.

Канали KV-групи інтернейронів культури клітин гіпокампа (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 2828
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

Григоров Олексій Олегович

УДК 577.352.5+612.822

Канали KV-групи інтернейронів культури клітин гіпокампа

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Федулова Світлана Анатоліївна

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України,

завідуюча лабораторією біофізики синаптичної передачі

Офіційні опоненти: академік НАН України,

доктор біологічних наук, професор

Магура Ігор Сильвестрович

Фізико-технічний навчально-науковий центр

НАН України,

професор кафедри молекулярної фізіології і біофізики

кандидат біологічних наук

Іванова Світлана Юріївна

Міжнародний центр молекулярної фізіології

НАН України,

науковий співробітник

Провідна установа: Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,

м. Київ

Захист відбудеться “05” червня 2007 р. о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології
ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: вул. Богомольця, 4, Київ
01024.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології

ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: вул. Богомольця, 4, Київ
01024.

Автореферат розісланий _28_ __квітня_____ 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-МарінаЗагальна характеристика
роботи

Актуальність теми. Однією з основних властивостей нервових клітин, що
забезпечує їх фізіологічну функцію, є електрична збудливість.
Найважливіша роль у регуляції збудливості належить різноманітним типам
потенціал-керованих каналів в сомі та відростках нейронів, не останнє
місце серед яких займають потенціал-залежні калієві канали. Вони
присутні у кожній збудливій клітині і являють собою найбільш
різноманітну відому групу трансмембранних протеїнів з дивовижною широтою
властивостей ADDIN REFMGR.CITE
Coetzee199949m>Molecular diversity of K+ channelsJournal49Molecular diversity of K+<br> channels<authors_primary>Coetzee,W.A.</authors_primary>Amarillo,Y.<authors_primary>Chiu,J.uthors_Primary><authors_primary>Chow,A.</authors_primary><authors_primar y>Lau,D.</authors_primar></authors_primary><authors_primary>McCormack,T.</authors_primary><authors_primary>Moreno,H.</authors_primary><authors_primary>Nadal,M.S.<br></authors_primary><authors_primary>Ozaita,A.</authors_primary><authors_p rimary>Pountney,D.<authors_primary>Saganich,M.s_Primary><authors_primary>Vega-Saenz,de<br> Miera</authors_primary><authors_primary>Rudy,B.</authors_primary><date_p rimary>1999/4/30<keywords>Alternative<br> Splicing</keywords><keywords>Animals</keywords><keywords>classification<keywords>Cloning,Molecular</keywords><keywords>Gene<br> Expression<br> Regulation</keywords><keywords>genetics</keywords><keywords>Humansords><keywords>Ion Channel Gating</keywords><keywords>Ion<br> Channels</keywords><keywords>Phylogeny</keywords><keywords>physiologyeywords><keywords>Potassium Channels</keywords><keywords>Protein<br> Conformation</keywords><keywords>Protein<br> Processing,Post-Translational</keywords><keywords>RNA<br> Editing</keywords><keywords>RNA,Messenger</keywords><keywords>Xenopuseywords><reprint>Not in<br> File</reprint><start_page>233</start_page><end_page>285</end_page><perio dical>Ann.N.Y.Acad.Sci.<volume><f name="Arial CYR">868</f></volume><zz_journalstdabbrev><f name="System">Ann.N.Y.Acad.Sci.</f></zz_journalstdabbrev><zz_workformid><br> 1</zz_workformid></perio></keywords></keywords></keywords></keywords></date_p></authors_primary></authors_p> (Coetzee et al., 1999) .

З електрофізіологічних досліджень відомо, що більшість нейронів ссавців
експресують набір різних типів потенціал-керованих калієвих каналів з
відмінними часовими та потенціал-залежними характеристиками.
Диференціальна їх експресія впливає на картину електричної активності
нейронів, на форму потенціалів дії, на вивільнення нейромедіатора і
синаптичну інтеграцію ADDIN REFMGR.CITE
Dolly1996121Molecular properties of voltage-gated K+ channelsJournal121Molecular properties of voltage-gated K+
channelsDolly,J.O.Parcej,D.N.1996/6imary>Amino Acid
Sequence
AnimalsBlotting,Wester
n
BrainBrain
Chemistry
chemistryGenesrds>Models,MolecularMolecular Sequence
Data
Molecular
Weight
NeurotoxinsPeptideswords>pharmacologyphysiologyPotassium ChannelsProtein
Conformation
ProteinsResearch
Support,Non-U.S.Gov't
Structure-Activity
Relationship
Not in
File
231253J.Bioenerg.Biomembr.283e>J.Bioenerg.Biomembr.1
Rudy1988 Year>619Diversity and ubiquity of K
channels
Journal619Diversity and ubiquity of K
channelsRudy,B.1988/6Action
Potentials
AnimalsBiophysicseywords>CalciumclassificationIon ChannelsMembrane
Potentials
metabolismNeuronseywords>pharmacokineticsphysiologyrds>PotassiumResearch
Support,U.S.Gov't,P.H.S.
Not in
File
729749Neuroscience.253Neuroscience.1Z_WorkformID>
(Dolly and Parcej, 1996; Rudy, 1988)
. Величезна кількість їх підтипів і неоднакове представництво в різних
збудливих клітинах обумовлюють великий сучасний інтерес в визначенні їх
функціональної ролі. Оскільки специфічний набір калієвих каналів
визначає особливості фізіологічної діяльності нейрону, то очевидно, що
питання їх розподілу в нервовій системі є одним з найбільш актуальних
питань нейрофізіології.

Гіпокамп – це, з одного боку, одна з ключових ланок в механізмі
формування емоцій та короткочасної пам’яті і забезпечення ритмічної
активності кори, а з іншого – зручний модельний об’єкт для вивчення
нейрональних взаємовідносин і роботи живих нейронних мереж. З’ясування
специфіки розподілу калієвих каналів на його збуджуючих та гальмівних
нейронах може пролити світло як на принципи організації і роботи
нервових структур взагалі, так і на особливості будови і функціонування
гіпокампа зокрема, що, в свою чергу, дозволить з’ясувати причини, що
лежать в основі порушень його діяльності.

За сучасними уявленнями гальмівні ГАМК-ергічні інтернейрони є ключовою
ланкою в формуванні специфічних для гіпокампа ритмів і виконують функцію
синхронізації роботи величезної мережі пірамідних нейронів. Але, на
відміну від пірамідних клітин, картина калієвих струмів і набір
потенціал-керованих калієвих каналів, властивих саме гальмівним
інтернейронам гіпокампа, на сьогодні виглядають досить туманними. Як
приклад можна навести відомості щодо каналів Kv7- (KCNQ-) родини,
генетичні порушення в функціонуванні яких є однією з причин епілепсії у
людини ADDIN REFMGR.CITE
Okada200242
Impaired M-current and neuronal excitabilityJournal42Impaired M-current and neuronal<br> excitability<authors_primary>Okada,M.</authors_primary>Wada,K.<authors_primary>Kamata,A.hors_Primary><authors_primary>Murakami,T.</authors_primary><authors_prim ary>Zhu,G.</authors_prim></authors_primary><authors_primary>Kaneko,S.</authors_primary><br><date_primary>2002</date_primary><keywords>Age<br> Factors</keywords><keywords>Animals</keywords><keywords>Bicucullinewords><keywords>Central Nervous System</keywords><keywords>Comparative<br> Study</keywords><keywords>Data<br> Interpretation,Statistical</keywords><keywords>drug<br> effects</keywords><keywords>Electroencephalography</keywords><keywords>E<br> pilepsy</keywords><keywords>Epilepsy,Benign<br> Neonatal</keywords><keywords>etiology</keywords><keywords>Excitatory<br> Amino Acid Antagonists</keywords><keywords>Excitatory Postsynaptic<br> Potentials</keywords><keywords>GABA<br> Antagonists</keywords><keywords>gamma-Aminobutyric<br> Acid</keywords><keywords>genetics</keywords><keywords>Hippocampusrds><keywords>Humans</keywords><keywords>Indoles</keywords><keywords>Inf<br> ant,Newborn</keywords><keywords>Male</keywords><keywords>metabolismwords><keywords>methods</keywords><keywords>Mice</keywords><keywords>Mic<br> e,Knockout</keywords><keywords>Microdialysis</keywords><keywords>Mutatio<br> n</keywords><keywords>Neurons</keywords><keywords>pharmacology</keywords><keywords>physiology</keywords><keywords>physiopathology</keywords><key words>Potassium Channel Blockers</key></keywords><keywords>Potassium<br> Channels</keywords><keywords>Pyridines</keywords><keywords>Quinoxalines<keywords>Rats</keywords><keywords>Rats,Wistar</keywords><keyw ords>Research<br> Support,Non-U.S.Gov't</keyw></keywords><keywords>Seizures</keywords><keywo rds>Synaptic Transmission</keywo></keywords><reprint>Not in<br> File</reprint><start_page>36</start_page><end_page>38</end_page><periodi cal>Epilepsia.<volume>43 Suppl<br> 9:36-8.</volume><zz_journalstdabbrev><f name="System">Epilepsia.</f></zz_journalstdabbrev><zz_workformid>1orkformID></zz_workformid></periodi></keywords>
Jentsch200024Neuronal KCNQ potassium channels: physiology
and role in disease
Journal24Neuronal KCNQ potassium channels: physiology and role in<br> disease<authors_primary>Jentsch,T.J.</authors_primary><d ate_primary>2000/10<keywords>Animals</keywords><keywords><br> Brain<br> Stem</keywords><keywords>Deafness</keywords><keywords>Epilepsy</keywords><keywords>Epilepsy,Benign<br> Neonatal</keywords><keywords>genetics</keywords><keywords>Hair<br> Cells</keywords><keywords>Hearing</keywords><keywords>Humans</keywords>Long QT<br> Syndrome<keywords>Mutation</keywords><keywords>physiologyywords><keywords>Potassium</keywords><keywords>Potassium<br> Channels</keywords><keywords>Potassium<br> Channels,Voltage-Gated</keywords><keywords>Protein<br> Isoforms</keywords><keywords>Research<br> Support,Non-U.S.Gov't</keywords><reprint>Not in<br> File</reprint><start_page>21</start_page><end_page>30</end_page><periodi cal>Nat.Rev.Neurosci.<volume>1</volume><issue>1</issue><zz_ journalstdabbrev><f name="System">Nat.Rev.Neurosci.</f><zz_workformid><br> 1</zz_workformid></zz_></periodi></keywords></d>
(Jentsch, 2000; Okada et al.,
2002) . Оскільки гіпокамп є однією з структур, що визначають ритмічну
активність верхніх ділянок головного мозку, а його гіперактивність
тісно пов’язана з порушеннями гальмівної ГАМК-ергічної передачі, то
дослідження наявності Kv7-каналів в його інтернейронах виглядає особливо
актуальним. Але експресія і функціонування цих каналів досить детально
вивчена лише в пірамідних клітинах гіпокампа ADDIN REFMGR.CITE
Shah200210Molecular correlates of the M-current in cultured rat hippocampal
neuronsJournal10Molecular correlates of the M-current in cultured rat<br> hippocampal<br> neurons<authors_primary>Shah,M.M.</authors_primary><auth ors_primary>Mistry,M.<authors_primary>Marsh,S.J.</authors_primary></auth>ors_Primary><authors_primary>Brown,D.A.</authors_primary><authors_primar y>Delmas,P.<date_primary>2002/10/1</date_primary><keyw ords>Animals<keywords>Cells,Cultured</keywords><keywords>Elec<br> tric Conductivity</keywords><keywords>Fluorescent Antibody<br> Technique</keywords><keywords>Hippocampus</keywords><keywords>Indoleseywords><keywords>Neurons</keywords><keywords>pharmacology</keywords><ke ywords>physiology</ke></keywords><keywords>Polymerase Chain<br> Reaction</keywords><keywords>Potassium Channel<br> Blockers</keywords><keywords>Potassium<br> Channels</keywords><keywords>Potassium<br> Channels,Voltage-Gated</keywords><keywords>Pyridines</keywords><keywords>Rats</keywords><keywords>Research<br> Support,Non-U.S.Gov't</keywords><keywords>Tetraethylammoniumrds><keywords>Tissue Distribution</keywords><reprint>Not in<br> File</reprint><start_page>29</start_page><end_page>37</end_page><periodi cal>J.Physiol<volume>544</volume><issue>Pt<br> 1</issue><zz_journalstdabbrev><f name="System">J.Physiol</f></zz_journalstdabbrev><zz_workformid>1rkformID></zz_workformid></periodi></keywords></keyw></authors_primar>
Cooper200117M channel KCNQ2 subunits are localized to key
sites for control of neuronal network oscillations and synchronization
in mouse brain
Journal17M channel KCNQ2 subunits are localized to key sites for control<br> of neuronal network oscillations and synchronization in mouse<br> brain<authors_primary>Cooper,E.C.</authors_primary><auth ors_primary>Harrington,E.<authors_primary>Jan,Y.N.thors_Primary><authors_primary>Jan,L.Y.</authors_primary><date_primary>2<br> 001/12/15</date_primary><keywords>Acetylcholine</keywords><keywords>Anim<br> als</keywords><keywords>Antibodies</keywords><keywords>Antibody<br> Specificity</keywords><keywords>Biological<br> Clocks</keywords><keywords>Brain</keywords><keywords>Cells,Culturedwords><keywords>Conserved<br> Sequence</keywords><keywords>cytology</keywords><keywords>Epilepsyords><keywords>Epilepsy,Benign<br> Neonatal</keywords><keywords>genetics</keywords><keywords>Hippocampuseywords><keywords>Humans</keywords><keywords>Immunohistochemistryrds><keywords>Kidney</keywords><keywords>Male</keywords><keywords>Membra<br> ne<br> Potentials</keywords><keywords>metabolism</keywords><keywords>Miceords><keywords>Mice,Inbred<br> C57BL</keywords><keywords>Mutation</keywords><keywords>Nerve<br> Net</keywords><keywords>Neurons</keywords><keywords>Organ<br> Specificity</keywords><keywords>Periodicity</keywords><keywords>pharmaco<br> logy</keywords><keywords>physiology</keywords><keywords>Potassiumrds><keywords>Potassium Channel Blockers</keywords><keywords>Potassium<br> Channels</keywords><keywords>Potassium<br> Channels,Voltage-Gated</keywords><keywords>Protein<br> Subunits</keywords><keywords>Research<br> Support,Non-U.S.Gov't</keywords><keywords>Research<br> Support,U.S.Gov't,P.H.S.</keywords><keywords>Transfection</keywords><reprint>Not in<br> File</reprint><start_page>9529</start_page><end_page>9540</end_page><per iodical>J.Neurosci.<volume>21</volume><issue>24</issue><zz_ journalstdabbrev><f name="System">J.Neurosci.</f><zz_workformid>1</zz_workformid></zz_>WorkformID></per></keywords></keywords></keywords></keywords></keywords></keywords></authors_primary></auth>
Yus-Najera2003r>23Localization of KCNQ5 in the normal and
epileptic human temporal neocortex and hippocampal
formation
Journal23Localization of KCNQ5 in the normal and epileptic human<br> temporal neocortex and hippocampal<br> formation<authors_primary>Yus-Najera,E.</authors_primary><authors_primary>Munoz,A.</authors_primary><authors_primary>Salvador,N.<br></authors_primary><authors_primary>Jensen,B.S.</authors_primary><authors _primary>Rasmussen,H.B.<authors_primary>Defelipe,J.uthors_Primary><authors_primary>Villarroel,A.</authors_primary><date_pri mary>2003<keywords>Adolescent</keywords><keywords>Adult Keywords><keywords>Aged</keywords><keywords>Blotting,Western</keywords>Cell<br> Line</keywords><keywords>chemistry</keywords><keywords>Comparative<br> Study</keywords><keywords>cytology</keywords><keywords>Epilepsys><keywords>Female</keywords><keywords>Fetus</keywords><keywords>Fluores<br> cent Antibody<br> Technique</keywords><keywords>genetics</keywords><keywords>Hippocampus Keywords><keywords>Humans</keywords><keywords>Immunohistochemistryords><keywords>immunology</keywords><keywords>Kidney</keywords><keywords>Male</keywords><keywords>metabolism</keywords><keywords>methodsds><keywords>Middle<br> Aged</keywords><keywords>Mutation</keywords><keywords>Neurons</keywords><br><keywords>pathology</keywords><keywords>Potassium<br> Channels</keywords><keywords>Potassium<br> Channels,Voltage-Gated</keywords><keywords>Precipitin<br> Tests</keywords><keywords>Recombinant Fusion<br> Proteins</keywords><keywords>Research<br> Support,Non-U.S.Gov't</keywords><keywords>Temporal<br> Lobe</keywords><keywords>Transfection</keywords><reprint>Not in<br> File</reprint><start_page>353</start_page><end_page>364</end_page><perio dical>Neuroscience<volume>120</volume><issue>2</issue><zz_j ournalstdabbrev><f name="System">Neuroscience</f><zz_workformid>1_WorkformID></zz_workformid></zz_j></perio></keywords></keywords></keywords></keywords></date_pri></authors_primary></authors>
Yue200676Axo-Somatic and Apical Dendritic Kv7/M Channels
Differentially Regulate the Intrinsic Excitability of Adult Rat CA1
Pyramidal Cells
Journal76Axo-Somatic and Apical Dendritic Kv7/M Channels Differentially<br> Regulate the Intrinsic Excitability of Adult Rat CA1 Pyramidal<br> Cells<authors_primary>Yue,C.</authors_primary><authors_p rimary>Yaari,Y.<date_primary>2006/6</date_primary><key words>Adult<keywords>Axons</keywords><keywords>Dendrites</keywords></key>words><keywords>Neurons</keywords><keywords>physiology</keywords><keywor ds>Pyramidal Cells<reprint>Not in<br> File</reprint><start_page>3480</start_page><end_page>3495</end_page><per iodical>J.Neurophysiol.<volume>95</volume><issue>6</issue><f name="System">J.Neurophysiol.</f><zz_workformid>1</zz_workformid></per></keywor></authors_p>
(Cooper et al., 2001; Shah et al.,
2002; Yue and Yaari, 2006; Yus-Najera et al., 2003) , і практично нема
робіт, присвячених дослідженню цього питання в ГАМК-ергічних нейронах.
Цей факт є одним з свідоцтв того, що, незважаючи на наявність окремих
даних, чіткої системи знань про притаманні гальмівним інтернейронам
гіпокампа калієві струми і відповідні набори потенціал-керованих
калієвих каналів на сьогодні не існує. Наша робота вносить деяку ясність
у це питання.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано
в рамках наукових проектів Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН
України “Дослідження молекулярних механізмів – проявів функціонування
геному, що зумовлюють специфічність діяльності фізіологічних систем
організму в нормі та патології” (Державний реєстраційний номер
0102U002472) і “Дослідження збуджуючої та гальмівної синаптичної
передачі центральних та периферичних нейронів в залежності від
функціональних властивостей їх пре- та постсинаптичних мембран” (Держ.
реєстр. № 0105U003232) та наукового проекту Міжнародного центру
молекулярної фізіології НАН України “Роль потенціал-керованих калієвих
каналів у викиді ГАМК в центральних нейронах” (Держ. реєстр.
№ 0103U003288).

