НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Скоробогатова Наталія Григорівна

УДК: 615.361.36.013.014.41:547.569.2

Кріоконсервування фібробластоподібних клітин-попередників ембріональної
печінки людини

03.00.19 – кріобіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН
України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Петренко Олександр
Юрійович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України,
завідувач відділу кріобіохімії, м. Харків

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Малоштан Людмила Миколаївна,
Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри фізіології,
м. Харків

доктор біологічних наук Розанов Леонід Федорович, Інститут проблем
кріобіології і кріомедицини НАН України, провідний науковий співробітник
відділу низькотемпературного консервування, м. Харків

Провідна установа: Харківський національний університет
ім. В.Н. Каразіна, кафедра молекулярної біології і біотехнології,
м. Харків

Захист дисертації відбудеться “_23_” ___січня______ 2007 р. о _13-30
годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д64.242.01 в Інституті
проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, за адресою: 61015,
Харків-15, вул.Переяславська,23

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту проблем
кріобіології і кріомедицини НАН України, за адресою: 61015, Харків-15,
вул.Переяславська,23

Автореферат розісланий “_20_” ___грудня_____ 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

член-кореспондент НАН України
Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В останні роки підвищена увага дослідників до
мультипотентних стовбурових клітин (СК) пояснюється перспективами їх
застосування в різних галузях клітинної біології та регенераційної
медицини.

Ембріональна печінка людини (ЕПЛ) 6-12 тижнів гестації – основний
гемопоетичний орган в період формування кровотворної системи організму
(Peshle C. et al., 1984, Торубарова Н.А., 1997, O’Donoghue K., 2004).
Стовбурові кровотворні клітини ЕПЛ характеризуються високим
проліферативним потенціалом (Lansdorp P.M. et al, 1993; Muench M.O. et
al, 1994), який зумовлений стадією онтогенетичного розвитку і
специфічними особливостями мікрооточення. Серед популяцій клітин
негемопоетичного пулу кровотворних органів важливе місце посідають
фібробластоподібні клітини-попередники (ФКП), які здатні до
колонієутворення в умовах in vitro. В дослідженнях, проведених на
кістковому мозку дорослих, було визначено, що стромальні ФКП мають
істотне значення для становлення і функціонування гемопоезу (Чертков
И.Л., Фриденштейн А.Я., 1977, Simmons P.J. et al., 1994). Згідно з
сучасними уявленнями (Caplan A.I., 1991; Deans R.J. et al., 2000), до
цієї популяції належать мезенхімальні стовбурові клітини (МСК), які
мають здатність до диференціювання в різні типи сполучної тканини
(Pittenger M.F. et al., 1999; Dennis J.E. et al., 1999). Однак
властивості цих клітин у пренатальному періоді, зокрема в ЕПЛ, ще
недостатньо вивчені, що і зумовлює актуальність обраного напрямку
досліджень.

Розробка нових та удосконалення існуючих методів кріоконсервування
клітинних суспензій спрямовані на збереження унікальних властивостей СК
і створення низькотемпературних банків, необхідних для забезпечення
більш поширеного експериментального та клінічного використання цих
клітин. Більшість кріобіологічних робіт, що виконувались на кровотворних
тканинах, присвячено вивченню впливу кріоконсервування на життєздатність
і функціональну активність гемопоетичних клітин (Stiff P.J. et al.,
1983; Цуцаева А.А. и др., 1983; Гольцев А.Н. и др., 2005), в тому числі
ЕПЛ (Грищенко В. И. и др., 1988; Zhao J. et al., 2001; Tarasov A. I.,
Petrenko A. Yu. et al., 2004).

Чутливість ембріональних МСК та їх недиференційованих нащадків до дії
факторів низькотемпературного консервування до теперішнього часу не
вивчалась. Враховуючи низький вміст МСК у первинній суспензії, в деяких
випадках дослідники намагаються одержати окремі клітинні фракції або
розмножити конкретні типи клітин-попередників (КП) в культурі (Huss R.,
2000; Reyes M et al., 2001). Однак відомо, що маніпуляції, пов’язані зі
збагаченням суспензій клітинами з певними характеристиками,
супроводжуються дією додаткових фізико-хімічних факторів, що може
негативно впливати на результати наступного кріоконсервування. Крім
того, властивості МСК і комітованих попередників, безпосередньо
ізольованих з органу, можуть змінюватись при культивуванні in vitro
(Digorolamo C.M. et al., 1999). У зв’язку з цим дослідження впливу умов
кріоконсервування на збереження ФКП у складі первинних суспензій важливе
для виявлення кріочутливості цих клітин та визначення адекватних умов їх
низькотемпературного консервування.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана відповідно до плану НДР ІПКіК НАН України у відділі
кріобіохімії за темами: №87 “Вивчення механізмів біологічного впливу
кріоконсервованих препаратів ембріональної печінки на метаболізм
гепатоцитів в умовах функціональної недостатності печінки” (№
держреєстрації 0202U000833); №7 “Вивчення морфофункціональних
особливостей регіональних стовбурових клітин ембріонів, їх
кріочутливості та механізмів реалізації біологічної активності в умовах
культивування та на моделях деяких патологічних станів” (№
держреєстрації 0102U002026); №19 “Біорегулятори стовбурових клітин” (№
держреєстрації 0104U006440).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи – визначити вплив умов
кріоконсервування на життєздатність клітин у первинній суспензії
ембріональної печінки людини, вміст фібробластоподібних
клітин-попередників і їх здатність до проліферації та індукованого
диференціювання.

Для досягнення мети поставлені наступні задачі:

Оцінити адгезивні властивості клітин ембріональної печінки людини, вміст
фібробластоподібних клітин-попередників у первинній суспензії та їх
колонієутворюючу активність в умовах моношарового культивування.

Визначити здатність фібробластоподібних клітин-попередників
ембріональної печінки людини до диференціювання в остеогенному та
адипогенному напрямках при культивуванні in vitro.

Провести порівняльну оцінку життєздатності клітин ембріональної печінки
людини з застосуванням експрес-методів прижиттєвого забарвлення
трипановим синім, бромистим етидієм і флуоресцеїндіацетатом до та після
кріоконсервування первинних суспензій.

