НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИКИ

ГОЛУБ АНДРІЙ ГРИГОРОВИЧ

УДК 577.322

In silico дизайн інгібіторів протеїнкінази СК2

03.00.03 – молекулярна біологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007 Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі комбінаторної хімії Інституту молекулярної
біології та генетики НАН України (м. Київ).

Науковий керівник: доктор хімічних наук, професор

Ярмолюк Сергій Миколайович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач
відділу комбінаторної хімії.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Тукало Михайло Арсентійович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

заступник директора інституту з наукової роботи,

завідувач відділу ензимології білкового синтезу;

доктор хімічних наук

Качковський Олексій Дмитрович,

Інститут органічної хімії НАН України,

провідний науковий співробітник

відділу кольору та будови органічних сполук.

I?ia?aeia onoaiiaa: Київський національний університет імені Т. Г.
Шевченка, біологічний факультет, м. Київ.

Caoeno a?aeaoaeaoueny 19 /a?aiy 2007 ?ieo i 10 aiaeei? ia can?aeaii?
niaoe?ae?ciaaii? a/aii? ?aaee Ae 26.237.01 Інституту молекулярної
біології та генетики НАН України за адресою: 03143, Київ-143, вул.
Академіка Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної
біології та генетики НАН України (03143, Київ-143, вул. Академіка
Заболотного, 150).

Автореферат розіслано 17 травня 2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук О.В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Передача сигналу шляхом
фосфорилювання/дефосфо-рилювання білків є загальновідомим механізмом, що
забезпечує більшість фізіологічних та патологічних процесів у клітині. З
огляду на те, що процес фосфорилювання каталізують ферменти
протеїнкінази, вони є важливими регуляторами клітинних функцій. Одним з
таких ферментів, що належить до класу серин-треонінових протеїнкіназ, є
протеїнкіназа СК2, яка контролює значну кількість клітинних процесів,
включаючи клітинний ріст та проліферацію. СК2 є плейотропною,
конститутивною кіназою, що локалізується у цитоплазматичних та ядерних
компартментах відповідно до її клітинних функцій (Ahmed et al., 2002).

Хоча СК2 є об’єктом інтенсивного вивчення протягом останніх 50 років, її
біологічна роль та способи регуляції активності залишаються не до кінця
зрозумілими (Battistutta et al., 2005). Одним із підходів, який
застосовують для вивчення функцій протеїнкіназ, а також сигнальних
шляхів, у яких вони беруть участь, є використання специфічних
низькомолекулярних інгібіторів. Такі інгібітори є особливо ефективними у
випадку конститутивно активних протеїнкіназ, які не активуються у
відповідь на специфічні стимули та існують у клітині лише в активній
формі (Sarno et al., 2005). Отже, у випадку протеїнкінази СК2
використання специфічних інгібіторів є однією із найперспективніших
стратегій для вивчення її функціональних особливостей.

Якщо активність протеїнкінази або її підвищення за певних умов
призводить до патологічних змін (Cohen, 2002; Noble et al., 2005), то
інгібітори такої протеїнкінази є потенційними попередниками
фармацевтичних препаратів. Щодо СК2, то значна кількість
експериментальних даних вказує на те, що вона бере участь у розвитку
низки патологічних станів. СК2 функціонує як загальний антиапоптотичний
агент (Wang et al., 2005), який сприяє виживанню клітини в умовах, коли
клітинна смерть є необхідною. Експресія СК2 значно підвищена в більшості
пухлин та у швидко проліферуючих тканинах (Tawfic et al., 2001). СК2
використовується багатьма вірусами для фосфорилювання власних білків
(Meggio et al., 2003), а також бере участь у розвитку запальних процесів
(Yamada et al., 2005). Таким чином, СК2 є перспективною мішенню для
розробки протипухлинних, противірусних та протизапальних препаратів.

Разом із тим, поки що жоден з відомих інгібіторів СК2 не використовують
у клінічній практиці. Отже, пошук нових специфічних інгібіторів СК2, що
мали б високу активність, є нині актуальним.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконувалась за конкурсною тематикою “Розробка інгібіторів
протеїнкіназ CDK2 та CK2 як потенційних ліків проти онкологічних
захворювань” в рамках проекту “Новітні медико-біологічні проблеми та
оточуюче середовище людини”, договори №№ 3/2004, 3/2005, 3/2006,
затверджено президією НАНУ від 25.11.03.

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи була розробка
нових низькомолекулярних інгібіторів СК2 людини та дослідження їхньої
взаємодії з амінокислотними залишками активного центру СК2 методами
комп’ютерного моделювання. Для досягнення цієї мети було поставлено та
вирішено такі завдання:

Провести рецептор-орієнтований віртуальний скринінг бібліотеки малих
органічних сполук та перевірити активність in vitro перспективних
сполук.

