ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН

БІРОНТ НАДІЯ ВОЛОДИМИРІВНА

УДК: 577. 158:616. 631. 11]. 08: 577.16

Корекція порушень антиоксидантної системи крові та клітин кісткового
мозку нікотинамідом за умов стрептозотоцинового діабету

03.00.04 – біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів — 2004 Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в Львівському національному університеті імені Івана
Франка МОН України

Інститут фізичної оптики МОН України,

завідувач лабораторії оптичного аналізу.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

Луцик Максим Дмитрович,

Інститут біології клітини НАН України,

провідний науковий співробітник відділу регуляції проліферації клітин;

доктор біологічних наук, доцент,

Антоняк Галина Леонідівна,

Львівський аграрний університет, МАП України, професор кафедри
агроекології та біології.

Провідна установа: Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,
відділ коферментів, м.Київ

Захист відбудеться “ 7 ” вересня 2004 р. о 10 00 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д35 368.01 в Інституті біології тварин УААН:
вул. Стуса, 38, м. Львів, 79034.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин
УААН за адресою: вул. Стуса, 38, м. Львів, 79034.

Автореферат розісланий “ 3 ” серпня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради O.І. Віщур

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Згідно з даними ВООЗ цукровий діабет (ЦД) посідає
третє місце за поширенням після серцево-судинних і онкологічних
захворювань. У 2000 р. у світі налічувалось 177 млн хворих, з них 1 млн
в Україні. Поєднання екологічних чинників і спадковості сприяє розвитку
автоімунних процесів, які викликають руйнування ?-клітин підшлункової
залози у генетично чутливих осіб, що є головною причиною ЦД І типу
(Балаболкин М.И., 2000).

У таких хворих у разі тривалої хвороби часто розвиваються анемії,
переважною причиною яких є зміни в кровопостачанні нирок та розвиток у
них деструктивних процесів, діабетичні нефропатії, дія уремічних
токсинів (Смикодуб О.І., 2002). Суттєві порушення у постачанні тканин
киснем, які виявляються за цієї патології (Браславская Г.М., 1980),
можуть зумовити зміни в процесах кровотворення в кістковому мозку (Гущин
В.А., 1984). Однак ці процеси на сьогодні досліджені недостатньо.

Головними підходами до лікування ЦД I типу є інсулінотерапія, проте,
паралельне застосування інших препаратів може впливати на потребу
організму в інсуліні (Корпачев В.В., 2001). Застосування нікотинаміду
(НАм) – водорозчинного аміду нікотинової кислоти – сприяє тимчасовим
послабленням чи зникненням ознак діабету за введення інсуліну
(Нагорна О.О., 2003).

Постульовано декілька можливих механізмів захисної дії НАм за умов
діабету: антиоксидантний ефект (Farber J., 1990), регулювання процесів
полі(ADP)-рибозилювання (Virag L., 2002), безпосереднє поповнення
запасів клітинного NAD+ (Могилевич С.Е., 1981), регулювання редокс-стану
NAD(P), регулювання поліолового шляху метаболізму глюкози. З’ясовано, що
введення НАм пацієнтам з ЦД I типу та щурам з експериментальним
стрептозотоциновим діабетом сприяє зниженню вмісту антитіл до ?-клітин
та гальмуванню автоімунних процесів (Reddy S., 1995).

Оскільки вільнорадикальні процеси та реакції перекисного окиснення тісно
пов’язані з NAD- і NADP-залежними окисно-відновними процесами в
клітинах, то важливо з’ясувати вплив уведення НАм на процеси перекисного
окиснення ліпідів (ПОЛ) та функціональну активність системи
антиоксидантного захисту в клітинах кісткового мозку (КМ) та еритроцитах
у тварин за умов експериментального стрептозотоцинового діабету.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є
частиною фундаментальних досліджень науково-дослідної лабораторії
“Радіаційної та молекулярної біології” Львівського національного
університету імені Івана Франка за темою: “Регуляторна дія НАД та
гістидинвмісних дипептидів у корекції метаболічних порушень при гіпоксії
різної етіології” (№ державної реєстрації 0100U001443). Автор
дисертаційної роботи є одним з виконавців названого вище дослідження.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи — з’ясувати участь НАм у
процесах перекисного окислення ліпідів і в функціонуванні системи
антиоксидантного захисту клітин еритроїдного (ЕР) та
гранулоцитарно-моноцитарного (ГМР) рядів кісткового мозку й еритроцитів
за умов стрептозотоцинового діабету.

Відповідно до поставленої мети вирішували такі завдання:

( Дослідити вміст продуктів ПОЛ та активність ферментів антиоксидантного
захисту в еритроцитах і клітинах ЕР та ГМР кісткового мозку щурів зі
стрептозотоциновим діабетом.

( З’ясувати можливий коригувальний вплив НАм на процеси ПОЛ та
функціонування системи антиоксидантного захисту як в еритроцитах, так у
клітинах ЕР та ГМР кісткового мозку.

( Дослідити вплив НАм на процес кислотного гемолізу еритроцитів за умов
стрептозотоцинового діабету.

( Визначити в еритроцитах тварин вміст креатину як показника
інтенсивності еритропоезу.

( Вивчити особливості нітрозилювання дезоксигемоглобіну оксидом азоту in
vitro, а також вплив НАм на цей процес.

( У дослідах in vitro дослідити нітритредуктазну активність
дезоксигемоглобіну за умов діабету і введення НАм.

Об’єкт досліджень – оксидаційний стрес за умов стрептозотоцинового
діабету та внутрішньом’язового введення НАм в еритроцитах та їхніх
попередниках у кістковому мозку. Морфологічний стан кровотворної тканини
кісткового мозку.

Предмет досліджень – продукти ПОЛ та ферменти антиоксидантного захисту
як показники оксидаційного стресу; морфологічні показники препаратів КМ,
вміст креатину та стійкість еритроцитів до кислотного гемолізу як
показники активності еритропоезу; дезоксигемоглобін як джерело синтезу
оксиду азоту за нітритредуктазним механізмом, нітрозогемоглобін.

Методи досліджень. Цитологічні дослідження клітин кісткового мозку, які
отримували гравіметричним методом розділення. Кількісна оцінка
біохімічних показників та інтенсивності еритропоезу із застосуванням
методів спектрофотометрії, колориметрії для дослідження модифікацій Hb
in vitro та оцінки ефективності застосування нікотинаміду.