Вивчити вплив різних режимів заморожування первинної суспензії
ембріональної печінки людини під захистом диметилсульфоксиду на
життєздатність і функціональні властивості клітин.

Дослідити вплив диметилсульфоксиду на проліферативні властивості і
здатність до диференціювання фібробластоподібних клітин-попередників
ембріональної печінки людини.

Визначити вплив різних умов кріоконсервування на колонієутворюючу
активність і диференціювальні потенції фібробластоподібних
клітин-попередників ембріональної печінки людини.

Об’єкт дослідження. Дія кріопротектора диметилсульфоксиду (ДМСО) та
низькотемпературного консервування на життєздатність і
морфофункціональні властивості клітин ембріональної печінки людини.

Предмет дослідження. Фібробластоподібні клітини-попередники і первинна
суспензія ембріональної печінки людини (8-11 тижнів гестації).

Методи дослідження. В роботі використовували методи: двох- і трьох
етапного заморожування клітинних суспензій; культивування гемопоетичних
і стромальних клітин in vitro; люмінесцентної і світлової мікроскопії
(для оцінки життєздатності і морфофункціональних характеристик клітин,
включаючи цитохімічні засоби визначення специфічних ознак індукованого
диференціювання ФКП ЕПЛ in vitro).

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше встановлено, що умови
кріоконсервування, які забезпечують збереження
гранулоцитарно-макрофагальних гемопоетичних КП, не є адекватними для
колонієутворюючих ФКП ЕПЛ. Вперше визначено, що близько 50 % клітин
первинної суспензії ЕПЛ 8-11 тижнів гестації складає адгезивну фракцію.
Виявлено, що серед 100 000 життєздатних клітин ЕПЛ присутньо не менш
2-3-х ФКП, які формують колонії фібробластів при культивуванні in vitro.

Доведено, що у складі досліджуваної популяції стромальних ФКП ЕПЛ
присутні попередники, які здатні до індукованого in vitro
диференціювання в остеогенному і адипогенному напрямках.

Визначено, що первинна суспензія вміщує не менше 30 % клітин, які
одночасно негативні до прижиттєвого забарвлення трипановим синім (ТС) і
бромистим етидієм (БЕ), але не демонструють флуоресценції флуоресцеїну
при використанні флуоресцеїндіацетату (ФДА).

Вперше визначена роль переохолодження в збереженні проліферативних і
диференціювальних властивостей ФКП ЕПЛ. В роботі встановлено, що
ініціація кристалоутворення при повільному заморожуванні за трьохетапною
програмою первинної суспензії клітин ЕПЛ під захистом ДМСО забезпечує
збереження здатності ФКП ЕПЛ до колонієутворення та індукованого in
vitro остео- і адипогенезу.

Практичне значення отриманих результатів. У роботі проаналізовано та
визначено можливості і певні обмеження у використанні методів
прижиттєвого забарвлення ТС, БЕ і ФДА для лабораторної діагностики
життєздатності клітин ЕПЛ.

Результати роботи, спрямованої на удосконалення способу видалення
кріопротектору ДМСО при кріоконсервуванні клітин ЕПЛ, захищені
деклараційним патентом України № 67587А, МПК А01N1/02.

В умовах культивування in vitro здійснено індукцію диференціювання
кріоконсервованих ФКП ЕПЛ в остеогенному і адипогенному напрямках, що
може знайти використання в регенераційній медицині.Отримані в дисертації
результати можуть бути основою для розробки методів кріоконсервування
МСК різного походження, а також для створення низькотемпературного банка
досліджених СК і КП.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем самостійно проведено огляд
літератури за темою дисертаційної роботи, отримано експериментальні
результати, проведено їх статистичну обробку і аналіз. Винесені на
захист положення і результати отримані дисертантом особисто. У наукових
працях, що опубліковані у співавторстві, відбито результати спільного
планування, проведення експериментів та обговорення результатів.
Здобувачем сумісно з канд. хім. наук О.М. Новіковим були проведені
експерименти щодо програмного заморожування ФКП ЕПЛ. Разом із науковим
керівником проф. О.Ю. Петренко інтерпретовано результати і сформульовано
висновки. В опублікованих спільно із співавторами працях особистий
внесок здобувача полягає:

у роботі [1] у вивченні впливу умов видалення кріопротектора ДМСО на
життєздатність та колонієутворюючу активність гемопоетичних клітин ЕПЛ;

у роботі [3] у відпрацюванні методики культивування фібробластоподібних
клітин-попередників ЕПЛ та оцінці їх колонієутворюючої активності in
vitro;

у роботі [4] у вивченні впливу кріоконсервування на функціональні
властивості гемопоетичних та фібробластоподібних клітин ЕПЛ у складі
первинної суспензії;

у роботі [5] у вивченні впливу різних умов кріоконсервування на
проліферативні властивості колонієутворюючих фібробластоподібних клітин
ЕПЛ;

у роботі [6] в удосконаленні етапу видалення кріопротектора при
кріоконсервуванні суспензій клітин ЕПЛ;

у роботі [7] в аналізі експериментальних результатів щодо використання
сахарозо-сольового розчину при кріоконсервуванні клітин ЕПЛ;

у роботі [8] у вивченні морфофункціональних характеристик стромальних
клітин ЕПЛ;

у роботі [9] у вивченні впливу кріоконсервування на остеогенний та
адипогенний потенціал фібробластоподібних клітин-попередників ЕПЛ.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи
доповідались і обговорювались на наукових форумах: конференціях молодих
вчених ІПКіК НАН України “Холод в біології і медицині” (м. Харків, 2003,
2004); конференції «Cryo Biomol 2003, Society for Cryobiology»
(м. Коімбра, Португалія, 2003); Установчому з’їзді Українського
товариства клітинної біології (м. Львів, 2004); Всеукраїнській науковій
конференції з міжнародною участю “Актуальні проблеми і досягнення
кріобіології і кріомедицини. Структурна і функціональна організація
стовбурових клітин за умов дії низьких температур”(м. Харків, 2005);
конференції «Cryo 2006, Society for Cryobiology» (м. Гамбург, Германія,
2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 наукових праць, в
тому числі 5 статей у фахових журналах, 1 патент і 3 тези доповідей на
міжнародних і національних наукових конференціях.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 139
сторінках друкованого тексту, з яких 113 сторінок основного змісту.
Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і
методів досліджень, результатів власних досліджень, заключення,
висновків, списку цитованої літератури (19 сторінок), що включає 172
джерела. Дисертацію ілюстровано 7 таблицями і 36 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження

У роботі було використано фрагменти ЕПЛ, одержані від 64 ембріонів 8-11
тижнів гестації після планового переривання вагітності по соціальним
показникам та при наявності інформованої письмової згоди донора на
використання цього біоматеріалу для досліджень. Біоматеріал
транспортували при 4 оС у стерильних флаконах з 2 мл сахарозо-сольового
розчину (ССР), який був розроблений для гіпотермічного збереження
(Shanina I., Kravchenko L. et al., 2000) і кріоконсервування (Petrenko
A.Yu. et al., 1992) клітин печінки. Виділення ізольованих клітин
здійснювали в умовах бокса, як було описано (Демидова С.А. и др., 1971;
Петренко А.Ю. и др., 1991).

Експозицію клітин здійснювали у кріозахисному розчині з ДМСО в
концентрації 0,7 або 1,4 М при 4 оС протягом 30 хв. Заморожування
клітинних суспензій проводили у кріоконтейнерах фірми «Nunc» за режимами
двох- і трьохетапного заморожування, які наведені у табл. 1. Програмне
заморожування суспензій клітин ЕПЛ (режими III-VI) здійснювали на
заморожувачі ЗП 10 (СКТБ ІПКіК НАН України).

Таблиця 1

Режими заморожування суспензій клітин ЕПЛ

№/№ Режими

I перший етап – занурення кріоконтейнерів в спиртову баню при

-25  SYMBOL 176 \f «Symbol» \s 14 ° С та експозиція протягом 20 хв;
другий етап – перенесення в рідкий азот

II перший етап – розміщення кріоконтейнерів в контейнері Cryo 1 SYMBOL
176 \f «Symbol» \s 14 ° С Freesing Container (Nalgene) з ізопропіловим
спиртом та витримування при -80 оС протягом 4-х год; другий етап –
перенесення в рідкий азот

III перший етап – охолодження зі швидкістю 1 оС/хв до -40 оС, другий
етап –10 оС/хв до -80 оС; третій – перенесення в рідкий азот

IV перший етап – охолодження зі швидкістю 1 оС/хв до -20 оС; другий етап
– 10 оС/хв до -60 оС; третій – перенесення в рідкий азот

V перший етап – охолодження зі швидкістю 1 оС/хв до -20 оС; другий етап
– 5 оС/хв до -60 оС; третій – перенесення в рідкий азот

VI перший етап – охолодження (з використанням ініціації
кристалоутворення) зі швидкістю 1 оС/хв до -20 оС; другий етап – 5 оС/хв
до -60 оС; третій – перенесення в рідкий азот.

Кріоконсервовані клітинні суспензії зберігали в умовах
низькотемпературного банку ІПКіК НАН України протягом 1-16 тижнів.
Відігрів виконували на водяній бані при 37 оС протягом 40-50 с. При
видаленні кріопротектора ДМСО використовували розчини – ССР, розчин
Хенкса або культуральне середовище в залежності від задач та умов
експерименту.

Для характеристики стану клітин ЕПЛ на різних етапах дослідження
використовували експрес-методи оцінки життєздатності за допомогою
прижиттєвого забарвлення ТС (Seglen P., 1976), БЕ і ФДА (Dankberg F.et
al., 1976).

Під час забарвлення ТС проводили підрахунок кількості клітин у камері
Горяєва. Результати аналізували за допомогою формул (Armitage W. J.,
Mazur P., 1984):

A= a x100 %, B= c x100 %, C= c x100 %,

b

b

a

де A – вихід загальної кількості клітин;

B – вихід життєздатних клітин;

С – життєздатність;

a – загальна кількість клітин після дії факторів кріоконсервування;

b – загальна кількість клітин до дії факторів кріоконсервування;

c – кількість життєздатних клітин після дії факторів кріоконсервування.

Колонієутворюючу активність КП гранулоцитарно-макрофагального напрямку
диференціювання визначали при культивуванні клітин ЕПЛ в двошаровому
агарі (Гольдберг Е. Д., 1992). Загальну кількість колоній оцінювали на
10 добу культивування в препаратах культур, які були приготовлені за
методом Френкель М. А. (1982).

Адгезивні властивості клітин ЕПЛ вивчали в умовах моношарового
культивування. Ефективність прикріплення клітин до пластика оцінювали
через певні інтервали часу, як описано Davis J.M. (2001).

Колонієутворюючу активність ФКП ЕПЛ досліджували в умовах моношарового
культивування in vitro за методом Friedenstein A.J., Chailakhjan R.K. et
al. (1970). Кількість колоній ФКП, тобто число колонієутворюючих одиниць
фібробластів (КУОф), оцінювали на 14 добу культивування.

Ефективність колонієутворення (ЕКУ) визначали із співвідношення
кількості колоній до кількості експлантованих у культуру клітин,
одержаний показник виражали у відсотках (Davis J.M., 2001).

Диференціювальний потенціал ФКП ЕПЛ вивчали, як описано в роботі
Campagnoli C. et al. (2001). Індукцію остеогенного і адипогенного
диференціювання проводили в середовищі MesenCult TM MSC Basal Medium
(Stem Cell Technologies Inc., Vancouver, Canada), яке було доповнено
специфічними компонентами. Для індукції остеогенезу використовували
дексаметазон 0,1 мкМ, аскорбінову кислоту 0,05 мМ, гліцерол-2-фосфат 10
мМ и 10 % ембріональної сироватки (ЕС) великої рогатої худоби („Биолот”,
г. Санкт-Петербург, Россия). Для індукції адипогенезу середовище
культивування доповнювали комплексом адипогенних компонентів –
Adipogenic Stimulatory Supplements (Stem Cell Technologies Inc.,
Vancouver, Canada). Активність лужної фосфатази остеогенних клітин
визначали за методом Kaplow L.S. (1955), для виявлення адипогенних
клітин проводили фарбування препаратів культур Oil Red O
(Kilrnan J.A.,1990). Для контролю спонтанного диференціювання
використовували ФКП від тих же первинних культур, які культивували в
середовищі без специфічних компонентів, необхідних для індукції
досліджуваних типів диференціювання.

