного окислення
ліпідів. Інсулінпродукуюча здатність матеріалу не відрізняється від
контролю при використанні ДМСО та ПЕО-1500 в якості кріопротекторів.
Вперше показана висока ефективність поліетиленоксидів як кріопротекторів
при кріоконсервуванні фрагментів печінки та селезінки. Доведена також
можливість кріоконсервування такого матеріалу з використанням високих
швидкостей охолодження. Отже, отримані фундаментальні результати
дозволили теоретично обгрунтувати можливість оптимізації процесу
кріоконсервування фрагментів органів.

Вперше встановлено, що використання кріобіологічних підходів дозволяє
збільшити вихід в екстракт речовин пептидної природи, а також той факт,
що молекулярно-масовий спектр цих речовин залежить від органа та віку
тварин.

Важливе теоретичне значення мають вперше одержані дані, що речовини, які
входять до складу екстрактів кріоконсервованих фрагментів ксеноорганів,
зв’язуються з альбуміном сироватки крові. При уведенні в організм
пептидів таке зв’язування повинно захищати їх від дії пептидаз.

Показано, що вищезгадані екстракти проявляють високу біологічну
активність. При алоксановому цукровому діабеті екстракт підшлункової
залози свиней більш ефективно знижує рівень глюкози в крові та рівень
перекисного окислення ліпідів в організмі ніж фрагменти. Екстракти
печінки стимулюють процеси репарації та регенерації в ураженому органі
при токсичному гепатиті та цирозі печінки.

Встановлено також, що екстракти печінки та підшлункової залози свиней,
які проявляють високу біологічну активність при патологіях відповідних
органів, практично не впливають на перебіг патології в іншому органі.
Таким чином, регуляторний вплив екстрактів спрямовано на клітини органа,
з якого вони були отримані, тому характер їх дії є органоспецифічним.
Екстракт селезінки свиней сприяє нормалізації досліджених показників при
цукровому діабеті, токсичному гепатиті, прискорює процес загоєння
опікових ран.

Хронічне уведення щурам починаючи з 6-місячного віку екстрактів
ксеноорганів не впливає на зміну маси тварин, обумовлену фізіологічними
причинами. Концентрація ТБКАП в плазмі крові дослідних тварин достовірно
не відрізнялась від цього показника у контрольних протягом усього строку
спостереження (12 місяців). При уведенні суміші екстрактів 24-місячним
щурам спостерігаються зниження активності пероксидації ліпідів в
організмі та збільшення тривалості життя тварин.

За результатами проведених досліджень доведено, що використання суміші
екстрактів печінки, селезінки та підшлункової залози свиней протягом 10
діб сприяє гальмуванню росту карциноми Герена в початковий період на
24,7%, якщо уведення починали відразу після трансплантації пухлини. При
цьому збільшується тривалість життя щурів.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені методи
кріоконсервування фрагментів органів дозволяють створити банк
кріоконсервованого матеріалу для клінічного застосування та наукових
досліджень. Використання поліетиленоксидів як кріопротекторів дозволяє
спростити процес кріоконсервування, тому що зникає необхідність у
відмиванні матеріалу від кріопротектора розчинами цукрози.

Розроблений спосіб одержання екстрактів ксеногенних органів з
використанням кріобіологічних технологій дозволяє не тільки збільшити
кількість речовин пептидної природи, які виходять в розчин, але значно
спростити та скоротити процес одержання екстрактів у порівнянні з
відомими способами (Патент України № 64381 А).

Встановлений ефект зв’язування компонентів екстрактів з сироватковим
альбуміном може розглядатися як один із специфічних механізмів
транспортування біологічно активних речовин до відповідних тканин і
органів. Результати досліджень можуть застосуватися при розробці методів
терапії, заснованих на використанні сироваткового альбуміну як
переносника біологічно активних компонентів екстрактів (Патент України №
11183). На основі даних дослідження впливу екстрактів підшлункової
залози свиней на перебіг експериментального діабету було розроблено
засіб для лікування цукрового діабету (Патент України № 6704). Отримані
результати відносно біологічної дії екстрактів кріоконсервованих
фрагментів печінки при дифузних захворюваннях печінки можуть бути
використані при розробці препаратів для профілактики та лікування
токсичного гепатиту і цирозу печінки. На основі екстракту селезінки
свиней розроблено засіб для лікування ран (Патент України № 54055).

У зв’язку з тим, що екстракти зменшують рівень перекисного окислення
ліпідів у організмі старих тварин і збільшують тривалість їх життя, вони
можуть знайти використання в геріатричній практиці.

Встановлено, що досліджені екстракти сприяють гальмуванню росту
карциноми Герена, збільшують тривалість життя експериментальних щурів.
Одержані результати можуть бути основою для більш детальних досліджень
термінів, методів застосування екстрактів кріоконсервованих фрагментів
органів свиней і механізмів їх дії на ріст пухлин.

Особистий внесок здобувача. Основні результати досліджень, які наведені
в дисертації, одержані здобувачем особисто. Автором дисертаційної роботи
визначені тема, мета, задачі роботи та методи досліджень. Автор приймав
безпосередню участь у проведенні експериментів. Статистична обробка,
аналіз, інтерпретація та узагальнення одержаних результатів, а також
формулювання основних положень і висновків проведені автором самостійно.
При виконанні окремих розділів було отримано методичну та консультативну
допомогу від зав. відділу, канд. мед. наук І.П. Висеканцева, ст. наук.
співр., канд. біол. наук О.Ю. Семенченка, ст. наук. співр., канд. біол.
наук Т.С. Дюбко (Інститут проблем кріобіології і кріомедицини), доцента,
канд. мед. наук Т.В. Гануліч (Харківський державний медичний
університет), ст. наук. співр., канд. біол. наук Н.Є. Узлєнкової
(Інститут медичної радіології ім. С.П. Григор’єва АМН України).

В опублікованих із співавторами працях особистий внесок здобувача
полягає:

— у роботах [1 -6, 11, 12] у виборі режимів і проведенні
кріоконсервування; визначенні інтенсивності перекисного окислення
ліпідів і показників біоенергетики в фрагментах органів;

— у роботах [7 — 10] в одержанні екстрактів, оцінці їх біологічної дії в
експерименті;

— у роботах [13 — 17, 20, 23 — 26, 30, 31] в одержанні екстрактів;
виборі методичних підходів; участі в моделюванні патологічних станів;
експериментальному визначенні біологічної дії екстрактів;

— у роботах [21, 22, 32, 34] в одержанні екстрактів; виборі методичних
підходів; проведенні експериментальних досліджень взаємодії компонентів
екстрактів з альбуміном.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи доповідались та
обговорювались на Науково-практичній конференції
”Структурно-функциональные единицы и их компоненты в органах
висцеральных систем в норме и патологии» (Харьков, 1991); Conference
Theoretical basis of cryopreservation (Hradek Kralove, 1992); Burn
symposium on occasion of the 40-th anniversary of the Prague Burn Centre
(with international participation) (Prague, 1993); Международном
хирургическом конгрессе ”Раны, ожоги, повязки” (Тель-Авив, 1994); Proc.
3-rd Intern. Congress on Wound, Burn and Dressing (Tel-Aviv, 1994);
Proc. I-st Intern. Congress on Biological Med (Tel-Aviv, 1994); I
З’їзді українського товариства кріобіології і кріомедицини (Харьків,
1995); IWA. International Wound association the 4-th International
Congress (Tel-Aviv, 1996); CRYO’96 “The 33-rd Annual Meeting of the
Society for Cryobiology” (Indianapolis, 1996); CRYO’97 “The 34-th Annual
Meeting of the Society for Cryobiology” (Barcelone, 1997); «Актуальные
вопросы репродуктологии и криомедицины» (Харьков, 1998); “Allograft
against disability” 2-nd World Congress on Tissue Banking and 8-th
International Conference of EATB» (Warsawa, 1999); Всеукраинской
научной конференции “Успехи и перспективы развития криобиологии и
криомедицины” (Харьков, 2001); Научно-практической конференции
“Лекарства-человеку” (Харьков, 2001); Международной научно-практической
конференции “Новые технологии применения биологически активных веществ”
(Алушта, 2002); Науково-практичній коференції «Сучасні напрямки розвитку
ендокринології“ (Другі Данилевські читання) (Харків, 2003);
Науково-практичній конференції ”Проблеми клітинної та тканинної
трансплантології“ (Івано-Франківськ, 2003); «Cryobiomol, Low temperature
biology» (Coimbra, 2003); Х Конгресі Світової федерації українських
лікарських товариств (Чернівці, 2004); III съезде онкологов и радиологов
СНГ (Минск, 2004); Міжнародній науковій конференції “Каразинські
природознавчі студії” (Харків, 2004); Международной научно-практической
конференции “Применение лазеров в медицине и биологии” (Одесса, 2004); I
Міжнародній науково-практичній конференції «Створення, виробництво,
стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів та біологічно
активних добавок» (Тернопіль, 2004); III з’їзді трансплантологів України
(Донецьк, 2004); Четвертих Данилевських читаннях «Фундаментальні питання
експериментальної та клінічної ендокринології» (Харків, 2005).

Публікації. Основні положення дисертації викладені в 61 науковій праці:
32 статтях, опублікованих в фахових наукових виданнях, 4 патентах, 2
методичних рекомендаціях і 23 тезах доповідей.

Структура дисертації. Робота викладена на 272 сторінках. Вона має вступ,
основну частину, яка складається з трьох розділів (огляд літератури,
матеріали і методи дослідження, отримані результати та їх обговорення),
аналіз і узагальнення результатів, висновки. Список використаної
літератури складає 487 джерел і викладений на 55 сторінках. Дисертація
містить 31 рисунок та 52 таблиці.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Експерименти проведені відповідно до
«Загальних принципів експериментів на тваринах», схвалених II
Національним конгресом з біоетики (20.09.04 р., Київ, Україна) і
узгоджених з положеннями «Європейської Конвенції про захист хребетних
тварин, які використовуються для експериментальних і інших наукових
цілей» (Страсбург, 1985).

В дослідженнях були використані фрагменти органів статевозрілих свиней
та новонароджених поросят, а також водно-сольові екстракти, які
одержували з кріоконсервованих фрагментів ксеноорганів. Фрагменти
печінки одержували шляхом продавлювання її шматочків через решітку з
отворами діаметром 0,8 мм, а фрагменти підшлункової залози та селезінки
— подрібнюючи шматочки органів ножицями. Маса фрагментів становила в
середньому 2 – 5 мг.

Перед кріоконсервуванням до фрагментів органів по краплях додавали в
співвідношенні 1:1 розчин кріопротектора подвійної концентрації, завись
ретельно і обережно перемішували та розфасовували в поліетиленові ампули
об’ємом 1,5 або 20 мл при заморожуванні зі швидкостями охолодження 1, 10
та 100єС/хв. При заморожуванні зі швидкостями охолодження 1000, 8000 та
80000єС/хв матеріал поміщали в контейнери з алюмінієвої фольги товщиною
30 мкм. Товщина заморожуваного шару становила 0,3 мм. Розмір контейнера
40х45 мм.