Мета дослідження. Метою роботи було з’ясувати специфічний набір калієвих
каналів, що активуються при деполяризації клітинної мембрани,
притаманний ГАМК-ергічним нейронам культури клітин гіпокампа, встановити
участь цих каналів в забезпеченні електричної діяльності досліджуваних
нейронів і в регуляції гальмівної синаптичної передачі.

Завдання дослідження.

На гальмівних інтернейронах гіпокампа в умовах культури визначити
картину калієвих струмів, що активуються при деполяризації клітинної
мембрани.

Проаналізувати кінетичні і фармакологічні характеристики цих струмів і
за даними параметрами визначити типи калієвих каналів, що обумовлюють їх
формування.

З’ясувати ступінь участі різних потенціал-керованих калієвих каналів у
відповіді інтернейронів на деполяризацію.

Порівняти дані електрофізіологічних експериментів з результатами
імунологічних і молекулярно-біологічних дослідів.

Визначити участь типових для інтернейронів калієвих каналів в регуляції
їх електричної активності і вивільнення ГАМК синаптичними терміналями.

Наукова новизна одержаних результатів. В дисертаційній роботі описані
калієві струми гальмівних інтернейронів культури клітин гіпокампа, що
активуються при деполяризації нейрональної мембрани. Вперше показано, що
основним компонентом інтегрального калієвого струму соми інтернейронів є
струм, що не має інактивації. Показана експресія в ГАМК-ергічних
інтернейронах калієвих каналів Kv7-родини, а саме тих, які сформовані
Kv7.2-, Kv7.3- і Kv7.5-підтипами (-субодиниць. Виявлена різниця у
експресії цих субодиниць між інтернейронами і пірамідними клітинами
гіпокампа в умовах культури. Показано, що калієвий струм, який не має
інактивації, на гальмівних інтернейронах гіпокампа обумовлений роботою
каналів саме Kv7-родини. Показана наявність каналів Kv7-родини на
аксонах культивованих ГАМК-ергічних інтернейронів і здатність цих
каналів модулювати ГАМК-ергічну синаптичну передачу. Показано, що
калієві канали Kv2-, Kv3- та Kv4-родин мають лише незначний внесок у
інтегральний калієвий струм соми інтернейронів гіпокампа.

Отримані експериментальні дані суттєво доповнюють сучасні уявлення
стосовно механізмів роботи ГАМК-ергічних інтернейронів в ЦНС, а також
знання щодо функціонування різних підтипів калієвих каналів в нейронах
різних ділянок головного мозку ссавців.

Теоретичне та практичне значення отриманих результатів. Результати
дисертаційної роботи представляють передусім фундаментальний інтерес,
оскільки отримано нові дані стосовно розподілу калієвих каналів в ЦНС та
механізмів фізіологічної діяльності гальмівних інтернейронів гіпокампа.
Виявлений набір калієвих каналів, властивий інтернейронам гіпокампа, а
також встановлені фармакологічні властивості цих каналів можуть мати
суттєве значення для специфічної регуляції мозкової діяльності, зокрема
для ефективного лікування епілепсії. Робота є різнобічним науковим
дослідженням, в якому поєднано класичні та новітні електрофізіологічні,
імунологічні та молекулярно-біологічні підходи, що дозволило виявити і
детально охарактеризувати структури, які забезпечують селективну калієву
проникність плазматичної мембрани гальмівних інтернейронів.

Особистий внесок автора в отримання наукових результатів. Робота з
налагодження установки для електрофізіологічних досліджень та системи
локальної аплікації, електрофізіологічні та імуноцитохімічні досліди,
обробка експериментальних даних, аналіз та узагальнення результатів
досліджень була виконана особисто автором. Досліди із застосуванням
полімеразної ланцюгової реакції з одиничних інтернейронів гіпокампа
проводились при співучасті пров.н.с. Інституту фізіології ім. О. О.
Богомольця НАНУ д.м.н. Досенко В.Є. Досліди із застосуванням парної
реєстрації і стимуляції аксонів проводились при співучасті м.н.с.
Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАНУ к.б.н. Кравченко М.О.
Приготування первинної культури нейронів гіпокампа низької щільності
здійснювалось н.с. Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАНУ к.б.н.
Москалюк А.О. В розробці загальної концепції роботи, її обговоренні та
редагуванні брали участь співавтори публікацій.

Апробація результатів дисертації. Загальні положення роботи доповідались
на поточних наукових семінарах Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця
НАН України (Київ, 2006 р.), та наступних наукових конференціях:
Конференція для молодих вчених “Актуальні проблеми фармакології та
токсикології” (22 грудня 2005 р., Київ, Україна); ІІІ Всеукраїнська
наукова конференція “Психофізіологічні та вісцеральні функції в нормі і
патології” (4-6 жовтня 2006 р., Київ, Україна); ІV з’їзд Українського
біофізичного товариства (19-21 грудня 2006 р., Донецьк, Україна).

Публікації. Результати роботи опубліковано в 3 статтях у наукових
фахових журналах та тезах 3 доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, огляду
літератури, методів досліджень, результатів досліджень, обговорення
результатів, висновків та списку використаних джерел із 177 найменувань.
Роботу викладено на 141 сторінці та ілюстровано 38 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

У Вступі обґрунтовано актуальність дослідження потенціал-керованих
калієвих каналів в нервових структурах, зокрема в гіпокампі, ролі цих
каналів в забезпеченні функціонування нейронів і в модуляції синаптичної
передачі, сформульовано мету та задачі дослідження, наведено відомості
про наукову новизну, практичне значення та апробацію отриманих
результатів, публікацію матеріалів дисертації.

В розділі Огляд літератури розглянуті відомі на сьогодні
потенціал-керовані калієві канали, їх структура і функціонування,
розподіл в різних органах і тканинах організму, а також будова і функції
гіпокампа.

Для досягнення поставленої мети у розділі Методика досліджень описано
використані матеріали та методи досліджень, а саме:

приготування первинної культури дисоційованих нейронів гіпокампа низької
щільності;

методика фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина”;

методика парної реєстрації потенціалів і постсинаптичний струмів;

методика позаклітинної електричної стимуляції аксона нейрона;

методика локальної позаклітинної перфузії для аплікації фармакологічних
речовин;

методика імуноцитохімічного аналізу;

методика зворотної транскрипції і полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ
ПЛР);

статистична обробка отриманих результатів.

Приготування культури дисоційованих нейронів гіпокампа. Новонароджених
щурів лінії Вістар декапітували, гіпокамп виділяли та ферментативно
обробляли здійснювали 0,025%-м розчином трипсину (тип XII-S, “Sigma”,
США) при кімнатній температурі (21 / 24(С) протягом 5-6 хвилин. Після
механічної дисоціації клітини висівали на вкриті полі-L-орнітином та
ламініном (“Sigma”, США) чашки Петрі з щільністю 30000 од/см2. Клітини
культивувались у середовищі наступного складу: мінімальне середовище
Ігла, 10% кінської сироватки, 6 мкг/мл інсуліну, 2,3 мг/мл
бікарбонатного буферу NaHCO3, 25 од/мл натрієвої солі бензилпеніциліну
та 25 мкг/мл стрептоміцину сульфату в інкубаторі (“Jouan”, Франція) з
контрольованим вмістом двоокису вуглецю (5% СО2) і температурним режимом
(37(С) та постійним пасивним зволоженням. На третій день культивування
для пригнічення проліферації гліальних клітин в середовище додавали
5 мкмоль/л цитозин-?-D-арабіно-фуранозиду (“Sigma”, США). Повторна повна
заміна розчину для культивування проводилась через 20 / 24 години.

Електрофізіологічні експерименти проводились на нейронах, культивованих
протягом 18 / 28 днів, при кімнатній температурі

(20 / 23(С). На цей час клітини формували синаптичні контакти, також
можна було чітко ідентифікувати морфологічні типи клітин. У розгляд
брались бі- та мультиполярні клітини розміром 15-35 мкм. Нейрони
трикутної форми та всі клітини з трьома відростками виключались з
досліджень у зв’язку з можливою належністю їх до пірамідних нейронів.

Електрофізіологічні методи. Для вимірювання трансмембранних струмів, які
відводились від культивованих нейронів гіпокампа, було застосовано метод
фіксації потенціалу на обмеженій ділянці клітинної мембрани
(“patch-clamp”), який було описано Неєром та Сакманом ADDIN
REFMGR.CITE
Neher1976617Single-channel currents recorded from membrane of denervated
frog muscle fibres
Journal617Single-channel currents recorded from membrane of denervated
frog muscle
fibresNeher,E.Sakmann,B.1976/4/29ary>Acetylcholineanalogs &
derivatives
AnimalsCarbacholeywords>CholineElectric
Conductivity
In VitroMembrane
Potentials
Muscle
Denervation
Musclespharmacology
physiologyRana
pipiens
Research
Support,U.S.Gov't,Non-P.H.S.
Time
Factors
Not in
File
799802Nature2605554Nature1ormID>
Hamill1981228Improved patch-clamp techniques for high-resolution
current recording from cells and cell-free membrane patches
Journal228Improved patch-clamp techniques for high-resolution current
recording from cells and cell-free membrane
patchesHamill,O.P.Marty,A.Neher,E.rs_Primary>Sakmann,B.Sigworth,F.J.1981/8AcetylcholineAnimalsCattl
e
cytologyElectrophysiologyywords>embryologyFetusinstrumentationIon
Channels
MembranesMuscles
ords>Patch-Clamp
Techniques
pharmacologyphysiolo
gy
Rana
temporaria
RatsReceptors,Cholin
ergic
Support,Non-U.S.Gov'tTime FactorsNot in
File
85100Pflugers
Arch.3912PM:627062
9
Pflugers
Arch.
1
ite>
(Hamill et al., 1981; Neher and Sakmann, 1976) . Для всіх
досліджень обирались клітини, потенціал спокою яких був не позитивніший
за -40 мВ.

Режим фіксації потенціалу використовувався для реєстрації
потенціал-керованих калієвих струмів і постсинаптичних струмів. В
залежності від конкретної мети і від типів струмів, які необхідно було
ізолювати, застосовували різні протоколи підтримання мембранного
потенціалу і активації іонних каналів. Величина підтриманого потенціалу
коливалась в межах -110 / +60 мВ.

Режим фіксації струму використовувався для дослідження специфіки
викликаної електричної активності інтернейронів. Досліджуваний нейрон в
цьому режимі гіперполяризувався приблизно до –70 мВ. При фіксації струму
визначався потенціал спокою досліджуваних клітин і належність їх до
певних підтипів нейронів за здатністю генерувати потенціали дії. Серія
потенціалів дії викликалась деполяризуючим імпульсом струму тривалістю
500 мс. Амплітуда імпульсів поступово збільшувалась до досягнення такої,
при якій кількість потенціалів дії в викликаній серії була максимальною.

Для одночасної реєстрації ПД на пресинаптичній клітині і викликаних
постсинаптичних струмів на постсинаптичній використовувались методики
фіксації струму і потенціалу в режимі “ціла клітина” відповідно. Для
стимуляції пресинаптичної клітини і виклику в неї серії ПД
використовувався протокол стимуляції деполяризуючими імпульсами струму.
В постсинаптичній клітині при постійно підтримуваному потенціалі на
рівні -75 мВ реєструвались відповідні потенціалам дії постсинаптичні
струми.

Локальна електрична стимуляція проводилась за допомогою стимулятора з
ізольованим виходом ISO-Flex („AMPI”, Ізраїль). Стимуляційна
мікропіпетка з діаметром отвору близько 2 мкм виготовлялась за
технологією аналогічно піпеткам для реєстрації струмів. Викликані
постсинаптичні струми реєстрували при подразненні аксона серією
прямокутних імпульсів напруги негативної полярності тривалістю 1 мс
кожний. Частота стимуляції в серії становила 40 Гц, тривалість кожної
серії 500 мс, інтервал між серіями команд складав 5 с. Амплітуда напруги
на вході стимуляційної піпетки змінювалась в межах від 20 до 60 В.