Для вивчення загальної морфології культивованих клітин ЕПЛ зразки
культур фіксували 96 % етанолом протягом 20 хв та фарбували
гематоксиліном Ерліха (Волкова О.В., Елецкий Ю.К., 1971) або
азур-еозином (Козинец Г.И., 1998).

Статистичну обробку результатів проводили за непараметричним методом по
критерію Уілкоксона. Результати представлено як M±m. Рівень вірогідності
складав 0,05.

Матеріали і методи, які застосовані в дисертаційній роботі, розглянуті і
схвалені комісією по біоетиці ІПКіК НАН України.

Результати роботи та їх обговорення

Оцінка життєздатності клітин ембріональної печінки людини в первинній
суспензії до і після кріоконсервування. Для первісної характеристики
життєздатності клітин ЕПЛ у складі первинної суспензії було використано
методи прижиттєвого забарвлення за допомогою ТС, а також БЕ і ФДА.

Отримані результати показали, що життєздатність свіжоізольованих клітин
ЕПЛ за ТС і БЕ складала 87,3 ± 2,1 і 80,1 ± 3,1 % відповідно (рис. 1).

Рис. 1. Показники кількості (1) і життєздатності клітин ЕПЛ за тестами
прижиттєвого забарвлення ТС (2), БЕ (3), ФДА (4) до і після
кріоконсервування.

Примітки: * – відмінності статистично вірогідні по відношенню до
відповідних результатів свіжоізольованих клітин; + х – відмінності між
показниками ФДА-тесту та результатами прижиттєвого забарвлення ТС і БЕ
статистично вірогідні (p < 0,05; n = 6). В той же час життєздатність, яку визначали за вмістом в суспензії ЕПЛ флуоресцеїн-позитивних клітин після використання ФДА, дорівнювала 48,5±4,0%. Цей показник був вірогідно нижче отриманих при забарвленні ТС та БЕ (рис.1). За результатами даних експрес-тестів було встановлено, що після заморожування суспензій ЕПЛ за режимом III (табл. 1) на фоні незначного зменшення загальної кількості клітин їх життєздатність була вірогідно нижча за наведеними експрес-тестами і складала 63,7 ± 8,5 %; 54,6 ± 2,6 % і 24,3 ± 3,2 % при використанні ТС, БЕ і ФДА відповідно. Крім того, після кріоконсервування різниця показників життєздатності, яку виявлено при забарвленні ТС, БЕ та застосуванні ФДА, залишалась на тому ж рівні, що і у свіжоізольованих клітинах ЕПЛ. Отримані результати свідчать про те, що використання ФДА не виявляє реальної кількості клітин з непошкодженими мембранами в первинній суспензії ЕПЛ. Визначений факт відсутності світіння флуоресцеїну в близько 30 % клітин первинної суспензії ЕПЛ може бути зумовлений присутністю фетального гемоглобіну в еритроїдних КП. В літературі описано ефект маскування флуоресценції флуоресцеїну гемоглобіном еритроцитів, одержаних із крові дорослих донорів (Persidsky M. D., 1977). При вивченні життєздатності клітин ЕПЛ на різних етапах кріоконсервування прижиттєве забарвлення ТС у порівнянні з використанням БЕ і ФДА має ту перевагу, що даний тест дозволяє оцінити загальну кількість клітин, а також ураховувати втрату клітин після дії негативних факторів низькотемпературного консервування, як запропоновано Armitage W. J., Mazur P. (1984). Так, після кріоконсервування клітин ЕПЛ в ССР під захистом ДМСО 0,7 М за режимом III (табл.1) було виявлено вірогідне зниження виходу життєздатних клітин і життєздатності. Крім того, встановлено, що використання розчину Хенкса при відмиванні клітин від ДМСО призводило до зменшення як загальної кількості, так і кількості життєздатних клітин ЕПЛ. В той же час використання ізотонічного ССР як розчину для відмивання дозволяло зменшити негативну дію процедури видалення кріопротектора в умовах повільного крапельного його введення у відігріту клітинну суспензію і забезпечувало більш високий вихід життєздатних клітин. Результати життєздатності клітин ЕПЛ на різних етапах кріоконсервування за обраним протоколом і з видаленням кріопротектора за допомогою ізотонічного ССР наведено на рис. 2. Експозиція клітин ЕПЛ у кріозахисному розчині за певними умовами не призводила до зміни вивчених показників. Вихід життєздатних клітин і життєздатність вірогідно знижувались безпосередньо після заморожування-відігріву. Після видалення кріопротектора при використанні ССР визначено зменшення загальної кількості клітин, в той час як вихід життєздатних клітин вірогідно не змінювався. Рис.2. Вплив кріоконсервування на кількість і життєздатність клітин ЕПЛ: 1 – контроль (свіжоізольовані клітини); 2 – після контакту з ДМСО (0,7 M); 3 – після заморожування-відігріву; 4 –після заморожування-відігріву-видалення ДМСО. Примітки: х – відмінності статистично вірогідні по відношенню до контрольних значень; * – відмінності статистично вірогідні по відношенню до відповідних значень після заморожування-відігріву (p< 0,05; n = 6). O D ? A ® ° - D ????????????&? a$ `„?a$ c>¦i©A¬–±oµoµoeµ?¶U¶»·j·I·x?n?oeYYYNNNA1/2±±±±±YY

a

o

???????????????Свіжоізольовані клітини ЕПЛ, а також кріоконсервовані
клітини до і після видалення кріопротектора були експлантовані в агарову
культуру. В усіх варіантах спостерігали формування колоній
гранулоцитарного, макрофагального и гранулоцитарно-макрофагального
типів. Сумарна ЕКУ у групі свіжоізольованих клітин ЕПЛ складала
0,23±0,03 %; у групі кріоконсервованих клітин до видалення ДМСО –
0,32±0,09 % та у кріоконсервованих клітин після видалення кріопротектора
(при використанні ССР) – 0,28 ± 0,05 %. Статистично вірогідних
відмінностей ЕКУ у вивчених груп виявлено не було. Ці результати
свідчать, що кріоконсервування первинної суспензії клітин ЕПЛ у ССР з
ДМСО 0,7 М за режимом III (на першому етапі – охолодження зі швидкістю
близько 1 оС/хв до -40 оС, на другому етапі – 10 оС/хв до -80 оС, на
третьому – занурення зразків в рідкий азот) дозволяє зберегти
гранулоцитарно-макрофагальні КП.