Наукова новизна одержаних результатів. Виконаними дослідженнями вперше
виявлено зміни в активності головних антиоксидантних ферментів та
підвищення вмісту первинних продуктів ПОЛ у кровотворних клітинах КМ за
умов експериментального стрептозотоцинового діабету. Визначено
підвищення нітритредуктазної активності дезоксигемоглобіну за умов
стрептозотоцинового діабету. З’ясовано, що введення НАм підвищує
стійкість еритроцитів до кислотного гемолізу; водночас збільшується
вміст креатину в еритроцитах щурів, що свідчить про активацію
еритропоезу. Зафіксовано, що введення НАм зменшує інтенсивність
відновлення нітрит-іона за участю дезоксигемоглобіну, що може запобігати
виникненню структурних модифікацій цього білка, зумовлених оксидом азоту
за умов розвитку в разі діабету нітрозативного стресу.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані підтверджують
перспективність застосування НАм з метою корекції порушень системи
антиоксидантного захисту клітин КМ та попередження розвитку анемій, як
ускладнень цукрового діабету І типу.

Результати досліджень нітрозилювання дезоксигемоглобіну in vitro та
впливу НАм на цей процес доповнюють відомості про можливість модифікації
молекул гемоглобіну метаболітами оксиду азоту за цієї патології.

Отримані результати дають змогу рекомендувати НАм для застосування в
комплексній терапії ЦД І типу та його ускладнень, зокрема анемії. Їх
використовують у навчальному процесі під час викладання спецкурсів з
біохімії у Львівському національному університеті імені Івана Франка.

Особистий внесок здобувача. У всіх серіях досліджень здобувач самостійно
моделювала стрептозотоциновий діабет і виконувала його корекцію НАм.
Здобувач особисто виділяла клітини КМ, визначала ферментативну
активність глутатіонредуктази, глутатіонпероксидази, каталази та вміст
відновленого глутатіону і продуктів ПОЛ. Морфологію клітин КМ та крові
щурів досліджували спільно з канд. біол. наук, доцентом Н.О. Сибірною.
Побудову спектрів нітрозильованого гемоглобіну та НАм, визначення
супероксиддисмутазної та глюкозо-6-фосфатдегідрогеназної активності
виконано спільно із співробітниками науково-дослідної лабораторії
Радіаційної та молекулярної біології. Аналіз та обговорення отриманих
результатів проведено за участю наукового керівника, д-ра біол. наук
В.М. Коробова. У процесі виконання дисертації автор особисто
проаналізувала джерела вітчизняної та зарубіжної літератури на тему
дисертації і підготовлювала публікації до друку.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації
представлені на науково-практичній конференції “Диабет – проблема
общечеловеческая” (м. Дніпропетровськ, Україна, 2000); на науковій
конференції “Научное наследие академика И.Н. Буланкина и его развитие в
современной биохимии” (м.Харків, Україна, 2001); на VI з’їзді
ендокринологів України (м. Київ, Україна, 2001); на VI Міжнародній
конференції “Биоантиоксидант” (м. Москва, Росія, 2002); на Пущинській
школі-конференції молодих учених (м. Пущино, Росія, 2002); на 4-й
Парнасівській конференції “Molecular Mechanisms of Cell Activation:
Biological Signals and Their Target Enzymes” (Wroclaw, Poland, 2002); на
VIII Українському біохімічному з’їзді (м. Чернівці, 2002).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 5 статей у фахових наукових
виданнях і 11 тез доповідей у матеріалах з’їздів та конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 125 сторінках
друкованого тексту і складається зі вступу, огляду літератури, опису
матеріалів і методів дослідження, результатів дослідження та їхнього
обговорення, висновків, а також списку використаних джерел (266
найменувань). Робота ілюстрована 6 рисунками та 11 таблицями, які
займають 8 сторінок друкованого тексту.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

В огляді літератури висвітлена інформація стосовно етіології цукрового
діабету І типу та його ускладнень, пов’язаних із системою крові, описано
сучасні уявлення про оксидаційний стрес і роль антиоксидантної системи.
Особлива увага приділена застосуванню нікотинаміду в клініці та за умов
експериментального діабету.

Матеріали і методи досліджень. Дослідження виконані на безпородних білих
щурах-самцях масою 100-120 г, яких розділяли на три групи: “контроль”,
“діабет”, “діабет+нікотинамід”. Експериментальний ЦД спричинювали
введенням стрептозотоцину фірми «Sigma» в розрахунку 7 мг на 100 г маси
внутрішньочеревно. Розвиток діабету контролювали за зростанням рівня
глюкози в крові, який визначали глюкозооксидазним методом (Trinder P.,
1969). У дослід брали тварин через два тижні після введення препарату
при концентрації глюкози 10 — 15 мМ. Нікотинамід фірми “Sigma” вводили
внутрішньом’язово в дозі 200 мг на 1 кг маси щоденно протягом 14 діб
щурам з розвиненою гіперглікемією.

Клітини ЕР та ГМР отримували центрифугуванням суспензії клітин КМ у
тришаровому градієнті густини фіколу та суміші фіколу–верографіну
(d1=1,03 г/cм3, d2=1,09 г/cм3, d3=1,1 г/cм3) (Сибірна Н.О., 1991). Для
отримання цитологічних препаратів клітин КМ застосовували комбіноване
фарбування за Папенгеймом. Вміст ретикулоцитів визначали за
модифікованими методиками Л.Гейльмейєра та Зінгера (Сибірна Н.О., 1997);
кислотну резистентність еритроцитів — за їхньою стійкістю до 0,004 Н
соляної кислоти у фізрозчині (Терсков И.А., 1959).