Аплікація фармакологічних речовин здійснювалась за методикою швидкої
локальної перфузії ADDIN REFMGR.CITE
Veselovsky199657cNum>Fast local superfusion techniqueJournal57Fast local superfusion<br> technique<authors_primary>Veselovsky,N.S.ry><authors_primary>Engert,F.</authors_primary><authors_primary>Lux,H.D.<br></authors_primary><date_primary>1996/6</date_primary><keywords>Electroph<br> ysiology</keywords><keywords>Equipment<br> Design</keywords><keywords>instrumentation</keywords><keywords>methods Keywords><keywords>Neurons</keywords><keywords>Perfusion</keywords><keyw ords>physiology</keyw></keywords><keywords>Time Factors</keywords><reprint>Not<br> in<br> File</reprint><start_page>351</start_page><end_page>354</end_page><perio dical>Pflugers<br> Arch.<volume>432</volume><issue>2</issue>??????????????????<br> ??????????????????????????????????????????????????????????????</perio></authors_primary>

В експериментах використовувався зовнішньоклітинний розчин наступного
складу (ммоль/л): NaCl 140, KCl 3, CaCl2 2, MgCl2 2, Hepes 20, глюкоза
30. Внутрішньоклітинний розчин містив (ммоль/л): К-глюконат 100, KCl 50,
EGTA 10, MgCl2 5, HEPES 20. У зовнішньоклітинний розчин додавали
блокатори іонотропних глутаматних рецепторів NMDA- та не-NMDA-типів:
відповідно DL-2-аміно-5-фосфоновалеріанову кислоту (DL-AP5) и
6,7-динітрохіноксалін-2,3-діон (DNQX) у концентрації 20 мкмоль/л кожен.
При реєстрації потенціал-керованих калієвих струмів у перфузуючий розчин
включався 1 мкмоль/л тетродотоксину (TTX) для блокування натрієвих
каналів і 0,1 ммоль/л хлориду кадмію для блокування кальцієвих каналів.
Всі перераховані реактиви були виробництва „Sigma”, США. m
е_______________________________________________________________________
_____________________________________________________Заповнені розчином,
піпетки мали опір 4-6 МОм. Експериментальна установка була зібрана на
базі інвертованого мікроскопа Axiovert 200 („Carl Zeiss”, Німеччина),
який при використанні фазовоконтрастного об’єктиву забезпечував
400-кратне оптичне збільшення. В експериментах використовувався
підсилювач електричних сигналів Axopatch-200В („Axon Instruments”, США).
Сигнали відцифровувались та записувались за допомогою АЦП LabMaster TL-1
та програмного пакету pClamp 6.0 („Axon Instruments”, США) з частотою
дискретизації 10 кГц. Електричні сигнали, які відводились від нервових
клітин, піддавались фільтрації за допомогою високочастотного фільтру
Бесселя з частотою зрізу 5 кГц.

Імуноцитохімічне забарвлення проводилось за стандартною методикою
ADDIN REFMGR.CITE
Shah200210Molecular correlates of the M-current in cultured rat hippocampal
neuronsJournal10Molecular correlates of the M-current in cultured rat<br> hippocampal<br> neurons<authors_primary>Shah,M.M.</authors_primary><auth ors_primary>Mistry,M.<authors_primary>Marsh,S.J.</authors_primary></auth>ors_Primary><authors_primary>Brown,D.A.</authors_primary><authors_primar y>Delmas,P.<date_primary>2002/10/1</date_primary><keyw ords>Animals<keywords>Cells,Cultured</keywords><keywords>Elec<br> tric Conductivity</keywords><keywords>Fluorescent Antibody<br> Technique</keywords><keywords>Hippocampus</keywords><keywords>Indoleseywords><keywords>Neurons</keywords><keywords>pharmacology</keywords><ke ywords>physiology</ke></keywords><keywords>Polymerase Chain<br> Reaction</keywords><keywords>Potassium Channel<br> Blockers</keywords><keywords>Potassium<br> Channels</keywords><keywords>Potassium<br> Channels,Voltage-Gated</keywords><keywords>Pyridines</keywords><keywords>Rats</keywords><keywords>Research<br> Support,Non-U.S.Gov't</keywords><keywords>Tetraethylammoniumrds><keywords>Tissue Distribution</keywords><reprint>Not in<br> File</reprint><start_page>29</start_page><end_page>37</end_page><periodi cal>J.Physiol<volume>544</volume><issue>Pt<br> 1</issue><zz_journalstdabbrev><f name="System">J.Physiol</f></zz_journalstdabbrev><zz_workformid>1rkformID></zz_workformid></periodi></keywords></keyw></authors_primar>
(Shah et al., 2002) з використанням
антитіл (“Santa Cruz Biotechnology”, США), специфічних до
глутаматдекарбоксилази чи до досліджуваних підтипів калієвих каналів,
після того, як з нейронами був проведений ряд необхідних
електофізіологічних тестів. Ідентифікація забарвлених клітин на
зафіксованому препараті проводилось шляхом морфологічного порівняння
нейронів після забарвлення з їх фотографіями при електрофізіологічних
дослідах.

Зворотна транскрипція і полімеразна ланцюгова реакція були використані
для виявлення експресії каналів родини Kv7 в цілому гіпокампі, в
культурі нейронів гіпокампа і в одиничних культивованих гальмівних
інтернейронах культури гіпокампа за методом, детально описаним раніше
ADDIN REFMGR.CITE
Shah200210Molecular correlates of the M-current in cultured rat hippocampal
neuronsJournal10Molecular correlates of the M-current in cultured rat<br> hippocampal<br> neurons<authors_primary>Shah,M.M.</authors_primary><auth ors_primary>Mistry,M.<authors_primary>Marsh,S.J.</authors_primary></auth>ors_Primary><authors_primary>Brown,D.A.</authors_primary><authors_primar y>Delmas,P.<date_primary>2002/10/1</date_primary><keyw ords>Animals<keywords>Cells,Cultured</keywords><keywords>Elec<br> tric Conductivity</keywords><keywords>Fluorescent Antibody<br> Technique</keywords><keywords>Hippocampus</keywords><keywords>Indoleseywords><keywords>Neurons</keywords><keywords>pharmacology</keywords><ke ywords>physiology</ke></keywords><keywords>Polymerase Chain<br> Reaction</keywords><keywords>Potassium Channel<br> Blockers</keywords><keywords>Potassium<br> Channels</keywords><keywords>Potassium<br> Channels,Voltage-Gated</keywords><keywords>Pyridines</keywords><keywords>Rats</keywords><keywords>Research<br> Support,Non-U.S.Gov't</keywords><keywords>Tetraethylammoniumrds><keywords>Tissue Distribution</keywords><reprint>Not in<br> File</reprint><start_page>29</start_page><end_page>37</end_page><periodi cal>J.Physiol<volume>544</volume><issue>Pt<br> 1</issue><zz_journalstdabbrev><f name="System">J.Physiol</f></zz_journalstdabbrev><zz_workformid>1rkformID></zz_workformid></periodi></keywords></keyw></authors_primar>
(Shah et al., 2002) . Були використані
„інтрон-стягуючі” праймери, синтезовані таким чином, щоб вони
перекривали ділянки інтронів в нуклеотидній послідовності генів,
кодуючих Kv7.2 – Kv7.5 субодиниці рецепторів:

KCNQ2 (2900s): АГТГЦГГАТЦАГАГТЦТЦ;

KCNQ2 (3126a): ГТЦЦТГАТГЦТГАЦТТТГАГГЦ;

KCNQ3 (746s): ЦАГЦАААГААЦТЦАТЦАЦЦГ;

KCNQ3 (906a): АТГГТГГЦЦАГТГТГАТЦАГ;

KCNQ4 (40s): ЦЦЦТЦЦААГЦАГЦАТЦТГ;

KCNQ4 (420a): ТТГАТТЦГТЦЦЦАГЦАТГТЦТА;

KCNQ5 (995s): ГГААЦЦЦАГЦТГЦЦААЦЦТЦАТ;

KCNQ5 (1101a): ЦТТТЦТТГГТАГГГЦТГЦАГ.

Аналіз даних. Параметри калієвих і постсинаптичних струмів (амплітуда,
постійна часу інактивації) і потенціалів дії (частота, поріг виникнення,
тривалість) визначались за допомогою програмного пакету Clampfit 9.0
(„Axon Instruments”, США). Подальша обробка і представлення результатів,
включаючи статистичний аналіз, проводилась за допомогою електронних
таблиць Microsoft Excel („Microsoft”, США). Величини представлені в
тексті як “середнє значення” ± “середньоквадратична похибка середнього
(S.E.M.)”, після чого у дужках наведено розмір вибірки, за якою
проводилось усереднення. Для визначення статистичної достовірності
різниці між середніми значеннями двох груп даних було використано t-тест
Ст’юдента. Рівень значущості критерію на малюнках позначено наступним
чином: * P Brown198060
Muscarinic suppression of a novel voltage-sensitive K+ current
in a vertebrate neurone
Journal60Muscarinic suppression of a novel voltage-sensitive K+ current<br> in a vertebrate<br> neurone<authors_primary>Brown,D.A.</authors_primary><aut hors_primary>Adams,P.R.<date_primary>1980/2/14rimary><keywords>Acetylcholine</keywords><keywords>agonists</keywords><k eywords>Animals<keywords>Anura</keywords><keywords>drug<br> effects</keywords><keywords>Electric<br> Conductivity</keywords><keywords>Ganglia,Sympathetic</keywords><keywords>In<br> Vitro</keywords><keywords>Muscarine</keywords><keywords>Neuronss><keywords>pharmacology</keywords><keywords>physiology</keywords><keywo rds>Potassium</keywo></keywords><keywords>Rana<br> catesbeiana</keywords><keywords>Receptors,Cholinergic</keywords><keyword s>Receptors,Muscarinic<keywords>Research<br> Support,U.S.Gov't,P.H.S.</keywords><keywords>Tetraethylammonium<br> Compounds</keywords><reprint>Not in<br> File</reprint><start_page>673</start_page><end_page>676</end_page><perio dical>Nature.<volume>283</volume><issue>5748</issue><zz_jou rnalstdabbrev><f name="System">Nature.</f><zz_workformid>1formID></zz_workformid></zz_jou></perio></keyword></k></date_primary></aut>
(Brown and Adams, 1980) . На всіх
досліджених нейронах при тривалій деполяризації до –20 мВ виявлявся
вихідний струм, що мав амплітуду 100 / 500 пА ( REF _Ref142231083 \h
\* MERGEFORMAT Рис. 4 ). Його вольт-амперна характеристика мала
потенціал-залежний характер і показала потенціал його активації
приблизно –60 мВ ( REF _Ref142231083 \h \* MERGEFORMAT Рис. 4 ).
Деактиваційні криві цього струму добре апроксимувались двома
експонентами з постійними спаду 22(3,1 мс та 306(40 мс (n=32) при зміні
потенціалу від –20 до –50 мВ. За встановленими характеристиками
виявлений калієвий струм можна віднести до М-струму, який є результатом
активації каналів Kv7 (KCNQ) родини. Достовірної різниці у струмі без
інактивації між нейронами, що генерують ПД з високою та невисокою
частотою, не виявлено.

Рис. SEQ Рис. \* ARABIC 4 Калієвий струм інтернейронів гіпокампа, що
не має інактивації, зареєстрований від окремого інтернейрона (А)
(стрілкою позначений нульовий рівень струму, зверху показаний
деактиваційний протокол стимуляції) та усереднена вольт-амперна
характеристика струмів, що не мають інактивації, в інтернейронах
гіпокампа (Б) (струми нормовані за максимальною амплітудою, дані
представлені як середнє(довірчий інтервал, n=20)

Була перевірена дія на струм без інактивації селективних блокаторів
каналів Kv7-родини лінопірдину (ЛП) і XE991 та селективного активатора
Kv7-каналів ретигабіну (РТ).

Дію ЛП було досліджено на 16 нейронах, XE991 на 5 нейронах. Концентрації
блокаторів були підібрані такі, що приблизно у 10 разів перевищують
відомі концентрації половинного пригнічення для Kv7-каналів. Обидва
блокатори не спричиняли достовірного зменшення амплітуди вихідного
струму ( REF _Ref142244042 \h \* MERGEFORMAT Рис. 5 ). Збільшення
концентрації ЛП до 80 мкмоль/л також не призводило до появи ефекту.

Рис. SEQ Рис. \* ARABIC 5 Дія на струм, який не інактивується,
речовин, специфічних до каналів Kv7-родини. Зверху наведені приклади
записів струму в контролі (А), в присутності 50 мкмоль/л лінопірдину (Б)
та в присутності 15 мкмоль/л ретигабіну (В) (стрілками помічений
нульовий рівень струму). Знизу представлені вольт-амперні характеристики
струму в контролі ( ( ), в присутності ЛП ( ? ) чи РТ ( ? ) (Г, n=16),
в присутності XE991 ( ? )(Д,, n=5) та після відмивання ( ? ) (струми
нормовані за максимальною амплітудою в контролі, дані представлені як
середнє(довірчий інтервал).

Аплікація РТ у концентрації 15 мкмоль/л достовірно та зворотно зміщувала
вольт-амперну характеристику струму, що не має часової інактивації, до
більш негативних потенціалів. Амплітуда струму при потенціалі –20 мВ при
аплікації РТ зростала на 66(14% у порівнянні з контролем (n=16) ( REF
_Ref142244042 \h \* MERGEFORMAT Рис. 5 ). Оскільки такий вплив РТ є
відомим результатом його специфічної дії на Kv7-канали, це дозволило нам
стверджувати, що саме їх робота обумовлює наявність струму, що не має
інактивації, на гальмівних інтернейронах гіпокампа. Але нечутливість
цього струму до селективних блокаторів каналів Kv7-родини вимагало від
нас подальших досліджень з метою надійної ідентифікації типу калієвих
каналів, що відповідні за наявність зареєстрованого струму.

Імунофлуоресцентне забарвлення гальмівних інтернейронів культури клітин
гіпокампа на наявність Kv7.2-каналів. Імунофлуоресцентне забарвлення
показало, що кожен з 20 досліджених інтернейронів експресував калієві
канали Kv7.2-підтипу. При цьому забарвлення в більшому ступені
проявлялось на сомі клітин, а не на їх відростках, і його інтенсивність
дещо варіювала від нейрона до нейрона ( REF _Ref165152707 \h \*
MERGEFORMAT Рис. 6 ).

. Рис. SEQ Рис. \* ARABIC 6 Культивовані інтернейрони гіпокампа при
імунофлуоресцентному забарвленні на вміст Kv7.2-рецепторів. Зверху –
мікрофотографії інтернейронів, зняті в режимі фазового контрасту; знизу
– мікрофотографії тих самих клітин, які флуоресцують після забарвлення

Виявлення мРНК (-субодиниць Kv7-каналів в нейронах культури клітин
гіпокампа методом ЗТ ПЛР. Наступний метод, який був нами використаний
для дослідження Kv7-каналів в гіпокампі – це ЗТ ПЛР, за допомогою якого
ми встановлювали наявність матричних РНК (мРНК) Kv7.2, Kv7.3, Kv7.4 і
Kv7.5 субодиниць. Kv7.1 субодиниця була нами виключена з дослідження,
оскільки, як вважається, вона не властива нервовим структурам ADDIN
REFMGR.CITE
Barhanin1996117Num>K(V)LQT1 and lsK (minK) proteins associate to form the I(Ks)
cardiac potassium current
Journal117K(V)LQT1 and lsK (minK) proteins associate to form the I(Ks)
cardiac potassium
currentBarhanin,J.Lesage,F.Guillemare,E.Fink,M.Lazdunski,M.Romey,G.mary>1996/11/7Action
Potentials
Amino Acid
Sequence
AnimalsArrhythmiawords>Cation Transport ProteinsCell
Line
Cloning,MolecularCos
Cells
DNA-Binding
Proteins
Ether-A-Go-Go Potassium
Channels
geneticsHumansds>KCNQ Potassium ChannelsKCNQ1 Potassium
Channel
Long QT
Syndrome
metabolismMiceds>Molecular Sequence
Data
MyocardiumOocytess>Point
Mutation
PotassiumPotassium
Channels
Potassium
Channels,Voltage-Gated
Protein
Binding
ProteinsResearch
Support,Non-U.S.Gov't
Sequence Homology,Amino
Acid
Trans-ActivatorsTransfecti
on
XenopusNot in
File
7880Nature.3846604Nature.1formID>
Schroeder2000119A constitutively open potassium channel formed
by KCNQ1 and KCNE3
Journal119A constitutively open potassium channel formed by KCNQ1 and
KCNE3Schroeder,B.C.Waldegger,S.Fehr,S.uthors_Primary>Bleich,M.Warth,R.Greger,R.y>Jentsch,T.J.2000/1/13
Amino Acid
Sequence
AnimalsArrhythmiawords>Cloning,MolecularColonCyclic
AMP
ElectrochemistryGenesords>geneticsHumansI
ntestine,Small
KCNQ Potassium
Channels
KCNQ1 Potassium
Channel
metabolismMices>Molecular Sequence
Data
Mutationpharmacologyords>PotassiumPotassium
Channels
Potassium
Channels,Voltage-Gated
Proteins
Rats
Research
Support,Non-U.S.Gov't
RnaX
enopus
Not in
File
196199Nature.4036766Nature.1formID>
Delmas20057Pathways modulating neural KCNQ/M (Kv7) potassium
channels
Journal7Pathways modulating neural KCNQ/M (Kv7) potassium
channelsDelmas,P.Brown,D.A.2005/11mary>NeuronsphysiologyPotassiumPotassium
Channels
Not in
File
850862Nat.Rev.Neurosci.611Nat.Rev.Neurosci.
1
(Barhanin et al., 1996; Delmas
and Brown, 2005; Schroeder et al., 2000) .

