НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

ЛЬОШИНА ЛЮДМИЛА ГЕОРГІЇВНА

УДК 577.214.625+547.963.32

Клонування коренеспецифічного та світлозалежного промоторів генів рослин

03.00.20 – біотехнологія

А в т о р е ф е р а т

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі біоінженерії Інституту біоорганічної хімії та
нафтохімії НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук

Галкін Анатолій Павлович,

завідувач відділом біоінженерії

Інституту біоорганічної хімії та
нафтохімії НАН України,

м. Київ

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Кучук Микола Вікторович,

в.о. завідувача відділом
генетичної інженерії

Інституту клітинної біології і
генетичної інженерії НАН

України, м. Київ

доктор біологічних наук,
професор

Левенко Борис Олексійович,

провідний науковий співробітник
відділу нових культур

Національного ботанічного саду
ім. М.М.Гришка НАН

України, м.Київ

Провідна установа: Інститут фізіології рослин і генетики НАН України

Захист дисертації відбудеться „26” жовтня 2006 року о 12 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01 в Інституті клітинної
біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 02143,
Київ-143, вул.акад.Заболотного, 148

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної
біології та генетичної інженерії НАН України

Автореферат розісланий „ 20” вересня 2006 року

Вчений секретар

спеціалізованої ради
О.А.Кравець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Незважаючи на неоднозначне сприйняття світовою
громадськістю використання продукції трансгенних рослин у харчових
цілях, темпи робіт в області генетичної інженерії рослин невпинно
зростають в усьому світі. Це пов’язано насамперед з можливістю за
допомогою генно-інженерних технологій одержання нових сортів рослин з
високою продуктивністю, ознаками стійкості до шкідників, гербіцидів,
хвороб та несприятливих умов навколишнього середовища, рослин з
підвищеною кількістю білків, ліпідів, крохмалю, цукрів та здатністю
зберігатися більш тривалий час без погіршення якості (Кучук, 1997,
Zhang, 2004); рослин, що здатні синтезувати, глікозилювати і збирати
білки ссавців, напрацьовуючи їх в величезній кількості при низькій
собівартості (Goddijn et al.,1995). На сьогоднішній день вже
використовують трансгенні рослини для одержання дешевих фармацевтичних
білків, антитіл, вакцин, ліпідів з підвищеним вмістом жирних кислот та
різною довжиною ланцюга, а також декоративні і квіткові рослини з
екзотичними фенотипами (Daniell et al, 2001, Мельничук, 2003).

Найбільш актуальним питанням генетичної інженерії є одержання
трансгенних рослин з вибірковою експресією введеного гена в окремому
органі або у певному типі клітин. Вирішення цієї проблеми пов’язано з
необхідністю клонування промоторів, які забезпечують органоспецифічну
експресію генів, конструювання плазмідних векторів, що несуть селективні
гени й чужорідні структурні гени під органоспецифічними промоторами,
трансформації рослин цими конструкціями та одержанням із
трансформованих клітин рослин-регенерантів з експресією чужорідних генів
у вибіркових органах.

Здатність РНК-полімерази ініціювати транскрипцію залежить головним
чином від властивостей промотору та регуляторних ділянок, що відносяться
до його складу (McClure, 1985, Roeder, 1996). Тому виникає потреба в
клонуванні та структурно-функціональному вивченні промоторів, що
ініціюють експресію генів в вибіркових частинах рослини. На сьогоднішній
день у всьому світі клоновано біля п’ятдесяти органоспецифічних
промоторів (Potenza et al., 2004). В середині 90-х років у нашій
лабораторії Єфименком І.М. було клоновано бульбоспецифічний промотор
гена пататину класу І (Yefimenko, 1995).

Окрім нашої лабораторії, в Україні, фактично не проводилося
робіт по клонуванню промоторів генів рослин, одержанню на їх основі
рекомбінантних генів та плазмідних векторів для трансформації рослин та
вивченню експресії чужорідних генів в трансгенних рослинах, а
використовували та використовують лише готові генетичні конструкції, що
створені за кордоном. Недоліком цих векторів є неспроможність
розщеплення злитих конструкцій на складові компоненти і як
наслідок — неможливість їх модифікації та використання при
створенні власних ефективно експресуючих конструкцій.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами темами. Робота
виконувалась згідно науково-тематичного плану 2.1.10.12 — „Конструювання
векторів для органоспецифічної експресії в рослинних клітинах клонованих
гетерологічних генів і отримання на їх основі трансгенних рослин”
відділу біоінженерії Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії
Національної Академії Наук України ( № держ. реєстрації: 0193U027361).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було клонування
органоспецифічних промоторів генів рослин, створення рекомбінантних
генних конструкцій, векторів з цими конструкціями та одержання
трансформованих ними рослин тютюну.

Відповідно з цим були поставлені завдання:

1. Клонування промоторної ділянки ядерної ДНК тютюну та
промоторної ділянки гена малої субодиниці
рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилази/оксигенази (РДФК) та визначення їх
регуляторних елементів;

2. На основі клонованих промоторів конструювання векторів
ефективної експресії генів неоміцинфосфотрансферази ІІ та
хлорамфеніколацетилтрансферази і використання їх для генетичної
трансформації клітин рослин;

3. Проведення молекулярно-біологічного аналізу активності
ферментів НФТII та ХАТ в трансформованих рослинах тютюну;

4. Хімічний синтез і клонування гена металотіонеїну (МТ) із
Neurospora crassa та отримання трансформованих рослин тютюну з геном МТ
під досліджуваними промоторами;

5. Дослідження ефективності експресії гена металотіонеїну
під клонованими промоторами в умовах підвищеної концентрації міді та
кадмію в живильному середовищі.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше було клоновано
коренеспецифічний промотор помірної сили з ядерної ДНК тютюну
гомологічний 3′-кінцю хлоропластного гена рибосомного білка S12 тютюну.
Охарактеризована структура цієї регуляторної ділянки. На його основі
сконструйовано вектор pUC23t для коренеспецифічної експресії чужорідних
генів в клітинах тютюну.

Сконструйовано модельний вектор pDL1, що містить
ампліфікований нами промотор гена rbcS-3A малої субодиниці РДФК томату
для світлозалежної експресії підпромоторного гена.

В сконструйовані вектори введено маркерні гени
неоміцинфосфотрансферази та хлорамфеніколацетилтрансферази, за допомогою
яких доведено органоспецифічну та світлозалежну властивості цих
промоторів.

Вперше отримані трансгенні рослини тютюну з коренеспецифічною
та

світлозалежною експресією гена металотіонеїну із Neurospora crassa.
Показано збільшення толерантності рослин в умовах підвищеної
концентрації іонів кадмію та міді в живильному середовищі.