Заморожування фрагментів проводили за допомогою програмного заморожувача
УОП-6 виробництва СКТБ з ДВ ІПКіК НАН України (швидкості охолодження 1
та 10 єС/хв) до температури -70єС з наступним перенесенням в рідкий
азот; зануренням поліетиленового контейнера або контейнера з алюмінієвої
фольги в рідкий азот (швидкості охолодження 100 та 1000єС/хв відповідно)
та за допомогою пристрою для заморожування біологічних об’єктів (8000 та
80000єС/хв), який дозволяє отримувати високі швидкості охолодження
(Патент РФ № 1655426). Заморожений матеріал зберігали в рідкому азоті.

Матеріал відігрівали на водяній бані з температурою 37 – 40єС. Фрагменти
відмивали від ПЕО-400 та ПЕО-1500 фізіологічним розчином, а від
гліцерину та ДМСО — розчином сахарози тієї ж молярної концентрації що і
кріопротектор.

Інтенсивність дихання вимірювали полярографічним методом (Е.Н. Мохова,
1978) на полярографі фірми Radelkis (Угорщина) в нмоль О2/хв/ мг
тканини, швидкість відновлення фериціаніду калію — спектрофотометрично
при довжині хвилі 420 нм (Л.Д. Лукьянова и др., 1982).

Екстракти одержували з нативних або кріоконсервованих фрагментів органів
шляхом їх інкубації в фізіологічному розчині. Екстракти для дослідження
молекулярно-масового розподілу пептидів отримували з фрагментів органів,
кріоконсервованих в присутності 10%-го ПЕО-1500 зі швидкістю охолодження
1°С/хв. Ці ж екстракти використовували і в інших експериментальних
дослідженнях.

Загальну концентрацію білків в екстрактах визначали модифікованим
методом Лоурі (І.П. Кайдашев, 2003), концентрацію пептидів і нуклеотидів
– спектрофотометричним методом при довжині хвилі 280 і 260 нм
відповідно (Д. Уильямс, 1978). Молекулярно-масовий розподіл
низькомолекулярних фракцій пептидної природи досліджували методом
високоефективної гельпроникаючої хроматографії (Б.В. Столяров и др.,
1998).

Для моделювання експериментального цукрового діабету статевозрілим
щурам-самцям масою 180-210 г одноразово під шкіру вводили
алоксан-моногідрат (ICN Biomedical Inc.) в дозі 130 мг/кг маси тіла
тварини після попереднього 24-годинного голодування при вільному доступі
до води. Критерієм цукрового діабету була концентрація глюкози в
крові не менше 9 ммоль/л (А.С. Ефимов и др., 1981).

Токсичний гепатит викликали одноразовим уведення в черевну порожнину
40%-го розчину тетрахлорметану на вазеліновій олії в дозі 0,4 мл/100 г
маси тіла тварини (І.П. Кайдашев, 2003). Цироз печінки моделювали
введенням під шкіру 40%-го розчину тетрахлорметану в олії з персикових
кісточок у дозі 0,2 мл на 100 г маси тіла тварин два рази на тиждень
(Н.Х. Абдулаев и др., 1989). Всього було зроблено 16 ін’єкцій.

Термічний опік шкіри моделювали на щурах лінії Вістар масою 180 — 210 г
(Б.А. Парамонов и др., 2002). Під поверхневим ефірним наркозом видаляли
шерсть на спині. Опік викликали мідним аплікатором з діаметром 10 мм і
температурою 100°С, експозиція — 40 сек.

Експериментальною моделлю росту пухлини була аденокарцинома Герена, штам
якої був наданий Інститутом експериментальної патології, онкології та
радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Трансплантацію пухлини
проводили шляхом підшкірного уведення 0,5 мл 20%-ї суспензії клітин
пухлини (Н.Е. Узленкова, 2002).

Дослідження впливу препарату при хронічному уведенні (1 раз на місяць)
протягом року проводили на щурах лінії Вістар починаючи з 6-місячного
віку. Старим щурам, тобто тим, які досягли 24-місячного віку, уводили
суміш екстрактів протягом десяти діб.

Процеси вільнорадикального окислення оцінювали хемілюмінесцентним
методом. Рівень перекисного окислення ліпідів визначали за рівнем ТБКАП
в сироватці крові та тканинах органів спектрофотометричним методом (при
довжині хвилі 532 нм), використовуючи стандартні методики (А.В. Арутюнян
и др., 2000; С.Е. Овсянников и др., 1996).

Фрагменти підшлункової залози культивували в середовищі такого складу:
80% середовища 199, 10% ЕТС, 5% гідролізату лактальбуміна, 5% середовища
Ігла, пеніцилін і стрептоміцин із розрахунку по 100 од/мл (Б.К.
Гаврилюк, 1983). Вміст інсуліну в середовищі культивування визначали
радіоімунологічним методом за допомогою наборів РИО-ИНС-ПГ-125J (м.
Мінськ, Білорусь). Рівень глюкози в сироватці крові встановлювали натще
хромооксигеназним методом з використанням набору фірми “Lachema”
(Чехія). Активність АлАТ та АсАТ досліджували з використанням
стандартних наборів АО „Реагент” (м. Дніпропетровськ).

Для гістологічного аналізу шматочки тканини фіксували в 10%-му
нейтральному формаліні з подальшою заливкою в парафін. Одержані з
парафінових блоків зрізи завтовшки 6-8 мкм фарбували гематоксиліном і
еозином (О.В. Волкова и др., 1982). Мікрогемоциркуляцію в печінці
вивчали методом вітальної мікроскопії за допомогою контактного
мікроскопа Люмам К-1 (И.В. Слета, 2002).

Площу ран встановлювали планіметричним методом (І.П. Кайдашев, 2003).
Для визначення ступеня обсіменіння рани і видової приналежності
мікроорганізмів з поверхні рани відбирали біоптати та робили мазки.
Виділення та ідентифікацію аеробної і анаеробної мікрофлори проводили за
стандартними методиками (М.И. Кузин и др., 1990; Н.К. Коваленко и др.,
2000).

Взаємодію екстрактів з альбуміном визначали спектрофлуориметричним
методом на спектрофлуориметрі Varian Cary Eclipse (А.П. Демченко, 1988).
Калориметричні вимірювання виконували на диференційному адіабатичному
скануючому мікрокалориметрі ДАСМ-4 (А.В.Зинченко и др., 1977).

Статистичну обробку результатів проводили за допомогою пакета програм
Statistica for Windows 5.1 (В.П. Боровиков и др., 1997).

Результати власних досліджень

Збереження фрагментів підшлункової залози поросят в залежності від умов
кріоконсервування. До клітинного складу фрагментів підшлункової залози
поросят входять переважно ацинарні та острівцеві клітини. Після
отримання фрагментів звертає на себе увагу різний стан цих клітин:
ацинарні клітини на гістологічних зрізах мають ознаки набряку, тоді як
острівці складаються з характерних компактних сферичних клітин без ознак
дистрофії. Оскільки підшлункова залоза цікавить дослідників з точки зору
гормональної продукції, видалося доцільним вивчити стан її біоенергетики
та здатності до інсулінпродукції. Було встановлено, що під час
гіпотермічного зберігання фрагментів підшлункової залози протягом 15 год
досліджені показники біоенергетики та перекисне окислення ліпідів
залишаються на рівні контролю, а через 24 год спостерігається незначне
пошкодження біологічного матеріалу. Інсулінпродукуюча функція фрагментів
в момент вилучення залози і після 24 год зберігання при 4°С достовірно
не відрізняється.

При культивуванні фрагментів протягом 5 — 7-и діб в умовах нормотермії
спостерігається масова загибель ацинарних клітин при збільшенні
кількості ендокринних. В цей строк фрагменти адекватно реагували на
глюкозне навантаження та його відміну.

Фрагменти кріоконсервували на 5-7 му добу культивування при 37 оС.
Матеріал після еквілібрації з кріопротектором протягом 15 хв при
кімнатній температурі витримували 5 хв на водяній бані з температурою
0оС і заморожували під захистом кріопротекторів ДМСО, гліцерину, ПЕО-400
або ПЕО-1500 у 10%-й концентрації. Інтенсивність ендогенного дихання, а
також сполученість дихання та окислювального фосфорилювання — важливі
показники стану фрагментів органів, адже значна частина біологічних
процесів є енергозалежною. Виявилося, що краще збереження інтенсивності
ендогенного дихання деконсервованих фрагментів забезпечують ДМСО та
ПЕО-1500, причому ПЕО-1500 є ефективним в більш широкому діапазоні
швидкостей охолодження, в той час як ДМСО проявляє кріопротекторну
активність при низьких швидкостях охолодження (1оС/хв). Кількість ТБКАП
в деконсервованому матеріалі збільшується незначно, що може свідчити про
здатність антиоксидантних систем запобігати неконтрольованому розвитку
перекисного окислення ліпідів.

Дані, представлені в табл. 1, показують, що при культивуванні
розмороженого матеріалу спостерігаються як адекватна відповідь на
глюкозне навантаження так і зменшення інсулінпродукції після видалення
глюкози з середовища. Таким чином, деконсервованим фрагментам
підшлункової залози поросят притаманна висока життєздатність і
функціональна активність.