ЗТ ПЛР цілого гіпокампа новонародженого і 21-денного щурів показав
наявність мРНК всіх чотирьох Kv7-субодиниць, що тестувались, хоча
кількість ПЛР-продукту Kv7.4-субодиниці була значно меншою в порівнянні
з іншими. Суттєвої різниці у експресії Kv7-субодиниць у гіпокампах
новонародженого і 21-денного щурів виявлено не було.

В сумарній РНК трьохтижневої культури нейронів гіпокампа щура також була
виявлена досить висока експресія Kv7.2, Kv7.3 і Kv7.5 субодиниць, але,
разом з тим, відсутність експресії Kv7.4 субодиниці.

Для виявлення експресії Kv7-каналів в одиничних гальмівних інтернейронах
кожна клітина, що обиралась для дослідження, спочатку бралась у
електрофізіологічний дослід, в якому визначалась її належність до
гальмівних інтернейронів, встановлювався тип її електричної активності і
реєструвались властиві їй потенціал-керовані калієві струми. По
закінченні електрофізіологічного досліду цитоплазма клітини вилучалась у
петч-піпетку і переносилась до пробірки з сумішшю для ЗТ, після чого з
нею проводилась вся послідовність реакцій ЗТ ПЛР.

У всіх 42 тестованих клітинах було показано високий рівень експресії
Kv7.2-субодиниці та дещо менший рівень експресії Kv7.3-субодиниці. У 16
з 42 клітин було виявлено експресію Kv7.5-субодиниці, але її рівень був
значно менший за рівень експресії Kv7.2- і Kv7.3-субодиниць. В жодному з
тестованих інтернейронів не було виявлено наявності мРНК
Kv7.4-субодиниці ( REF _Ref165153302 \h \* MERGEFORMAT Рис. 7 ).

Рис. SEQ Рис. \* ARABIC 7 Приклади продуктів полімеразної
ланцюгової реакції з восьми (1-8) одиничних гальмівних інтернейронів
культури гіпокампа. Для кожної клітини показано результат реакції на
виявлення наявності мРНК Kv7.2 (А), Kv7.3 (Б), Kv7.4 (В) та Kv7.5 (Г)
cубодиниць калієвих каналів.

Дія РТ на потенціал спокою гальмівних інтернейронів і на формування ними
потенціалів дії. Для того, щоб перевірити можливу участь Kv7-каналів у
формуванні мембраною інтернейронів потенціалів спокою та дії, була
перевірена дія РТ не тільки на струми, що не активуються, а і на
потенціали мембрани інтернейронів в умовах фіксації струму. Аплікація РТ
в концентрації 15 мкмоль/л достовірно (р(0,001) і зворотно змінювала
потенціал спокою будь-якого з досліджених нейронів на –11,7 ( 0,9 мВ
(n=16). Крім того, РТ суттєво зменшував кількість ПД в серії, що
виникала у відповідь на тривалий деполяризуючий поштовх струму ( REF
_Ref142328385 \h \* MERGEFORMAT Рис. 8 ). Цей ефект РТ також мав
зворотну дію і був справедливий як для інтернейронів, що генерували ПД з
високою частотою, так і для тих, що генерували ПД з невисокою частотою.
З метою виключення можливості того, що вплив РТ на генерацію ПД в наших
дослідах був пов’язаний з його дією на ГАМК-рецептори, на чотирьох
клітинах була перевірена сумісна дія аплікації РТ і селективного
блокатору ГАМК-рецепторів бікукуліну. Аплікація РТ на фоні бікукуліну
призводила до зменшення кількості ПД у викликаній серії, аналогічного до
дослідів з відсутнім ГАМК-блокатором.

Дія РТ на проведення ПД в аксонах гальмівних інтернейронів. Здатність
ретигабіну пригнічувати викликану серію ПД на інтернейронах гіпокампа
навела нас на думку, що ця його властивість може дозволити нам
встановити наявність KCNQ-каналів на аксонах гальмівних інтернейронів і
можливість їх участі в модуляції ГАМК-ергічної синаптичної передачі.

Рис. SEQ Рис. \* ARABIC 8 Серії ПД, викликані деполяризуючим
імпульсом струму, інтернейрона, що генерував ПД з високою частотою
(зверху) та інтернейрона, що генерував ПД з невисокою частотою (знизу) в
контролі (А), в присутності 15 мкмоль/л РТ (Б) та після відмивання (В).

Перший методичний підхід, який ми використовували – локальна аплікація
ретигабіну в умовах реєстрації потенціалів і струмів від двох синаптично
зв’язаних нейронів культури гіпокампа. При цьому на пресинаптичному
нейроні в умовах фіксації струму деполяризуючим імпульсом викликалась
серія ПД, а на постсинаптичному нейроні в умовах фіксації потенціалу
реєструвались відповідні ПД постсинаптичні струми. Пари нейронів були

Рис. SEQ Рис. \* ARABIC 9 Викликані серії ПД на пресинаптичному
інтернейроні та відповідні постсинаптичні струми на постсинаптичному
нейроні в контролі (А), в присутності 15 мкмоль/л РТ (Б) та після
відмивання (В). Зверху (1) – реєстрація при локальній аплікації на зону
пресинаптичного нейрона, знизу (2) – при локальній аплікації на зону
постсинаптичного нейрона.

підібрані таким чином, щоб аплікацію речовин можна було здійснювати
окремо або на сому пресинаптичного нейрона, або на дистальні частини
його аксону. Ідея полягала в тому, що якщо на дистальній частині аксону
присутні канали Kv7-родини, то їх активація ретигабіном, можливо, буде
запобігати розповсюдженню серії ПД. При цьому ми спостерігали б
повноцінну серію ПД на сомі пресинаптичного нейрона, але кількість
постсинаптичних відповідей на постсинаптичному нейроні була б значно
меншою. Дія ретигабіну була перевірена на 8 парах синаптично зв’язаних
клітин. Аплікація ретигабіну в концентрації 15 мкмоль/л на сому
пресинаптичної клітини, як і при реєстрації від однієї клітини, значно
зменшувала кількість ПД у викликаній серії, що відповідним чином
відображалось і на формі постсинаптичної відповіді ( REF _Ref142332703
\h \* MERGEFORMAT Рис. 9 ). Однак аплікація ретигабіну в концентрації
15 мкмоль/л на дистальну частину аксона пресинаптичного нейрона
достовірно не змінювала постсинаптичну відповідь ( REF _Ref142332703 \h
\* MERGEFORMAT Рис. 9 ).

Рис. SEQ Рис. \* ARABIC 10 Гальмівні постсинаптичні струми нейрона
гіпокампа у відповідь на локальну електричну стимуляцію аксону, що
приходить на цей нейрон, в контролі (А), в присутності 15 мкмоль/л РТ
(Б, В) та після відмивання (Г). Зверху наведений протокол стимуляції
аксону, вертикальні риски відповідають стимулам.

В іншому варіанті постановки досліду ми реєстрували ГАМК-ергічні
постсинаптичні струми в нейроні культури при локальній електричній
стимуляції аксону, який має синаптичні закінчення на сомі обраної
клітини. Зона аплікації речовин в цьому випадку захоплювала місце
локальної стимуляції. Частота стимулів в серії була підібрана досить
високою для того, щоб можна було візуалізувати ефект дії ретигабіну, але
така, щоб на кожний викликаний ПД можна було відокремити чітку
постсинаптичну відповідь. З використанням локальної електричної
стимуляції дія ретигабіну була перевірена на 5 нейронах культури клітин
гіпокампа. В контрольних умовах після кожного стимулу аксона
спостерігалась поява гальмівного постсинаптичного струму в мембрані
нейрона. При аплікації ж ретигабіну в концентрації 15 мкмоль/л і при
незмінних умовах стимуляції кількість постинаптичних струмів була
суттєво меншою завдяки появі тривалих пропусків відповідей на протязі
протоколу стимуляції. Цей ефект ретигабіну був зворотнім, після
відмивання кількість відповідей повністю відновлювалась. Амплітуда
першої постсинаптичної відповіді у серії в контролі і в присутності
ретигабіну залишалась незмінною ( REF _Ref143453056 \h \* MERGEFORMAT
Рис. 10 ).

Обговорення. Наші результати показали, що інтегральний
потенціал-керований калієвий струм, притаманний гальмівним інтернейронам
культури гіпокампа, є багатоскладовим, і в ньому виявляються принаймні
три компонента: струм зі швидкою інактивацією А-типу, струм затриманого
випрямлення і струм без інактивації, який за кінетичними параметрами
близький до М-струму.

Виміряний нами потенціал активації інтегральних калієвих струмів
гальмівних інтернейронів знаходився в районі –50 мВ. Виключаючи канали
зі швидкою інактивацією, можлива участь яких в формуванні калієвих
струмів інтернейронів гіпокампа буде обговорена нижче, такий потенціал
активації властивий калієвим каналам Kv1-родини, які мають повільну
інактивацію, та Kv7- (KCNQ-) родини, які не мають інактивації ADDIN
REFMGR.CITE
Coetzee199949m>Molecular diversity of K+ channelsJournal49Molecular diversity of K+<br> channels<authors_primary>Coetzee,W.A.</authors_primary>Amarillo,Y.<authors_primary>Chiu,J.uthors_Primary><authors_primary>Chow,A.</authors_primary><authors_primar y>Lau,D.</authors_primar></authors_primary><authors_primary>McCormack,T.</authors_primary><authors_primary>Moreno,H.</authors_primary><authors_primary>Nadal,M.S.<br></authors_primary><authors_primary>Ozaita,A.</authors_primary><authors_p rimary>Pountney,D.<authors_primary>Saganich,M.s_Primary><authors_primary>Vega-Saenz,de<br> Miera</authors_primary><authors_primary>Rudy,B.</authors_primary><date_p rimary>1999/4/30<keywords>Alternative<br> Splicing</keywords><keywords>Animals</keywords><keywords>classification<keywords>Cloning,Molecular</keywords><keywords>Gene<br> Expression<br> Regulation</keywords><keywords>genetics</keywords><keywords>Humansords><keywords>Ion Channel Gating</keywords><keywords>Ion<br> Channels</keywords><keywords>Phylogeny</keywords><keywords>physiologyeywords><keywords>Potassium Channels</keywords><keywords>Protein<br> Conformation</keywords><keywords>Protein<br> Processing,Post-Translational</keywords><keywords>RNA<br> Editing</keywords><keywords>RNA,Messenger</keywords><keywords>Xenopuseywords><reprint>Not in<br> File</reprint><start_page>233</start_page><end_page>285</end_page><perio dical>Ann.N.Y.Acad.Sci.<volume><f name="Arial CYR">868</f></volume><zz_journalstdabbrev><f name="System">Ann.N.Y.Acad.Sci.</f></zz_journalstdabbrev><zz_workformid><br> 1</zz_workformid></perio></keywords></keywords></keywords></keywords></date_p></authors_primary></authors_p>Passmore200311KCNQ/M currents in sensory neurons:
significance for pain therapy
Journal11KCNQ/M currents in sensory neurons: significance for pain<br> therapy<authors_primary>Passmore,G.M.</authors_primary>Selyanko,A.A.<authors_primary>Mistry,M<br> .</authors_primary><authors_primary>Al<br> Qatari,M.</authors_primary><authors_primary>Marsh,S.J.</authors_primary><br><authors_primary>Matthews,E.A.</authors_primary><authors_primary>Dickens<br> on,A.H.</authors_primary><authors_primary>Brown,T.A.</authors_primary><a uthors_primary>Burbidge,S.A.<authors_primary>Main,M. Authors_Primary><authors_primary>Brown,D.A.</authors_primary><date_prima ry>2003/8/6<keywords>Animals</keywords><keywords>Anthrace<br> nes</keywords><keywords>Anura</keywords><keywords>Carbamates</keywords>Cells,Cultured<keywords>Cho<br> Cells</keywords><keywords>cytology</keywords><keywords>Disease<br> Models,Animal</keywords><keywords>drug<br> effects</keywords><keywords>Epilepsy</keywords><keywords>Ganglia,Spinal<keywords>genetics</keywords><keywords>Hamsters</keywords><key words>Hyperalgesia</key></keywords><keywords>Indoles</keywords><keywords>Male<keywords>metabolism</keywords><keywords>Neurons</keywords><ke ywords>Neurons,Afferent</ke></keywords><keywords>Oocytes</keywords><keywords><br> Pain</keywords><keywords>Pain<br> Measurement</keywords><keywords>Patch-Clamp<br> Techniques</keywords><keywords>pharmacology</keywords><keywords>Phenylen<br> ediamines</keywords><keywords>physiopathology</keywords><keywords>Potass<br> ium Channel Blockers</keywords><keywords>Potassium<br> Channels</keywords><keywords>Pyridines</keywords><keywords>Ratss><keywords>Rats,Sprague-Dawley</keywords><keywords>Research<br> Support,Non-U.S.Gov't</keywords><keywords>Reverse Transcriptase<br> Polymerase Chain<br> Reaction</keywords><keywords>therapy</keywords><keywords>Transfectioneywords><reprint>Not in<br> File</reprint><start_page>7227</start_page><end_page>7236</end_page><per iodical>J.Neurosci.<volume>23</volume><issue>18</issue><zz_ journalstdabbrev><f name="System">J.Neurosci.</f><zz_workformid>1</zz_workformid></zz_>WorkformID></per></keywords></keywords></date_prima></authors_primary></a>
(Coetzee et al., 1999; Passmore et
al., 2003) . Наша задача стояла в тому, щоб відокремити внесок в
сумарний струм каналів Kv1- і Kv7-родин, що ми зробили за допомогою
(DTX, який в наномолярних концентраціях є селективним блокатором
Kv1-каналів ADDIN REFMGR.CITE
Robertson1996645cNum>Novel effects of dendrotoxin homologues on subtypes of
mammalian Kv1 potassium channels expressed in Xenopus
oocytes
Journal645Novel effects of dendrotoxin homologues on subtypes of
mammalian Kv1 potassium channels expressed in Xenopus
oocytesRobertson,B.Owen,D.Stow,J.s_Primary>Butler,C.N
ewland,C.
1996/3/25AnimalsBrainChromatography,
High Pressure
Liquid
Cloning,Moleculardrug
effects
Elapid
Venoms
Electrophysiologygenetic
s
HumansIon Channel
Gating
KineticsKv1.1 Potassium
Channel
Kv1.2 Potassium
Channel
metabolismNeurotoxins Keywords>OocytesPatch-Clamp
Techniques
Peptidespharmacology
PotassiumPotassium Channel
Blockers
Potassium
Channels
Potassium
Channels,Voltage-Gated
RatsXeno
pus
Xenopus laevisNot in
File
2630FEBS
Lett.3831-2FEBS
Lett.
1
ite>Tytgat1995646The alpha-dendrotoxin footprint on a mammalian potassium
channelJournal646The alpha-dendrotoxin footprint on a mammalian potassium
channelTytgat,J.Debont,T.Carmeliet,E.thors_Primary>Daenens,P.1995/10Amino Acid
Sequence
analysisAnimalsrds>Binding SitesElapid
Venoms
FemaleKv1.1 Potassium
Channel
metabolismMolecular
Sequence
Data
MutationOocytes
pharmacologyphysiologyPotassium
Potassium Channel
Blockers
Potassium
Channels
Xenopus laevisNot in
File
2477624781

J.Biol.Chem.27042
J.Biol.Chem.1_WorkformID>

Scott1994647Antibodies specific for distinct Kv subunits
unveil a heterooligomeric basis for subtypes of
alpha-dendrotoxin-sensitive K+ channels in bovine brain
Journal647Antibodies specific for distinct Kv subunits unveil a
heterooligomeric basis for subtypes of alpha-dendrotoxin-sensitive K+
channels in bovine
brainScott,V.E.Muniz,Z.M.Sewing,S.rs_Primary>Lichtinghagen,R.Parcej,D.N.Pongs,O.rimary>Dolly,J.O.1994/2
/22
AnimalsAntibodiesords>Antibodies,MonoclonalBase
Sequence
Blotting,WesternBrainBrain ChemistryBrain
Stem
CattleCerebellumCerebral
Cortex
chemistryComparative
Study
Corpus
Striatum
DNA,ComplementaryElapi
d
Venoms
Hippocampusimmunologyeywords>Immunosorbent
Techniques
Macromolecular
Substances
Molecular Sequence
Data
pharmacologyPotassium
Channels
ProteinsRecombinant
Fusion Proteins
Research
Support,Non-U.S.Gov't
Tissue
Distribution
Not in
File
16171623Biochemistry.337Biochemistry.1Z_WorkformID>
(Robertson et al., 1996; Scott et
al., 1994; Tytgat et al., 1995) . Наші досліди з використанням цього
блокатора в концентрації 100 нмоль/л і 1 мкмоль/л не дозволили нам
виявити жодних компонентів, зі швидкою чи повільною інактивацією,
чутливих до (DTX. З останнього можна зробити висновок про відсутність
Kv1-каналів на сомах ГАМК-ергічних нейронів гіпокампа, що є першою
виявленою відмінністю між гіпокампальними принциповими і гальмівними
нейронами. Примітно, що відсутність каналів Kv1-родини не є загальною
рисою ГАМК-ергічних інтернейронів головного мозку, оскільки, наприклад,
є свідоцтва про блокуючий вплив (DTX на ГАМК-ергічну передачу в нейронах
енторинальної кори ADDIN REFMGR.CITE
Cunningham2001659ecNum>Dendrotoxin sensitive potassium channels modulate GABA but
not glutamate release in the rat entorhinal cortex in vitro
Journal659Dendrotoxin sensitive potassium channels modulate GABA but not
glutamate release in the rat entorhinal cortex in
vitroCunningham,M.O.Jones,R.S.2001mary>AnimalsAnticonvulsantsdrug effectsElapid
Venoms
Entorhinal
Cortex
Excitatory Postsynaptic
Potentials
gamma-Aminobutyric
Acid
Glutamic AcidIn
Vitro
Malemetabolism
Neural
Inhibition
NeurotoxinsPeptidesPerfusionpharmacologyPhenytoinphysiology
Potassium
Potassium
Channels
RatsRats,Wistarrds>SynapsesSynaptic
Transmission
TetrodotoxinNot in
File
395404Neuroscience.1073Neuroscience.1Z_WorkformID>
(Cunningham and Jones, 2001) .