Практичне значення одержаних результатів. Сконструйовані вектори,
що мають клоновані нами промоторні послідовності, які забезпечують
коренеспецифічну та світлозалежну експресію химерних генів, є
перспективними для введення чужорідних генів в рослини з метою надання
їм цінних сільськогосподарських ознак і для біотехнологічних цілей,
особливо в тих випадках, коли необхідно експресувати ген в певному
органі рослини.

Біфункціональний вектор pUC23t може бути використаний як
модельна система для вивчення експресії чужорідних генів як у бактеріях
так і у вищих рослинах.

Трансгенні рослини з геном металотіонеїну під промоторами rpS12 та
rbcS-3A можуть бути використані в цілях біоремедиації ґрунтів
забруднених важкими металами.

Особистий внесок дисертанта. Основний об’єм експериментальної роботи,
літературний пошук, обробка і аналіз отриманих результатів, формулювання
висновків роботи виконані автором особисто. Аналіз та обговорення
результатів проводилось спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи
доповідались на вітчизняних та міжнародних з’їздах та конференціях:
ІІ-му (1993) та ІІІ-му (1995) Симпозіумах “Нові методи біотехнології
рослин” (Пущино, Росія), на 4-му Міжнародному симпозіумі „In Situ and On
Site Phytoremediation” ( Нью-Орлеан, США,1997), на 9-му міжнародному
конгресі „Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century”
(Ієрусалім, Ізраїль, 1998), на Міжнародному симпозіумі “Intracellular
Signalling in Plant and Animal System (ISPAS)” (Київ, Україна, 2001), на
1-му з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, Україна,
2004) та на наукових конференціях і семінарах Інституту біоорганічної
хімії та нафтохімії НАН України.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 10 друкованих праць, а
саме 6 статей у наукових журналах та 4 тези доповідей на конференціях
та з’їздах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 136
сторінках тексту і складається з вступу, огляду літератури, опису
матеріалів і методів дослідження, результатів дослідження та їх
обговорення, висновків та списку використаних літературних джерел, який
містить 264 найменування. Робота проілюстрована 5 таблицями та 25
рисунками.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для створення експресуючих конструкцій використовували плазмідні вектори
рКС7, pML2d, pBlueskript(+), pUC19 (“Stratagene” США) та ферменти
рестрикції та модифікації фірм ”Promega” (США), “Fermentas” (Литва),
“Serva” (Швеція). Трансформацію Agrobacterium tumefaciens проводили
бінарним вектором pBin19 . Для клонування ДНК використовували
бактеріальний штам Esherichia coli TG-1. Рослини трансформували
штамами A. tumefaciens: PGV 3850 (С58С1); LBA 4404. Об’єктом
трансформації були рослини тютюну Nicotiana tabacum cv.Petit Havana SRI.

Роботи з бактеріальними культурами, трансформацію E.сoli, рестрикцію,
лігування, введення мітки в ДНК та видалення рекомбінантних плазмід
проводили за стандартною методикою, як описано у Маніатіс (Maniatis et
al, 1987).

Трансформацію компетентних клітин E.coli проводили за допомогою 75мМ
CaCl2. Трансформацію A.tumefaciens проводили прямим методом (Burow et
al., 1990) із модифікаціями.

Аналіз первинної нуклеотидної послідовності робили по методу Сенгера
(Sanger et al., 1977) з використанням набора “Т7-сиквенс” (“Fermentas”,
Литва), за методикою фірми-виробника.

Гібридизацію проводили на нейлонових фільтрах за методикою, яку
запропонували Саузерн із співавторами (Southern et al.,1975).

Ампліфікацію промотора проводили за допомогою полімеразної
ланцюгової реакції на приладі ТС480 (фірма Perkin-Elmer Cetus). За
відомою нуклеотидною послідовністю (Ueda et al.,1989) були підібрані
відповідні праймери, які, в свою чергу, були отримані за допомогою
хіміко-ферментативного синтезу твердофазним Н-фосфатним методом (Dubey
et al., 1993). Геномну ДНК отримували за стандартною методикою
використовуючи 2V буфера (1% саркозіл, 0,25М сахароза, 50мМ NaCl, 20мМ
ЕДТА, 50мМ тріс-HCl рН 8,0). Температурний режим для ПЛР підбирали з
урахуванням довжини ампліфікованого фрагмента, довжини і складу
використаних праймерів. Реакція ампліфікації була запрограмована на 30
циклів: гібридизація 500С-1 хв., елонгація 720С-1.5 хв. та денатурація
при 940С-1 хв. і потім одного кінцевого циклу: гібридизація 500С-1 хв,
елонгація 720С-5 хв. Для електрофоретичного аналізу ДНК в 1% агарозному
гелі в 1N ТВЕ буфері (45мМ тріс-борат, 1 мМ ЕДТА, рН 8,0) при 100В
впродовж 2 годин брали 1/10 частину суміші з подальшим фарбуванням
етидієм бромідом.

Картування за допомогою нуклеази S1 проводили по ДиРіту із співавторами
(DiRita et al.,1987).

Трансформацію протопластів проводили за модифікованою нами методикою
Шиліто ( Shillito et al., 1983 ). Трансформацію листових
дисків тютюну проводили згідно до Маніатіса (Maniatis et al, 1987).
Трансгенні рослини регенерували та підтримували в культурі за методом
Потрікуса (Potrikus et al., 1985). Селекцію трансформантів проводили
на середовищі з канаміцином (50-100 мг/л) та хлорамфеніколом
(90 мг/л).

Аналіз експресії гена npt-II в трансформованих протопластах тютюну
проводили за методикою запропонованою в керівництві Дрейпера (Дрейпер із
співав.,1991), а активність продукту cat-гена в трансформантах визначали
за модифікованим методом Гормана (Gorman and Moffet., 1982).

Концентрацію металів в рослинах визначали після вирощування
рослин на MS середовищі з агаром, що містило 0,86мг CuSO4 (200мкМ/л) та
0,2мг CdCl2 (40мкМ/л) за допомогою метода атомної адсорбційної
спектроскопії (Smeyers-Verbeke et al.,1973).

Комп’ютерний аналіз послідовностей проводили за допомогою пакетів
програм: “DNA-STAR”, “DNASIS”, “TRANSFAC”, “OLIGO“ (ver.3.3).

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ

1. Клонування та дослідження фрагмента геномної ДНК тютюну, що
функціонує як коренеспецифічний промотор в трансгенних рослинах. Для
пошуку й добору промоторних послідовностей ДНК тютюну було використано
метод клонування фрагментів ДНК перед маркерним геном, попередньо
позбавленим власного промотору (Nacahama et al., 1985).