Дослідити молекулярну динаміку (МД) СК2 та її комплексів із
найактивнішими інгібіторами.

Розробити модель взаємодії отриманих низькомолекулярних інгібіторів із
СК2.

Встановити кореляцію “хімічна структура — біологічна активність” в низці
розроблених інгібіторів.

Дослідити специфічність розроблених інгібіторів СК2 в ряду протеїнкіназ.

Спрогнозувати структуру інгібіторів СК2 з більш високою активністю.

Об’єкт дослідження: інгібіторна активність низькомолекулярних органічних
сполук щодо СК2 людини.

Предмет дослідження: комплекси “СК2-інгібітор”, молекулярна динаміка
комплексів “СК2-інгібітор”; механізми взаємодії інгібіторів з активним
сайтом СК2, які обумовлюють їхню інгібіторну активність; специфічність
інгібіторів СК2 щодо різних протеїнкіназ.

Методи дослідження: гнучкий молекулярний докінг, метод молекулярної
динаміки, метод термодинамічної інтеграції, біохімічне тестування
активності протеїнкіназ in vitro.

Наукова новизна одержаних результатів.

Розроблено та охарактеризовано два нові класи високоактивних специфічних
інгібіторів СК2 людини – тетрагалогено-1,3-діоксо-2,3-дигідроізоіндоли
та 3-карбокси-4-(1Н)-хінолони.

Уперше проведено розрахунок та дослідження молекулярної динаміки СК2
людини та її комплексів з низькомолекулярними інгібіторами.

Уперше побудовано модель взаємодії нових інгібіторів з амінокислотними
залишками активного сайту СК2 та визначено міжмолекулярні контакти, що
обумовлюють активність нових інгібіторів. Встановлено залежність
хімічної структури розроблених інгібіторів від їхньої біологічної
активності.

Уперше вивчено специфічність нових інгібіторів СК2 в ряду протеїнкіназ.

Передбачено хімічну структуру потенційно більш активних інгібіторів
протеїнкінази СК2.

Практичне значення одержаних результатів. У результаті цієї
дисертаційної роботи отримано 2 нових класи високоактивних специфічних
інгібіторів протеїнкінази СК2 та охарактеризовано їх взаємодію з
ферментом. Ці дані можуть бути використані:

Для вивчення особливостей функціонування СК2 в сигнальних шляхах, у яких
вона бере участь.

Для вивчення низки патологічних процесів, зокрема механізмів
пухлиноутворення, інфекційних та запальних процесів, які протікають за
участі СК2.

Розроблені інгібітори СК2 є потенційними попередниками терапевтичних
препаратів, на основі яких через подальшу оптимізацію можуть бути
розроблені ліки для терапії онкологічних, інфекційних та запальних
захворювань.

Запропонована модель взаємодії нових інгібіторів із СК2 дає змогу глибше
зрозуміти молекулярну картину функціонування протеїнкіназ та структурні
особливості комплексів СК2 із низькомолекулярними інгібіторами. Ця
модель може бути використана для подальшої розробки та структурної
оптимізації інгібіторів СК2.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи
автором власноручно проведено експерименти, пов’язані з молекулярним
моделюванням. Виконано віртуальний скринінг бібліотек низькомолекулярних
сполук, розраховано молекулярну динаміку СК2 та її комплексів з
інгібіторами, визначено різницю вільної енергії зв’язування методом
термодинамічної інтеграції, здійснено параметризацію програм
молекулярного докінгу та молекулярної динаміки. Здобувачем особисто
проведено аналіз та порівняння результатів МД, аналіз молекулярних
комплексів, що отримані гнучким докінгом.

Постановку наукових завдань дослідження та подальшу інтерпретацію
отриманих результатів здійснено спільно з науковим керівником д.х.н.,
проф. С. М. Ярмолюком та членами групи молекулярного моделювання відділу
комбінаторної хімії ІМБіГ НАНУ. Аналіз результатів біологічного
тестування in vitro та встановлення кореляційних залежностей “хімічна
структура-біологічна активність” у низці досліджуваних хімічних сполук
проводили спільно з к.х.н. В. Г. Бджолою. Параметризацію молекулярних
топологій досліджуваних лігандів та налагодження системи віртуального
скринінгу проведено спільно з О. Я. Яковенком.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи
доповідались на Конференції молодих вчених в Інституті молекулярної
біології та генетики НАН України (Київ, Україна, 2003), Конференції
“CNCH-2003” (Харків, Україна, 2003), 3-й Міжнародній конференції
“Інгібітори протеїнкіназ 2003” (Варшава, Польща, 2003), Міжнародній
конференції “Wold Conference on Magic Bullets” (Нюрнберг, Німеччина,
2004), XX Українській конференції з органічної хімії (Одеса, Україна,
2004), 4-й Міжнародній конференції “Інгібітори протеїнкіназ 2005”
(Варшава, Польща, 2005), 5-й Міжнародній конференції “Протеїнкінази”
(Цюріх, Швейцарія, 2006), Міжнародній конференції “Новітні досягнення
органічної хімії” (Судак, Україна, 2006).