З претендентів на проведення струму затриманого випрямлення в
досліджуваних нами клітинах залишились канали Kv2- і Kv3-родин.
Потенціал активації цих каналів знаходиться в районі –20 / –10 мВ
ADDIN REFMGR.CITE
Coetzee199949m>Molecular diversity of K+ channelsJournal49Molecular diversity of K+<br> channels<authors_primary>Coetzee,W.A.</authors_primary>Amarillo,Y.<authors_primary>Chiu,J.uthors_Primary><authors_primary>Chow,A.</authors_primary><authors_primar y>Lau,D.</authors_primar></authors_primary><authors_primary>McCormack,T.</authors_primary><authors_primary>Moreno,H.</authors_primary><authors_primary>Nadal,M.S.<br></authors_primary><authors_primary>Ozaita,A.</authors_primary><authors_p rimary>Pountney,D.<authors_primary>Saganich,M.s_Primary><authors_primary>Vega-Saenz,de<br> Miera</authors_primary><authors_primary>Rudy,B.</authors_primary><date_p rimary>1999/4/30<keywords>Alternative<br> Splicing</keywords><keywords>Animals</keywords><keywords>classification<keywords>Cloning,Molecular</keywords><keywords>Gene<br> Expression<br> Regulation</keywords><keywords>genetics</keywords><keywords>Humansords><keywords>Ion Channel Gating</keywords><keywords>Ion<br> Channels</keywords><keywords>Phylogeny</keywords><keywords>physiologyeywords><keywords>Potassium Channels</keywords><keywords>Protein<br> Conformation</keywords><keywords>Protein<br> Processing,Post-Translational</keywords><keywords>RNA<br> Editing</keywords><keywords>RNA,Messenger</keywords><keywords>Xenopuseywords><reprint>Not in<br> File</reprint><start_page>233</start_page><end_page>285</end_page><perio dical>Ann.N.Y.Acad.Sci.<volume><f name="Arial CYR">868</f></volume><zz_journalstdabbrev><f name="System">Ann.N.Y.Acad.Sci.</f></zz_journalstdabbrev><zz_workformid><br> 1</zz_workformid></perio></keywords></keywords></keywords></keywords></date_p></authors_primary></authors_p> (Coetzee et al., 1999) . Той
факт, що потенціал активації інтегрального струму в наших дослідах
знаходився в районі –50 мВ, а не зсувався до більш позитивних значень, і
відсутність суттєвого перегину вольт-амперних кривих сумарного струму в
районі –20 / –10 мВ, говорив про те, що внесок Kv2- і/або Kv3-каналів не
міг бути значним. Збільшення тривалості деполяризуючого стимулу в
протоколі стимуляції з 200 мс до 6,5 с виявило в інтегральному калієвому
струмі інтернейронів компонент з повільною інактивацією. Постійна часу
інактиваційного спаду цього компонента дорівнювала в середньому 3 с, що,
виключаючи канали Kv1-родини, є характерним для каналів Kv2- та
Kv3-родин ADDIN REFMGR.CITE
Coetzee199949m>Molecular diversity of K+ channelsJournal49Molecular diversity of K+<br> channels<authors_primary>Coetzee,W.A.</authors_primary>Amarillo,Y.<authors_primary>Chiu,J.uthors_Primary><authors_primary>Chow,A.</authors_primary><authors_primar y>Lau,D.</authors_primar></authors_primary><authors_primary>McCormack,T.</authors_primary><authors_primary>Moreno,H.</authors_primary><authors_primary>Nadal,M.S.<br></authors_primary><authors_primary>Ozaita,A.</authors_primary><authors_p rimary>Pountney,D.<authors_primary>Saganich,M.s_Primary><authors_primary>Vega-Saenz,de<br> Miera</authors_primary><authors_primary>Rudy,B.</authors_primary><date_p rimary>1999/4/30<keywords>Alternative<br> Splicing</keywords><keywords>Animals</keywords><keywords>classification<keywords>Cloning,Molecular</keywords><keywords>Gene<br> Expression<br> Regulation</keywords><keywords>genetics</keywords><keywords>Humansords><keywords>Ion Channel Gating</keywords><keywords>Ion<br> Channels</keywords><keywords>Phylogeny</keywords><keywords>physiologyeywords><keywords>Potassium Channels</keywords><keywords>Protein<br> Conformation</keywords><keywords>Protein<br> Processing,Post-Translational</keywords><keywords>RNA<br> Editing</keywords><keywords>RNA,Messenger</keywords><keywords>Xenopuseywords><reprint>Not in<br> File</reprint><start_page>233</start_page><end_page>285</end_page><perio dical>Ann.N.Y.Acad.Sci.<volume><f name="Arial CYR">868</f></volume><zz_journalstdabbrev><f name="System">Ann.N.Y.Acad.Sci.</f></zz_journalstdabbrev><zz_workformid><br> 1</zz_workformid></perio></keywords></keywords></keywords></keywords></date_p></authors_primary></authors_p> (Coetzee et al., 1999) . Але, як
нами і очікувалось, виявлений компонент з інактивацією складав в
середньому 17% від амплітуди сумарного струму, більшу ж частину струму
складав постійний компонент, що не мав інактивації.

Багатьма авторами показано, що однією з особливостей інтернейронів є
висока експресія каналів Kv3-родини, які вважаються необхідною умовою
для здатності клітин до високочастотної генерації ПД і найбільш
притаманні парвальбумін-вмісним інтернейронам ADDIN REFMGR.CITE
Martina199831m>Functional and molecular differences between voltage-gated K+
channels of fast-spiking interneurons and pyramidal neurons of rat
hippocampus
Journal31Functional and molecular differences between voltage-gated K+<br> channels of fast-spiking interneurons and pyramidal neurons of rat<br> hippocampus<authors_primary>Martina,M.</authors_primary><br><authors_primary>Schultz,J.H.</authors_primary><authors_primary>Ehmke,H.<br></authors_primary><authors_primary>Monyer,H.</authors_primary><authors_p rimary>Jonas,P.<date_primary>1998/10/15</date_primary><br><keywords>4-Aminopyridine</keywords><keywords>Action<br> Potentials</keywords><keywords>analysis</keywords><keywords>Animalswords><keywords>chemistry</keywords><keywords>Comparative<br> Study</keywords><keywords>cytology</keywords><keywords>drug<br> effects</keywords><keywords>Electric<br> Stimulation</keywords><keywords>gamma-Aminobutyric<br> Acid</keywords><keywords>Gene<br> Expression</keywords><keywords>genetics</keywords><keywords>Hippocampus<keywords>Interneurons</keywords><keywords>Ion Channel<br> Gating</keywords><keywords>metabolism</keywords><keywords>Neuronsrds><keywords>Neuropeptides</keywords><keywords>Organ Culture<br> Techniques</keywords><keywords>Patch-Clamp<br> Techniques</keywords><keywords>pharmacology</keywords><keywords>Phenotyp<br> e</keywords><keywords>physiology</keywords><keywords>Potassium</keywords><keywords>Potassium Channels</keywords><keywords>Potassium<br> Channels,Voltage-Gated</keywords><keywords>Pyramidal<br> Cells</keywords><keywords>Rats</keywords><keywords>Rats,Wistar</keywords><keywords>Research<br> Support,Non-U.S.Gov't</keywords><keywords>Reverse Transcriptase<br> Polymerase Chain<br> Reaction</keywords><keywords>RNA,Messenger</keywords><keywords>Tetraethy<br> lammonium</keywords><keywords>Transcription,Genetic</keywords><reprint>N<br> ot in<br> File</reprint><start_page>8111</start_page><end_page>8125</end_page><per iodical>J.Neurosci.<volume>18</volume><issue>20</issue><zz_ journalstdabbrev><f name="System">J.Neurosci.</f><zz_workformid>1</zz_workformid></zz_>WorkformID></per></keywords></keywords></keywords></authors_p>
Lien200322Kv3 potassium conductance is necessary and
kinetically optimized for high-frequency action potential generation in
hippocampal interneurons
Journal22Kv3 potassium conductance is necessary and kinetically<br> optimized for high-frequency action potential generation in hippocampal<br> interneurons<authors_primary>Lien,C.C.</authors_primary><br><authors_primary>Jonas,P.</authors_primary><date_primary>2003/3/15_Primary><keywords>4-Aminopyridine</keywords><keywords>Action<br> Potentials</keywords><keywords>Animals</keywords><keywords>cytologywords><keywords>drug effects</keywords><keywords>Electric<br> Stimulation</keywords><keywords>Hippocampus</keywords><keywords>In<br> Vitro</keywords><keywords>Interneurons</keywords><keywords>Ion Channel<br> Gating</keywords><keywords>Kinetics</keywords><keywords>metabolismords><keywords>methods</keywords><keywords>Models,Neurological</keywords><keywords>Neurons</keywords><keywords>Patch-Clamp<br> Techniques</keywords><keywords>pharmacology</keywords><keywords>Phenotyp<br> e</keywords><keywords>physiology</keywords><keywords>Potassium</keywords><keywords>Potassium Channel Blockers</keywords><keywords>Potassium<br> Channels</keywords><keywords>Potassium<br> Channels,Voltage-Gated</keywords><keywords>Rats</keywords><keywords>Rats<br> ,Wistar</keywords><keywords>Research<br> Support,Non-U.S.Gov't</keywords><keywords>Sensory<br> Thresholds</keywords><keywords>Signal<br> Processing,Computer-Assisted</keywords><keywords>Tetraethylammoniumwords><reprint>Not in<br> File</reprint><start_page>2058</start_page><end_page>2068</end_page><per iodical>J.Neurosci.<volume>23</volume><issue>6</issue><zz_j ournalstdabbrev><f name="System">J.Neurosci.</f><zz_workformid>1WorkformID></zz_workformid></zz_j></per></keywords></keywords></keywords></date_primary>
Tansey2002499Developmental expression of potassium-channel
subunit Kv3.2 within subpopulations of mouse hippocampal inhibitory
interneurons
Journal499Developmental expression of potassium-channel subunit Kv3.2
within subpopulations of mouse hippocampal inhibitory
interneuronsTansey,E.P.y>Chow,A.Rudy,B.thors_Primary>McBain,C.J.2002analysisAnimalswords>Biological
Markers
Blotting,Westernchemist
ry
cytologyDendrites
gamma-Aminobutyric AcidGene Expression
Regulation,Developmental
geneticsgrowth &
development
HippocampusImmunobl
otting
ImmunohistochemistryInte
rneurons
KineticsMiceMice,Inbred C57BLNeural
Inhibition
NeuropeptidesNitric
Oxide
ParvalbuminsPhenotypeywords>physiologyPotassiumPotassium ChannelsPotassium
Channels,Voltage-Gated
Research
Support,U.S.Gov't,Non-P.H.S.
Research
Support,U.S.Gov't,P.H.S.
Shaw Potassium
Channels
SomatostatinNot in
File
137148Hippocampus.122Hippocampus.1_WorkformID>
(Lien and Jonas, 2003; Martina et
al., 1998; Tansey et al., 2002) . Опираючись на ці дані, можна
припустити, що за виявлений в наших експериментах компонент калієвого
струму з повільною інактивацію в інтернейронах, які були здатні
генерувати ПД з високою частотою, відповідали канали саме Kv3-родини. З
іншого боку, досліджені нами інтернейрони, які генерували ПД з невеликою
частотою, також мали компонент струму з повільною інактивацією, при чому
нами не було помічено достовірної різниці в кінетиці інтегральних
струмів між нейронами з різним типом генерації ПД. Можливо, в
інтернейронах гіпокампа, які не здатні генерувати ПД з високою частотою,
за струм затриманого випрямлення відповідають Kv2-канали, оскільки вони
близькі за кінетикою інактивації до Kv3-каналів, а останні вважаються
невластивими для даних клітин.