Клонування ядерної ДНК N.tabacum здійснювали в плазміді pDN (4,5
т.п.о.), яка несе гени стійкості до ампіциліну й канаміцину, має
ділянку початку реплікації плазміди pBR322 і не містить послідовностей,
що блокують її реплікацію в клітинах еукаріот. Плазміду послідовно
гідролізували рестриктазами BglII і EcoRI, виділяли довший фрагменти
який лігували із фрагментами ядерної ДНК тютюну, також обробленими
рестриктазами BglII і EcoRI. Замість вилученого промотору перед геном
неоміцинфосфотрансферази (npt-II) вбудовували різні послідовності ДНК
тютюну у довільній орієнтації.

Сумішшю після процесу лігування трансформували клітини E.coli,
скориставшись тим, що гібридних генах була збережена послідовність
Шайна-Дельгарно, яка повинна забезпечити трансляцію гена в бактеріальних
клітинах. У результаті трансформації нам вдалося відібрати колонію
бактерій, стійку до ампіциліну й канаміцину. Цей клон містив плазміду,
що була названа нами pDNt23 і мала промоторну вставку 500 п.о. перед
геном npt-II.

Після сиквенування отриманої послідовності, її порівнювали із ядерною та
хлоропластною ДНК тютюну, використовуючи комп’ютерну пошукову програму
“DNA-STAR”. У результаті було визначено, що фрагмент довжиною 470 п.о.,
введений в pDNt23, має 100% гомологію з фрагментом 3′-частини
хлоропластного гена рибосомного білка S12 (Torazawa et al., 1986).

Надалі, клонований фрагмент промотороподібної ДНК був досліджений на
наявність потенційних сайтів зв’язування для різних факторів
транскрипції. Для цього була використана база даних “TRANSFAC”, версія
2.3. Виявилось, що фрагмент, по-перше, містить послідовності, подібні
по структурі до прокаріотичних промоторів (TATA/GATG), а саме до
промотору гена тирозинової тРНК E.Coli — (TATGATG) (Pribnow, 1975). Має
послідовність, подібну до послідовності Шайна-Дельгарно ( HYPERLINK
«http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&term
=%22Hirose+T%22%5BAuthor%5D» \o «Click to search for citations by this
author.» Hirose HYPERLINK
«http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&term
=%22Hirose+T%22%5BAuthor%5D» \o «Click to search for citations by this
author.» et al., 2004 ), що пояснює функціонування фрагмента як
промотора в бактеріальних клітинах. І по-друге, послідовність містить в
собі райони, які можуть потенційно регулювати експресію генів в
еукаріотах. Ділянка GGTTAA є суттєвою для фотохромної відповіді (Dean et
al., 1989), але показана далі відсутність в наших дослідах
світлозалежної експресії, обумовлена, скоріш за все, тим, що
світлочутливі елементи направляють експресію генів тільки в комбінації
цис-регуляторних послідовностей і їх активність є результатом
синергічної взаємодії між ними, їх факторами і, у деяких
випадках, відповідними ко-факторами (Gilmartin et al.,1992). Необхідна
для коренеспецифічної експресії GT-багата послідовність (Bastolaet
al.,1998), в нашому фрагменті це GAGGTG та GATA-мотиви, розташовані на
відстані 439 п.о. на відстані 207 п.о. відповідно.

Аналіз нуклеотидної послідовності перед точками ініціації транскрипції
показав, що найближча послідовність, що нагадує ТАТА-бокс, знаходиться
від точки початку синтезу мРНК на відстані 130 п.о. Таким чином,
організація досліджуваної регуляторної послідовності відрізняється від
організації більшості вже відомих промоторів еукаріот, у яких ТАТА-бокс
розташований на відстані 10-30 п.о. від сайту ініціації транскрипції
(Guilfoyle, 1997). У той же час існує цілий ряд еукариотичних генів,
промотори яких не містять ТАТА-боксу (Martinez et al.,1994). Очевидно,
що досліджуваний нами фрагмент відноситься саме до таких регуляторних
послідовностей.

Вивчення експресiї гена npt-II та cat під досліджуваним промотором в
трансгенних рослинах-регенерантах. Для доказу того, що стійкість до
канаміцину зумовлена експресією химерного гена npt-II, визначали
активність НФT-II в трансгенних рослинах. Позитивним контролем слугували
рослини, що містили плазмiду pLGV23neo, в якій ген npt-II знаходиться
під контролем nos промотора.

В результаті трансформації та регенерації протопластів тютюну
плазмідною ДНК з геном npt-II під досліджуваною промоторною
послідовністю, було отримано сім стійких до канаміцину рослин.
Активність ферменту визначали в різних органах рослин. Результати
проведених дослiдiв представлені на pис.1, з якого видно, що
активність npt-II в рослинах-регенерантах з плазмідою pDNt23 максимальна
в коренях, дещо слабша в стеблах i практично відсутня в листовій
тканині, що свідчить про коренеспецифiчний характер експресії гена
npt-II. Крім того, рівень експресії під контролем промоторної
послiдовностi

тютюну помітно нижчий, ніж у випадку позитивного контролю.

Розміри білкових продуктів химерних генів npt-II як в дослiдi,
так i в контролі приблизно однакові, хоча в дослiдi
молекулярна маса білка дещо

Рис. 1. Визначення активності НФТ-II в органах трансгенних рослин
тютюну: 1 — лист, 2 — стебло, 3 — корінь трансгенної рослини, що
трансформована плазмідою pDNt23neo; 4 — лист контрольної рослини
трансформованої pLGV23neo.

нижча, а розподілення його в гелi більш дифузне. Це може бути зв’язано
з вiдсутнiстю в промоторі класичного еукарiотичного 5′-регуляторного
елементу, що може бути причиною молекулярної негомогенності мРНК і
білкового продукту.

Картування 5’-кінців транскриптів, що синтезуються в клітинах тютюну й
E.coli. Для гібридизації досліджуваного фрагмента із сумарною мРНК
трансгенної рослини, що містить химерний ген npt-II, використовували
EcoRI – BglII фрагмент, мічений 32Р по 5’-кінцю рестрикційного сайту
BglII. У результаті гібридизації із мРНК N. tabacum і обробки гібрида
нуклеазой S1 було виявлено два фрагменти, захищені від гідролізу.
Розрахункова довжина цих фрагментів відповідно — 147 і 149 п.о. Початок
ініціації транскрипції локалізовано всередині rpS12 фрагмента і перший
нуклеотид в обох випадках є гуанін в положеннях (-147) і (-149) п.о. від
сайта BglII .

У результаті картування 5’-кінця бактеріальної РНК було виявлено, що
точка ініціації транскрипції прокаріот знаходиться на відстані 45
нуклеотидів від ділянки BglII. Перед сайтом початку синтезу
бактеріальної РНК перебуває АТ-багата область, що нагадує послідовність
Прибнова, яка характерна для бактеріальних промоторів.