В той же час дослідження адгезивних властивостей клітин ЕПЛ в умовах
моношарової культури виявило порушення процесу їх адгезії на субстраті.
Хоча кріоконсервовані клітини прикріплювались до культурального
пластика, при наступному культивуванні протягом тижня спостерігалась
поступова деградація значної частини клітин адгезивного пулу. Крім того,
при культивуванні в селективних для стромальних КП умовах визначалась
відсутність колонієутворення ФКП. У зв’язку з цим доцільним було більш
детальне вивчення адгезивних властивостей клітин і функціональної
активності ФКП при кріоконсервуванні первинної суспензії клітин ЕПЛ в
різних умовах.

Функціональні властивості стромальних ФКП ЕПЛ в умовах культивування in
vitro. Вивчення ефективності прикріплення клітин первинної суспензії ЕПЛ
8-11 тижнів гестації показало, що 46,5 ± 4,5 % клітин прикріплюється до
пластика протягом першої години після експлантації в умови моношарового
культивування. Культивування протягом 18 і 36 год не призводило до
вірогідної зміни кількості клітин, які були здатні до адгезії,
ефективність прикріплення відповідно складала 53,3 ± 6,8 і 48,6 ± 8,0 %.

На 2 добу культивування серед клітин адгезивної фракції виявлялися
фібробластоподібні клітинні елементи. При використанні різних посівних
концентрацій клітин встановлено, що для первинної суспензії ЕПЛ
ефективна посівна доза – 20000-40000 клітин/см2. За даними умовами було
визначено ЕКУ, яка складала в середньому 0,002 — 0,003 % (n = 7).

При культивуванні протягом 14 діб виявлено утворення двох типів колоній
ФКП. Колонії першого типу характеризувались компактним центром, який
було сформовано дрібними округлими клітинами, та більш розрідженою
периферійною зоною, в якій розміщувались фібробластоподібні клітини.
Другий тип мав рівномірне розташування ФКП по всій площі колонії. Крім
того, в первинній культурі у складі обох типів колоній у периферійних
зонах зустрічались одиночні клітини, які характеризувались більшим
розміром, округлою формою та відносно великим об’ємом цитоплазми. Серед
них були виявлені клітини з морфологічними ознаками мегакаріоцитів. Ці
клітини можуть виконувати фідерну роль для проліферації КУОф ЕПЛ in
vitro.

На 14 добу культивування колонії ФКП відрізнялись за розміром, що є
показником різної проліферативної активності КУОф ЕПЛ. При наступному
субкультивуванні формувались нові колонії ФКП, які також відрізнялись за
розміром і морфологією, як і в первинній культурі.

Згідно з сучасними уявленнями, здатність до індукованого диференціювання
в остеогенному і адипогенному напрямках вважають специфічною властивістю
мультипотентних МСК та їх незрілих нащадків (Pittenger M.F. et al.,
1999; Deans R.J., Moseley A.B., 2000; Baksh D. et al., 2004). Тому було
важливо оцінити здатність виділених у первинну суспензію ФКП ЕПЛ до
індукованого остеогенного і адипогенного диференціювання в умовах in
vitro.

ФКП ЕПЛ були експлантовані в культуральні середовища, які вміщували
специфічні компоненти для індукції остеогенезу і адипогенезу in vitro.
Після культивування в остеогенному середовищі протягом 19 діб були
виявлені фібробластоподібні клітини, а також клітинні елементи з
морфологією остеобластів, позитивні до наявності лужної фосфатази. При
культивуванні ФКП в адипогенному середовищі протягом такого ж періоду
спостерігали клітини, більшість з яких мали фібробластоподібну
морфологію і були позитивні при фарбуванні Oil Red O, специфічному для
визначення нейтральних ліпідів при адипогенезі. У контролях на спонтанне
остео- та адипогенне диференціювання культивовані клітини мали типову
морфологію фібробластів і залишались негативними до вивчених
цитохімічних маркерів.

Таким чином, отримані результати свідчать, що в первинній суспензії ЕПЛ
присутні ранні ФКП, які здатні до колонієутворення та індукованого
диференціювання в остеогенному і адипогенному напрямках за умовами in
vitro.

Пошук умов кріоконсервування ФКП ЕПЛ. Для дослідження кріочутливості ФКП
ЕПЛ, насамперед, було вивчено вплив експозиції свіжоізольованих клітин у
кріозахисних середовищах, що вміщували ДМСО в концентраціях 0,7 або 1,4
М. Виявлено, що експозиція клітин з розчином ДМСО 0,7 М протягом 30 хв
при 4 оС не змінює кількість клітин, здатних прикріплюватись до
пластика, яка складала в середньому 50 %. У випадку експозиції з ДМСО
1,4 М було визначено тенденцію до зростання ефективності прикріплення
клітин ЕПЛ до 65,7 ± 5,8 %.

Після видалення кріопротектора та при наступному культивуванні клітин
змін в динаміці розвитку первинної культури, морфології клітин і
колонієутворюючої активності ФКП, у порівнянні з нативним контролем,
виявлено не було.