Досліди з відокремленням струму зі швидкою інактивацією А-типу показали
його наявність на всіх досліджених нами клітинах, але його амплітуда
виявилась досить мала в порівнянні з сумарними калієвими струмами: вона
складала в середньому 9,4(1,3% від сумарного струму, що корелює з
результатами інших авторів ADDIN REFMGR.CITE
Chikwendu199655Num>Two temporally overlapping "delayed-rectifiers"
determine the voltage-dependent potassium current phenotype in cultured
hippocampal interneurons
Journal55Two temporally overlapping "delayed-rectifiers"<br> determine the voltage-dependent potassium current phenotype in cultured<br> hippocampal<br> interneurons<authors_primary>Chikwendu,A.ry><authors_primary>McBain,C.J.</authors_primary><date_primary>1996/9ate_Primary><keywords>4-Aminopyridine</keywords><keywords>Animalsrds><keywords>Animals,Newborn</keywords><keywords>Cells,Culturedds><keywords>cytology</keywords><keywords>drug<br> effects</keywords><keywords>Electrophysiology</keywords><keywords>gamma-<br> Aminobutyric<br> Acid</keywords><keywords>genetics</keywords><keywords>Hippocampusrds><keywords>Immunohistochemistry</keywords><keywords>In<br> Vitro</keywords><keywords>Interneurons</keywords><keywords>Ion Channel<br> Gating</keywords><keywords>Kinetics</keywords><keywords>Membrane<br> Potentials</keywords><keywords>Neuroglia</keywords><keywords>Neuronsywords><keywords>pharmacology</keywords><keywords>Phenotype</keywords><k eywords>physiology</k></keywords><keywords>Potassium</keywords><keywords>Pot<br> assium<br> Channels</keywords><keywords>Rats</keywords><keywords>Rats,Sprague-Dawle<br> y</keywords><keywords>Tetraethylammonium</keywords><keywords>Tetraethyla<br> mmonium Compounds</keywords><reprint>Not in<br> File</reprint><start_page>1477</start_page><end_page>1490</end_page><per iodical>J.Neurophysiol.<volume>76</volume><issue>3</issue><f name="System">J.Neurophysiol.</f><zz_workformid>1</zz_workformid></per></keywords></keywords></keywords></date_primary></authors_primary>
Fan1996110Selective expression of transient outward
currents in different types of acutely isolated hippocampal
interneurons
Journal110Selective expression of transient outward currents in
different types of acutely isolated hippocampal
interneuronsFan,S.H.Wong,R.K.1996/11rimary>AnimalsGuinea
Pigs
HippocampusInterneuronseywords>Membrane
Potentials
NeuronsPatch-Clamp
Techniques
pharmacologyphysiolo
gy
Pyramidal CellsResearch
Support,U.S.Gov't,P.H.S.
Not in
File
35633567J.Neurophysiol.765J.Neurophysiol.1
(Chikwendu and McBain, 1996; Fan
and Wong, 1996) . Цей факт виявляє чергову суттєву відмінність між
пірамідними нейронами гіпокампа і ГАМК-ергічними інтернейронами: в
пірамідних нейронах А-струм складає біля 50% сумарного вихідного струму
при деполяризації ADDIN REFMGR.CITE
Martina199831m>Functional and molecular differences between voltage-gated K+
channels of fast-spiking interneurons and pyramidal neurons of rat
hippocampus
Journal31Functional and molecular differences between voltage-gated K+<br> channels of fast-spiking interneurons and pyramidal neurons of rat<br> hippocampus<authors_primary>Martina,M.</authors_primary><br><authors_primary>Schultz,J.H.</authors_primary><authors_primary>Ehmke,H.<br></authors_primary><authors_primary>Monyer,H.</authors_primary><authors_p rimary>Jonas,P.<date_primary>1998/10/15</date_primary><br><keywords>4-Aminopyridine</keywords><keywords>Action<br> Potentials</keywords><keywords>analysis</keywords><keywords>Animalswords><keywords>chemistry</keywords><keywords>Comparative<br> Study</keywords><keywords>cytology</keywords><keywords>drug<br> effects</keywords><keywords>Electric<br> Stimulation</keywords><keywords>gamma-Aminobutyric<br> Acid</keywords><keywords>Gene<br> Expression</keywords><keywords>genetics</keywords><keywords>Hippocampus<keywords>Interneurons</keywords><keywords>Ion Channel<br> Gating</keywords><keywords>metabolism</keywords><keywords>Neuronsrds><keywords>Neuropeptides</keywords><keywords>Organ Culture<br> Techniques</keywords><keywords>Patch-Clamp<br> Techniques</keywords><keywords>pharmacology</keywords><keywords>Phenotyp<br> e</keywords><keywords>physiology</keywords><keywords>Potassium</keywords><keywords>Potassium Channels</keywords><keywords>Potassium<br> Channels,Voltage-Gated</keywords><keywords>Pyramidal<br> Cells</keywords><keywords>Rats</keywords><keywords>Rats,Wistar</keywords><keywords>Research<br> Support,Non-U.S.Gov't</keywords><keywords>Reverse Transcriptase<br> Polymerase Chain<br> Reaction</keywords><keywords>RNA,Messenger</keywords><keywords>Tetraethy<br> lammonium</keywords><keywords>Transcription,Genetic</keywords><reprint>N<br> ot in<br> File</reprint><start_page>8111</start_page><end_page>8125</end_page><per iodical>J.Neurosci.<volume>18</volume><issue>20</issue><zz_ journalstdabbrev><f name="System">J.Neurosci.</f><zz_workformid>1</zz_workformid></zz_>WorkformID></per></keywords></keywords></keywords></authors_p>
Birnbaum2004
96Structure and function of Kv4-family
transient potassium channels
Journal96Structure and function of Kv4-family transient potassium<br> channels<authors_primary>Birnbaum,S.G.</authors_primary><br><authors_primary>Varga,A.W.</authors_primary><authors_primary>Yuan,L.L.<authors_primary>Anderson,A.E.</authors_primary><author s_primary>Sweatt,J.D.</author></authors_primary><authors_primary>Schrader,L.A.uthors_Primary><date_primary>2004/7</date_primary><keywords>Alzheimer<br> Disease</keywords><keywords>Animals</keywords><keywords>Brain</keywords><br><keywords>Cell<br> Physiology</keywords><keywords>chemistry</keywords><keywords>Epilepsyeywords><keywords>Heart<br> Diseases</keywords><keywords>Humans</keywords><keywords>metabolismords><keywords>Molecular<br> Structure</keywords><keywords>Myocardium</keywords><keywords>Neuronsywords><keywords>physiology</keywords><keywords>Potassium</keywords><key words>Potassium Channels</key></keywords><keywords>Potassium<br> Channels,Voltage-Gated</keywords><keywords>Protein<br> Isoforms</keywords><keywords>Protein<br> Processing,Post-Translational</keywords><keywords>Proteins</keywords><ke ywords>Shal Potassium Channels</ke></keywords><keywords>Structure-Activity<br> Relationship</keywords><keywords>Subcellular<br> Fractions</keywords><reprint>Not in<br> File</reprint><start_page>803</start_page><end_page>833</end_page><perio dical>Physiol<br> Rev.<volume>84</volume><issue>3</issue><zz_journalstdabbrev><f name="System">Physiol<br> Rev.</f></zz_journalstdabbrev><zz_workformid>1</zz_workformid></perio></keywords></authors_primary>te>
(Birnbaum et al., 2004; Martina et al., 1998) .

T

z

3/4

u

Oul

 

?????

P

R

T

3/4

u

d?OOl

 

???$?0 ???$??

???????

&

F

4

6

p

r

?H

????

??

????

o

o

oE/E/

Q

J/Year>668Mechanism of 4-aminopyridine block of
the transient outward K-current in identified Helix neuron
Journal668Mechanism of 4-aminopyridine block of the transient outward
K-current in identified Helix
neuronKiss,T.Laszlo,Z.Szabadics,J.rs_Primary>2002/2/154-Aminopyridi
ne
AnimalsBinding
Sites
drug effectsHelix
(Snails)
Membrane
Potentials
NeuronspharmacologyphysiologyPotassiumPotassium Channel BlockersPotassium
Channels
Not in
File
168179Brain
Res.9272Brain
Res.
1
te>Coetzee199949Molecular diversity of K+ channelsJournal49Molecular diversity of K+<br> channels<authors_primary>Coetzee,W.A.</authors_primary>Amarillo,Y.<authors_primary>Chiu,J.uthors_Primary><authors_primary>Chow,A.</authors_primary><authors_primar y>Lau,D.</authors_primar></authors_primary><authors_primary>McCormack,T.</authors_primary><authors_primary>Moreno,H.</authors_primary><authors_primary>Nadal,M.S.<br></authors_primary><authors_primary>Ozaita,A.</authors_primary><authors_p rimary>Pountney,D.<authors_primary>Saganich,M.s_Primary><authors_primary>Vega-Saenz,de<br> Miera</authors_primary><authors_primary>Rudy,B.</authors_primary><date_p rimary>1999/4/30<keywords>Alternative<br> Splicing</keywords><keywords>Animals</keywords><keywords>classification<keywords>Cloning,Molecular</keywords><keywords>Gene<br> Expression<br> Regulation</keywords><keywords>genetics</keywords><keywords>Humansords><keywords>Ion Channel Gating</keywords><keywords>Ion<br> Channels</keywords><keywords>Phylogeny</keywords><keywords>physiologyeywords><keywords>Potassium Channels</keywords><keywords>Protein<br> Conformation</keywords><keywords>Protein<br> Processing,Post-Translational</keywords><keywords>RNA<br> Editing</keywords><keywords>RNA,Messenger</keywords><keywords>Xenopuseywords><reprint>Not in<br> File</reprint><start_page>233</start_page><end_page>285</end_page><perio dical>Ann.N.Y.Acad.Sci.<volume><f name="Arial CYR">868</f></volume><zz_journalstdabbrev><f name="System">Ann.N.Y.Acad.Sci.</f></zz_journalstdabbrev><zz_workformid><br> 1</zz_workformid></perio></keywords></keywords></keywords></keywords></date_p></authors_primary></authors_p> (Coetzee et al., 1999; Kiss et
al., 2002) . Оскільки 4-АП в концентрації 1 ммоль/л в наших дослідах не
виявляв ніякого впливу на струм зі швидкою інактивацією, це дозволило
нам прийти до висновку, що цей струм на гальмівних інтернейронах
гіпокампа пов’язаний з роботою каналів саме Kv4-родини. Аналогічні
результати були показані іншими авторами на пірамідних нейронах, де
виявлена наявність А-струму, що обумовлений роботою каналів Kv4-родини,
але не каналів Kv1.4-підтипу ADDIN REFMGR.CITE
Kirichok1998658Num>[K+]out accelerates inactivation of Shal-channels
responsible for A-current in rat CA1 neurons
Journal658[K+]out accelerates inactivation of Shal-channels responsible
for A-current in rat CA1
neuronsKirichok,Y.V.Nikolaev,A.V.Krishtal
,O.A.
1998/3/9An
imals
Cells,CulturedDendrites Keywords>drug
effects
HippocampusHydrogen
Peroxide
KineticsKv1.4
Potassium Channel
Membrane
Potentials
NeuronsPatch-Clamp
Techniques
pharmacologyphysiolo
gy
PotassiumPotassium
Channels
Potassium
Channels,Voltage-Gated
Pyramidal
Cells
RatsRats,WistarShal Potassium ChannelsNot in
File
625629??????????????? ???????????????????????????????????????????????????????????????????????? ??????????????????????????????? Таким чином, підсумовуючи викладені вище результати, ми прийшли до висновку, що більшу частину інтегрального потенціал-керованого калієвого струму гальмівних інтернейронів гіпокампа складає струм, який обумовлений роботою каналів, що не мають часової інактивації. Також на мембрані цих інтернейронів присутні канали Kv4-родини зі швидкою інактивацією і канали з повільною інактивацією Kv2- і/або Kv3-родин. Але внесок останніх в інтегральний калієвий струм досліджених клітин порівняно незначний. Тому подальші наші зусилля були зосереджені на відокремленні і вивченні струму, що не має часової інактивації, і ідентифікація каналів, активація яких призводить до його появи. Оскільки будь-яка клітина, що обиралась для дослідження, виявляла наявність струму, що не інактивувався з часом, це підтвердило нас у думці, що саме цей струм є основним компонентом у калієвій відповіді інтернейронів на деполяризацію. На користь цього говорило також те, що потенціал активації стаціонарного струму знаходився в районі -60 мВ, що було близько до виміряного потенціалу активації інтегрального калієвого струму. На сьогоднішній день єдиним калієвим струмом, що активується при деполяризації клітинної мембрани і не інактивується з часом, вважається М-струм, чи струм, обумовлений роботою каналів Kv7-родини ADDIN REFMGR.CITE Marrion1997673um>Control of M-currentJournal673Control of
M-currentMarrion,N.V.
1997AnimalsC
alcium
Electric
Conductivity
HumansIon Channel
Gating
physiologyPotassiumwords>Receptors,Cell SurfaceSecond
Messenger Systems
Not in
File
483504Annu.Rev.Physiol.59:483-504.Annu.Rev.Physiol.
1
(Marrion, 1997) . За даними
літератури потенціал активації Kv7-каналів знаходиться в районі –60 мВ
ADDIN REFMGR.CITE
Selyanko1999635Num>M-channel gating and simulationJournal635M-channel gating and
simulationSelyanko,A.A.y>Brown,D.A.1999/8e_Primary>analysisAnimalsBiophysics
cytologyIn
Vitro
Ion Channel
Gating
KineticsMembrane
Potentials
metabolismModels,Neu
rological
NeuronsPatch-Clamp
Techniques
pharmacologyPotassiu
m
Potassium
Channels
RatsResearch
Support,Non-U.S.Gov't
Superior Cervical
Ganglion
Not in
File
701713Biophys.J.772Biophys.J.1orkformID>
Selyanko200113Properties of single M-type KCNQ2/KCNQ3
potassium channels expressed in mammalian cells
Journal13Properties of single M-type KCNQ2/KCNQ3 potassium channels<br> expressed in mammalian<br> cells<authors_primary>Selyanko,A.A.</authors_primary><au thors_primary>Hadley,J.K.<authors_primary>Brown,D.A. Authors_Primary><date_primary>2001/7/1</date_primary><keywords>Animals Keywords><keywords>Cho Cells</keywords><keywords>Electric<br> Conductivity</keywords><keywords>Hamsters</keywords><keywords>Ion<br> Channels</keywords><keywords>pharmacology</keywords><keywords>physiology<br></keywords><keywords>Potassium</keywords><keywords>Potassium<br> Channels</keywords><keywords>Potassium<br> Channels,Voltage-Gated</keywords><keywords>Research<br> Support,Non-U.S.Gov't</keywords><keywords>Transfection</keywords><r eprint>Not in<br> File<start_page>15</start_page><end_page>24</end_page><periodi cal>J.Physiol<volume>534</volume><issue>Pt<br> 1</issue><zz_journalstdabbrev><f name="System">J.Physiol</f></zz_journalstdabbrev><zz_workformid>1rkformID></zz_workformid></periodi></r></keywords></authors_primary></au>
(Selyanko et al., 2001; Selyanko and
Brown, 1999) , що цілком співпадає з виміряним нами для струму, що не
мав інактивації, на гальмівних інтернейронах. Постійні часу
деактиваційного спаду дослідженого нами струму дорівнювали в середньому
22 і 306 мс, що також дуже близько до відомих постійних часу деактивації
М-струму ADDIN REFMGR.CITE
Pan2001634Alternative splicing of KCNQ2 potassium channel transcripts
contributes to the functional diversity of M-currentsJournal634Alternative splicing of KCNQ2 potassium channel transcripts
contributes to the functional diversity of
M-currentsPan,Z.Selyanko,A.A.Hadley,J.K.Brown,D.A.Dixon,J.E.McKinnon,D._Primary>2001/3/1Alternative
Splicing
Amino Acid
Sequence
analysisAnimalsrds>antagonists & inhibitorsBase
Sequence
BiophysicsCho
Cells
Comparative
Study
Cricetinaecytologyrds>DNA,ComplementaryExonsGene
Expression
geneticsKCNQ2
Potassium
Channel
KineticsMolecular
Sequence
Data
Neuronsphysiologys>PotassiumPotassium Channel
Blockers
Potassium
Channels
Potassium
Channels,Voltage-Gated
Protein
Isoforms
Receptors,CholinergicR
esearch Support,Non-U.S.Gov't
Research
Support,U.S.Gov't,P.H.S.
Superior Cervical
Ganglion
Transcription,GeneticNo
t in
File
347358J.Physiol.531Pt
2
J.Physiol.1orkformID>
Passmore200311KCNQ/M currents in sensory neurons:
significance for pain therapy
Journal11KCNQ/M currents in sensory neurons: significance for pain<br> therapy<authors_primary>Passmore,G.M.</authors_primary>Selyanko,A.A.<authors_primary>Mistry,M<br> .</authors_primary><authors_primary>Al<br> Qatari,M.</authors_primary><authors_primary>Marsh,S.J.</authors_primary><br><authors_primary>Matthews,E.A.</authors_primary><authors_primary>Dickens<br> on,A.H.</authors_primary><authors_primary>Brown,T.A.</authors_primary><a uthors_primary>Burbidge,S.A.<authors_primary>Main,M. Authors_Primary><authors_primary>Brown,D.A.</authors_primary><date_prima ry>2003/8/6<keywords>Animals</keywords><keywords>Anthrace<br> nes</keywords><keywords>Anura</keywords><keywords>Carbamates</keywords>Cells,Cultured<keywords>Cho<br> Cells</keywords><keywords>cytology</keywords><keywords>Disease<br> Models,Animal</keywords><keywords>drug<br> effects</keywords><keywords>Epilepsy</keywords><keywords>Ganglia,Spinal<keywords>genetics</keywords><keywords>Hamsters</keywords><key words>Hyperalgesia</key></keywords><keywords>Indoles</keywords><keywords>Male<keywords>metabolism</keywords><keywords>Neurons</keywords><ke ywords>Neurons,Afferent</ke></keywords><keywords>Oocytes</keywords><keywords><br> Pain</keywords><keywords>Pain<br> Measurement</keywords><keywords>Patch-Clamp<br> Techniques</keywords><keywords>pharmacology</keywords><keywords>Phenylen<br> ediamines</keywords><keywords>physiopathology</keywords><keywords>Potass<br> ium Channel Blockers</keywords><keywords>Potassium<br> Channels</keywords><keywords>Pyridines</keywords><keywords>Ratss><keywords>Rats,Sprague-Dawley</keywords><keywords>Research<br> Support,Non-U.S.Gov't</keywords><keywords>Reverse Transcriptase<br> Polymerase Chain<br> Reaction</keywords><keywords>therapy</keywords><keywords>Transfectioneywords><reprint>Not in<br> File</reprint><start_page>7227</start_page><end_page>7236</end_page><per iodical>J.Neurosci.<volume>23</volume><issue>18</issue><zz_ journalstdabbrev><f name="System">J.Neurosci.</f><zz_workformid>1</zz_workformid></zz_>WorkformID></per></keywords></keywords></date_prima></authors_primary></a>
(Pan et al., 2001; Passmore et al.,
2003) . Все це дозволило нам припустити, що калієвий струм, який
реєструвався нами на гальмівних інтернейронах і який не мав інактивації,
є М-струмом, обумовленим роботою Kv7-каналів. Для перевірки цього ми
використали специфічні блокатори і активатор М-струму. Аплікація
блокаторів у концентраціях, що у десять разів перевищують відомі
концентрації половинного пригнічення для Kv7-каналів, не призводила до
будь-яких змін дослідженого стаціонарного струму. Однак аплікація
активатора РТ у робочих концентраціях призводила до збільшення амплітуди
стаціонарного струму і до специфічного зсуву його вольт-амперної
характеристики до зони більш негативних потенціалів, що є відомою
характерною реакцією Kv7-каналів на дію РТ ADDIN REFMGR.CITE
Tatulian200167um>Activation of expressed KCNQ potassium currents and native
neuronal M-type potassium currents by the anti-convulsant drug
retigabine
Journal67Activation of expressed KCNQ potassium currents and native<br> neuronal M-type potassium currents by the anti-convulsant drug<br> retigabine<authors_primary>Tatulian,L.</authors_primary><br><authors_primary>Delmas,P.</authors_primary><authors_primary>Abogadie,F.<br> C.</authors_primary><authors_primary>Brown,D.A.</authors_primary><date_p rimary>2001/8/1<keywords>Action<br> Potentials</keywords><keywords>Animals</keywords><keywords>Anticonvulsan<br> ts</keywords><keywords>Carbamates</keywords><keywords>Cells,Culturedywords><keywords>Cho<br> Cells</keywords><keywords>Cricetinae</keywords><keywords>cytologyrds><keywords>drug<br> effects</keywords><keywords>genetics</keywords><keywords>Humanss><keywords>Indoles</keywords><keywords>Ion<br> Transport</keywords><keywords>KCNQ Potassium<br> Channels</keywords><keywords>KCNQ1 Potassium<br> Channel</keywords><keywords>KCNQ2 Potassium<br> Channel</keywords><keywords>KCNQ3 Potassium<br> Channel</keywords><keywords>metabolism</keywords><keywords>Muscarinic<br> Agonists</keywords><keywords>Neurons</keywords><keywords>Patch-Clamp<br> Techniques</keywords><keywords>pharmacology</keywords><keywords>Phenylen<br> ediamines</keywords><keywords>Potassium</keywords><keywords>Potassium<br> Channels</keywords><keywords>Potassium<br> Channels,Voltage-Gated</keywords><keywords>Pyridines</keywords><keywords>Rats</keywords><keywords>Rats,Sprague-Dawley</keywords><keywords>Recept<br> or,Muscarinic<br> M1</keywords><keywords>Receptors,Muscarinic</keywords><keywords>Research<br> Support,Non-U.S.Gov't</keywords><keywords>Superior Cervical<br> Ganglion</keywords><keywords>Sympathetic Nervous<br> System</keywords><keywords>Transfection</keywords><reprint>Not in<br> File</reprint><start_page>5535</start_page><end_page>5545</end_page><per iodical>J.Neurosci.<volume>21</volume><issue>15</issue><zz_ journalstdabbrev><f name="System">J.Neurosci.</f><zz_workformid>1</zz_workformid></zz_>WorkformID></per></keywords></keywords></keywords></date_p>
(Tatulian et al., 2001) .