Таблиця 1

Інсулінпродукуюча здатність (мкОд/г/год) культур фрагментів підшлункової
залози поросят після кріоконсервування

Умови експерименту Продукція інсуліну

базальна Індукована

глюкозою базальна після індукованої

Контроль 174,1±12,8 612,7±42,5 202,4±14,1

ДМСО 204,1±18,3 641,5±51,8 224,3±21,6

ПЕО-1500 207,9±20,5 678,5±56,2 207,7±19,5

Примітка. Відмінності від контролю при всіх умовах експерименту
статистично недостовірні, р<0,05. Вплив умов кріоконсервування на збереження фрагментів печінки поросят та свиней. В момент отримання фрагментів печінки поросят інтенсивність їх ендогенного дихання і дихання в присутності дінітрофенолу (ДНФ) досить висока (табл. 2). Кріоконсервування фрагментів призводить до достовірного порівняно з контролем зменшення цих показників відразу після відігріву при всіх досліджених режимах заморожування. Ендогенне дихання фрагментів в контролі через 60 хв зменшується до 0,51±0,05 нмоль О2/хв/мг тканини. Одночасно зменшується і сполученість дихання з окислювальним фосфорилюванням. Після отримання фрагментів відношення VДНФ/VО становило 2,81, а через 60 хв - 2,39. Таке значення досить високе для тканинних препаратів (Л.Д. Лукьянова, 1982). В цей термін інтенсивність ендогенного дихання кріоконсервованих фрагментів статистично достовірно не відрізняється від ендогенного дихання в контролі незалежно від швидкості охолодження і використаного кріопротектора. Відношення дихання, стимульованого ДНФ, до ендогенного, в кріоконсервованих фрагментах знаходиться в межах 2,31–2,41, а в контролі становить 2,39. Отже, в цей термін спостереження досліджені показники біоенергетики не відрізняються від контрольних значень. В контролі на 120-ту хвилину у порівнянні з 60-ю Таблиця 2 Інтенсивність ендогенного дихання (VО), та дихання в присутності ДНФ (VДНФ) (нмоль О2/хв/мг тканини) фрагментів печінки поросят в залежності від умов кріоконсервування та часу інкубації Час інкубації, хв Показник Конт-роль Кріопротектор та швидкість охолодження ПЕО-400 ПЕО-1500 1ОС/хв 8000ОС/хв 1ОС/хв 8000ОС/хв 5 VО 0,72± 0,61 0,34± 0,03 0,48± 0,04 0,33± 0,02 0,46± 0,04 VДНФ 2,21± 0,20 0,41± 0,03 0,67± 0,05 0,30± 0,03 0,58± 0,05 VДНФ/VО 2,81 1,21 1,40 0,91 1,21 60 VО 0,51± 0,05 0,45± 0,04* 0,49± 0,05* 0,42± 0,04* 0,48± 0,04* VДНФ 1,22± 0,10 1,04± 0,09* 1,13± 0,10* 0,97± 0,091 1,18± 0,11* VДНФ/VО 2,39 2,36 2,31 2,40 2,41 120 VО 0,48± 0,04 0,36± 0,03* 0,38± 0,03* 0,32± 0,03 0,30± 0,03 VДНФ 0,67± 0,05 0,46± 0,05 0,48± 0,04 0,39± 0,03 0,37± 0,02 VДНФ/VО 1,39 1,29 1,27 1,21 1,23 Примітка. * - відмінності статистично недостовірні в порівнянні з контролем, р > 0,05.

спостерігається незначне зменшення ендогенного дихання. Але стимуляція
дихання ДНФ значно зменшується. В фрагментах, кріоконсервованих під
захистом ПЕО-1500, інтенсивність ендогенного дихання достовірно менша,
ніж в контролі. Якщо ж використовувався кріопротектор ПЕО-400, то цей
показник достовірно не відрізняється від контролю. Але стимуляція
дихання в усіх випадках незначна.

Інтенсивність ендогенного дихання фрагментів печінки свиней в момент
отримання була менша, ніж фрагментів печінки поросят, і становила
0,54±0,03 нмоль О2/хв/мг тканини, але відношення VДНФ/VО досить високе,
і становить 2,41. Кріоконсервування цього матеріалу також призводить до
значного зменшення ендогенного дихання і сполучення дихання та
окислювального фосфорилювання. При незмінному ендогенному диханні
нативного матеріалу через 60 хв спостерігається його відновлення в
кріоконсервованих фрагментах. В кріоконсервованих фрагментах також
збільшується відношення VДНФ/VО. В цей термін досліджені показники
дихання в кріоконсервованих фрагментах статистично достовірно не
відрізняються від таких показників в контролі. На 120-ту хв в
кріоконсервованому матеріалі показники дихання зменшуються більш
швидкими темпами, ніж в контролі. І тільки інтенсивність ендогенного
дихання фрагментів печінки свиней, кріоконсервованих у присутності
ПЕО-400 зі швидкістю охолодження 8000ОС/хв, залишається на рівні
контролю.

Дослідження дії аміталу на НАД-залежну ділянку окислення дає інформацію
про направленість метаболічного потоку в клітині. Встановлено, що ця
частина дихання в кріоконсервованих фрагментах залишається практично
незмінною протягом 120 хв спостереження.

У модельних ситуаціях для дослідження обміну відновними еквівалентами
тканинних препаратів із зовнішнім середовищем використовується
непроникаючий в клітини акцептор електронів – фериціанід калію, за
допомогою якого можна оцінити активність НАДФН-регенеруючих систем.
Одразу після відігріву матеріалу і протягом 60 хв швидкість його
відновлення фрагментами печінки не відрізняється від такої у контролі
при усіх режимах кріоконсервування. Цей показник на 120-ту хвилину
спостереження не відрізняється від контролю тільки в фрагментах печінки
при їх кріоконсервуванні в присутності ПЕО-400.

Одержані нами дані свідчать про те, що кріоконсервування активує процеси
перекисного окислення ліпідів у фрагментах печінки свиней: накопичення
ТБКАП проходе більш швидкими темпами, хоча на 60-ту хвилину після
відігріву в фрагментах, кріоконсервованих під захистом ПЕО-400, в
окремих випадках цей показник не перевищує контрольних величин.

Збереження фрагментів селезінки свиней після їх кріоконсервування в
присутності поліетиленоксидів. Як видно з наведених даних (табл. 3),
ендогенне дихання фрагментів селезінки, заморожених зі швидкістю
охолодження 1°С/хв, статистично достовірно не відрізняється від
контролю. При додаванні ДНФ спостерігаються незначна стимуляція дихання,
а, отже, і незначне сполучення дихання та окислювального фосфорилювання
як в контролі, так і в деконсервованих фрагментах. На 60-ту хвилину
спостереження при незмінній інтенсивності ендогенного дихання в контролі
спостерігається збільшення відношення VДНФ/VО до 1,9, в
кріоконсервованих фрагментах селезінки – до 1,8-1,9, що свідчить про
збільшення сполученості дихання та окислювального фосфорилювання. На
120-ту хвилину спостереження відмічається значне падіння досліджених
показників біоенергетики як в контролі, так і в кріоконсервованих
фрагментах селезінки. Отже, біоенергетика кріоконсервованих фрагментів
селезінки змінюється в процесі інкубації матеріалу таким же чином, як і
контрольних. Одночасно кількість ТБКАП в кріоконсервованих фрагментах
зберігається на рівні контролю до 60-ї хвилини інкубації, але на 120-ту
хвилину цей показник різко збільшується і статистично достовірно
перевищує значення норми. В цей же час відмічалося значне зменшення
досліджуваних показників біоенергетики.

Таблиця 3

Інтенсивність ендогенного дихання (VО) та дихання в присутності
ДНФ (VДНФ)

нмоль О2/хв/мг тканини) фрагментів селезінки свиней в
залежності від умов

кріоконсервування та часу інкубації

Час інкубації,

хв

Показник

Контроль Кріопротектор та швидкість охолодження

ПЕО-400 ПЕО-1500

1ОС/хв 1000ОС/хв 1ОС/хв 1000ОС/хв

5 VО 0,39±0,03 0,35±

0,041 0,27±0,02 0,32±

0,031 0,23±0,02

VДНФ 0,62±0,05 0,49±

0,03 0,32±0,03 0,48±

0,04 0,32±0,02

VДНФ/VО 1,6 1,4 1,2 1,5 1,4

60 VО 0,32±0,02 0,30±

0,031 0,28±0,021 0,29±

0,031 0,23±0,02

VДНФ 0,61±0,05 0,57±

0,051 0,50±0,041 0,52±

0,051 0,46±0,041

VДНФ/VО 1,9 1,9 1,8 1,8 1,9

120 VО 0,21±0,02 0,15±

0,01 0,09±0,01 0,10±

0,01 0,11±0,01

VДНФ 0,29±0,02 0,20±

0,02 0,10±0,01 0,12±

0,01 0,13±0,01

VДНФ/VО 1,4 1,3 1,1 1,2 1,2

Примітка. 1 — відмінності статистично недостовірні в порівнянні з

контролем, р > 0,05.

Дослідження залежності складу екстрактів від умов кріоконсервування
фрагментів органів. Вікова та органна специфічність екстрактів. Однією з
задач, що виникають при одержанні екстрактів із ксеноорганів, є задача
одержання препарату з максимально можливим вмістом біологічно активних
речовин, особливо пептидної природи. Ми вивчали концентрацію білка,
пептидів і нуклеотидів в екстракті, який одержували з кріоконсервованих
фрагментів селезінки, печінки та підшлункової залози свиней, а також
печінки та підшлункової залози новонароджених поросят у залежності від
кріопротектора та його концентрації.

Мінімальний вихід білка в розчин спостерігається при інкубації
фрагментів, що не піддавалися заморожуванню, або заморожених у
присутності 10-и або 20-и процентів ПЕО–1500, а максимальний – при
заморожуванні в присутності 10%-го ДМСО. З даних, наведених в табл. 4,
видно, що мінімальний вихід пептидів у розчин спостерігається в
випадках, коли екстракт отримували з некріоконсервованих фрагментів
(контроль).

Таблиця 4

Концентрація пептидів (мкг/мл) у супернатанті в залежності від джерела
фрагментів, кріопротектора та його концентрації. Швидкість охолодження
1°С/хв