При культивуванні в остеогенному середовищі близько 80 % клітин, що були
попередньо експоновані з ДМСО 0,7 або 1,4 М, демонстрували позитивне
фарбування на лужну фосфатазу. В той же час у групі клітин, які були
культивовані в остеогенному середовищі без попередньої експозиції з
ДМСО, було визначено близько 40 % клітин, позитивних до даного ферменту.
Після контакту клітин з ДМСО 0,7 та 1,4 М остеобласти не відрізнялись
від остеогенних клітин в аналогічній культурі свіжоізольованих клітин.
Відзначено, що найбільш вираженим стимулювання індукції остеогенезу ФКП
ЕПЛ було після експозиції з ДМСО в концентрації 0,7 М. При дослідженні
адипогенного диференціювання ФКП ЕПЛ після експозиції з ДМСО 0,7 і 1,4 М
було виявлено клітини, які демонстрували позитивне фарбування Oil Red O.
Однак у зв’язку з високою проліферативною активністю ФКП ЕПЛ в
адипогенному середовищі кількісних відмінностей диференціювальних
процесів у цих культурах встановити не було можливим. Спонтанних
процесів остео- і адипогенного диференціювання не виявлено.

Таким чином, експозиція ФКП ЕПЛ з ДМСО за вищеназваними умовами не
призводить до пошкодження клітин, хоча відзначено вплив ДМСО на
остеогенні диференціювальні властивості досліджених КП.

Наведені результати давали підставу для припущення, що виявлені при
кріоконсервуванні первинної суспензії негативні зміни ФКП ЕПЛ
відбувались на наступних етапах. Заміна ССР на культуральне середовище з
ЕС у складі кріозахисного розчину не призводила до покращення
результатів кріоконсервування КУОф ЕПЛ. Тому для визначення умов
кріоконсервування, критичних для збереження колонієутворюючих ФКП, нами
було проведено дослідження їх життєздатності і функціональної активності
після заморожування первинних суспензій ЕПЛ за різними режимами. Для
вирішення цієї задачі випробували декілька варіантів двох- і
трьохетапного заморожування (див. табл.1) при використанні ДМСО 0,7 або
1,4 М.

Кріоконсервування, що включало швидке двохетапне заморожування з
зупинкою при — 25 оС (режим I), яке успішно використовувалось при
кріоконсервуванні фібробластів (Farrant J. et al., 1977), забезпечувало
збереження 48,0 ± 2,9 і 63,0 ± 4,7 % клітин ЕПЛ, життєздатних за
забарвленням ТС, у випадках використання ДМСО 0,7 і 1,4 М відповідно.
Однак при культивуванні спостерігалось пошкодження значної частини
клітин адгезивної фракції ЕПЛ. Маючи на увазі, що цей метод
характеризувався високою і нерегульованою швидкістю зниження температури
на початковому етапі, у наступних експериментах було обрано повільне
заморожування (режими II-VI).

Використання режиму II, рекомендованого для багатьох типів клітин (Davis
J.M., 2001), яке забезпечувало охолодження суспензій зі швидкістю
близько 1 оС/хв до -80 оС, не давало покращення результатів
кріоконсервування колонієутворюючих ФКП ЕПЛ. При використанні режимів
програмного трьохетапного заморожування (III-V) з початковою швидкістю
охолодження 1 оС/хв було фактично здійснено варіювання швидкостями
охолодження на першому і другому етапах. Після відігріву суспензій,
кріоконсервованих за всіма обраними протоколами заморожування, на фоні
незначної втрати загальної кількості клітин їх життєздатність при
забарвленні ТС була близько 50-60 %. Ефективність прикріплення
кріоконсервованих клітин залишалась на рівні нативного контролю, але
наступне культивування виявило пошкодження клітин адгезивної фракції ЕПЛ
в усіх досліджуваних варіантах.

Аналіз термограм показав, що всі застосовані режими мали загальний
недолік – переохолодження, яке складало 6-10 оС. Тому у наступній серії
експериментів було проведено трьохетапне програмне заморожування з
використанням ініціації кристалоутворення за режимом VI (табл.1).
Використання ініціації кристалоутворення забезпечувало зниження
діапазону переохолодження в системі до 3 оС і менш. Життєздатність
клітин ЕПЛ, кріоконсервованих за такою програмою, складала 69,3 ± 5,0 і
73,0 ± 3,6 % при використанні ДМСО 0,7 і 1,4 М відповідно. При
культивуванні деконсервованих клітин ЕПЛ визначено збереження ФКП, які
були здатні формувати характерні колонії після кріоконсервування з ДМСО
в обох концентраціях. ЕКУ ФКП після кріоконсервування під захистом ДМСО
0,7 і 1,4 М складала (0,4± 0,1)х10-3 і (1,6±0,7)х10-3 % відповідно.
Разом з цим ці показники були вірогідно нижчі у порівнянні з ЕКУ
нативного контроля, що дорівнювала (2,8±0,7)х10-3 %.

При наступному субкультивуванні клітин, кріоконсервованих з ДМСО в обох
вивчених концентраціях, кількість КУОф багаторазово зростала (табл. 2).
Було визначено, що при першому пасажі ФКП, кріоконсервованих з ДМСО
0,7 М, ЕКУ ФКП зростала практично у 300 разів, а в групі клітин,
кріоконсервованих з ДМСО 1,4 М, – у 150 разів. Така різниця може бути
зумовлена тим, що ДМСО в концентраціях 0,7 та 1,4 М при
кріоконсервуванні за наведеним режимом заморожування забезпечує
збереження різних за ступенем комітованості ФКП ЕПЛ.