Активність супероксиддисмутази (СОД) визначали за допомогою реакції
відновлення нітротетразолію синього до нітроформазану (Чевари С., 1991),
каталази – з використанням реакції Н2О2 з молібдатом амонію (Королюк
М.А., 1991). Для визначення активності глутатіонпероксидази (ГПО) (Моин
В.И., 1986) та вмісту відновленого глутатіону (G-SH) (Thamas D.S., 1960)
застосовували реактив Елмана (5,5’-дитіобіс-2-нітробензойну кислоту),
який взаємодіє з сульфгідрильними групами. Активність глутатіонредуктази
(ГР) визначали за зменшенням вмісту NADPH при 340 нм у реакції з
окисленим глутатіоном (Путилина Ф.Е., 1982);
глюкозо–6–фосфатдегідрогеназну активність — за швидкістю утворення NADPH
при 340 нм за надлишку глюкозо-6-фосфату і NADP (Путилина Ф.И., 1982);
вміст креатину — спектрофотометрично після його взаємодії з
діацил-?-нафтолом (Виноградова И.Л., 1983); вміст кон’югованих дієнових
структур гідроперекисів ліпідів — за інтенсивністю поглинання в ділянці
232 — 234 нм (Гаврилов В.Б., 1983); рівень ТБК-позитивних продуктів – за
інтенсивністю забарвлення при взаємодії продуктів ПОЛ з тіобарбітуровою
кислотою (Тимирбулатов Р.А., 1981); вміст глікозильованого Hb —
колориметричним методом, що грунтується на утворенні забарвленої сполуки
при взаємодії продукту кислотного гідролізу — 5-оксиметилфурфуролу з
2-тіо-барбітуровою кислотою (Dormandy T.L., 1965).

Процес дезоксигенації Hb проводили у вакуумі (Федорович І.П., 1996) і
контролювали спектрофотометрично. Концентрацію Hb визначали
спектрофотометрично, використовуючи молярний коефіцієнт екстинкції для
ціаноферигему 11 мМ-1·см-1 (Van Kampen E.I., 1961). Реакцію відновлення
NO2—аніонів за участю дезоксигемоглобіну (R-Hb) ініціювали додаванням
до гемолізату розчину NaNO2 (6мМ) і реєстрували зростання оптичної
густини розчину при 480нм (Zijlstra W.G., 1981). Електронні адсорбційні
спектри нітрозо-Hb реєстрували на спектрофотометрі UV-VIS “Specord M-40”
(Німеччина). HbNO отримували пропускаючи через відновлений дитіонітом
натрію R-Hb (7,5 мМ) оксид азоту, отриманий шляхом відновлення
нітроксильного іона молекули NaNO2 аскорбіновою кислотою (Kr?ncke K.D.,
1996).

Варіаційно-статистичне опрацювання одержаних результатів виконали з
використанням критерію Стьюдента за допомогою комп’ютерної програми
Origin.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХНЄ ОБГОВОРЕННЯ

1. Гемопоез за умов цукрового діабету. Відомо, що більшість кровотворних
клітин чутливі до інсуліну (Aoki I., 1994). Зокрема, з’ясовано, що
інсулін стимулює процес проліферації еритроїдних клітин КМ, які
утворюють колонії (100 клітин, 5 поділів), незалежно від наявності
еритропоетину (Boyer S.H., 1992). Інтенсивність зв’язування інсуліну з
рецепторами мембран як ЕР, так і ГМР знижується при диференціації клітин
(Gambhir K.K., Agarwal V.R., 1993 ).

Результати цитологічних досліджень свідчать про зміни в складі клітин ЕР
як за умов експериментального діабету, так і за умов уведення НАм (табл.
1). Зокрема, виявлено вірогідне зниження відносного вмісту
поліхроматофільних та оксифільних нормоцитів у щурів зі
стрептозотоциновим діабетом порівняно з контрольними тваринами. Це може
бути зумовлене прискоренням процесів дозрівання еритрокаріоцитів і
швидкими темпами надходження ретикулоцитів у кров. Це узгоджується з
вірогідним збільшенням вмісту ретикулоцитів у периферійній крові за умов
стрептозотоцинового діабету порівняно з контролем і свідчить про
інтенсифікацію еритропоезу (табл. 1).

Ці процеси, на нашу думку, пов’язані з нестачею в організмі інсуліну,
який бере участь у регулюванні еритропоезу на стадіях термінальної
диференціації еритроїдних клітин (Антоняк Г.Л., 1999), та з розвитком
гіпоксії за умов стрептозотоцинового діабету. Адже відомо, що за
довготривалої адаптації щурів до гіпоксії зменшується тривалість усіх
фаз мітозу клітин ЕР, що свідчить про їхнє прискорене дозрівання з
утворенням зрілих форм (Гущин В.А., 1984).

Таблиця 1

Вміст окремих типів клітин еритроїдного ряду кісткового мозку та
ретикулоцитів крові щурів за умов стрептозотоцинового діабету та
введення нікотинаміду, % (М ± m, n = 11)