Джерело фрагментів Кріопро-тектор Концен-трація, % Час інкубації, хв

30 60 90

Селезінка

свиней Контроль 20,4(1,3 42,7(3,5 51,2(4,11

ДМСО 10 43,8(3,2 68,7(5,1 71,9(5,91

20 54,6(4,0 74,6(5,9 74,6(6,11

ПЕО-1500 10 56,7(3,93 85,4(6,73 88,2(6,51

20 61,0(4,7 92,8(7,43 106,4(7,21,3

Печінка

свиней Контроль 16,0(0,9 17,0(1,1 20,0(2,31

ДМСО 10 16,8(1,2 29,3(4,4 37,9(2,71

20 27,0(1,72 41,7(3,22 53,3(4,91,2

ПЕО-1500 10 36,7(2,6 62,2(4,03 67,3(3,41,3

20 29,7(2,3 72,2(3,83 71,7(4,71,3

Підшлункова залоза

свиней Контроль 26,2(2,0 38,3(2,9 47,5(2,8

ДМСО 10 31,3(2,7 51,5(2,4 62,3(3,9

20 36,8(2,9 61,5(3,5 66,2(3,31

ПЕО-1500 10 54,3(3,9 87,3(3,63 97,0(4,01,3

20 64,7(3,4 97,3(8,73 102,3(7,61,3

Примітки: 1 – відмінності статистично недостовірні в порівнянні з
попереднім строком спостереження, р > 0,05; 2 — відмінності статистично
достовірні в порівнянні з концентрацією кріопротектора 10%, р < 0,05; 3 - відмінності статистично достовірні в порівнянні з тією ж концентрацією ДМСО, р < 0,05. Максимальна концентрація пептидів у супернатанті спостерігалася в тому випадку, коли фрагменти кріоконсервували в присутності ПЕО-1500. Вихід цих речовин в розчин не залежав від використаних концентрацій кріопротектора. Але їх концентрація достовірно зростала при збільшенні строку інкубації з 30 до 60 хв. Збільшення цього строку до 90 хв не призводило до статистично достовірного збільшення концентрації пептидів. Динаміка виходу нуклеотидів із кріоконсервованих фрагментів органів свиней нагадує динаміку виходу пептидів в залежності від використаного кріопротектора та його концентрації. Вихід білків і нуклеотидів з кріоконсервованих фрагментів печінки та підшлункової залози новонароджених поросят в залежності від використаного кріопротектора, його концентрації та часу інкубації принципово не відрізняється від наведених вище результатів для фрагментів органів статевозрілих свиней. Вихід пептидів в розчин із контрольних та кріоконсервованих в присутності ПЕО-1500 фрагментів органів новонароджених поросят дещо вищий, ніж з фрагментів органів свиней. При цьому вихід пептидів з кріоконсервованих фрагментів значно вищий, ніж з нативних. Збільшення часу інкубації до 90 хв не призводить до збільшення концентрації пептидів у порівнянні з інкубацією 60 хв. Отже, максимальний вихід речовин пептидної природи спостерігається у випадку, коли екстракт одержується із фрагментів, кріоконсервованих в присутності ПЕО–1500. В подальших дослідженнях використовувались саме такі екстракти. Аналізуючи хроматограми екстракту печінки свиней і екстракту печінки поросят, можна відмітити, що поліпептидний склад цих екстрактів відрізняється як якісно, так і кількісно (рис. 1). Встановлено, по-перше - екстракт кріоконсервованих фрагментів печінки поросят має меншу кількість фракцій, по-друге – в ньому значно менша кількість пептидів з м.м., яка перевищує 10000 (пік 1). На хроматограмі екстракту печінки свиней ця фракція становить 42,6%, а на хроматограмі екстракту печінки поросят – 3,7%. Другою за величиною в екстракті печінки свиней є фракція з м.м. 1270, питома площа якої становить 21,6% (пік 8), а на хроматограмі екстракту печінки поросят вона відсутня. В цьому екстракті найбільшу фракцію становлять поліпептиди з м. м. 1100 (пік 6). Інші фракції значно менші. В екстракті печінки поросят також відсутні поліпептиди з м.м. меншою 800, які в екстракті печінки свиней виявляються (піки 11 та 12). Екстракт підшлункової залози свиней відрізняється від екстракту підшлункової залози поросят незначною кількістю пептидів з м.м. більшою за 10000 (питома площа фракції – 3,4%) і доволі значною кількістю пептидів з м.м. 500 (13,4%). Також виявляється досить значна кількість пептидів з м.м. 1080 та 800. Звертаючи увагу на фракції, які містять велику кількість пептидів, слід враховувати незначну кількість пептидів інших фракцій. Відомо, що біологічна дія регуляторних пептидів і деяких інших речовин in vitro та in vivo виявляється при незначних концентраціях їх концентраціях (Е.И. Григорьев и др., 2003). Хроматограма екстракту селезінки свиней має чотири піки. Піки практично однакові по питомій площі, відповідають пептидам з м.м. більшою за 10000 (23,1%) та 1306 (22,5%). Максимальний по площі пік пептидів з м.м. 820 (46,2%), а мінімальний – 1087 (8,1%). Рис. 1. Хроматограми екстрактів кріоконсервованих фрагментів печінки свиней (а) та печінки новонароджених поросят (б). Отже, молекулярно-масовий розподіл пептидів у водно-сольових екстрактах кріоконсервованих фрагментів ксеноорганів залежить від органу, з якого одержані екстракти, та віку тварин. Отримані дані треба враховувати при дослідженні механізмів дії таких екстрактів. Дослідження взаємодії екстрактів з альбуміном сироватки крові. Ми дослідили зв’язування біологічно активних речовин, що входять до складу екстрактів, з розчиненим ліофілізованим сироватковим альбуміном людини і альбуміном сироватки крові донорів методом спектрофлуориметрії з використанням власної флуоресценції білків. Флуоресценція тканинних екстрактів знаходиться в області 290–450 нм. При збудженні світлом з довжиною хвилі 280 нм максимум спектрів флуоресценції знаходиться у області 340–354 нм, що може свідчити про наявність в екстрактах залишків триптофану доступних розчиннику. Додавання досліджуваних екстрактів до сироватки крові приводить до зниження її власної флуоресценції та зміни форми і положення спектрів. Додавання екстрактів до розчину альбуміну суттєво впливало на спектральні характеристики білка. Спостерігалося до гасіння власної флуоресценції ((збудж = 280 нм) і зміна стану триптофанових залишків білка ((збудж = 296 нм), що є доказом взаємодії компонентів даних екстрактів з білками сироватки крові. Ми також дослідили вплив екстрактів на зв'язуючу здатність розчину альбуміну і альбуміну сироватки крові донорів методом спектрофлуориметрії з використанням флуоресцентного зонда К-35, який в сироватці крові зв'язується з альбуміном на 95%. Як видно з рис. 2, титрування сироватки крові досліджуваними екстрактами приводить до зниження інтенсивності флуоресценції зв'язаного з сироватковим альбуміном зонда К-35. Рис. 2. Вплив екстрактів підшлункової залози (1), печінки (2) і селезінки (3) свиней на нормовану інтенсивність флуоресценції зонда К-35 (2,5 мкмоль/л), зв'язаного з альбуміном сироватки крові. Наведені дані свідчать про конкуренцію складових екстрактів з молекулами К-35 за центри зв’язування на макромолекулі альбуміну. F H ’ E I 6 8 O O ¦ ? I <1/4?aAuuoeuuuuuuuuuueeaOOOOOO d d roccUeUeUeUeUeUeUecc?AeAeAeAeAeAeccc d d & d d d ‡¬‡ ‰A‰H‹????*!,¤.¤Z¤,§???®?A?I¶??i1/4o?&AoooooooooooooocUUUUUUUUUU d d d d d d d y†thh_ZNNBB d d d d d d d d d d d `„Aa$ d d d ? ? ? ”ym : ”ym : d ??????С у присутності екстракту підшлункової залози та печінки свиней також протікає на 3-5єС вище, ніж це спостерігається для чистого альбуміну. Таким чином, методом диференціальної скануючої калориметрії встановлено, що пептиди екстрактів кріоконсервованих фрагментів органів свиней зв’язуються з альбуміном і впливають на його конформаційний стан. Встановлено, що пептиди екстрактів підвищують загальну кооперативність плавлення молекули альбуміну, але вплив екстрактів печінки та підшлункової залози на молекулу альбуміну відрізняється від впливу екстракту селезінки. Вплив фрагментів підшлункової залози поросят та екстракту кріоконсервованих фрагментів підшлункової залози свиней на динаміку метаболічних порушень при експериментальному цукровому діабеті. У тварин, хворих на діабет, які не отримували лікування, рівень глюкози в крові натще на 7-му добу перевищував норму в 2,2 рази, а на 15-ту добу - в 3,6. На 30-ту добу спостереження рівень глюкози в крові дещо зменшувався, але залишався значно вище норми (табл. 5). Таблиця 5 Рівень глюкози (ммоль/л) в сироватці крові щурів в залежності від умов експерименту та строку спостереження Умови експерименту Строк спостереження, доба 7 15 30 Контроль 4,8±0,9 Цукровий діабет 13,1±1,5 20,2±1,2 16,1±2.1 Цукровий діабет+фрагменти 14.3±0,8 13,2,0±1,12 8,5±0,82 Цукровий діабет+екстракт 13,5±1,6 9,2±0,92,3 6,8±1,21,2 Примітки: 1 – відмінності статистично недостовірні в порівнянні з контролем, р>0,05; 2 – відмінності статистично достовірні в порівнянні з
цукровим діабетом, р<0,05; 3 – відмінності статистично достовірні в порівнянні з цукровим діабетом+фрагменти підшлункової залози, р<0,05. У тварин, яким були введені фрагменти підшлункової залози, цей показник до 15-ї доби залишався незмінним і зменшився тільки на 30-ту, а при введенні екстракту він зменшився на 15-ту добу, і ще більше на 30-ту добу спостереження, і в цей строк перевищував норму всього в 1,3 рази. Коли тварини, хворі на цукровий діабет не одержували лікування, максимальна концентрація ТБКАП в плазмі спостерігалась на 15-ту добу експерименту, а деяке їх зниження спостерігалося на 30-ту добу. Максимум концентрації на 15-ту добу відмічено і при лікуванні тварин з допомогою фрагментів, але при цьому концентрація ТБКАП на 30-ту добу достовірно менша, ніж у тварин, що не отримували лікування. При лікуванні екстрактом підшлункової залози свиней спостерігається зменшення концентрації кінцевих продуктів перекисного окислення на 15-ту добу спостереження, і на 30-ту добу кількість ТБКАП в плазмі крові статистично достовірно не відрізняється (р<0,05) від значень, характерних для контрольних тварин, і достовірно менше, ніж у тварин, яким уводили фрагменти підшлункової залози. Підвищений рівень перекисного окислення ліпідів характерний не тільки для плазми крові, але і для печінки. При лікуванні тварин за допомогою фрагментів або екстракту показники перекисного окислення ліпідів в печінці на 30-ту добу статистично достовірно менші, ніж у тварин, що не отримували лікування. Органоспецифічний вплив екстрактів при дифузних захворюваннях печінки. Проблема лікування гострої печінкової недостатності, викликаної токсичним ураженням печінки, залишається актуальною (В.Е. Рябинин, 2002), а пошук чинників, здатних позитивно скорегувати структурно-функціональний стан цього органу після токсичного впливу, триває. Тому ми дослідили вплив екстрактів кріоконсервованих фрагментів печінки свиней та поросят на перебіг гострого токсичного гепатиту. Через добу після уведення CCl4 активність АлАТ в сироватці крові щурів збільшувалась у 18 разів, а АсАТ - у 5,6 рази у порівнянні з нормою. Через 3 доби вона зменшувалась як у контрольних тварин, так і у тих, яким уводили екстракт печінки свиней або поросят, але відмінності між групами були відсутні. На 5-ту добу спостереження активність амінотрансфераз у тварин, яким уводили екстракт печінки поросят, вища за значення, характерні для інтактних тварин, але вірогідно нижча, ніж у контрольних. Концентрація ТБКАП в печінці інтактних тварин становила 4,4+0,3 нмоль/мг тканини. Введення тетрахлорметану вірогідно збільшувало концентрацію ТБКАП в 2,1 рази у порівнянні з результатами, отриманими на інтактних тваринах, і вона залишається незмінною у контрольних тварин протягом п’яти діб. У тварин, яким уводили екстракт печінки поросят або свиней, цей показник був вірогідно менше, ніж у контрольних щурів, вже на 3-ю добу і ще зменшувався на 5-ту. Відмінностей між вмістом ТБКАП в печінці тварин, яким вводили екстракт печінки поросят або свиней, не спостерігалось. У печінці тварин, які не отримували лікування, на 3-ю добу після уведення тетрахлорметана видно формування хибних долей, спостерігаються гепатоцити з ознаками поліморфності. Структура печінки у тварин, яким уводили екстракт печінки свиней, практично нічим не відрізняється від стану печінки щурів з токсичним гепатитом. Тоді як на зрізах печінки, зроблених після уведення екстракту печінки поросят при аналогічних умовах, загальна архітектоніка печінки не змінена, ознаки некрозу тканини відсутні. На п’яту добу експерименту у контрольних тварин видно порушення архітектоніки печінки і розповсюдження центролобулярного некрозу. При уведенні екстракту печінки свиней на фоні токсичного гепатиту некроз був менш виражений, хоча і спостерігались явища жирової дистрофії гепатоцитів. При уведенні екстракту печінки поросят на фоні токсичного гепатиту архітектоніка печінки не змінена. Кількість гепатоцитів збільшена як в печінці тварин, яким вводили екстракт печінки поросят, так і у тварин, що отримували екстракт печінки свиней, у порівнянні з токсичним гепатитом. Після закінчення уведення тетрахлорметану для моделювання цирозу печінки, вона мала загострені края та мілкобугристу структуру. У деяких тварин у черевній порожнині з’являлася асцитична рідина. Циротичні зміни печінки супроводжувались збільшенням активності амінотрансфераз (табл. 6). Таблиця 6 Активність амінотрансфераз (мкмоль/мл/60 хв) у сироватці крові щурів з цирозом печінки та при його лікуванні екстрактом печінки поросят Фер- мент Норма Строк спостереження, доба 1 15 30 Цироз Цироз Цироз+ екстракт печінки Цироз Цироз+ екстракт печінки АлАТ 0,34± 0,02 1,67± 0,07 1,40±0,07 0,61±0,051 0,52±0,05 0,41±0,032 АсАТ 0,98± 0,07 1,90± 0,12 1,83±0,11 1,37±0,071 1,41±0,09 1,23±0,082 Примітки: 1-відмінності статистично достовірні в порівнянні з цирозом печінки, р < 0,05; 2 – відмінності статистично недостовірні в порівнянні з нормою, р > 0,05.