Отримані результати свідчать про те, що досліджуваний фрагмент
має біфункціональні властивості еукаріотичного й прокаріотичного
промоторів, і що точки ініціації синтезу НФТ-II у клітинах тютюну й у
бактеріальних клітинах не збігаються.

Дослідження транзієнтної експресії гена cat в протопластах тютюну. Ще
одним підтвердженням того, що фрагмент ДНК хлоропластного геному,
клонований в векторі, є промотором, стало дослідження експресії cat
гена, транскрипційно злитого з цим промотором. Для цього, було
розроблено стратегію конструювання вектору, яку відображено на схемі
рис.2.

EheI

Amr HindIII

pUC19
pLGV23neo Knr

BamHI
+HindIII

BamHI +HindIII

HindIII

EcoRI term BamHI

HindIII

EheI +HindIII linker

BamHI

Amr

pUCt term

HindIII

HindIII EcoRI

EcoRI

EcoRI+
BamHI rpS12

rpS12

BamHI

BglII

pDNt23 BglII-BamHI адаптор
pUC23t

Amr +EcoRI
Amr term

Knr
HindIII

HindIII EcoRI

BamHI

rpS12

BamHI

Chr
Amr

pCaMVcat BamHI
pUC23tcat

Chr

BamHI

term BamHI

††††?†††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††††?????

Рис.2. Схема переклонування досліджуваного фрагмента в
плазміду pUC23cat.

Базовим відібрано вектор pUC19, в якому по сайтах BamHI i HindIII
полілінкеру спрямовано лігували фрагмент поліаденілювання гена
нопалінсинтази Ti-плазміди (термінатор транскрипції — term) із вектора
pLGV23neo. Нова конструкція, плазміда pUCt, отримала термінуючу
послідовність, фланковану BamHI та HindIII, перед якими знаходяться
сайти рестрикції для ферментів EcoRI та EheI. Для зручності подальшої
роботи з гетерогенною конструкцією, в гідролізований сайт EheI
вбудовували нефосфорильований лінкер HindIII. В результаті чого
фрагмент полілінкер + термінатор набув границі з HindIII-сайтами.

Вихідний вектор pDNt23 гідролізували рестриктазою BglII і цей сайт
замінювали на BamHI за допомогою BglII-BamHI адаптора.

У результаті було отримано фрагмент rpS12 обмежений ділянками рестрикції
EcoRI – BamHI, що дозволило спрямовано перенести його в плазміду pUCt,
і вбудувати перед термінатором транскріпції.

Ген cat вирізали із вектора pCaMVcat по BamHI сайтах і лігували з
вектором pUC23t, що був попередньо гідролізований BamHI. Відбір
рекомбінантів проводили по здатності колоній рости на середовищі з
ампіциліном та хлорамфеніколом.

Далі, cat-ген, фланкований послідовністю rpS12 і nos термінатором в
складі плазміди pUC23tcat було введено у протопласти тютюну.Для чого
отриману плазмiду pUC23tcat інкубували з протопластами тютюну
протягом 25 хвилин за відпрацьованою методикою i після відмивання
культивували в рідкому живильному середовищі (Nagy and Maliga, 1976)
протягом 48 годин, після чого протопласти використовували для
визначення ферментативної активності ХAT.

На радiоавтографi хроматограми (рис.3) видно, що в дослiдi реакція
пройшла до кінця i утворились всі три форми ацетильованого
хлорамфенiколу, що показує наявність ХAT-активності досліджуваного
екстракту.

Рис. 3. ХАТ-активність в рослинних
протопластах тютюну
трансформованих вектором pUC23tcat: 1 – контрольні клітини
E.coli, використані як маркер ацетильованої форми 14С-
хлорамфениколу; 2 – трансформовані протопласти тютюну.

1 2

Наведені результати свідчать про те, що фрагмент ядерної ДНК тютюну
плазмiди pDNt23, має промоторні властивості і може самостійно iнiцiювати
транскрипцію cat-гена.

Для доказу того, що досліджуваний фрагмент присутній не тільки в
ядерному, а і в хлоропластному геномі, ми гібридизували мічену плазміду
pDNt23 з ядерним і хлоропластним геномом N.tabacum. Введена в pDNt23
ДНК гібридизувалась як з ядерною, так і з хлоропластною ДНК.

Відомо, що багато генів, первісно кодованих в хлоропластному геномi,
були перенесені протягом еволюції в ядра. Про таку мiжклiтинну
«мiграцiю» генів з

хлоропластів в ядра повідомляли ряд авторів (Oliveret et al., 1990,
Baldauf et al., 1990) Оскільки переміщення генів періодично зустрічалось
в еволюції рослин, виявляється, що бiльшiсть із пластидних генів мають
«двiйникiв» в ядрах (DuJardin, 1990). Тому можна припустити, що в
хлоропластному геномi існують приховані або „криптичні” регуляторні
елементи і що їх промоторна функція може бути активована внаслідок їх
природної або штучної транслокації у ядерний геном.

Виходячи з вищесказаного, можна стверджувати, що клонований в плазміді
pDNt23 фрагмент ядерної ДНК тютюну, що відповідає фрагменту
хлоропластної ДНК, а саме 3′-частинi хлоропластного гена рибосомного
білка S12, має властивості бактеріального і еукаріотичного промотору.
Він може зв’язувати еукаріотичну РНК-полімеразу і внаслідок цього
ініціювати транскрипцію, не зважаючи на те, що він не являється
класичним промотором, а також має здатність регуляторної ділянки, що
може спрямовувати коренеспецифічну експресію злитого з ним гена.

Запропонований нами підхід клонування промотору такого типу відкриває
можливості для використання цього промотору для аналізу функціонування
структурних генів як у бактеріальних клітинах, так і у рослинних
організмів.

2. Клонування промотору, що спрямовує світлозалежну експресію в
регенерованих рослинах тютюну. Для клонування світлозалежного промотору
ми ампліфікували промоторний фрагмент гена rbcS-3A томату,
використовуючи синтезировані праймери, що фланкують вибрану ділянку
ДНК. За допомогою комп’ютерної програми OLIGO (ver.3.3), були підібрані
олігонукеотиди, що мають вигляд:

3’-GGTATACTAACTCACTTACCTG-5’ та

5’-GTGCTTATCTTGAACTCAAGAGGG—3’.