Таблиця 2

Ефективність колонієутворення ФКП ЕПЛ після кріоконсервування

(з ініціацією кристалоутворення) під захистом ДМСО

Тип культури ЕКУх10-3, %

ДМСО 0,7 М ДМСО 1,4 М

Первинна 0,4 ± 0,1 1,6 ± 0,7*

Пасаж 1 118,2 ± 17,0 239,1 ± 46,0*

Примітка: * – відмінності між групами клітин, кріоконсервованих з ДМСО
0,7 та 1,4 М, статистично вірогідні (p<0,05; n = 5). Після культивування кріоконсервованих клітин у специфічних остео- і адипогенному середовищах виявлено присутність клітин, позитивних до лужної фосфатази і нейтральних ліпідів. Остеобласти і адипогенні клітини, що диференціювались in vitro, не мали морфологічних відмінностей від аналогічних клітин у культурі нативного контролю. Отримані результати свідчать про збереження остеогенних і адипогенних потенцій у ФКП ЕПЛ після кріоконсервування первинної суспензії під захистом ДМСО за режимом із ініціацією кристалоутворення. Однак було відзначено, що після заморожування процеси дифференціювання були виражені у меншої кількості КП в порівнянні зі свіжоізольованими клітинами або експонованими з кріопротектором ДМСО. Оскільки в усіх інших експериментальних групах клітин ЕПЛ, кріоконсервованих без ініціації кристалоутворення при використанні різних комбінацій швидкостей охолодження (варіанти I-V), колонієутворюючі, остеогенні та адипогенні КП пошкоджувались, то слід вважати, що вивчений тип стромальних КП ЕПЛ високочутливий до переохолодження. Таким чином, повільне заморожування первинних суспензій клітин ЕПЛ під захистом ДМСО 0,7 або 1,4 М за трьохетапною програмою при початковій швидкості охолодження близько 1 оС/хв та зниженні діапазону переохолодження до 3 оС і менш, дозволяє кріоконсервувати ФКП у складі первинної суспензії клітин ЕПЛ зі збереженням їх здатності до колонієутворення та індукованого диференціювання в остеогенному і адипогенному напрямках. ВИСНОВКИ В дисертації наведено теоретичне узагальнення і вирішення наукової проблеми кріочутливості колонієутворюючих фібробластоподібних клітин-попередників ембріональної печінки людини. В роботі визначені умови кріоконсервування фібробластоподібних клітин-попередників, що мають здатність до колонієутворення, остеогенного та адипогенного диференціювання in vitro. Визначено, що близько 50 % клітин первинної суспензії ембріональної печінки людини (8-11 тижнів гестації) здатно прикріплюватися до пластика протягом години після експлантації. Адгезивна фракція включає популяцію колонієутворюючих фібробластоподібних клітин, що складають не менш 0,002-0,003 % від загальної кількості клітин первинної суспензії. Показано, що фібробластоподібні клітини-попередники ембріональної печінки людини здатні до індукованого остеогенного і адипогенного диференціювання в умовах культивування. Порівняльна оцінка життєздатності клітин ембріональної печінки людини показала, що прижиттєве забарвлення трипановим синім і бромистим етидієм дозволяє отримувати подібні результати, в той час як використання флуоресцеїндіацетату дає можливість виявити лише частину життєздатних клітин у складі первинної суспензії. Встановлено, що експозиція клітин ембріональної печінки людини в кріозахисному розчині з диметилсульфоксидом 0,7 або 1,4 М при 4 оС протягом 30 хвилин не призводить до зниження життєздатності і адгезивних властивостей клітин, а також їх здатності до колонієутворення. Показано, що повільне заморожування первинної суспензії клітин ембріональної печінки людини в сахарозо-сольовому розчині під захистом диметилсульфоксиду забезпечує збереження гранулоцитарно-макрофагальних гемопоетичних попередників, але не є ефективним для колонієутворюючих фібробластоподібних клітин-попередників. Виявлено стимулювання індукції остеогенного диференціювання фібробластоподібних клітин-попередників ембріональної печінки людини після експозиції первинної суспензії з кріопротектором диметилсульфоксидом. Визначено, що зниження переохолодження за допомогою ініціації кристалоутворення при кріоконсервуванні первинної суспензії клітин ембріональної печінки людини під захистом диметилсульфоксиду забезпечує збереження здатності фібробластоподібних клітин-попередників до колонієутворення та диференціювання в остеогенному і адипогенному напрямках. СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Скоробогатова Н.Г., Грищук В.П., Петренко А.Ю. Влияние условий удаления криопротектора ДМСО на жизнеспособность и колониеобразующую активность криоконсервированных клеток эмбриональной печени человека // Проблемы криобиологии. – 2002. – № 4. – С.16–23. Скоробогатова Н.Г. Сравнение методов оценки жизнеспособности клеток эмбриональной печени человека после криоконсервирования // Проблемы криобиологии. – 2003. – №2. – С.84–90. Грищенко В.И., Петренко А.Ю., Волкова Н.А., Скоробогатова Н.Г. Колониеобразующая активность фибробластоподобных клеток-предшественников из эмбриональной печени человека в условиях in vitro // Доповіді Національної академії наук України. – 2005. – №2. – С.138–141. Скоробогатова Н.Г., Волкова Н.А., Петренко А.Ю. Криочувствительность гемопоэтических и стромальных предшественников в первичной суспензии клеток эмбриональной печени человека // Проблемы криобиологии. – 2005. – Том 15, №3. –С. 577–580. Скоробогатова Н.Г., Грищук В.П., Петренко А.Ю. Роль переохлаждения в сохранении клоногенных свойств фибробластоподобных клеток – предшественников эмбриональной печени человека после криоконсервирования // Проблемы криобиологии. – 2006. – Том 16, №1. – С. 24–31. Патент № 67587А, МПК А01N1/02. Спосіб кріоконсервування гемопоетичних клітин ембріональної печінки людини / В.І. Грищенко, О.Ю. Петренко, Н.Г. Скоробогатова, С.П. Мазур, В.П. Грищук, Н.О. Волкова. Заявл.31.10.03; Опубл. 15.06.2004. – Бюл. № 6. – С. 4.7. Petrenko A.Yu., Petrenko Yu.A., Skorobogatova N.G., Improvement of some cryopreservation stages of suspensions enriched with stem haemopoietic cells// Abstrats of Meeting of the Society of low temperature biology Cryobiomol. – Coimbra, 2003. – P. 155. Petrenko A.Yu.,Grischenko V.I.,Petrenko Yu.A., Skorobogatova N.G. Cellular hierarchy of human fetal liver cells // Матеріали Установчого з’їзду Українського товариства клітинної біології (25-28 квітня 2004). – Львів, 2004. – С.147. Petrenko Yu. A., Skorobogatova N. G., Jones R. E., Petrenko A. Yu. Cryosensitivity of hematopoietic and mesenchymal stem / progenitor cells derived from human fetal liver // Abstracts of Meeting of Society for Cryobiology and Society for low temperature biology. – Hamburg, 2006. – P. 43. АНОТАЦІЇ Скоробогатова Н.