Тип клітин Контроль Діабет Діабет+НАм

Нормоцити Базофільні 18,40±0,50 29,90±0,30* 18,00±0,20**

Поліхроматофільні 51,40±0,40 37,80±0,25* 46,00±0,50 **

Оксифільні 16,30±0,15 9,60±0,30* 21,50±0,20**

Ретикулоцити 2,5±0,07 3,1±0,06* 3,6±0,05**

Примітки.Тут і далі: 1. * — Різниця вірогідна порівняно з контролем,
Р<0,05, 2. ** - Різниця вірогідна порівняно з показниками за умов діабету, Р<0,05 Уведення НАм щурам зі стрептозотоциновим діабетом нормалізує вміст базофільних та призводить до збільшення відносного вмісту поліхроматофільних (46,00±0,50 %) і оксифільних (21,50±0,20 %) нормоцитів, порівняно з такими у щурів з діабетом. Окрім того, за цих умов збільшується частка ретикулоцитів у периферійній крові (табл. 1). Можливо, збільшення вмісту циклічної ADP-рибози – метаболіту NAD, яка виявляє активність цитокіну, стимулюючи проліферацію попередників кровотворних клітин людини in vitro (Podesta M., 2000), є однією з причин активації еритропоезу при дії НАм. Динаміку змін фізико-хімічних властивостей еритроцитів досліджено за їхньою стійкістю до кислотного гемолізу. Зміщення ериро-грами ліворуч щодо контролю є наслідком зниження стій-кості еритроци-тів за умов ЦД (рис. 1). За введення НАм виявлено змі-щення кривої гемолізу право-руч, що свідчить про підвищення стійкості загаль-ної популяції еритроцитів. У випадку введе-ння НАм ви-явлено збільшення вмісту креатину в еритроцитах (0,232±0,013 мкмоль/мл) на відміну від клітин контрольних тварин (0,124±0,006) та зі стрептозотоциновим діабетом (0,108±0,009). Це може бути доказом стимуляції еритропоезу під впливом НАм, оскільки відомо, що зростання рівня креатину в еритроцитах є ознакою активації еритропоезу (Syllm-Rapoport I., 1981). 2. Дослідження продуктів ПОЛ та ферментів антиоксидантного захисту. Результати досліджень свідчать про накопичення дієнових кон’югатів у всіх досліджуваних клітинах за умов експериментального діабету (табл. 2). Рівень ТБК-позитивних продуктів не змінюється у клітинах досліджуваних рядів КМ за цих умов, проте зростав у плазмі крові на 44 %. Таблиця 2 Вміст дієнових кон’югатів в еритроцитах та клітинах кісткового мозку щурів за умов стрептозотоцинового діабету та введення нікотинаміду (М ± m, n = 6) Тип клітин Контроль Діабет Діабет+НАм Еритроцити, D233/мл 2,2±0,4 4,1±0,7* 2,2±0,2** Еритроїдний ряд, D233/мг білка 13,0±0,4 17,4±1,6* 11,0±0,8** Гранулоцитарно-моноцитарний ряд, D233/мг білка 12,7±0,15 21,7±1,9* 15,8±1,3** Очевидно, в клітинах КМ діють механізми, які запобігають нагромадженню кінцевих продуктів ПОЛ і пошкодженню мембранних структур. Лише наявність еластичної мембрани, здатності до деформації і швидкого відновлення форми визначає зрілість клітин і їхню вибіркову можливість виходити із КМ (Владимирская Е.Б., 1990). Уведення НАм приводить до вірогідного зменшення вмісту дієнових кон’югатів в еритроцитах і клітинах КМ (табл. 2) та ТБК-позитивних продуктів у плазмі крові тварин. В основі антиоксидантної дії НАм, можливо, є його здатність безпосередньо взаємодіяти з гідропероксидами ліпідів з утворенням N-оксиду нікотинаміду (Абакумов Г.З., Бушма М.И., 1988). Таблиця 3 Супероксиддисмутазна активність в еритроцитах та клітинах кісткового мозку щурів за умов стрептозотоцинового діабету та введення нікотинаміду (М ± m) Тип клітин Контроль (n=10) Діабет (n=10) Діабет+НАм (n=8) Еритроцити, умовн. од.·мл-1 2,3±0,3 1,5±0,4 1,5±0,2 Еритроїдний ряд, умовн. од. ·мг-1 білка 10,1±1,2 6,47±0,8* 5,1±0,4 Гранулоцитарно-моноцитарний ряд, умовн. од. ·мг-1 білка 13,2±1,2 9,5±0,9* 5,3±0,5** Нагромадження дієнових кон’югатів зумовлене зменшенням СОД активності у клітинах ЕР, ГМР кісткового мозку та еритроцитах периферійній крові за умов експериментального діабету (на 36, 28 і 34 %, відповідно) (табл. 3). У літературі наявні дані щодо можливості неферментативної модифікації молекул СОД як активним киснем, так і глюкозою (Arai R., Maguchi S., 1987). Таблиця 4 Каталазна активність в еритроцитах та клітинах кісткового мозку щурів за умов стрептозотоцинового діабету та введення нікотинаміду (М ± m) Показник Контроль Діабет Діабет+НАм (n = 8) Еритроцити, нмоль Н2О2·хв-1 · мг-1 Hb 20,91±1,42 (n = 15) 32,09±4,4* (n = 10) 15,14±2,32** Еритроїдний ряд, нмоль Н2О2·хв-1·мг-1 білка 42,85±3,41 (n = 15) 63,29±0,83* (n = 13) 48,22±1,42** Гранулоцитарно-моноцитарний ряд, нмоль Н2О2·хв-1·мг-1 білка 46,1±5,53 (n = 16) 84,18±9,79* (n = 16) 51,23±4,4** Водночас за стрептозотоцинового діабету вірогідно зростає каталазна активність: на 47,7 % у клітинах ЕР, на 82,6 % у ГМР кісткового мозку і на 53,5 % в еритроцитах периферійної крові порівняно з контрольними значеннями (табл. 4). Такий ефект треба розглядати як компенсаторну реакцію на збільшення активних кисневих метаболітів за інактивації СОД. За умов уведення НАм в еритроцитах та клітинах ЕР кісткового мозку СОД активність не змінюється порівняно зі значеннями за умов ЦД, а в клітинах ГМР вірогідно зменшується, ймовірно, внаслідок пошкодження великої частки молекул ферменту в результаті окисної модифікації за діабету (табл. 3). У випадку введення НАм простежено вірогідне зменшення каталазної активності: в еритроцитах на 53%, у клітинах ГМР на 39 %, у клітинах ЕР кісткового мозку на 23 % відносно значень за умов діабету. 3. Дослідження глутатіонової системи. В еритроцитах за умов експериментального діабету рівень G-SH зменшується, ймовірно, для підтримання відновленого стану Fe2+ Hb, SH-груп білків, а також для знешкодження Н2О2 та гідропероксидів (Кулинский В.И., 1993). Також можливе порушення синтезу трипептиду, оскільки відомо, що за умов діабету знижується ?