Як результат того, що мультигенна родина РДФК генів має схожі
нуклеотидні послідовності (Sugita et al, 1987), ми отримали на
агарозному гелі набір фрагментів різної довжини. Щоб одержати промотор
саме rbcS-3А ми провели доампліфікацію з внутрішніми праймерами цієї
нуклеотидної послідовності

(3’-CTAACTCACTTACCTGAAAAACACG-5’,

5’-AAGAGGGTTATTGCTTTCTAGTCTCTC—3’).

При цьому підняли температуру гібридизації до 58оС, та збільшили
кількість циклів до 40.

В результаті дістали фрагмент довжиною до 1000 п.н., придатний для
сиквенсу та клонування (рис.4).

Рис.4. Результати ПЛР: 1 – маркер ( ДНК фага л, гідролізована
рестриктазою HaeIII); 2-6 – фрагмент промоторної послідовності гена
rbcS-3A довжиною 1094 п.н.

1 2 3 4 5 6 7

Клонування ампліфікованого фрагмента в плазмідному векторі
рBluescript SK(+/-). Далі ампліфікований фрагмент було клоновано в
плазмідному векторі рBluescriptSK(+/-) по ділянці упізнавання
рестриктазою SmaI по «тупих» кінцях. Рекомбінанти на середовищі з IPTG
давали незабарвлені колонії. Наявність потрібної вставки визначали після
рестрикції плазмід з відібраних колоній ендонуклеазами AluI та RsaI, які
присутні тільки в клонованому фрагменті.

Після подальшого сиквенування отриманого фрагмента, проведеного по
методу Сенгера, ми проаналізували його на наявність регуляторних
послідовностей. Виявилось, що досліджуваний фрагмент містить
передбачений ТАТА бокс (-29 ТАТАТА –24 від розрахункової точки ініціації
транскрипції) та СААТ ділянку (-99 СCAAT –96), які беруть участь у
зв`язуванні РНК-полімерази ІІ. В положенні –75 п.о. знаходиться
GT1-бокс, на відстані –251 п.о. від точки ініціації транскрипції
розташовано G-бокс, а у положенні –135 п.о., –274 п.о. та –529 п.о.
знайдено три I-бокси. Ці послідовності приймають участь в світлозалежній
регуляції підпромоторної експресії (Terzaghi, Cashmore, 1995).

Конструювання вектора для експресії гена cat. Для створення
експресуючого у рослинах вектора ми переклонували промоторний фрагмент
гена rbcS-3A із плазміди рBluescript SK(+/-) у плазміду pDL1.
Схематично це показано на рис.5.

В якості базового вектора, використовували отриманий нами
раніше вектор pUCt в якому по сайтах BamHI i HindIII полілінкеру
міститься фрагмент поліаденілювання гена нопалінсинтази Ti-плазміди
(термінатор транскрипції — term) із вектора pLGV23neo. Перед термінуючою
послідовністю знаходяться сайти рестрикції для ферментів EcoRI та
HindIII.

В цю плазміду по сайтах EсoRI і BamHI спрямовано вводили
промотор rbcS-3А, раніш проклонований по SmaI-сайтах в полілінкері
вектора рBluescript SK(+/-).

b

d

|

~

?

1/4

A

A

i

> @ R T ? ® ° A E ae „

?

?

¬

~

?

a$

?

?

1/4

3/4

A

A

i

@ v x z | ” – ? Ae AE E †

?

?

?

a

??

=h>JA?BHDaDZF?IeJ.LBNiaaICCCCCCCCC»»C?C»»

BBNT4UiWiW,Xj\&^|_a`ia»jTHjHnrpdrdsfsooc*IoA??¬¤?oo¬o¬

›Z?v?x?z?|?~?H?„ NcV§Ue©oeeeeeeTHeOeOeOeeeeeeAEOeOe?TH

„o

^„o

?

!??F?¦?§?¬?

?&?3/4»E»O»a»a»ae»i»I1/4I1/4Oe1/4O1/4U1/4

oooocccUUccICCC»cCCc»

KТаким чином, ми отримали модельний вектор, який між промотором та
термінуючою послідовністю містить унікальний сайт BamHI,в який було
вбудовано маркерний ген cat із вектора pCaMVcat.Перенос створеної
конструкції в рослинну клітину проводили за допомогою бінарного
вектора pBin19. Потім, методом прямої трансформації його мобілізували у
штам A.tumefaciens з подальшим перенесенням в геном N.tabacum шляхом
трансформації листових дисків.

Впродовж культивування на живильному середовищі з додаванням канаміцину
більшість експлантів розвились в рослини з корінцями. Загибель
спостерігалась на тих рослинах, які мали дуже маленькі корінці, або
коренеформування було відсутнє. Тривалий відбір на антибіотиках дав
можливість уникнути помилкової трансформації, або мозаїчності
експлантів, які могли бути похідними від суміші трансформованих та не
трансформованих клітин.

HindIII

EcoRI

pUCtН

Amr
BamHI

term

HindIII

EcoRI+ BamHI

HindIII

EcoRI

EcoRI

prom
rbcS-3A

prom rbcS-3A

pSK(+/- ) EcoRI+
BamHI pDL1

BamHI

Amr

term

HindIII

BamHI

HindIII

EcoRI

BamHI

prom rbcS-3A

BamHI
BamHI

pCaMVcat
pDL1cat

Chr
Amr

Chr

BamHI

term

HindIII BamHI

Рис. 5. Загальна схема конструювання вектора pDL1, що містить
касету

rbcS-cat-term.

Делеційний аналіз клонованого фрагмента. Для виявлення мінімального
промотору та ділянок, що впливають на ефективність експресії, було
проведено делеційний аналіз клонованого нами фрагмента.

Були створені три 5?-делеційні конструкції: фрагмент довжиною 785 п.о.,
утворений після гідролізу первинного промотору рестриктазою RsaI,
фрагмент в 505 п.о., рестрикований StyI, та 205 п.о. отриманий за
допомогою ферменту AluI. Ці ділянки ліговані з геном cat у векторах
pDL1-del1,2,3 були перенесені в рослини тютюну. Після цього проводили
ферментативний аналіз листкової тканини трансформованих рослин. На
рис.6 видно, що делеція до 785 п.о. 5?-кінцевої ділянки промотору
призвела до різкого зменшення ХАТ експресії порівняно з початковим
промотором довжиною 1075 п.о. Подальша делеція до 505 п.о. призвела до
слабого підвищення експресії підпромоторного гена, але фрагмент довжиною
205 п.о. показав практичну відсутність експресії ХАТ в трансформованих
рослинах, так само як і в нетрансформованому контролі.

Рис. 6. Експресія гена cat під делетованими промоторами: К —
контрольний екстракт E.colі, використаний як маркер ацетильованої
форми 14С-хлорамфениколу; цифрами позначені делетовані варіанти
промотору rbc-S3A.