Активність АлАТ була вище норми в 5,4 рази, а АсАТ- в 2. На 15-ту добу
при введенні екстракту печінки поросят спостерігається достовірне
зменшення активності трансаміназ в порівнянні з нелікованим цирозом
печінки. На 30-ту добу активність ферментів зменшується в обох випадках,
але при використанні екстракту печінки поросят цей показник повертається
до норми.

Рівень ТБКАП на 1-ту добу спостереження був вище норми в печінці у 3
рази, а в сироватці крові — майже в 2,9. На 15-ту та 30-ту доби
спостерігається зменшення рівня перекисного окислення ліпідів в усіх
випадках.

Після закінчення моделювання цирозу печінки на гістологічних препаратах
спостерігалась типова для цієї патології картина: некроз гепатоцитів
групами по кілька клітин, розростання фіброзної тканини в паренхимі,
вузлова перебудова та інш. Спостерігалося різке зменшення кількості та
звивистості функціонуючих синусоїдів та їх калібру. Термінальні та
портальні венули меншого діаметра, укорочені, а діаметр печінкових венул
— збільшений. Таким чином має місце зміна архітектоніки печінки і
перебудова судинного русла. Практично таку ж картину спостерігали на
15-ту добу.

Прояви цирозу зменшилися на 30-ту добу спостереження зменшення обох
групах тварин, але вони відрізнялися ступенем цього зменшення. При
гістологічному дослідженні у тварин, які отримували екстракт печінки
поросят, прояви внутрішньоклітинної, клітинної та тканинної регенерації
були більш вираженими, ніж у тварин, які не отримували лікування. В
сполучній тканині несправжніх часток та септ утворення капілярів
відмічалось тільки в групі тварин, яким уводили екстракт. В цій же групі
частіше фіксували дво- та багатоядерні гепатоцити та зменшення кількості
сполучної тканини.

Методом прижиттєвої мікроскопії було встановлено, що у щурів, яким
уводили екстракт, на 30-ту добу спостерігалось значне збільшення
кількості функціонуючих судин та діаметра синусоїдів. Швидкість
кровотоку збільшувалась в 2 – 2,5 рази. В цілому картина
гемоциркуляторного русла печінки у цих тварин наближалась до нормальної,
хоча повного відновлення структури русла не відбувалося. У контрольних
тварин нормалізація гемоциркуляції хоча і спостерігалася, але була
виражена в значно меншій мірі.

Вплив екстракту селезінки свиней на процес регенерації шкіри при
опіковій травмі. В результаті візуального контролю стану опікових ран
було встановлено, що на 1-шу добу з моменту травми спостерігається
значна гіперемія і набряк шкіри. На 3-ю добу відмінностей в лікованих і
нелікованих ранах відмічено не було.