-глутамілцистеїнсинтетазна активність (Murakami K., Kondo T., 1989). У клітинах ЕР і ГМР виявлено вірогідне збільшення рівня G-SH (приблизно в 2 і 3 рази) за умов стрептозотоцинового діабету (табл. 5), що, ймовірно, пов’язано зі збільшенням проліферативної активності клітин за цих умов (Meister A., Anderon M.E., 1983). Крім того, причиною збільшення вмісту G-SH у клітинах КМ може бути вірогідне підвищення ГР активності: на 77 % у клітинах ЕР та на 25,5 % у клітинах ГМР порівняно з контрольними значеннями. Однак у ГМР відмінність невірогідна (табл. 6). У клітинах ГМР вірогідно збільшується ГПО активність з 8,47±0,50 у контролі до 10,19±0,31 мкмоль·хв-1·мг-1 білка. Таблиця 5 Вміст відновленого глутатіону в еритроцитах та клітинах кісткового мозку щурів за умов стрептозотоцинового діабету та введення нікотинаміду (М ± m) Тип клітин Контроль Діабет (n = 6) Діабет+НАм (n = 6) Еритроцити, мкмоль·мл-1, (n = 11) 1,75±0,26 1,42±0,13 2,70±0,01** Еритроїдний ряд, мкмоль·мг-1 білка 0,22±0,06 0,47±0,05* 0,49±0,07 Гранулоцитарно-моноцитарний ряд, мкмоль·мг-1 білка 0,12±0,01 0,33±0,09* 0,53±0,04** ? A ¦ ? I ? ? T ¦ ? ? 2 ? ??$ ”y? i ”yth? ”yth? ”yth? ?\??????? ”y ”y ????????$??????????$ –kd- ??????????????????????$ T?V?1/4???ae?th?hYYYK но вірогідне підвищення ГР активності на 41 %, причиною якого, ймовірно, є зниження співвідношення NADP/NADPH у клітинах за діабету (Великий Н.Н., Обросова И.Т., 1992). Таблиця 6 Глутатіонредуктазна активність еритроцитів та клітин кісткового мозку щурів за умов стрептозотоцинового діабету та введення нікотинаміду (М ± m) Тип клітин Контроль (n = 6) Діабет (n = 8) Діабет+НАм (n = 6) Гемолізати еритроцитів, нмоль NADPH·хв-1·мг-1 Hb 3,40±0,22 4,79±0,39* 3,50±0,27** Еритроїдний ряд, мкмоль NADPH·хв-1·мг-1 білка 39,42±6,79 69,76±13,25 86,18±9,99 Гранулоцитарно-моноцитарний ряд, мкмоль NADPH·хв-1·мг-1 білка 49,15±10,14 61,68±11,1 41,34±8,03 У випадку введення НАм вміст G-SH є на високому рівні у клітинах ЕР кістковоко мозку та вірогідно збільшується ГМР порівняно зі значеннями за умов експериментального діабету. Вірогідне збільшення рівня G-SH порівняно з діабетом зафіксовано в еритроцитах периферійної крові (табл. 5). Введення НАм нормалізує ГР активність (табл. 6) в еритроцитах порівняно з експериментальним діабетом. ГПО активність у клітинах еритроїдного і ГМР кісткового мозку, навпаки, вірогідно зменшується (відповідно, на 33 і 44 %) при введенні НАм. Зміни у ГПО активності клітин КМ у всіх серіях досліду ідентичні зміні каталазної активності. Це свідчить про більшу реактивність ГПО і каталази, які реагують на збільшення активних форм кисню за інактивації СОД в умовах експериментального стрептозотоцинового діабету. 4. Дослідження впливу нікотинаміду на нітритредуктазну активність дезоксигемоглобіну. Відомо, що за гіпоксії різної етіології в тканинах ссавців посилюється синтез оксиду азоту (NO) (Pyner S., Coney A., 2003). Згідно з уявленнями про функціонування циклу оксиду азоту в клітинах ссавців (Реутов В.П., 1995), продукти перетворення NO – NO2- та NO3--аніони можуть зазнавати біотрансформації, а саме - відновлюватися до оксиду азоту в процесі нітрит/нітратредуктазної реакцій. Нітритредуктазні реакції каталізують флавопротеїни і цитохромоксидази у мітохондріях, цитохром P450 в ендоплазматичному ретикулумі, дихальні гемопротеїни – міоглобін та Hb. Вважають, що відновлення NO2- аніонів, яке виявляється в гемолізатах еритроцитів, зумовлене активністю дезоксигемоглобіну (R-Hb). Швидкість перетворення NO2--аніонів у дезоксигенованих у вакуумі гемолізатах еритро-цитів крові щурів зі стрептозотоциновим діабетом вірогідно підвищується порів-няно з контролем (2,47±0,44 с-1·10-4) і становить 4,08±0,17 с-1·10-4 (рис.  2). У дослідах in vitro доведено, що глікозильовані аміно-кислоти та глікози-льований альбумін є ефективними донора-ми електронів і здатні відновлювати гемо-протеїни (Степуро И., Чайковская Н.А., 1999) та нітрит-аніон (Степуро И.И., Чайковская Н.А., 1997) в анаеробних умовах. Тому збільшення нітритредуктазної активності R-Hb за умов експериментального діабету на відміну від контрольних тварин, можна пояснити вірогідним зростанням рівня глікозильованого Hb з 2,12±0,22 % у контролі до 4,46±0,45 % в еритроцитах щурів з розвиненим стрептозотоциновим діабетом. Уведення НАм діабетичним щурам гальмувало швидкість відновлення нітрит-аніонів R-Hb крові (2,78±0,33 с-1·10-4). Очевидно, це пов’язано з гіпоглікемічними ефектами препарату, оскільки рівень глікозильованого Hb при введенні останнього становить 2,05(0,17 %. За умов збільшення рівня оксиду азоту можлива модифікація молекули Hb цим реактивним радикалом чи його метаболітами. Перебіг цих процесів та здатність Hb взаємодіяти з NO за цих умов оцінено експериментально у дослідах in vitro. З'ясовано, що нітрозилювання R-Hb щурів зі стрептозотоциновим діабетом супрово-джується гіперхром-ним ефектом у ділянці поглинання ароматичних аміно-кислот і появою широкої смуги поглинання при 334 нм порівняно з нітрозо-Hb конт-рольних тварин (рис.  3). Очевидно, зміни в ультра-фіолетовій ділянці спектра виникають унаслідок взаємодїї NO з білковою частиною молекули. Відомо, що в ділянці 320-360 нм поглинають світло S-нітрозотіольні похідні білків (Stamler J.S., 1992). Зміни типового електронного адсорбційного спектра в ділянці 280 нм можуть бути пов’язані, частково, з розгортанням білкової глобули, індукованим нітрозилюванням амінокислотних залишків у складі гідрофобного ядра глобіну. У спектрах нітрозо-Hb щурів, яким уводили НАм, посилення поглинання світла при 334 нм не зафіксовано. Різниці в поглинанні ароматичних амінокислот у спектрах нітрозо-Hb тварин, яким уводили НАм, та нітрозо- Hb тварин зі стрептозотоциновим діабетом не виявлено (рис. 3). Отже, введення НАм упродовж двох тижнів тваринам з розвинутим стрептозотоциновим діабетом запобігало тим структурним модифікаціям Hb, які можуть виникати в умовах розвинутої хвороби. ВИСНОВКИ У дисертації