К -1075 -785 -505 -205

Отримані результати є свідченням того, що мінімального фрагмента, який
містить три цис-активні послідовності ефективної світлоіндукуємої
регуляції підпромоторних генів (GT-1-з?єднувальний сайт на відстані -74
п.о. від точки початку транскрипції, три I -бокси на відстані 134 п.о.,
273 п.о. і 530 п.о. відповідно й G-бокс, віддалений від ініціюючого
сайту на 250 п.о.), недостатньо для активації експресії підпромоторного
гена. Різке скорочення промоторної активності після видалення 290 п.о. з
5′-кінця повного промоторного фрагмента можна пояснити присутністю
у цьому регіоні енхансерних елементів, які

необхідні для комбінаторної цис-активної регуляції генів. Делеція до 505
п.о. призвела до часткового підвищення експресії cat-гена. Це
пояснюється присутністю на ділянці від –785 до –505 п.о. послідовностей
із властивостями сайленсерів, при відсутності яких частково поновлюється
промоторна активність фрагмента.

Вивчення світлоіндукуємої та органоспецифічної експресії химерного
rbcS3A-cat гена. Регуляцію світлом експресії cat-гена визначали,
порівнюючи активність ХАТ у трансформованих рослинах, що росли на світлі
й у темряві. Одну із клонованих рослин, трансформованих вектором
rbcS3A-cat, вирощували в темряві протягом 7 днів. Контрольну рослину
трансформовану cat геном, активність якого скеровувалась сильним
конститутивним промотором 35SCaMV, також вирощували 7 днів у темряві.
Всі нові пагони “темнових” рослин були етиольовані. Порівняння
активності ХАТ в рослинах, що перебували на світлі й у темряві,
підтверджує те, що досліджуваний нами промоторний фрагмент регулюється
світлом (рис.7), а саме зменшення розміру та інтенсивності плям
„темнових” контрольних рослин з 35SCaMV-cat вставками свідчать про те,
що зниження рівня експресії ХАТ в темряві є наслідком зниження
загального метаболізму рослини, а не результатом специфічної регуляції,
як у випадку з експериментальними рослинами, які містять ген cat під
досліджуваним промотором.

35CaMV-cat rbcS3A-cat

Рис. 7. Порівняння активності ХАТ в рослинах, що росли на
світлі і в темряві.

світло темрява світло темрява

Для доказу наявності маркерного гена в трансформованих
рослинах на рівні транскрипції та в різних органах рослини ми також
використовували метод визначення ХАТ активності. Результати проведених
дослідів представлені на рис.8.

На радiоавтографi видно, що ХАТ активність в трансформованих
рослинах-регенерантах максимальна в листах та практично не виявлена в
коренях, що свідчить про органоспецифічний характер експресії cat-гена.

Рис.8. Аналіз ХАТ-активності в рослинах трансформованих плазмідою
pDL1cat: 1 — контрольний екстракт E.colі, використаний як маркер
ацетильованої форми 14С-хлорамфениколу; 2 – листя; 3 — корінь.

В цілому, клонований нами фрагмент rbcS-3A гена томату є промотором,
який після клонування його у відповідних векторах здатний направляти
органоспецифічну й світлозалежну експресію химерного cat-гена в рослинах
N.tabacum.

3. Органоспецифічна експресія химерного грибного гена металотіонеїну в
трансгенних рослинах. Для перевірки ефективності клонованих промоторних
послідовностей відносно структурного гена ми клонували їх перед геном,
що кодує білок металотіонеїн (МТ), який зв’язує в організмі іони важких
металів.

Послідовність гена МТ з Neurospora crassa (царство Fungi, кл.
Ascomicetes, сім. Sordariaceae) синтезували хіміко-ферментативним
методом в дві стадії (Dubey,et al., 1993).

Далі ген клонували в полілінкері плазміди pSKBluescript(+), відбір
рекомбінантних колоній проводили по зміні кольору на середовищі з IPTG
та X-gal. Відібрані плазміди перевіряли на наявність в них вставки по
рестрикції ендонуклеазою NcoI.

Отриманий ген, по сайту BamHI, вбудовували в вектори: під
коренеспецифічний промотор rpS12 у вектор рUC23t та під світлозалежний
rbcS-3А у вектор pDL1.

В результаті були отримані чотири трансформовані лінії рослин, що
містили ген металотіонеїна під досліджуваними промоторами.

Присутність в геномі тютюну гена МТ визначали за допомогою
Саузерн-гібридизації геномної ДНК (рис.9), що була виділена з отриманих
рослин. Вбудований ген МТ було ідентифіковано як фрагмент довжиною 80
п.о.

80 п.о.
Рис.9. Саузерн-гібридизація рослин

трансформованих геном металотіонеїну.

Відмінності інтенсивності плям на авторадіограмі свідчить про
те, що трансгенні рослини тютюну мають не однакову кількість копій гена
МТ на геном.

Аналіз експресії гена МТ під досліджуваними промоторами.
Згідно з літературними даними (Misra and Gedamu, 1989), найшвидше
перевірити експресію генів, які забезпечують стійкість до іонів важких
металів, можна, проаналізувавши, як трансгенні рослини ростуть на
середовищі, що містить метал (в нашому випадку це Cd2+ та Cu2+).
Отримані лінії тютюну поміщали на середовище MS, що містить різні
концентрації CuSO4 (0-200 мкМ/л) та CdCl2( 0-140мкМ/л).

Летальні дози металів (Сu – 200 мкМ/л, Cd – 140 мкМ/л) викликали у
контрольних рослин тютюну значне уповільнення росту та їх поступову
загибель. У трансформованих рослинах, на 15 день, спостерігалась поява
коренів (для порівняння, у нормальних рослини в нетоксичному середовищі
ризогенез ініціювався на 8 день).

Рослини тютюну з експресією гена МТ під коренеспецифічним
промотором розвивались наступним чином: ріст надземної частини було
сповільнено (затримка в рості порівнювалась з контрольними рослинами),
коренеутворення було аналогічно рослинам з 35S промотором.

У рослин з експресією МТ гена під світлозалежним промотором
спостерігався непропорційний розвиток морфологічних ознак. Тоді, як
зелена надземна частина рослин розвивалась нормально, формування коренів
майже не спостерігалось. На межі надземної та підземної частин рослин
формувалась калусна тканина. На поверхні пагонів з`являлись повітряні
кореневі утворення.

Концентрацію важких металів в рослинах визначали методом атомної
адсорбційної спектроскопії. Отримані результати показали, що рослини
трансформовані геном МТ під коренеспецифічним промотором rps12
акумулюють йони Cd2+ та Cu2+ переважно в коріннях, в рослинах з геном МТ
під світлозалежним промотором цей ген експресується в листках, а в
коріннях майже не виявляється.