Таке протиріччя в отриманих результатах можна пояснити двома шляхами.
Перший, знов ж таки, полягає в тому, що, можливо, Kv7-канали присутні на
інтернейронах в невеликій кількості чи, з якихось причин, в неактивному
стані, і їх внесок в вихідний струм в звичайних умовах мізерний, хоч в
спеціальних умовах (дія РТ) їх активація здатна суттєво змінити стан
нервової клітини. Зареєстрований ж нами при відсутності РТ струм
обумовлений роботою якихось інших, досі невідомих форм калієвих каналів.
Теоретично це можливо, оскільки на сьогодні відомо 11 Kv-родин, при чому
останні відкриті зовсім недавно ADDIN REFMGR.CITE
Ottschytsch200248ecNum>Obligatory heterotetramerization of three previously
uncharacterized Kv channel alpha-subunits identified in the human
genome
Journal48Obligatory heterotetramerization of three previously<br> uncharacterized Kv channel alpha-subunits identified in the human<br> genome<authors_primary>Ottschytsch,N.</authors_primary>Raes,A.<authors_primary>Van<br> Hoorick,D.</authors_primary><authors_primary>Snyders,D.J.ry><date_primary>2002/6/11</date_primary><keywords>Amino Acid<br> Sequence</keywords><keywords>analysis</keywords><keywords>Biophysicsywords><keywords>chemistry</keywords><keywords>Ether-A-Go-Go Potassium<br> Channels</keywords><keywords>genetics</keywords><keywords>Genome,Human Keywords><keywords>Humans</keywords><keywords>Macromolecular<br> Substances</keywords><keywords>Membrane<br> Potentials</keywords><keywords>Molecular Sequence<br> Data</keywords><keywords>Patch-Clamp<br> Techniques</keywords><keywords>pharmacology</keywords><keywords>Phylogen<br> y</keywords><keywords>physiology</keywords><keywords>Potassium<br> Channels</keywords><keywords>Potassium<br> Channels,Voltage-Gated</keywords><keywords>Protein<br> Subunits</keywords><keywords>Research<br> Support,Non-U.S.Gov't</keywords><keywords>Research<br> Support,U.S.Gov't,P.H.S.</keywords><keywords>Sequence<br> Alignment</keywords><keywords>Sequence Homology,Amino<br> Acid</keywords><keywords>Shab Potassium Channels</keywords><reprint>Not<br> in<br> File</reprint><start_page>7986</start_page><end_page>7991</end_page><per iodical>Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.<volume>99</volume><issue><br> 12</issue><zz_journalstdabbrev><f name="System">Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.</f></zz_journalstdabbrev><zz_wor kformid>1</zz_wor></per></keywords></keywords></authors_primary>
Ottschytsch
2005655Domain analysis of Kv6.3,
an electrically silent channel
Journal655Domain analysis of Kv6.3, an electrically silent
channelOttschytsch,N.
Raes,A.L.Timmermans,
J.P.
Snyders,D.J.2005/11/1Amino Acid
Sequence
analysisBiophysicsywords>chemistryElectric
Impedance
Endoplasmic
Reticulum
HumansIon Channel
Gating
metabolismMolecular
Sequence
Data
pharmacologyphysiologyywords>PotassiumPotassium
Channels,Voltage-Gated
Protein
Structure,Tertiary
Research
Support,N.I.H.,Extramural
Research
Support,Non-U.S.Gov't
Sequence Homology,Amino
Acid
Shab Potassium
Channels
Structure-Activity
Relationship
Not in
File
737747J.Physiol.568Pt
3
J.Physiol.1orkformID>
Post1996657Kv2.1 and electrically silent Kv6.1 potassium
channel subunits combine and express a novel current
Journal657Kv2.1 and electrically silent Kv6.1 potassium channel subunits
combine and express a novel
currentPost,M.A.Kirsch,G.E.Brown,A.M.thors_Primary>1996/12/9Animalseywords>OocytesPatch-Clamp
Techniques
pharmacologyphysiolo
gy
PotassiumPotassium Channel
Blockers
Potassium
Channels
Recombinant Fusion
Proteins
Research
Support,U.S.Gov't,P.H.S.
Shab Potassium
Channels
TetraethylammoniumTetr
aethylammonium
Compounds
XenopusNot in
File
177182FEBS
Lett.3991-2FEBS
Lett.
1
ite>
(Ottschytsch et al., 2002; Ottschytsch et al., 2005; Post
et al., 1996) . Шість з них (Kv5, Kv6, Kv8-Kv11) утворюють гетеромери з
іншими родинами (в основному з Kv2), змінюючи їх властивості ADDIN
REFMGR.CITE
Coetzee199949m>Molecular diversity of K+ channelsJournal49Molecular diversity of K+<br> channels<authors_primary>Coetzee,W.A.</authors_primary>Amarillo,Y.<authors_primary>Chiu,J.uthors_Primary><authors_primary>Chow,A.</authors_primary><authors_primar y>Lau,D.</authors_primar></authors_primary><authors_primary>McCormack,T.</authors_primary><authors_primary>Moreno,H.</authors_primary><authors_primary>Nadal,M.S.<br></authors_primary><authors_primary>Ozaita,A.</authors_primary><authors_p rimary>Pountney,D.<authors_primary>Saganich,M.s_Primary><authors_primary>Vega-Saenz,de<br> Miera</authors_primary><authors_primary>Rudy,B.</authors_primary><date_p rimary>1999/4/30<keywords>Alternative<br> Splicing</keywords><keywords>Animals</keywords><keywords>classification<keywords>Cloning,Molecular</keywords><keywords>Gene<br> Expression<br> Regulation</keywords><keywords>genetics</keywords><keywords>Humansords><keywords>Ion Channel Gating</keywords><keywords>Ion<br> Channels</keywords><keywords>Phylogeny</keywords><keywords>physiologyeywords><keywords>Potassium Channels</keywords><keywords>Protein<br> Conformation</keywords><keywords>Protein<br> Processing,Post-Translational</keywords><keywords>RNA<br> Editing</keywords><keywords>RNA,Messenger</keywords><keywords>Xenopuseywords><reprint>Not in<br> File</reprint><start_page>233</start_page><end_page>285</end_page><perio dical>Ann.N.Y.Acad.Sci.<volume><f name="Arial CYR">868</f></volume><zz_journalstdabbrev><f name="System">Ann.N.Y.Acad.Sci.</f></zz_journalstdabbrev><zz_workformid><br> 1</zz_workformid></perio></keywords></keywords></keywords></keywords></date_p></authors_primary></authors_p> (Coetzee et al., 1999) . Але
випадковий збіг кінетичних параметрів винайдених каналів з параметрами
Kv7-каналів виглядає дуже малоймовірним. Крім того, на нашу думку, в
цьому випадку стаціонарний калієвий струм гальмівних інтернейронів не
проявляв би таку високу чутливість до РТ, до того ж з реакцією, яка
характерна для Kv7-каналів. Тому більш реальною нам здається інша
гіпотеза – наявність на гальмівних інтернейронах нечутливих до
блокаторів форм Kv7-каналів чи клітинних механізмів, здатних суттєво
знижувати цю чутливість, хоча уявити принципи дії цих механізмів досить
важко.

Аплікація РТ на гальмівні інтернейрони культури клітин гіпокампа в наших
дослідах не тільки збільшувала рівень стаціонарного струму при їх
деполяризації, а й суттєво впливала на формування і підтримання
нейронами потенціалів на плазматичній мембрані: потенціал спокою
зміщувався у більш негативну зону і нейрон втрачав здатність генерувати
тривалу серію ПД. Такий ефект дії цієї речовини є відомим і також
свідчить про активацію Kv7-каналів ADDIN REFMGR.CITE
Tatulian200167um>Activation of expressed KCNQ potassium currents and native
neuronal M-type potassium currents by the anti-convulsant drug
retigabine
Journal67Activation of expressed KCNQ potassium currents and native<br> neuronal M-type potassium currents by the anti-convulsant drug<br> retigabine<authors_primary>Tatulian,L.</authors_primary><br><authors_primary>Delmas,P.</authors_primary><authors_primary>Abogadie,F.<br> C.</authors_primary><authors_primary>Brown,D.A.</authors_primary><date_p rimary>2001/8/1<keywords>Action<br> Potentials</keywords><keywords>Animals</keywords><keywords>Anticonvulsan<br> ts</keywords><keywords>Carbamates</keywords><keywords>Cells,Culturedywords><keywords>Cho<br> Cells</keywords><keywords>Cricetinae</keywords><keywords>cytologyrds><keywords>drug<br> effects</keywords><keywords>genetics</keywords><keywords>Humanss><keywords>Indoles</keywords><keywords>Ion<br> Transport</keywords><keywords>KCNQ Potassium<br> Channels</keywords><keywords>KCNQ1 Potassium<br> Channel</keywords><keywords>KCNQ2 Potassium<br> Channel</keywords><keywords>KCNQ3 Potassium<br> Channel</keywords><keywords>metabolism</keywords><keywords>Muscarinic<br> Agonists</keywords><keywords>Neurons</keywords><keywords>Patch-Clamp<br> Techniques</keywords><keywords>pharmacology</keywords><keywords>Phenylen<br> ediamines</keywords><keywords>Potassium</keywords><keywords>Potassium<br> Channels</keywords><keywords>Potassium<br> Channels,Voltage-Gated</keywords><keywords>Pyridines</keywords><keywords>Rats</keywords><keywords>Rats,Sprague-Dawley</keywords><keywords>Recept<br> or,Muscarinic<br> M1</keywords><keywords>Receptors,Muscarinic</keywords><keywords>Research<br> Support,Non-U.S.Gov't</keywords><keywords>Superior Cervical<br> Ganglion</keywords><keywords>Sympathetic Nervous<br> System</keywords><keywords>Transfection</keywords><reprint>Not in<br> File</reprint><start_page>5535</start_page><end_page>5545</end_page><per iodical>J.Neurosci.<volume>21</volume><issue>15</issue><zz_ journalstdabbrev><f name="System">J.Neurosci.</f><zz_workformid>1</zz_workformid></zz_>WorkformID></per></keywords></keywords></keywords></date_p>
(Tatulian et al., 2001) . Можливість
того, що отримана реакція нейронів на РТ пов’язана з активацією
ГАМК-рецепторів, була виключена завдяки нашим дослідам з сумісною
аплікацією РТ і бікукуліну, при якій перший також гальмував утворення
нейроном ПД.

У зв’язку з отриманням нами дещо суперечних електрофізіологічних
результатів щодо впливу блокаторів і активатора Kv7-каналів на калієвий
струм, що не має інактивації, ми вирішили перевірити наявність на
гальмівних інтернейронах культури клітин гіпокампа каналів Kv7-родини
методами імунофлуоресцентного забарвлення і одноклітинного ЗТ ПЛР.
Імунофлуоресцентне забарвлення підтвердило наявність Kv7.2-субодиниці
калієвого каналу в кожній з досліджених клітин. ЗТ ПЛР з одиничних
інтернейронів показав, що в гальмівних інтернейронах культури гіпокампа
експресуються гени, які кодують Kv7.2-, Kv7.3- та Kv7.5-підтипи
(-субодиниць калієвих каналів. При цьому експресія гену Kv7.5-субодиниці
виявлена лише приблизно в 40% цих клітин, і рівень його експресії значно
менший, порівняно з генами Kv7.2- і Kv7.3-субодиниць. Цей факт
демонструє відмінність у наявності різних підтипів Kv7-каналів між
інтернейронами і пірамідними клітинами гіпокампа, оскільки, за
літературними даними, усі пірамідні нейрони гіпокампа мають добре
виражену експресію генів як Kv7.2- і Kv7.3-субодиниць, так і
Kv7.5-субодиниці ADDIN REFMGR.CITE
Shah200210Molecular correlates of the M-current in cultured rat hippocampal
neuronsJournal10Molecular correlates of the M-current in cultured rat<br> hippocampal<br> neurons<authors_primary>Shah,M.M.</authors_primary><auth ors_primary>Mistry,M.<authors_primary>Marsh,S.J.</authors_primary></auth>ors_Primary><authors_primary>Brown,D.A.</authors_primary><authors_primar y>Delmas,P.<date_primary>2002/10/1</date_primary><keyw ords>Animals<keywords>Cells,Cultured</keywords><keywords>Elec<br> tric Conductivity</keywords><keywords>Fluorescent Antibody<br> Technique</keywords><keywords>Hippocampus</keywords><keywords>Indoleseywords><keywords>Neurons</keywords><keywords>pharmacology</keywords><ke ywords>physiology</ke></keywords><keywords>Polymerase Chain<br> Reaction</keywords><keywords>Potassium Channel<br> Blockers</keywords><keywords>Potassium<br> Channels</keywords><keywords>Potassium<br> Channels,Voltage-Gated</keywords><keywords>Pyridines</keywords><keywords>Rats</keywords><keywords>Research<br> Support,Non-U.S.Gov't</keywords><keywords>Tetraethylammoniumrds><keywords>Tissue Distribution</keywords><reprint>Not in<br> File</reprint><start_page>29</start_page><end_page>37</end_page><periodi cal>J.Physiol<volume>544</volume><issue>Pt<br> 1</issue><zz_journalstdabbrev><f name="System">J.Physiol</f></zz_journalstdabbrev><zz_workformid>1rkformID></zz_workformid></periodi></keywords></keyw></authors_primar>
(Shah et al., 2002) .