наведено узагальнення і нове вирішення проблеми порушень гемопоезу за умов експериментального стрептозотоцинового діабету шляхом корекції змін в антиоксидантній системі крові та клітинах кісткового мозку. Виявлено, що введення нікотинаміду щурам із експериментальним діабетом у дозі 200 мг на кг маси щоденно впродовж двох тижнів стимулює еритропоез, про що свідчить збільшення відносного вмісту поліхроматофільних (на 21,7 %) та оксифільних (приблизно в 2 рази) нормоцитів у кровотворній тканині і поява в крові значної кількості еритроцитів з підвищеною стійкістю до кислотного гемолізу, а також вірогідного підвищення креатину в цих клітинах. З'ясовано розвиток оксидаційного стресу як у крові, так і в клітинах кісткового мозку за умов експериментального діабету, про що свідчить збільшення вмісту дієнових кон’югатів в еритроцитах на 83 %, у клітинах ЕР на 33,8 % та в клітинах ГМР – на 70,9 % і ТБК-позитивних продуктів у плазмі крові (на 42,2 %). Водночас простежується зростання каталазної активності в досліджуваних клітинах (на 53,5, 36,6 і 82,6%, відповідно) та глутатіонпероксидазної активності в клітинах ГМР, що можна розцінювати як компенсаторну реакцію на зменшення супероксиддисмутазної активності в досліджуваних клітинах (на 34, 36, і 28 %, відповідно). Уведення нікотинаміду призводить до зменшення глутатіонпероксидазної активності в клітинах кісткового мозку, каталазної активності і вмісту дієнових кон’югатів у всіх досліджуваних клітинах, а також ТБК-позитивних продуктів у плазмі крові. Стрептозотоциновий діабет супроводжується підвищенням рівня відновленого глутатіону в клітинах кісткового мозку та глутатіонредуктазної активності в еритроцитах та клітинах ЕР. Уведення нікотинаміду призводить до вірогідного збільшення вмісту відновленого глутатіону в еритроцитах та клітинах ГМР кісткового мозку на відміну від умов експериментального діабету. Виявлено підвищення нітритредуктазної активності дезоксигемоглобіну на 87,5 % у крові тварин з експериментальним стрептозотоциновим діабетом. Під впливом нікотинаміду швидкість відновлення нітрит-аніонів дезоксигемоглобіном крові зменшується на 33,4 %. Визначено, що нітрозилювання in vitro дезоксигемоглобіну діабетичних щурів супроводжується утворенням S-нітрозотіольних похідних глобіну, про що свідчить гіперхромний ефект у типовому електронному адсорбційному спектрі при 334 нм. Уведення нікотинаміду запобігає модифікації гемоглобіну за його нітрозилювання in vitro. СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Нітритредуктазна активність дезоксигемоглобіну при діабеті та її корекція нікотинамідом / В.М. Коробов, Н.В. Біронт, А.М. Федорович, В.А. Бурда // Укр. біохім. журн. – 2002. – Т.74, №6. – С.125-127. (Дисертант визначила нітритредуктазну активність, виконала нітрозилювання гемоглобіну, брала участь у написанні та оформленні статті). Характеристика динамічного стану еритрону за умов експериментального стрептозотоцинового діабету / Бурда В.А., Біронт Н.В., Великий М.М., Сибірна Н.О., Клевета Г.Я., Федорович А.М // Труды научной конф. "Научное наследие академика И.Н. Буланкина и его развитие в современной биохимии". - Харьков: Харьков. нац. ун-т. - 2001. - С.24-25. (Дисертант створила модель стрептозотоцинового діабету і виконала його корекцію нікотинамідом, виділила клітини кісткового мозку). Біронт Н., Бурда В., Великий М. Вміст продуктів перекисного окислення ліпідів і активність ферментів антиоксидантного захисту крові та кісткового мозку щурів за умов експериментального стрептозотоцинового діабету і введення нікотинаміду // Вісник Львів. ун-ту. Сер. біол. - 2000. - Вип. 25. - С.11-17. (Дисертант визначила продукти ПОЛ, каталазну активність, статистично опрацювала та проаналізувала результати). Вплив нікотинаміду на активність ферментів антиоксидантного захисту при експериментальному діабеті / Великий М.М., Бурда В.А., Біронт Н.В., Оліярник О.Д., Великий А.М. // Укр. біохім. журн. – 1996. – Т.68, №2. – С.109-114. (Дисертант створила модель стрептозотоцинового діабету, визначила активність ферментів обміну глутатіону та його вміст). Корригирующий эффект никотинамида на процессы гликозилирования гемоглобина при стрептозотоциновом диабете у крыс / Великий Н.Н., Бурда В.А., Обросова И.Г., Биронт Н.В., Федык М.Я. // Вопр. мед. химии. – 1995. – Т.41, №1. – С.36-38. (Дисертант створила модель стрептозотоцинового діабету і виконала його корекцію нікотинамідом, визначила глікозильований гемоглобін). Nitrosohemoglobin’s spectral рroperties of rats with streptozotosin-induced diabetes / V. Korobov, N. Biront, A. Phedorovуch, V. Burda // 4nd - Parnas conf. - Wroclav (Poland). - 2002. - Р.115. (Дисертант виконала нітрозилювання дезоксигемоглобіну, статистично опрацювала та проаналізувала експериментальні дані). Спектральные свойства нитрозогемоглобина крыс с экспериментальным стрептозотоциновым диабетом / В.Н. Коробов, Н.В. Биронт, А.Н. Федорович, В.А. Бурда // 6-я Пущинская школа-конф. молодых ученых. - Пущино (Россия) – 2002. – Т.1. – С.97-98. (Дисертант виконала нітрозилювання дезоксигемоглобіну, статистично опрацювала результати, брала участь у написанні тез). Біронт Н.В., Бурда В.А., Федорович А.М. Глюкозо-6-фосфатдегідрогеназна активність за стрептозотоцинового діабету // Матеріали VIII Укр. біохім. з’їзду. –Чернівці. – 2002. – С.113. (Дисертант статистично опрацювала результати, проаналізувала їх, оформила тези доповіді). Креатин як індикатор ефективності еритропоезу за умов експериментального стрептозотоцинового діабету / Н.В. Біронт, В.М. Коробов, В.А. Бурда, Є.М. Голубій // Матеріали VI з’їзду ендокринологів України. - Київ. – 2001. - С.19. (Дисертант визначила вміст креатину, статистично опрацювала та проаналізувала результати). Псевдоферментативні активності гемоглобіну хворих на ІЗЦД / Н.