Експеримент показав, що всі рослини, трансформовані геном
металотіонеїну, набули стійкості до підвищеної концентрації іонів важких
металів в живильному середовищі. В залежності від експресії МТ гена
спостерігалась селективна толерантність до шкідливого впливу металів в
різних органах трансформантів. Вивчення акумулюючих якостей трансгенних
рослин, дозволило встановити, що клоновані нами світлозалежний та
коренеспецифічний промотори здатні скеровувати експресію підпромоторного
гена металотіонеїну. Промотор rbcS та rpS12 промотор скеровують
приблизно однакову експресію гена МТ в трансформантах, але рослини, що
містять світлозалежний промотор, менш життєздатні внаслідок слабко
розвинутої кореневої системи. Взагалі, досить високий рівень
акумуляції трансформантами іонів важких металів за допомогою цих
промоторів дає підставу для використання таких трансгенних рослин в
цілях біоремедитації забруднених ґрунтів.

ВИСНОВКИ

За допомогою рестриктаз BglII і EcoRI одержано фрагменти ядерної ДНК
клітин тютюну для відбору з них регуляторних (промоторних) ділянок
генів. Відбір промоторних послідовностей проведено за допомогою
бактеріальних клітин, трансформованих векторними плазмідами, що містили
маркерний ген неоміцинфосфотрансферази під різними фрагментами ядерної
ДНК, вбудованими замість власного промотору маркерного гена.

У результаті скринінгу на середовищі з канаміцином відібрано
послідовність з промоторною активністю розміром 470 п.о. Фрагмент
сиквеновано, встановлено його гомологію з 3?-промоторною послідовністю
хлоропластного гена рибосомного білка S12 тютюну і визначені його
регуляторні елементи.

На основі плазміди pUC19 сконструйовано вектор pUC23t, який містить
досліджувану промоторну послідовність rpS12, сайт рестрикції BamHI для
вбудовування структурних генів та термінатор транскрипції гена
нопалінсинтази Ti-плазміди.

За допомогою вектора pUC23t з введеними генами npt-II та cat під
контролем промоторної послідовності rpS12, отримані трансгенні рослини
N. tabacum, у яких виявлена коренеспецифічна експресія маркерних генів.

За допомогою полімеразної ланцюгової реакції ампліфіковано промотор
гена томату rbcS-3A, проклоновано в векторі рBluescript SK(+/-),
сиквеновано та охарактеризовано його регуляторні ділянки.

На основі плазміди pUCt одержано експресуючий вектор з касетою
rbcS3A-cat-term, який в результаті Agrobacterium-опосередкованої
трансформації перенесено в рослини тютюну. Показана світлоіндукуєма та
органоспецифічна експресія cat-гена в трансформованих рослинах. За
допомогою делеційного аналізу промотору rbcS-3A показана наявність в
ньому елементів позитивної та негативної регуляції.

За допомогою векторних конструкцій рUC23t та pDL1 з введеним в них геном
металотіонеїну, одержані трансгенні рослини тютюну з органоспецифічною
експресією гена металотіонеїна визначеною по показнику накопичення в них
йонів Cu2+ та Cd2+ з живильного середовища.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. N.V.Grzhelyak, A.P.Galkin, L.V.Gening, T.V.Medvedeva, L.G.Lioshina,
O.V.Bulko, K.G.Gazaryan Chloroplast «cryptic» promoter can be activated
upon their transfer to plant nuclear genome // Биополимеры и клетка.-
1996.-т.12.-№6.-С.87-93.

2. A.P.Galkin, O.V.Bulko, L.G.Lеoshina, A.N.Vasiliev, T.V.Medvedeva
Clean-up of contaminated lands from heavy metals using transgenic plants
// Proc. 4th Itern. Sity and on Site Phytoremeditation Symp..
New-Orlean, USA.- 1997.-V.3.-Р.325-329.

3. Л.Г.Льошина, Т.В.Медведєва, О.В.Булко, А.П.Галкін Клонування та
дослідження промоторних послідовностей, що скеровують органоспецифічну
та світлозалежну регуляцію химерних генів в трансформованих рослинах //
Збірник праць “Генетика і селекція в Україні на межі тисячоліть”.-
2001.-т.1- С.635-641.

4. Л.Г.Льошина, Т.В.Медвєдєва, О.В.Булко, А.П.Галкин, В.П.Кухар.
Органоспецифічна та світлозалежна експресія генів в трансгенних
рослинах: одержання та клонування корене- бульбо- та листспецифічних
промоторів // Біополімери та клітина.- 2003.- т.19.-.№2.- С.169-178.

5. А.П.Галкин, Т.В.Медведева, Л.Г.Лёшина, О.В.Булко, В.П.Кухар.
Трансгенные растения: за и против // Биополимеры и клетка.-
2003.-т.19.-№4.-С.317-327.

6. А.П.Галкин, Л.Г.Лёшина, Т.В.Медведева, О.В.Булко, В.П.Кухар
Регуляторные области промоторов генов растений и белки-регуляторы
промоторной активности// Биополимеры и клетка.- 2004.- т.20.-.№5.-
С.363-379.

7. A.P.Galkin, L.G.Lioshina, O.V.Bulko Cloning of the 3
organ-specific promoters: root-, tuber- and leafspecific // Abstr. of
the IX International Congress on Plant Tissue and Cell Culture (14-19
June 1998).-Jerusalem (Israel).-1998.-Р.142.

8. A.P.Galkin, P.G.Kovalenko, L.G.Lioshina, O.V.Bulko, D.M.Fedoryak
Obtaining of transgenic plants of tobacco and potato with organ-specific
expression of hymeric metallothionein // Interactions and Intersection
in Plant Signaling Pathways (February 8-14,
1999).-Idaho(USA).-1999.-Р.57.

9. L.G.Lioshina, T.V.Medvedeva, O.V.Bulko, A.P.Galkin About
participation of eucariotic cys and trans factors in the regulation of
procariotic (cloroplastic) promoter’s activity // International
Symposium “Intracellular Signalling in Plant and Animal Systems
(ISPAS)”, (September 9-14, 2001).- Kiev (Ukraine).- 2001.-С.75.

10. L.Lioshina, O.Bulko The induction of extensine and
metallothioneine synthesis in the cells of genetically transformed
plants // First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology (April
25-28, 2004).-Lviv (Ukraine).- 2004.- p.106.

АНОТАЦІЇ

Льошина Л.Г. Клонування промоторів світлозалежної та
коренеспецифічної експресії чужорідних генів в клітинах рослин. –
Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія. — Інститут клітинної біології та
генетичної інженерії НАН України, Київ, 2006.