Поєднуючи отримані нами данні імуноцитохімії і ЗТ ПЛР з одиничних клітин
з результатами електрофізіологічних експериментів, ми можемо
стверджувати, що калієвий струм, який не має інактивації, гальмівних
інтернейронів гіпокампа є М-струмом, а Kv7-канали, відповідно, грають
основну роль у формуванні калієвої відповіді цих клітин на
деполяризацію.

Описані результати, отримані нами, дозволяють робити висновки про
наявність і функціональну роль Kv7-каналів на сомі досліджених нейронів.
Але не менш цікавим є питання їх розподілу на відростках гальмівних
інтернейронів. Властивість РТ активувати М-струм і тим самим
пригнічувати здатність нейрона генерувати серію ПД, навела нас на думку,
що ми можемо скористатися нею для визначення наявності Kv7-каналів на
аксонних терміналях гальмівних інтернейронів, а також перевірити
можливість модуляції ГАМК-ергічної синаптичної передачі активацією
Kv7-каналів. Ми припустили, що РТ, при умові локальної аплікації на
дистальні частини аксона пресинаптичного нейрона у синаптично зв’язаній
парі клітин, може активувати Kv7-канали аксонних терміналей і
превентувати виникнення в них серії ПД, на зразок того, як він це робить
на сомі нейрона. При цьому ми повинні спостерігати зменшену в порівнянні
з контролем синаптичну відповідь.

Але в наших дослідах при генерації ПД на сомах пресинаптичних нейронів і
аплікації РТ на дистальні частини аксонів кожному ПД, що виникав на
сомах, як і в контрольних умовах, відповідало збільшення інтенсивності
постсинаптичного струму. Ми припустили, що, можливо, цей факт пов’язаний
не з відсутністю Kv7-каналів в аксонах, а з тим, що активація
Kv7-каналів здатна пригнічувати лише виникнення ПД, але не здатна
запобігати їх проведенню, якщо вони вже виникли. Тому ми провели
наступну серію дослідів з локальною стимуляцією аксонів гальмівних
інтернейронів і реєстрацією постсинаптичних відповідей на нейронах, на
яких стимульовані аксони мають синаптичні закінчення. В цьому випадку
зона аплікації речовин захоплювала місце стимуляції аксона, завдяки чому
РТ міг впливати як на розповсюдження, так і на виникнення ПД. В контролі
у відповідь на кожний стимул в серії реєструвався чіткий постсинаптичний
струм на мембрані нейрона, а при аплікації РТ значна частина стимулів
аксону не супроводжувалась синаптичними відповідями. Спостережувана
зміна постсинаптичних струмів в присутності РТ в цьому випадку, на нашу
думку, може пояснюватись тільки відсутністю ПД, які приходять до
синаптичних терміналей. Це, в свою чергу, говорить про інгібуючий вплив
РТ на виникнення ПД в аксоні, при якому не кожен стимул в стимуляційній
серії призводив до появи ПД. Отримані результати свідчать про наявність
Kv7-каналів в аксонах гальмівних інтернейронів і про можливість
модуляції цими каналами ГАМК-ергічної синаптичної передачі.

ВИСНОВКИ

&

&

их інтернейронів культури клітин гіпокампа, що виникають у відповідь на
деполяризацію. Вперше показано, що основним компонентом інтегрального
калієвого струму інтернейронів є струм, що не має інактивації.

В культивованих інтернейронах гіпокампа виявлений калієвий струм зі
швидкою інактивацією, який складає біля 10% сумарного калієвого струму
інтернейронів. Показано, що цей компонент обумовлений роботою каналів
Kv4-родини.

Компонент калієвого струму з повільною інактивацією в інтернейронах
культури клітин гіпокампа пов’язаний з роботою каналів Kv3- і Kv2-родин.
Внесок цих каналів у відповідь інтернейронів на деполяризацію складає в
середньому 15% від інтегрального вихідного струму. Канали Kv1-родини не
задіяні в формуванні калієвого струму соми інтернейронів.

Основний компонент калієвого струму соми гіпокампальних інтернейронів,
який не має інактивації, обумовлений роботою каналів Kv7-родини. За
допомогою імуноцитохімічних і молекулярно-біологічних методів в
гальмівних інтернейронах культури гіпокампа виявлена експресія Kv7.2-,
Kv7.3- і Kv7.5-підтипів (-субодиниць цих каналів.

Показана наявність каналів Kv7-родини в аксонах інтернейронів гіпокампа
і їх здатність впливати на ГАМК-ергічну синаптичну передачу.
Встановлено, що активація Kv7-каналів суттєво пригнічує генерацію серії
потенціалів дії, що, в свою чергу, призводить до зменшення кількості
вивільнень ГАМК з терміналей і зменшення синаптичної відповіді.

Перелік опублікованих праць здобувача за темою дисертації

Статті

А.О.Григоров, А.А.Москалюк, С.А.Федулова, Н.С.Веселовский.
Дифференциация калиевых токов в культивируемых тормозных интернейронах
гиппокампа (идентификация калиевого тока М-типа) //
Нейрофизиология/Neurophysiology – 2006. – Т.38, №3. – с.198-204.

О.О.Григоров, А.О.Москалюк, С.А.Федулова, М.С.Веселовський.
Потенціал-керовані калієві канали гальмівних інтернейронів культури
гіпокампа // Фізіологічний журнал – 2006. – Т.52, №6. – с.35-44.

О.О.Григоров, В.Є.Досенко, М.О.Кравченко, А.О.Москалюк, С.А.Федулова,
М.С.Веселовський. Експресія генів калієвих каналів родини KCNQ у
гальмівних інтернейронах культури гіпокампа та участь цих каналів в
регуляції ГАМК-ергічної синаптичної передачі //
Нейрофизиология/Neurophysiology – 2006. – Т.38, №5/6, с.381-389.

Тези доповідей

А.О.Григоров, А.А.Москалюк, С.А.Федулова, Н.С.Веселовский
Неинактивирующийся калиевый ток тормозных интернейронов культуры
гиппокампа: биофизические и фармакологические свойства // Матеріали ІІ
науково-практичної конференції молодих вчених та спеціалістів “Актуальні
проблеми фармакології та токсикології”, Київ, 22 грудня, 2005 р. – К.:
Архетип, 2005. – С. 21.

О.О.Григоров, А.О.Москалюк, В.Є.Досенко, С.А.Федулова, М.С.Веселовський
Потенціалкеровані калієві канали гальмівних інтернейронів культури
гіпокампа // Тези доповідей ІІІ Всеукраїнської наукової конференції,
присвяченої 70-річчю з дня народження Г.М.Чайченка „Психофізіологічні та
вісцеральні функції в нормі та патології”, Київ, 4-6 жовтня 2006 р. –
К.: Знання України, 2006. – С.29-30.

О.О.Григоров, А.О.Москалюк, М.О.Кравченко, В.Є.Досенко, С.А.Федулова,
М.С.Веселовський Участь калієвих каналів Kv7-родини в регуляції
фізіологічної активності культивованих гальмівних інтернейронів
гіпокампа і в модуляції ГАМК-ергічної синаптичної передачі // Тези
доповідей IV з’їзду Українського біофізичного товариства (Донецьк, 19-21
грудня 2006 р.). – Донецьк: ДонНУ, 2006. – С 43-45.

Анотація

Григоров О.О.“Канали Kv-групи інтернейронів культури клітин гіпокампа”.
– Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.13 – фізіологія людини і тварин – Інститут
фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, Київ, 2006

Дисертація присвячена вивченню потенціал-керованих калієвих каналів, що
притаманні ГАМК-ергічним культивованим інтернейронам гіпокампа.
Використання електрофізіологічних методик фіксації струму і потенціалу в
конфігурації „ціла клітина”, парної реєстрації від синаптично зв’язаних
клітин і електричної стимуляції аксону в комбінації з методиками
імуноцитохімічного забарвлення і зворотної транскрипції з полімеразною
ланцюговою реакцією дозволило широко дослідити специфічні підтипи
калієвих каналів, властивих інтернейронам гіпокампа, внесок цих каналів
в інтегральний калієвий струм інтернейронів, а також їх участь в
регуляції гальмівної синаптичної передачі. Показано, що основна роль в
формуванні інтегрального калієвого струму культивованих інтернейронів
гіпокампа належить струму, що не має інактивації. Також показаний
незначний внесок в інтегральний калієвий струм каналів Kv2-, Kv3- і
Kv4-родин. Доведено, що виникнення стуму без інактивації обумовлено
активацією каналів Kv7-родини, що складаються з Kv7.2-, Kv7.3- та
Kv7.5-підтипів ?-субодиниць. Показана наявність Kv7-каналів на сомі і на
аксонах гальмівних інтернейронів, а також їх здатність впливати на
мембранні потенціали і функціональний стан клітини. Зроблено висновок
про основну роль каналів Kv7-родини в формуванні калієвого струму соми
інтернейронів у відповідь на деполяризацію і про здатність цих каналів
модулювати ГАМК-ергічну синаптичну передачу.

Ключові слова: Kv-канали, KCNQ-канали, культура нейронів гіпокампа,
потенціал-керований калієвий струм.

Аннотация.

Григоров А.О. “Каналы Kv-группы интернейронов культуры клеток
гиппокампа”. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.13.– физиология человека и животных – Институт
физиологии им.А.А.Богомольца НАН Украины, Киев, 2006.

Диссертация посвящена изучению потенциал-управляемых калиевых каналов,
свойственных ГАМК-эргическим культивированным интернейронам гиппокампа.
Использование электрофизиологических методов, таких как “пэтч-клэмп” в
конфигурации “целая клетка” в модификациях фиксации потенциала или тока,
одновременная регистрация токов и потенциалов от пары синаптически
связанных нейронов и локальная электрическая стимуляция аксонов нервных
клеток в комбинации с методами иммуноцитохимической окраски, обратной
транскрипции (ОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволило широко
исследовать специфические подтипы калиевых каналов, свойственных
интернейронам гиппокампа, вклад этих каналов в интегральный калиевый ток
интернейронов, а также их участие в регуляции синаптической передачи.

Показано, что основная роль в формировании интегрального калиевого тока
культивированных интернейронов гиппокампа принадлежит
неинактивирующемуся току, который составлял 83 ( 1,7 % от амплитуды
суммарного тока. Суммарный выходящий калиевый ток исследуемых клеток
имел порог активации в районе –50 мВ и проявлял низкую чувствительность
к (-дендротоксину, что исключает участие в его формировании каналов
Kv1-семейства. Постоянная времени спада тока с медленной инактивацией
равнялась 3 ( 0,15 с, что является характерным для каналов задержанного
выпрямления Kv2-, Kv3.1- и Kv3.2-подтипов. Быстро инактивирующийся А-ток
составлял 9,4 ( 1,3% от общей амплитуды выходящего тока и был
нечувствителен к 4-аминопиридину, что говорит о наличии на нейронах
каналов Kv4-семейства.

При длительной деполяризации на всех нейронах наблюдался
неинактивирующийся калиевый ток с амплитудой при потенциале –20 мВ
100 / 500 пА. Потенциал его активации, равный –60 мВ,
двухэкспоненциальный деактивационный спад и постоянные времени
деактивации совпадали с известными для калиевого тока М-типа,
обусловленного работой каналов Kv7-семейства. Их специфический активатор
ретигабин вызывал обратимый сдвиг вольт-амперной характеристики тока в
сторону более отрицательных потенциалов и увеличивал его амплитуду при
-20 мВ на 66 ( 14%, что говорит о наличии на нейронах каналов
Kv7-семейства. Однако селективные блокаторы Kv7-каналов линопирдин и
XE991 не оказывали достоверного влияния на неинактивирующийся выходящий
ток.

При иммуноцитохимическом окрашивании все клетки выявляли позитивную
окраску на содержание Kv7.2-субъединиц калиевых каналов. Метод ОТ ПЦР с
единичных клеток (single cell RT-PCR) во всех исследованных
ГАМК-эргических интернейронах выявил экспрессию генов Kv7.2- и
Kv7.3-подтипов (-субъедениц калиевых каналов. В 38% интернейронов также
найдена невысокая экспрессия Kv7.5-субъединиц.

Также установлено наличие функциональных каналов Kv7-семейства в аксонах
тормозных интернейронов. Показано, что их активация в аксонах, благодаря
способности угнетать генерацию ПД, приводит, в свою очередь, к
уменьшению количества выбросов ГАМК из терминалей и, следовательно, к
уменьшению синаптического ответа.

Сделан вывод, что в формировании потенциал-управляемого калиевого тока
на тормозных интернейронах культуры гиппокампа в небольшой степени
принимают участие каналы Kv2-, Kv3- и Kv4-семейств. Большая же часть
выходящего тока не имеет временной инактивации и обусловлена работой
Kv7-каналов, состоящих из Kv7.2-, Kv7.3- и на некоторых клетках
Kv7.5-субъединиц. Также сделан вывод про способность Kv7-каналов
модулировать ГАМК-эргическую синаптическую передачу.

Ключевые слова: Kv-каналы, KCNQ-каналы, культура нейронов гиппокампа,
потенциал-активированный калиевый ток.

annotation

Grygorov O.O. “Kv channels of interneurons of culture of hippocampal
cells”. – Manuscript

Thesis for Candidate of Sciences degree in speciality 03.00.13 – human
and animal physiology – Bogomoletz Institute of Physiology, National
Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2006.

This work is devoted to investigation of voltage-activated potassium
channels in GABAergic interneurons of hippocampal culture. Using the
combination of electrophysiological (voltage or current clamp in “whole
cell” configuration, pair recording from the synaptically connected
neurons, axon stimulation) and non-physiological (immunocytochemestry
and single cell RT-PCR) techniques together with fast local superfusion
technique allowed the studying of specific subtypes of potassium
channels peculiar to hippocampal interneurons, the contribution of these
channels to potassium currents of interneurons and their participation
in regulation of the synaptic transmission. It was shown that
non-inactivating current plays a main role in the forming of the
integral potassium current of the soma of inhibitory interneurons. The
minor contribution of the Kv2-, Kv3- and Kv4-channels to interneurons’
integral potassium current was also revealed. It was proven the
non-inactivation current appearance is caused by activation of channels
of Kv7-family that may consist of Kv7.2, Kv7.3 and Kv7.5 subtypes of
(-subunits. It was displayed the presence of Kv7-channels in the somas
and axons of inhibitory interneurons and demonstrated the ability of
these channels to regulate membrane potentials and cells’ functioning.
It was conclude, first, the Kv7 channels family plays the main role in
the forming of potassium currents of soma of hippocampal inhibitory
cells and, second, these channels can influence on physiological
behavior of interneurons and modulate the GABAergic synaptic
transmission.

Key words: Kv-channels, KCNQ-channels, voltage-activated potassium
currents, cultured hippocampal neurons.

PAGE 26

А

Б

І/Іконтмах

Б

А

І/Іконтмах

В

Б

А

*

***

***

***

***

***

Д

Г

І/Іконтмах

1 2 3 4 5 6 7 8

А

Б

Г

В

В

А

Б

А

Б

В

1

2

А

Б

В

Г

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020