У контрольній групі на 7-му добу опікові рани були покриті
некротизованою тканиною та фібрином, спостерігалась плазморея на всій
опіковій поверхні. У тварин, яким уводили екстракт селезінки, рани
набули рівномірного рожевого забарвлення, грануляція розросталася на
всій площі, гранулююча поверхня була гладшою. Площа опікової поверхні в
контролі становила 4,9±0,6 см2, а у тварин, яким уводили екстракт —
2,5±0,3 см2. Відмінності в середніх розмірах ран статистично достовірні
(р < 0,05). У контрольній групі тварин на 14-ту добу на опіковій поверхні зберігався важко відокремлюваний струп. В дослідній групі тварин рани практично загоїлися. Середній строк загоєння контрольних і дослідних ран становив 23,2±2,3 та 13,8±2,1 діб відповідно (р < 0,05). Таким чином, при уведенні екстракту селезінки відмічався вищий темп загоєння опікової рани, що виражалося в прискоренні зміни фаз регенеративного процесу: скорочувалися терміни періоду клітинної інфільтрації і прискорювалося утворення грануляції. Спостерігається більш рання ерадикація ран від мікроорганізмів. Порівняльне вивчення біологічної дії екстрактів кріоконсервованих фрагментів ксеноорганів. При цукровому діабеті було досліджено ефективність екстрактів селезінки та печінки свиней, а при токсичному гепатиті проведено вивчення впливу екстракту селезінки та підшлункової залози свиней на перебіг цієї патології. На 7-му добу після початку уведення екстрактів у контрольних та дослідних щурів з цукровим діабетом концентрація глюкози в крові значно перевищувала норму і достовірних відмінностей цього показника між групами не відмічалося. У тварин з цукровим діабетом і у тих, які отримували екстракт печінки, рівень глюкози на 15-ту добу збільшувався в порівнянні з 7-ю добою. Якщо ж вони отримували екстракт селезінки, то на 15-ту добу концентрація глюкози була достовірно нижчою, ніж у щурів з цукровим діабетом, а на 30-ту добу поверталася до норми. У інших тварин вона залишалася значно вище норми. Концентрація ТБКАП в сироватці крові при цукровому діабеті та уведенні екстракту печінки залишалась високою протягом всього експерименту. При уведенні екстракту селезінки цей показник не відрізнявся від норми вже на 15-ту добу експерименту. При токсичному гепатиті екстракт селезінки сприяв достовірному в порівнянні з контролем зменшенню активності АлАТ на 5-ту добу, тоді як при уведенні екстракту підшлункової залози такого ефекту не спостерігалось. Ще більш ефективно екстракт селезінки свиней зменшував активність АсАТ і концентрацію ТБКАП в сироватці крові, які на 5-ту добу повертались до норми. У тварин, яким уводили екстракт підшлункової залози, спостерігалося тільки зменшення концентрації ТБКАП на 5-ту добу. Отримані результати дозволяють стверджувати, що екстракти печінки та підшлункової залози свиней, які при експериментальних патологіях відповідних органів у щурів проявляють високу біологічну активність, практично не призводять до нормалізації досліджених біохімічних показників в організмі при ураженні інших органів. Таким чином, їх вплив спрямований на клітини органа, з якого вони були отримані, а їх дія є органоспецифічною. Екстракт селезінки свиней сприяє нормалізації досліджених показників як при цукровому діабеті, так і при токсичному гепатиті. Отже його дія видається органонеспецифічною. Але, якщо прийняти до уваги, що екстракт селезінки нормалізує імунний статус організму, в тому числі і систему лімфоцитів (В.В. Бызов и др., 2001), то можна припустити, що його органоспецифічність проявляється саме в такій дії. При цьому, стимуляція репарації в ураженому органі відбувається опосередковано завдяки нормалізації кількості і функціональної активності лімфоцитів, які приймають активну участь в регуляції фізіологічної та репараційної регенерації (В.И. Донцов, 1998). Біологічна дія екстрактів при їх уведенні молодим та старим щурам. Хронічне уведенні щурам з 6-місячного віку екстрактів ксеноорганів не впливає на зміну маси тварин, обумовлену фізіологічними причинами. Концентрація ТБКАП в плазмі крові дослідних тварин достовірно не відрізнялась від цього показника у контрольних тварин протягом усього строку спостереження (12 місяців). Вище було показано, що екстракти тканин ксеноорганів сприяють нормалізації перекисного окислення ліпідів в організмі при різних патологіях. Тому ми дослідили, як впливає уведення суміші екстрактів на інтенсивність пероксидації ліпідів в сироватці крові та печінці старих тварин. Отримані дані свідчать, що рівень ТБКАП в крові та печінці 24-місячних щурів перевищує в 1,3 та 1,4 рази показники, характерні для 6-тимісячних тварин. Уведення суміші екстрактів приводить до зменшення інтенсивності перекисного окислення ліпідів в організмі старих щурів до рівня, який спостерігався у 6-місячних. При цьому тривалість життя таких тварин збільшувалася. Експериментальне вивчення впливу суміші екстрактів на ріст пухлини Герена. У тварин, яким суміш екстрактів уводили, починаючи з 1-ї доби перевивання пухлини (доба перевивання пухлини вважається нульовою), спостерігалося відставання в рості пухлин у порівнянні з контрольними пухлинами. Середній об'єм пухлин у дослідних тварин на 10-ту добу після трансплантації був меншим в 1,3 рази в порівнянні з контрольними. Відсоток гальмування росту пухлини на 10-ту добу склав 24,7% . На 15-ту і 21-шу добу спостереження також відмічався менший розмір пухлин в цій групі. У другій серії експериментів, при уведенні суміші екстрактів починаючи з 10-ї доби після трансплантації пухлини, гальмування росту пухлини на 30-ту добу склало 12,1% по відношенню до групи контрольних пухлин. Після перевивання пухлини середня тривалість життя щурів у контрольній групі дорівнювала 33,3±2,6 діб. У дослідних групах цей показник був вищим в середньому в 1,2 рази. Достовірне збільшення тривалості життя щурів було відмічено в обох дослідних групах, і відсоток збільшення тривалості життя у цих групах склав відповідно 21,3 і 27,9%. Таким чином, уведення суміші екстрактів кріоконсервованих фрагментів органів свиней сприяє гальмуванню росту карциноми Герена у щурів і збільшує тривалість життя дослідних тварин. Аналіз та узагальнення результатів. У розділі проведено підсумковий аналіз, зроблено порівняння одержаних результатів з даними, наведеними в літературі, а також узагальнення одержаних теоретичних та експериментальних даних і зроблено висновки. ВИСНОВКИ Вивчення впливу режимів кріоконсервування на збереження фрагментів ксеноорганів представляє значний науковий та практичний інтерес. Адже одержані в результаті фундаментальних досліджень дані можуть бути застосовані при розробці методів кріоконсервування і створенні низькотемпературних банків фрагментів органів, які все ширше використовуються в наукових дослідженнях та клінічній практиці. Активізація фундаментальних і прикладних досліджень, присвячені одержанню та вивченню біологічної дії препаратів, які містять біорегулятори пептидної природи, обумовлена тим, що такі препарати проявляють високу біологічну активність у вигляді стимуляції процесів репарації та регенерації при різних патологічних процесах в організмі. На цій підставі в дисертаційній роботі проведені дослідження, результати яких дали змогу теоретично та експериментально вирішити вказані вище проблеми. Вивчено вплив різних кріопротекторів, їх концентрацій та швидкостей охолодження на збереження фрагментів органів свиней та поросят, а також на склад одержуваних з них водно-сольових екстрактів. Проведено також вивчення біологічної дії одержаних екстрактів при різних експериментальних патологічних станах. Під час гіпотермічного зберігання фрагментів підшлункової залози поросят протягом 15 год ендогенне дихання та інтенсивність перекисного окислення ліпідів залишаються на рівні контролю, а через 24 год спостерігається незначне зменшення ендогенного дихання та активація процесів пероксидації ліпідів. При температурі зберігання 37°С аутолітичні процеси активуються в значно більшій мірі, що призводить до значного пошкодження матеріалу. Після 24 год гіпотермічного зберігання інсулінпродукуюча здатність фрагментів підшлункової залози поросят достовірно не відрізняється від цього показника для свіжевилученого матеріалу. Краще збереження фрагментів підшлункової залози при кріоконсервуванні забезпечують ДМСО та ПЕО-1500, причому ПЕО-1500 є ефективним кріопротектором в більш широкому діапазоні швидкостей охолодження, в той час як ДМСО проявляє кріопротекторну активність при швидкості охолодження 1оС/хв. Деконсервований матеріал в культурі адекватно відповідає збільшенням продукції інсуліну на збільшення концентрації глюкози до стимулюючих значень, а повернення біоматеріалу до умов з низьким вмістом глюкози призводить до зменшення продукції інсуліну, що свідчить про функціональну повноцінність деконсервованих фрагментів. Кріоконсервування фрагментів печінки свиней та поросят призводить до зменшення як ендогенного дихання, так і сполучення дихання та окислювального фосфорилювання. При використанні в якості кріопротекторів поліетиленоксидів в деконсервованих фрагментах спостерігається відновлення цих показників до рівня контролю. Ендогенне дихання фрагментів селезінки свиней, кріоконсервованих у присутності поліетиленоксидів зі швидкістю охолодження 1°С/хв, статистично достовірно не відрізняється від контролю. При цьому спостерігається незначне сполучення дихання та окислювального фосфорилювання, яке на 60 хв після відігріву статистично достовірно не відрізняється від контрольного показника. Виявлено, що вихід у розчин білків, пептидів і нуклеотидів з кріоконсервованих фрагментів органів свиней та поросят більший, ніж з нативних, а концентрація і співвідношення цих речовин залежать від використаного кріопротектора. При одержанні екстрактів максимальна концентрація пептидів у супернатанті відмічається в тому випадку, коли фрагменти органів заморожували під захистом ПЕО-1500. Вихід пептидів у розчин не залежить від використаних концентрацій кріопротектора. Спектри молекулярних мас пептидів, які входять до складу екстрактів, залежать від органу, з фрагментів якого вони були одержані, та віку тварин. Встановлено, що складові досліджених екстрактів зв’язуються з альбуміном сироватки крові, і це зв’язування може розглядатися як один із специфічних механізмів транспортування біологічно активних речовин до відповідних органів і тканин. Кріоконсервовані фрагменти підшлункової залози поросят та екстракт кріоконсервованих фрагментів підшлункової залози свиней сприяють зменшенню рівня глюкози в крові, а також зменшують рівень пероксидації ліпідів в організмі експериментальних тварин. При цьому в деяких випадках нормалізація досліджених показників при застосуванні екстракту більш виражена, ніж при використанні фрагментів. Екстракти кріоконсервованих фрагментів печінки проявляють високу біологічну активність при дифузних її ураженнях. Вони нормалізують біохімічні показники та процеси репарації при токсичному гепатиті та цирозі печінки, що виявляється в зниженні активності амінотрансфераз у сироватці крові тварин та в зниженні інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів як в ураженій печінці, так і в сироватці крові щурів. Спостерігаються нормалізація гістологічної будови органа, збільшення кількості функціонуючих судин, їх діаметра та швидкості кровотоку. Місцеве застосування екстракту кріоконсервованих фрагментів селезінки свиней прискорює загоєння опікових ран. Скорочується час проходження фази запалення, а ерадикація ран від мікроорганізмів і утворення грануляційної тканини відбуваються в більш ранні строки. Екстракти кріоконсервованих фрагментів печінки та підшлункової залози свиней не сприяють нормалізації біохімічних показників в організмі при експериментальному цукровому діабеті та токсичному гепатиті відповідно. Отже їх дія є органоспецифічною. Екстракт кріоконсервованих фрагментів селезінки свиней сприяє нормалізації досліджених показників при обох патологічних станах. Хронічне уведення молодим щурам екстрактів ксеноорганів не впливає на вікову зміну маси тварин, обумовлену фізіологічними причинами, і не стимулює процеси перекисного окислення ліпідів в організмі. Уведення суміші екстрактів 24-місячним щурам призводить до зменшення інтенсивності процесів пероксидації ліпідів в організмі до рівня, який спостерігається у 6-місячних щурів. При цьому тривалість життя тварин збільшується. Уведення суміші екстрактів кріоконсервованих фрагментів органів свиней сприяє гальмуванню росту карциноми Герена у щурів і збільшує тривалість життя дослідних тварин. Список опублікованих праць за темою дисертації Сандомирский Б.