Одержано та досліджено дві регуляторні послідовності, що забезпечують
коренеспецифічну та світлозалежну експресію химерних генів в
бактеріальних та рослинних клітинах. Промотор, що має коренеспецифічні
властивості отримано в результаті клонування фрагментів ядерної ДНК
тютюну перед кодуючою послідовністю безпромоторного гена
неоміцинфосфотрансферази–ІІ (npt-II). Відібрано фрагменти, що ініціюють
транскрипцію в бактеріальних клітинах. Промоторну послідовність гена
малої субодиниці рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилази (rbcS-3A) отримано
шляхом її ампліфікації за допомогою полімеразної ланцюгової реакції.
Одержані послідовності проклоновано у плазмідних векторах. Рекомбинантні
плазміди, що містять ці фрагменти перед репортерними генами, введені в
клітини тютюну. Регуляторну активність та органоспецифічність доведено
за допомогою генів npt-II та хлорамфеніколацетилтрансферази (cat). В
сконструйовані вектори введено ген металотіонеїна. Показана підвищена
здатність трансгенних рослин до акумуляції іонів важких металів в
клітинах органів з експресією гена металотіонеїну, що вибірково
індукується досліджуваними промоторами.

Ключові слова: коренеспецифічна, світлозалежна експресія; вектор
експресії, rpS12, rbcS, металотіонеїн, трансгенні рослини.

Lioshina L.G. Cloning root-specific and light-dependent promoters of
genes of plant cells. – Manuscript.

Thesis for a candidate’s degree by specialty 03.00.20 – Biotechnology.
— Institute of Cell Biology and Genetic Engineering of National Academy
of Sciences of Ukraine, Kyiv,2006.

The regulator sequences, which ensuring root-specific and
light-dependent expression of chimerical genes in bacterial and plant
cells are received and investigated. The promoter, which has
root-specific properties, was selected in result of the cloning of
fragments nuclear DNA of tobacco, which are located forward of the
coding sequence of promoterless gene npt-II (neomycinphosphotransferase
II). Fragments which initiated transcription in bacterial cells were
selected. The promoter sequence of a gene of small subunit
ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase (rbc-3A) with the polymerase chain
reaction has been received. The received sequences are cloned in
plasmids vectors. Recombinant plasmids, which contain selected fragments
before reporter genes, are entered into tobacco cells. The regulatory
activity and organo-specific are proved with the help of npt-II and
chloramphenicolacetyltransferase genes (cat). The gene of
metallothioneine was introduced into constructed vector. The increased
ability of transgenic plants to accumulation of ions of heavy metals in
organ’s cells with selective promoter-induced expression of
metallothioneine gene has been demonstrated.

Key words: root-specific, light-dependent expression, vector of
expression, rpS12, rbcS, metallothionein, transgenic plants.

Лёшина Л.Г. Клонирование корнеспецифического и
светозависимого промоторов генов растений. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата
биологических наук по специальности 03.00.20 – биотехнология. — Институт
клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2006.

Диссертация посвящена клонированию и исследованию промоторных
последовательностей, способных направлять светозависимую и
органоспецифическую экспрессию подпромоторных структурных генов.

Клонированы фрагменты ядерной ДНК табака расположенные перед кодирующей
последовательностью беспромоторного гена неомицинфосфотрансферазы
(npt-II) и отобраны те, которые инициировали транскрипцию в
бактериальных клетках. Анализ нуклеотидной последовательности показал,
что один из клонируемых участков соответствует 3′-концевой части
хлоропластного гена рибосомного белка S12. Внутри фрагмента определены
участки, характерные для бактериальных и эукариотических промоторов,
цис-регуляторные последовательности для органоспецифической экспрессии и
точки инициации транскрипции для бактерий и эукариот. Рекомбинантная
плазмида, содержащая этот фрагмент перед npt-II-геном, введена в
протопласты табака методом прямого переноса генов. Отбор трансформантов
проводился по способности клеток расти на среде, содержащей
канамицин-сульфат. Анализ активности НФТ-II в трансгенных растениях
показал наибольшую экспрессию фермента в корнях, слабее в стебле и
практическое отсутствие ее в листьях. Созданный вектор, содержащий
генную конструкцию rpS12-cat-term, введен в протопласты табака методом
обработки ПЭГом. Дальнейший анализ активности
хлорамфениколацетилтрансферазы (ХАТ) в регенерированных растениях также
показал, что клонированный фрагмент имеет свойства промотора и может
самостоятельно инициировать экспрессию подпромоторного гена.

Для изучения светозависимой экспрессии клонирована и исследована
промоторная последовательность гена rbc-3A томату. Амплифицированный
промотор был встроен в плазмидный вектор перед cat-геном. С помощью
бинарного вектора конструкция перенесена в A. tumefaciens и затем в
N.tabacum путем трансформации листовых дисков. Анализ активности ХАТ
показал способность промотора направлять светозависимую экспрессию в
зеленой части растения. Для выявления минимального промотора и участков,
которые влияют на эффективность экспрессии, проведен делеционный анализ
клонированного фрагмента. Делеция до 785 п.о. 5′-концевого участка
промотора привела к резкому уменьшению экспрессии cat-гена по сравнению
с начальным промотором длиной 1075п.о. Дальнейшая делеция до 505 п.о.
привела к небольшому повышению экспрессии подпромоторного гена, фрагмент
длиной 205 п.о. показал практически полное отсутствие экспрессии в
трансформированных растениях, также как и в нетрансформированном
контроле.

Изучение растений, выращенных на свету и в темноте, показало, что
снижение экспрессии ХАТ в контрольных растениях под конститутивным
промотором 35SCaMV является следствием снижения общего метаболизма
растения, а не результатом специфической регуляции транскрипции, как в
случае с экспериментальными растениями, которые содержат ген cat под
исследуемым промотором.

Получены доказательства органоспецифической активности гена
металлотионеина (МТ) под клонированными нами промоторами. Для этого
синтезированный ген МТ, по сайту BamHI, встраивали в вектора: в рUC23t
под коренеспецифический промотор rpS12 и в pDL1 под светозависимый
промотор rbc-3А. С помощью Agrobacterium-опосредуемой трансформации
вектора вводили в растения. Полученные линии табака помещали на
среду MS, которая содержала разные концентрации CuSO4 и CdCl2.

Эксперимент показал, что все растения, трансформированные геном
металлотионеина, приобрели толерантность к повышенной концентрации
ионов тяжелых металлов в питательной среде. В зависимости от
эффективности экспрессии МТ гена наблюдалась селективное накопление
ионов тяжелых металлов в разных органах трансформантов.

Ключевые слова: корнеспецифическая, светозависимая экспрессия, вектор
экспрессии, rpS12, rbcS, металлотионеин, трансгенные растения.

PAGE 1

Похожие записи