В. Біронт, В.М. Коробов, М.М. Великий, В.А. Бурда // Тез. докл. науч.-практ. конф. “Диабет – проблема общечеловеческая”. - Днепропетровск. – 2000. – Вып.5. – 58-59. (Дисертант визначила псевдоферментативні активності гемоглобіну, опрацювала та проаналувала результати, оформила тези доповіді). Роль циклоспорина А и никотинамида в коррекции иммунных и метаболических нарушений при инсулинзависимом сахарном диабете (ИЗСД) / Е.Д. Олиярнык, Н.В. Биронт, Л.И. Солтыс, Н.Н. Великий // Рос. конф. посв. 100-летию со дня рожд. акад. СССР В.Г. Баранова. - Санкт-Петербург. – 2000. – С.83. (Дисертант створила модель стрептозотоцинового діабету і виконала його корекцію нікотинамідом). Effect of nicotinamide’s treatment on ascorbate/dehydroascorbate pools and lipid peroxidation in tissues of streptozotocine diabetic rats / O.D. Oliyarnyk, N.V. Biront, T.L. Vygnan, M.M. Velyky // 17th Intern. Diab. Feder. Congr. - Mexico – 2000. – P.S154. (Дисертант створила модель стрептозотоцинового діабету і виконала корекцію нікотинамідом, визначала продукти ПОЛ). Никотинамид в регуляции антиоксидантной системы организма / В.А. Бурда, Н.Н. Великий, Н.В. Биронт, М.Л. Барская, Н.А. Сибирная // V Междунар. конф. “Биоантиоксидант”. – Москва. – 1998. – С.116. (Дисертант визначила активність ферментів обміну глутатіону та його рівень в еритроцитах, статистично опрацювала та проаналізувала результати). Біронт Н.В., Бурда В.А., Великий М.М. Антиоксидантна система захисту кісткового мозку при стрептозотоциновому діабеті у щурів // Тез. докл. конф. “Международные дни диабета в Украине”. - Днепропетровск. – 1998. – Вып.3. – С.87-88. (Дисертант визначила рівень продуктів ПОЛ та активність ферментів антиоксидантного захисту, статистично опрацювала і проаналізувала результати,брала участь у написанні тез доповіді). Перекисне окислення ліпідів і фізико-хімічний стан плазматичних мембран еритроцитів при цукровому діабеті / В.А. Бурда, Т.Р. Махневич, Н.О. Сибірна, Н.В. Біронт //Тези доп. VII Укр. біох. з’їзду. – Київ. – 1997. – Ч.I. – С.56. (Дисертант визначила рівень продуктів ПОЛ та активність ферментів антиоксидантного захисту). Біронт Н.В., Бурда В.А., Сибірна Н.О. Система антиоксидантного захисту в еритроцитах і кістковому мозку щурів при стрептозотоциновому діабеті // Тези доп. VII Укр. біохім. з’зду. – Київ. – 1997. - Ч. III. – С.9-10. (Дисертант визначила рівень продуктів ПОЛ та активність ферментів антиоксидантного захисту, статистично опрацювала і проаналізувала результати,брала участь у написанні тез доповіді). АНОТАЦІЯ Біронт Н.В. Корекція порушень антиоксидантної системи крові та клітин кісткового мозку нікотинамідом за умов стрептозотоцинового діабету – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступення кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. Інститут біології тварин, Львів, 2004. Дисертація присвячена проблемі пошуку шляхів фармакологічної корекції оксидаційного стресу в крові, еритроїдному і гранулоцитарно-моноцитарному рядах кісткового мозку за експериментального стрептозотоцинового діабету у щурів. Уведення нікотинаміду щоденно впродовж двох тижнів попереджує зменшення клітин еритроїдного ряду, збільшує кількість еритроцитів, стійких до кислотного гемолітика і концентрацію креатину в них. Ці результати свідчать про стимуляцію еритропоезу щурів нікотинамідом за стрептозотоцинового діабету. Збільшення вмісту дієнових кон’югатів на фоні зменшення супероксиддисмутазної активності й активації каталази у всіх досліджуваних клітинах за стрептозотоцинового діабету підтверджує розвиток оксидаційного стресу як у крові, так і в кровотворній тканині. Введення нікотинаміду нормалізує дані показники, крім супероксиддисмутазної активності. За стрептозотоцинового діабету простежується збільшення вмісту відновленого глутатіону та глутатіонредуктазної активності в клітинах кісткового мозку. Введення нікотинаміду збільшує вміст відновленого глутатіону в клітинах кровотворної тканини і глутатіонредуктазну активність у клітинах еритроїдного ряду. Наведено експериментальні докази активації нітритредуктазної ланки утворення оксиду азоту дезоксигемоглобіном за стрептозотоцинового діабету. Уведення нікотинаміду зменшує активність відновлення нітрит-аніону до оксиду азоту, а також запобігає утворенню S-нітрозотіольних похідних гемоглобіну за його нітрозилювання in vitro. Ключові слова: стрептозотоциновий діабет, нікотинамід, кров, кістковий мозок, антиоксидантна система. АННОТАЦИЯ Биронт Н.В. Коррекция нарушений антиоксидантной системы крови и клеток костного мозга никотинамидом при стрептозотоциновом диабете – Рукопись. Диссертация на соискание ученной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. Институт биологии животных УААН, Львов, 2004. Диссертация посвящена проблеме фармакологической коррекции нарушений антиоксидантной системы крови, клеток эритроидного и гранулоцитарно-моноцитарного ростков костного мозга при оксидативном стрессе, вызванном экспериментальным стрептозотоциновым диабетом у крыс. Как известно, свободнорадикальные процессы и реакции перекисного окисления связаны с NAD- и NADP-зависимыми окислительно-восстановительными процессами в клетке. Никотинамид – водорастворимый амид никотиновой кислоты – является предшественником NAD и обладает антиоксидантными свойствами. В работе изучено влияние никотинамида на активность ферментов антиоксидантной системы и содержание продуктов перекисного окисления липидов в эритроцитах и клетках костного мозга. Установлено, что ежедневное введение никотинамида в течении двух недель предотвращает истощение содержания клеток эритроидного ряда (полихроматофильных и оксифильных нормоцитов), которое наблюдается при стрептозотоциновом диабете и увеличивает количество ретикулоцитов в