П., Гальченко С.Е., Тыныныка Л.Н. Влияние криопротекторов на уровень перекисного окисления липидов нативных и криоконсервированный фрагментов ткани печени новорожденных и половозрелых свиней // Проблемы криобиологии.-1996.-№ 3.-С.26-29. Тыныныка Л.Н., Гальченко С.Е., Сандомирский Б.П. Интенсивность перекисного окисления липидов фрагментов ткани печени новорожденных и половозрелых свиней в зависимости от скоростей охлаждения // Укр. биохимич. журнал.–1997.-№ 2.-С. 130-133. Гальченко С.Е., Мамонтова А.В., Сандомирский Б.П. Влияние режимов криоконсервирования фрагментов селезенки свиньи на интенсивность перекисных процессов // Пробл. криобиологии.-1998.-№1.-С.58-61. Гальченко С.Е., Мамонтова А.В., Тыныныка Л.Н., Сандомирский Б.П. Влияние криоконсервирования на интенсивность дыхания фрагментов ксеноорганов // Пробл. криобиологии.-1998.-№3.-С.45-48. Гальченко С.Е., Мамонтова А.В., Сандомирский Б.П. Сохранность спленоцитов после криоконсервирования фрагментов селезенки // Пробл. криобиологии.-1998.-№4.-С.57-59. Сандомирский Б.П., Волкова Н.А., Гальченко С.Е., Белочкина И.В. Влияние режимов криоконсервирования на сохранность микрофрагментов поджелудочной железы поросят // Пробл. криобиологии.-2000.-№ 2.-С. 76-80. Бызов В.В., Высеканцев И.П., Гальченко С.Е., Сандомирский Б.П. Опыт применения эндотрахеального введения экстракта криоконсервированных фрагментов ксеноселезенки в комплексном лечении больных с гнойными процессами в легких // Пробл. криобиологии.-2001.-№ 3.-С87-88. Бызов В.В., Высеканцев И.П., Гальченко С.Е., Сандомирский Б.П. Влияние эндобронхиального введения экстракта криоконсервированных фрагментов ксеноселезенки на некоторые факторы местного иммунитета в комплексной терапии больных с абсцессами легких //Пробл. криобиологии.-2001.-№ 4.-С.65-70. Сандомирский Б.П., Гальченко С.Е., Тыныныка Л.Н. Сохранность фрагментов печени половозрелых свиней и новорожденных поросят при различных условиях криоконсервирования // Пробл. криобиологии.-2003.-№ 4.-С. 77-84. Гальченко С.Є., Бєлочкіна І.В., І.П. Михайлова., Гальченко К.С., Сандомирський Б.П. Вплив комплексного застосування екстракту підшлункової залози свиней і ліофілізованого молозива корів на перебіг експериментального цукрового діабету // Клініч. та експерим. патологія.-2004.-Т. 3, № 2.-С. 158-159. Гальченко С.Є. Показники окислювального метаболізму фрагментів печінки свиней та поросят після їх кріоконсервування в присутності поліетиленоксидів // Пробл. криобиологии.-2004.-№ 3.-С. 72-78. Гальченко С.Є. Склад водно-сольових екстрактів кріоконсервованих фрагментів органів свиней / /Пробл. криобиологии.-2004.-№ 4.-С. 72-78. Гальченко С.Є., Бєлочкіна І.В, Мамонтова А.В., Михайлова І.П., Сандомирський Б.П. Вплив препаратів із ксеногенної підшлункової залози на рівень глікемії і вільнорадикальні процеси у щурів з експериментальним цукровим діабетом // Мед. хімія.-2004.-№ 4.-С. 63-67. Гальченко С.Є., Тининика Л.М., Сандомирський Б.П. Вплив екстрактів з кріоконсервованих фрагментів ксеногенної печінки на активність амінотрансфераз та перекисне окислення ліпідів при експериментальному токсичному гепатиті // Мед. хімія.-2005.-№ 1.-С. 67-71. Гальченко С.Е., Узленкова Н.Е., Слета И.В., Сандомирский Б.П. Влияние экстрактов криоконсервированных фрагментов ксеноорганов на рост опухоли Герена // Експерим. і клініч. медицина.-2005.-№ 1.-С. 17-20. Гальченко С.Є. Тканинна та вікова специфічність водно-сольових екстрактів кріоконсервованих фрагментів ксеноорганів // Пробл. криобиологии.-2005.-Т. 15, № 2.-С. 153-158. Гальченко С.Є. Екстракти кріоконсервованих фрагментів ксеноорганів: одержання та біологічна дія // Пробл. кріобіології.-2005.-Т. 15, № 3.-С. 403 – 406. Гальченко С.Є, Тыныныка Л.Н, Сандомирский Б.П. Стимуляция репарационных процессов в печени при токсическом гепатите // Експерим. і клініч. медицина.-2005.-№ 4.-C. 26-30. Гальченко С.Е., Дюбко Т.С., Паценкер Л.Д., Сандомирский Б.П. Спектрофлуориметрическое исследование экстрактов криоконсервированных фрагментов органов свиней. I. Собственная флуоресценция // Експерим. і клініч. медицина.– 2006.– № 1.– С. 48-52. Гальченко С.Є. Кріоконсервування фрагментів селезінки свиней у присутності поліетиленоксидів // Проблеми кріобіології.-2006.-Т. 16, № 1.-С. 82-87. Гальченко С.Е., Дюбко Т.С., Сандомирский Б.П., Паценкер Л.Д. Спектрофлуориметрическое исследование экстрактов криоконсервированных фрагментов органов свиней. II. Анализ с помощью флуоресцентного зонда К-35 // Експерим. і клініч. медицина.– 2006.– № 3.– С. 57-61. Сандомирский Б.П., Гальченко С.Е., Тыныныка Л.Н. Влияние условий криоконсервирования на сохранность фрагментов печени свиней и поросят // Пробл. медич. науки та освіти.-2003.-№ 2.-С. 46 – 48. Гальченко С.Є., Бєлочкіна И.В., Тининика Л.М., Сандомирський Б.П. Вплив екстрактів підшлункової залози і печінки свиней на щурів з експериментальними патологіями відповідних органів // Трансплантологія.-2003.-Т. 4, № 1.-С. 68 -70. Гальченко С.Є., Тининика Л.М., Сандомирський Б.П., Ганулич Т.В. Вплив екстрактів кріоконсервованих фрагментів ксеногенної печінки на структуру печінки щурів при токсичному гепатиті // Пробл. медич. науки та освіти.-2004.-№ 2.-С. 58-60. Гальченко С.Є., Бєлочкіна І.В., Сандомирський Б.П. Водно-сольові екстракти ксенотканин як альтернатива ксенотрансплантації // Трансплантологія.-2004.-Т. 7, № 3.-С. 258-260. Гальченко С.Є., Тининика Л.М., Мамонтова А.В., Сандомирський Б.П. Ефективність екстракту кріоконсервованих фрагментів ксенопечінки при експериментальному цирозі // Трансплантологія.-2004.-Т. 7, № 3.-С. 260-262. Гальченко С.Е., Дюбко Т.С., Зинченко А.В., Сандомирский Б.П., Поврозин Е.А., Паценкер Л.Д. Исследование механизмов взаимодействия биологически активных ксеногенных тканевых экстрактов с сывороточным альбумином // Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів та біологічно активних добавок: Матер. I міжнарод. наук.-практ. конф.– Тернопіль, 2004.– С. 332-335. Гальченко С.Є., Дюбко Т.С., Зінченко О.В., Сандомирський Б.П., Поврозін Е.О. Дослідження впливу ксеногенних тканинних екстрактів на процес термоденатурації альбуміну // Актуальные проблемы медицины и биологии: Сб. научн. трудов.– Киев, 2004.– С. 403-408. Гальченко С.Є., Бєлочкіна І.В., Гальченко К.С., Сандомирський Б.П. Стимуляція регенерації підшлункової залози у щурів з експериментальним цукровим діабетом // 4-і Данилевські читання "Фундаментальні питання експериментальної та клінічної ендокринології" (Харків, 24-25 лютого 2005р.).-Харків, 2005.-С. 39-41. Гальченко С.Є., Тининика Л.М., Слета І.В., Гойденко Н.И., Сандомирський Б.П. Стимуляція регенерації при експериментальному цирозі печінки // Пробл. медич. науки та освіти.-2005.-№ 1.-С. 58-61. Гальченко С.Є. Рівень перекисного окислення ліпідів у щурів різного віку після дії ксеноекстрактів // Пробл. мед. науки та освіти.-2005.-№ 3.-С. 47-48, 56. Гальченко С.Е, Бєлочкіна І.В., Тининика Л.М., Сандомирський Б.П. Порівняльне вивчення біологічної дії екстрактів кріоконсервованих фрагментів ксеноорганів // Пробл. мед. науки та освіти.-2006.-№ 1.-С. 67-69. Пат. 54055 Україна, МПК7 A61K35/28. Засіб для лікування ран ”Кріосплін”: Сандомирський Б.П., Гальченко С.Є., Гальченко К.С., Грищенко В.І., Синчикова О.П., Шевченко Л.Є.; ІПКіК НАН України.- № 2002043527; Заявл. 26.04.2002; Опубл. 17.02.2003; Бюл. № 2. Пат. 64381 А Україна, МПК7 А61К35/12. Спосіб отримання екстрактів ксеногенних органів: Гальченко С.Є., Шкодовська Н.Ю., Сандомирський Б.П., Грищенко В.І.; ІПКіК НАН України.-№ 2003054649; Заявл. 22.05.2003; Опубл. 16.02.2004; Бюл. № 2. Пат. № 6704, Україна, А61 К35/39. Засіб "Експан" для лікування цукрового діабету: Гальченко С.Є., Бєлочкіна І.В., Михайлова І.П., Сандомирський Б.П.; ІПКіК НАН України.-№ 20041108980; Заявл. 03.11.04; Опубл. 16.05.05. Бюл. № 5. Пат. № 11183, Україна, G01N21/64, G01N33/48, A61K35/12. Спосіб оцінки біологічної активності екстрактів тканин: Грищенко В.І., Дюбко Т.С., Гальченко С.Є., ІПКіК НАН України.-№ u200505293; Заявл. 03.06.2005; Опубл. 15.12.2005. Бюл. №. 12. Сандомирский Б.П., Волкова Н.А., Гальченко С.Е., Белочкина И.В. Криоконсервирование инсулинпродуцирующей ткани поджелудочной железы поросят для клинического применения // Структурно-функциональные единицы и их компоненты в органах висцеральных систем в норме и патологии: Тез. докл. науч.-практич. конф. (Харьков, 1-3 октября 1991).-Харьков, 1991.-С. 227-228. Sandomirsky B.P., Volkova N.A. Galchenko S.E.,Shapovalov D.V. Creation of low temperature bank of pancreas island tissue xenocultures for clinical use // Conference Theoretical basis of cryopreservation: Abstract.-Hradek Kralove, 1992.-Р. 37. Sandomirsky B.P., Nikonenko A.S., Kovalyov A.A., Zavgorodny S.N., Volkova N.A. Galchenko S.E., Shapovalov D.V. Xenogenous transplantation of Pancreatic Islets // Раны, ожоги, повязки: Международный хирургич. конгресс (7-9 марта, 1994).-Тель-Авив, 1994.-С. 71. Sandomirsky B.P., Nikonenko A.S., Kovalyov A.A., Zavgorodny S.N., Volkova N.A. Galchenko S.E., Shapovalov D.V. The transplantation of xenogenous pancreatic islets // J. Data Medica.-1994.-Vol. 2, № 1.-Р. 60. Сандомирский Б.П., Никоненко А.С., Ковалев А.А., Завгородний С.Н., Волкова Н.А., Шаповалов Д.В. Гальченко С.Е. Ксенотрансплантация островковой ткани поджелудочной железы в хирургической клинике//Proc. 3-rd Intern. Congress on Wound, Burn and Dressing.-Tel-Aviv, 1994.-Р. 165-166. Sandomirsky B.P., Nikonenko A.S., Kovalyov A.A., Zavgorodny S.N., Volkova N.A. Galchenko S.E., Shapovalov D.V. Cellular therapy implantation of cryopreserved pancreatic islets // Proc. Ist Intern. Congress on Biological Med. (21-23 Nov., 1994.-Israil).-Tel.-Aviv, 1994.-Р. 48. Sandomirsky B.P., Galchenko S.E., Tynynyka L.N. Cryopreservation of xenogenic spleen and fragments for clinical application // CRYO-95 The 32-rd Annual Meeting of the Society for Cryobiology.-Madison, Wisconsin, 1995.-P. 61. Сандомирский Б.П., Никоненко А.С., Ковалев А.А., Волкова Н.А., Завгородний С.Н., Гальченко С.Е. Ксенотрансплантация криоконсервированных культур островковой ткани поджелудочной железы в комплексном лечении инсулинзависимого сахарного диабета и его осложнений // Сучасні проблеми клінічної та експериментальної трансплантології // Укртрансплант.-К., 1995.-С. 155-156. Сандомирский Б.П., Волкова Н.А., Гальченко С.Е., Белочкина И.В. Банк криоконсервированных культур ОТПЖ для клинического применения // I З’їзд українського товариства кріобіології і кріомедицини (18-20 жовтня 1995 р.): Тези доповідей.-Харків, 1995.- С. 223-225. Сандомирский Б.П., Гальченко С.Е., Тыныныка Л.Н., Мамонтова А.В. Разработка технологии криоконсервирования фрагментов ксеноорганов для клинического применения // I З’їзд українського товариства кріобіології і кріомедицини.-Харків, 1995.-С. 222-223. Sandomirsky B.P., Galchenko S.E., Volkova N.A., Mamontova A.V., Tynynyka L.N., Belochkina I.V. Xenogenic fragments preservation for clinical application // CRYO’96 “The 33-rd Annual Meeting of the Society for Cryobiology” USA Indiana Indianapolis, 1996, P.- 164. Sandomirsky B.P., Galchenko S.E., Volkova N.A., Belochkina I.V., Mamontova A.V., Tynynyka L.N. High cooling rate effect on the integrity of some tissue fragments // CRYO’97 The 34-th Annual Meeting of the Society for Cryobiology (Spain, Barcelone, June, 8-12).- Barcelone, 1997.-P. 171. Сандомирский Б.П., Гальченко С.Е., Мамонтова А.В., Тыныныка Л.