Г. „Кріоконсервування фібробластоподібних клітин-попередників ембріональної печінки людини.” – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 – кріобіологія. – Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2007. Дисертація присвячена дослідженню впливу кріоконсервування на збереження фібробластоподібних клітин-попередників ембріональної печінки людини (ЕПЛ). Встановлено, що в первинній суспензії ЕПЛ близько 50 % клітин здатні прикріплюватися до пластика. Ефективність колонієутворення фібробластоподібних клітин-попередників ЕПЛ складає близько 0,002-0,003 %. Експозиція з диметилсульфоксидом 0,7 або 1,4 М призводить до стимулювання індукції остеогенного диференціювання фібробластоподібних попередників ЕПЛ in vitro. Виявлено роль переохолодження в збереженні фібробластоподібних попередників ЕПЛ при їх кріоконсервуванні. Визначено, що ініціація кристалоутворення при повільному заморожуванні первинної суспензії клітин ЕПЛ з диметилсульфоксидом 0,7 або 1,4 М забезпечує збереження фібробластоподібних попередників, здатних до колонієутворення та індукованого остеогенного і адипогенного дифференціювання. Ключові слова: кріоконсервування, диметилсульфоксид, ембріональна печінка людини, фібробластоподібні клітини-попередники. Скоробогатова Н.Г. “Криоконсервирование фибробластоподобных клеток-предшественников эмбриональной печени человека”. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 – криобиология. – Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2007. Диссертационная работа посвящена исследованию влияния различных условий криоконсервирования на сохранение фибробластоподобных клеток-предшественников эмбриональной печени человека (ЭПЧ), способных к колониеобразованию и индуцированным дифференцировкам in vitro. Установлено, что около 50 % клеток первичной суспензии ЭПЧ 8-11 недель гестации способно прикрепляться к пластику в течение часа после эксплантации. В селективных условиях культивирования адгезивной фракции клеток ЭПЧ изучены свойства фибробластоподобных клеток, обладающих колониеобразующей активностью. Эффективность колониеобразования для данных клеток из первичной суспензии ЭПЧ составила в среднем 0,002-0,003 %. При культивировании фибробластоподобных клеток-предшественников ЭПЧ в средах, содержащих индукторы остео- и адипогенной дифференцировок, было выявлено, что исследуемые клетки способны к направленной дифференцировке в остеогенном и адипогенном направлениях. Установлено, что экспозиция клеток ЭПЧ в криозащитном растворе с диметилсульфоксидом 0,7 или 1,4 М в течение 30 минут при 4 оС не приводит к снижению жизнеспособности и адгезивных свойств клеток ЭПЧ, а также пролиферативной активности фибробластоподобных клеток-предшественников. Выявлено, что такой кратковременный контакт клеток в первичной суспензии ЭПЧ с указанным криопротектором приводит к увеличению пула предшественников, способных к индуцированной остеогенной дифференцировке in vitro. При экспресс-оценке жизнеспособности клеток ЭПЧ по прижизненному окрашиванию трипановым синим и этидиум бромидом получены сходные результаты, а использование флуоресцеиндиацетата позволило выявить только часть жизнеспособных клеток в составе исследуемой первичной суспензии. Изучение функциональной активности гемопоэтических и стромальных фибробластоподобных предшественников в условиях культивирования позволило установить, что криоконсервирование первичной суспензии клеток ЭПЧ в сахарозо-солевом растворе по трехэтапной программе медленного замораживания под защитой диметилсульфоксида в концентрации 0,7 М обеспечивает сохранение кроветворных клеток гранулоцитарно-макрофагального ряда, но не является эффективным для колониеобразующих фибробластоподобных клеток-предшественников. Использование различных режимов замораживания под защитой диметилсульфоксида позволило выявить высокую чувствительность фибробластоподобных клеток-предшественников ЭПЧ к переохлаждению. Установлено, что замораживание первичных суспензий клеток ЭПЧ по трехэтапной программе с инициацией кристаллообразования и начальной скоростью охлаждения около 1оС/мин, при условии снижения диапазона переохлаждения до 3 оС и менее, позволяет успешно криоконсервировать фибробластоподобные клетки-предшественники под защитой диметилсульфоксида 0,7 и 1,4 М. После криоконсервирования в указанных условиях сохраняется способность фибробластоподобных предшественников к колониеобразованию и индуцированным остеогенной и адипогенной дифференцировкам in vitro. Полученные результаты могут быть использованы при разработке метода криоконсервирования мезенхимальных стволовых клеток и их недифференцированных потомков, полученных из различных источников. Ключевые слова: криоконсервирование, диметилсульфоксид, эмбриональная печень человека, фибробластоподобные клетки-предшественники. Skorobogatova N.G. “Cryopreservation of human fetal liver fibroblast-like precursors”. – A manuscript. Dissertation for the candidate of biological science degree in specialty 03.00.19 – Cryobiology. – Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, 2007. The Dissertation is aimed to investigate the influence of cryopreservation on survival of human fetal liver (HFL) fibroblast-like precursors. The amount of about 50 % HFL cells derived from primary suspension is capable of plastic attaching. Colony forming efficiency of HFL fibroblast-like precursors was about 0.002-0.003 %. Exposure of HFL cells to 0.7 or 1.4 M dimethyl sulphoxide results in stimulation of osteogenic differentiation induction of HFL fibroblast-like precursors in vitro. Role of overcooling for HFL fibroblast-like precursor survival during cryopreservation has been determined. The initiation of ice-formation during slow freezing of HFL primary suspension with 0.7 M or 1.4 M dimethyl sulphoxide is necessary for protection of the precursors which able to form the colonies and to be differentiated into both osteogenic and adipogenic lineages. Key words: cryopreservation, dimethyl sulphoxide, human fetal liver, fibroblast-like precursors. Відповідальний за випуск Г.О. Бабійчук Підписано до друку 12.12.2006. Формат 60х84 1/16. Наклад 100  прим. Умов. друк. арк. 0,9. Друк. на ризографі. PAGE 21

Похожие записи