периферической крови. Введение никотинамида способствует увеличению количества эритроцитов, стойких к кислотному гемолизу, и повышает концентрацию креатина в этих клетках. Результаты свидетельствуют о стимуляции эритропоэза у стрептозотоциновых диабетических крыс при введении никотинамида. Увеличение диеновых коньюгатов на фоне активации каталазы и уменьшения супероксиддисмутазной активности во всех исследуемых клетках при стрептозотоциновом диабете свидетельствует о развитии оксидативного стресса как в крови, так и в кровотворной ткани. Введение никотинамида нормализирует эти показатели, за исключением супероксиддисмутазной активности. Вероятно, этот фермент подвергается гликозилированию и возможной окислительной модификации. Результаты свидетельствуют об антиоксидантных свойствах никотинамида и его способности предотвращать нарушение метаболизма эритроцитов и клеток костного мозга при стрептозотоциновом диабете. При стрептозотоциновом диабете наблюдается увеличение количества восстановленного глутатиона, вероятно, вследствие повышения глутатионредуктазной активности в клетках костного мозга. В эритроцитах периферической крови количество этого низкомолекулярного антиоксиданта уменьшается. Отмечено также уменьшение глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной и повышение глутатионредуктазной активности в эритроцитах при стрептозотоциновом диабете у крыс. Причиной этого может быть ограниченное использование NADPH в процессах липогенеза и уменьшение соотношения NADP/NADPH при этой патологии. Известно, что при сахарном диабете и развитии гипоксии усиливается образование оксида азота (II) и его метаболитов – нитрит- и нитрат-анионов. Последние могут опять трансформироваться в оксид азота в нитритредуктазных реакциях с участием дезоксигемопротеинов, замыкая, таким образом, цикл. В работе приведены экспериментальные доказательства активации нитритредуктазного звена образования оксида азота дезоксигемоглобином при стрептозотоциновом диабете. По данным ряда авторов гликозилированные аминокислоты и белки способны восстанавливать нитриты. Увеличение количества продуктов гликирования при сахарном диабете может быть еще одним источником образования оксида азота с участием нитритредуктазного механизма. Введение никотинамида уменьшает интенсивность восстановления нитрит-аниона дезоксигемоглобином. При повышении количества оксида азота возможна модификация молекулы гемоглобина этим активным оксидантом или продуктами его метаболизма. Нитрозилирование in vitro дезоксигемоглобина полученного от крыс с развитым стрептозотоциновым диабетом, сопровождается гиперхромным эффектом в области поглощения ароматических аминокислот и появлением широкой полосы поглощения с максимумом при 334 нм, по сравнению с дезоксигемоглобином контрольных крыс. Изменения в ультрафиолетовой области спектра гемоглобина обусловлены взаимодействием оксида азота с полипептидной цепью молекулы. В спектре нитрозогемоглобина, полученного от крыс со стрептозотоциновым диабетом и введением никотинамида полосы поглощения при 334 нм, не наблюдается. Следует полагать, что введение никотинамида предотвращает те структурные модификации гемоглобина, которые могут иметь место при развитой форме заболевания. Ключевые слова: стрептозотоциновый диабет, никотинамид, кровь, костный мозг, антиоксидантная система. SUMMARY Biront N.V. Correсtion of disordes in antioxidant system of blood and bone marrow cells by treatment with nicotinamide at streptozotocin-induced diabetes mellitus. Thesis for a Ph. D. Science degree by speciality 03.00.04 – biochemistry. Institute of Animal Biology of the Ukranian Academy of Agrarian Sciences, Lviv, 2004. The present study is devoted to the problem of pharmacological correction of metabolic disorders caused by oxidativ stress in blood cells, erythroid cells and cells of granulocyte-macrophage origime at streptozotocin-induced diabetes mellitus in rats. The daily injection of nicotinamide during 14 days prevent a depletion of erythroid precursor cells, increase the amount of erythrocytes which are stable to acid hemolysis and enhance creatine content in erythrocytes. The result indicates that nicotinamide stimulates erythropoiesis at streptozotocin-induced diabetes mellitus in rats. Increase dienes conjugates as compared with the background, reduction superoxide dismutase activity and catalase activation in all studied cells are engaged suppor in the development of oxidativ stress both in blood and in haemopoietic tissue at streptozotocin-induced diabetes mellitus. Injections of nicotinamide normalize these parameters, except superoxide dismutase activity. The increase of reduced glutathione content and glutathione reductase activity in bone marrow cells was observed at streptozotocin-induced diabetes mellitus. Nicotinamide injection enhanced raised glutathione content in haemopoietic tissue and glutathione reductase activity in erythroid precursor cells. In the present study the experimental proofs are given of obtained on activation of nitrite reductase link of nitric oxide cycle by deoxyhemoglobin at streptozotocin-induced diabetes mellitus. Injections of nicotinamide suppress the activity of reduction of nitrite-anions with involvement of deoxyhemoglobin and also prevent formation of S-nitrosothiol hemoglobin derivatives during it nitrosylation in vitro. Key words: streptozotocin-induced diabetes mellitus, nicotinamide, blood, bone marrow, antioxidant system. Формат 60 ( 90/16. Папір офсет. Офсет. друк. Ум. друк. арк. 0,9. Замов. Наклад 100. Надрукованого з готового оригінал-макету у видавничому центрі Львівського національного університету імені Івана Франка 79000 Львів, вул. Дорошенка, 41 PAGE 23 Коробов В’ячеслав Миколайович,

Похожие записи