Н. Криоконсервирование фрагментов ксеноорганов для клинического применения // Актуальные вопросы репродуктологии и криомедицины: Сб. науч. трудов. – Харьков, 1998.–С. 198-201. Sandomirsky B.P., Galchenko S.E., Tynynyka L.N. Cryopreservation of pig spleen and liver fragment // Allograft against disability”: 2nd World Congress on Tissue Banking and 8th International Conference of EATB (October 7-10, 1999.-Warsawa, Poland).- Warsawa, 1999.-Р. 201. Сандомирский Б.П., Гальченко С.Е., Белочкина И.В., Мамонтова А.В., Гальченко Е.С. Криобиологические технологии получения ряда препаратов из ксеногенного сырья // Успехи и перспективы развития криобиологии и криомедицины: Тез. докл. Всеукраинской науч. конф.-Харьков, Украина, Пробл. криобиологии.-2001.-№ 3.-С. 30-31. Сандомирский Б.П., Гальченко С.Е., Гальченко Е.С. Криобиологические подходы к созданию препаратов из ксеногенного сырья // Лекарства-человеку: Мат. науч.-практич. конф.-Харьков, 2001.-Т.14, № 1.-С. 56-57. Гальченко С.Е., Сандомирский Б.П., Бызов В.В., Слета И.В. Криобиологические технологии получения экстракта из фрагментов свиной селезенки с целью его клинического применения // Новые технологии получения биологически активных веществ: Тез. докл. международ. науч.-практич. конф.-Алушта, 2002.-С. 185-186. Гальченко С.Е., Белочкина И.В., Гальченко Е.С., Сандомирский Б.П. Эффективность комплексного применения экстракта поджелудочной железы свиней и лиофилизированного молозива коров при экспериментальном сахарном диабете // Сучасні напрямки розвитку ендокринології“ (Другі Данилевські читання): Мат. наук.-практич. конф. (Харків, 27-28 лютого 2003).-Харків, 2003.-С. 39-41. Galchenko S.E., Belochkina I.V., Sleta I.V., Galchenko E.S., Shkodovskaya N.Yu., Sandomirsky B.P. Biologically active substance extracting from xenogenic organs with applying cryobiological technologies // Cryobiomol, Low temperature biology.-(Coimbra, Portugal, 14-18 September 2003).-Coimbra, 2003.-P. 164. Гальченко С.Є., Бєлочкіна І.В., Тининика Л.М., Слета І.В., Гальченко К.С., Шкодовська Н.Ю., Сандомирський Б.П. Порівняльне вивчення ефективності різних форм препаратів з ксеногенних органів // Х конгрес світової федерації українських лікарських товариств: Тез. допов.-Чернівці, 2004.-С. 617. Гальченко С.Е., Узленкова Н.Е., Слета И.В., Сандомирский Б.П. Экспериментальное изучение влияния экстрактов криоконсервированных фрагментов ксеногенных органов на рост опухоли Герена // III съезд онкологов и радиологов СНГ: Материалы съезда (Минск, 25-28 мая 2004 г.).-Минск, 2004.-Ч. І.-С. 329-330. Гальченко С.Є., Сандомирський Б.П. Застосування екстрактів ксенотканин замість ксенотрансплантації при патологіях відповідних органів // Каразинські природознавчі студії: Міжнар. наук. конф. (14-16 червня 2004 р., м. Харків).-Харків, 2004.-С. 260. Ромоданова Э.А., Дюбко Т.С, Гальченко С.Е., Сандомирский Б.П., Поврозин Е.А., Погожих Д.Н. Изучение влияния низкоинтенсивного лазерного излучения на взаимодействие альбумина с экстрактами различных тканей // Применение лазеров в медицине и биологии: Мат. XXI Международ. науч.-практ. конф. (26-29 мая 2004 г., Одесса).-Одесса, 2004.-С. 110-111. Заготівля, кріоконсервування та клінічне застосування фрагментів селезінки свиней та екстракту з них: Методич. рекомендації / ІПКіК НАН України.-Уклад. Сандомирський Б.П., Гальченко С.Є., Бизов В.В., Грищенко В.І., Велигоцький М.М., Велигоцький О.М.- Харків, 2001.-9 с. Заготівля, кріоконсервування та клінічне застосування фрагментів печінки свиней і поросят, підшлункової залози поросят та екстракту з них: Методич. рекомендації / ІПКіК НАН України.–Уклад. Сандомирський Б.П., Гальченко С.Є., Грищенко В.І., Бєлочкіна І.В., Слета І.В.-Харків, 2002.- 8 с. АНОТАЦІЇ Гальченко С.Є. Кріоконсервування фрагментів органів ссавців і біологічна дія одержаних з них водно-сольових екстрактів.-Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія.-Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків-2007. У роботі досліджено вплив умов кріоконсервування фрагментів органів (підшлункова залоза, печінка, селезінка) свиней та новонароджених поросят на їх збереження та склад одержуваних з цих фрагментів водно-сольових екстрактів. Показана висока кріопротекторна ефективність поліетиленоксидів при кріоконсервуванні фрагментів органів. Встановлено, що вихід речовин пептидної природи в розчин більший з фрагментів органів, кріоконсервованих під захистом поліетиленоксиду з м.м. 1500. Встановлено, що молекулярно-масовий розподіл пептидів в екстрактах залежить від органа та віку тварин. Екстракт підшлункової залози нормалізує біохімічні показники при експериментальному цукровому діабеті, а екстракт печінки стимулює процеси репарації в ураженому органі при токсичному гепатиті та цирозі печінки. Уведення екстракту селезінки позитивно впливає на перебіг цукрового діабету, токсичного гепатиту та прискорює загоєння опікових ран. Суміш екстрактів сприяє гальмуванню росту карциноми Герена і збільшує тривалість життя щурів. Ключові слова: кріоконсервування, фрагменти органа, екстракт, пептиди, цукровий діабет, токсичний гепатит, цироз печінки, рана, пухлина. Гальченко С.Є. Криоконсервирование фрагментов органов млекопитающих и биологическое действие полученных из них водно-солевых экстрактов.-Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология.-Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков-2007. В работе исследовано влияние условий криоконсервирования фрагментов органов (поджелудочная железа, печень, селезенка) свиней и новорожденных поросят на их сохранность и состав получаемых из этих фрагментов водно-солевых экстрактов. Показана высокая криопротекторная эффективность полиэтиленоксидов при криоконсервировании фрагментов органов. Установлено, что выход веществ пептидной природы в раствор больше из фрагментов органов, криоконсервированных под защитой полиэтиленоксида с м.м. 1500. Определено, что молекулярно-массовое распределение пептидов в экстрактах зависит от органа и возраста животных. Экстракт поджелудочной железы нормализует биохимические показатели при экспериментальном сахарном диабете, а экстракт печени стимулирует процессы репарации в пораженном органе при токсическом гепатите и циррозе печени. Введение экстракта селезенки положительно влияет на протекание сахарного диабета, токсического гепатита и сокращает сроки заживления ожоговых ран. Смесь экстрактов способствует торможению роста карциномы Герена и увеличивает продолжительность жизни крыс. Ключевые слова: криоконсервирование, фрагменты органа, экстракт, пептиды, сахарный диабет, токсический гепатит, цирроз печени, рана, опухоль. Galchenko S.E. Cryopreservation of mammals’ organ fragments and the biological effect of obtained water-saline extracts.-Manuscript. Thesis for conferring a scientific degree for Doctor of Biological Sciences, speciality 03.00.19 – cryobiology.-Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkiv-2007. The effect of cryopreservation conditions on the integrity of mature pigs’ and newborn piglets’ organ fragments (pancreas, liver, spleen) and on the composition of water-saline extracts derived from these fragments has been studied in the work. The biological effect of extracts has also been investigated under different pathological conditions. The best preservation of pancreas fragments was observed under cryoprotection with DMSO and PEO-1500, the latter acting effectively in the wider range of cooling rates, while DMSO showed cryoprotective activity at 1єC/min. The cultured tissue responded adequately to the increase in glucose concentration up to stimulative indices (16.7 mmol/l), while low glucose level (5.6 mmol/l) led to the decrease in insulin production. Cryopreservation of pigs’ and newborn piglets’ liver fragments in the presence of polyethylene oxides led to the decrease of both endogenous respiration and coupling between respiration and oxidative phosphorylation. In 60 min in contrast to the decrease of native material respiration, the cryopreserved fragments showed respiration recovery. The increase of coupling between respiration and oxidative phosphorylation was also defined in cryopreserved fragments, but by 120 min these indices were lower than in the control. Endogenous respiration of pigs’ liver fragments cryopreserved with polyethylene oxides at 1єC/min did not differ significantly in comparison to the control. At the same time slight coupling between respiration and oxidative phosphorylation was defined both in the control and in cryopreserved material. By 60 min of incubation there were no changes in endogenous respiration intensity, although the normalization of respiration and oxidative phosphorylation coupling was identified. By 120 min a considerable decrease of the studied bioenergetic indices was observed both in the control and in cryopreserved fragments. During extracts obtaining the maximum peptide concentration in the supernatant was defined after organ fragments preservation under PEO-1500 protection. The amount of peptides in the solution did not depend on cryoprotectant concentrations used. The significant decrease of peptide concentration in solution was observed during first 60 min of incubation. Extracts obtained from cryopreserved xenogenic organ fragments are characterised by presence of substances of peptide nature with wide spectra of molecular masses. These spectra are different for extracts derived from different organ fragments, and extracts composition also depends on animal age. It was established that extracts’ ingredients bind to blood serum albumin, and this binding could be regarded as one of the specific mechanisms of biologically active substances transportation to relevant organs and tissues. Both newborn piglets’ pancreas fragments and the extract derived from pigs’ cryopreserved pancreas fragments promoted the decrease of glucose level in blood as well as the decrease of lipid peroxidation level in the organism of diabetic rats. In some instances the normalization of the studied indices was more noticeable under extract injection rather than under fragments application. Extracts, obtained from cryopreserved fragments of pigs’ and piglets’ liver, stimulated reparative processes under diffuse diseases of liver. The effect of extracts manifested in the decrease of aminotransferase activity in blood serum of rats and also in the decrease of lipid peroxidation intensity both in the damaged liver and blood serum of animals. The normalisation of organ histological structure, the increase in number and diameter of functioning vessels as well as the increase in blood flow rate were also observed. The local application of the extract of pigs’ cryopreserved spleen fragments accelerated the healing of burns in experimental animals. This manifested in earlier eradication of wounds from microorganisms, shortening of inflammation phase time as well as earlier granulative tissue formation. Extracts of pigs’ cryopreserved liver fragments and pancreas fragments did not promote the normalisation of biochemical indices in the organism of rats under experimental diabetes mellitus and toxic hepatitis accordingly. The extract of pigs’ cryopreserved spleen fragments promoted the normalisation of the studied indices under both pathological conditions. Chronic injection of xenogenic organ extracts to young rats did not influence the animals’ weight change, caused by physiological effects, and did not stimulate lipid peroxidation processes in the organism. The injection of extract mixture to 24-months old animals led to the decrease in lipid peroxidation intensity to the level observed in 6-months old animals. The lifetime of treated animals was prolonged. The injection of extracts obtained from pigs’ cryopreserved organs inhibited the tumour growth (Heren’s carcinoma) and promoted the increase of the life in rats. Key words: cryopreservation, organ fragments, extract, peptides, diabetes mellitus, toxic hepatitis, liver cirrhosis, burn, tumour. PAGE 26

Похожие записи