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковані у 3 статтях у
наукових фахових журналах, а також представлені на 8 наукових
конференціях у вигляді усних доповідей, постерних презентацій та тез. За
результатами роботи було отримано 2 деклараційних патенти на винахід.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду
літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів дослідження,
які викладено у двох розділах, аналізу та узагальнення результатів
роботи, висновків, списку використаних джерел, який нараховує 134
найменувань, та додатків. Дисертація містить 38 рисунків та 13 таблиць.
Загальний обсяг дисертації складає 139 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження.

Віртуальний скринінг. Для віртуального скринінгу просторову структуру
каталітичної субодиниці СК2 (рецептор) було взято з бази даних RCSB
Protein Data Bank (ID: 1JWH). Сфери активного сайту (точки докінгу)
розраховано програмами sphgen (пакет DOCK) та Connolly MS. Обертальні
зв’язки та якірні елементи молекул лігандів ідентифікували програмою
DOCK в автоматичному режимі. Множинні якірні елементи у структурі
ліганду були дозволені. Орієнтаційний пошук здійснено із застосуванням
автоматичного збігу. Було дозволено локальну мінімізацію та
ре-мінімізацію енергії орієнтацій та конформацій ліганду і його якірних
елементів. Параметри мінімізації енергії взято за умовчанням.

Молекулярна динаміка комплексів СК2-інгібітор у водному середовищі.
Розрахунок молекулярної динаміки комплексів СК2-інгібітор
(рецептор-ліганд) у водному середовищі проведено з використанням пакета
програм GROMACS. Топології лігандів (формат файлів gro та itp) будували
за допомогою програми TOPBUILDER. Часткові атомні заряди лігандів
розраховували програмою GAMESS. Стартову позицію лігандів в активному
сайті рецептора генерували за допомогою пакета програм DOCK. Структуру
комплексу “ліганд-рецептор” розміщували в центрі кубічного боксу, після
цього бокс заповнювали молекулами води (модель SPC216). Далі проводили
мінімізацію енергії комплексу у водному оточенні. Фінальні координати
системи рецептор-ліганд-розчинник, отримані в результаті мінімізації
енергії, було використано для розрахунку “обмеженої” молекулярної
динаміки протягом 40 пс, яка включала гармонічну прив’язку позицій
важких атомів рецептора та ліганду до вихідних координат. Систему
“білок-ліганд-вода”, отриману в результаті “обмеженої” динаміки, брали
як вихідну для розрахунку “повної” динаміки протягом 2 нс.

Термодинамічна інтеграція. Перехід (пертурбацію) системи зі стану Х в
стан Y здійснювали шляхом поступової мутації параметрів, що описують
систему X, в набір параметрів системи Y. Для проведення мутацій будували
відповідні файли топологій, які описували початкову (X) та кінцеву (Y)
структуру ліганду. Для інтерполяції ван-дер-ваальсових та
електростатичних взаємодій застосовували помірний потенціал (soft-core
potential), реалізований у програмі GROMACS.

Вільну енергію ДFbX–Y для усіх випадків розраховували з використанням 21
л-точки, тобто під час аналізу системи при л = 0…л = 1 інкремент
дорівнював 0,05. Розрахунок (Н(л)/ (л проводили протягом 400 пс. Середнє
значення похідних обчислювали при кожному значенні л, отриманий профіль
вільної енергії було проінтегровано з використанням трапеційного методу.
Оціночну похибку розраховано за допомогою методу блочного усереднення.

Результати досліджень та обговорення.

Пошук інгібіторів протеїнкінази СК2 серед похідних 4-амінохіназоліну. На
першому етапі досліджень пошук інгібіторів СК2 проводили серед похідних

4-амінохіназоліну (рис. 1). Пригнічення активності CK2 похідними
4-амінохіназоліну до цього часу практично не вивчали. Проте відомо, що
амінохіназоліни є найпоширенішими інгібіторами протеїнкіназ, зокрема
циклін-залежних та тирозинових. З огляду на це проведено
рецептор-орієнтований віртуальний скринінг бібліотеки 1000 похідних
4-амінохіназоліну. В результаті скринінгу відібрано 75 сполук для
біологічного тестування in vitro.

R1=H, Ar, COOAlk

R2=H, Alk

R3=Alk, Ar, Het

R4=H

R5=H, Alk, Hal

R6=H

4.57

IC50 = 7,7 мМ Рис. 1. Структура та активність 4-амінохіназолінів; а –
загальна хімічна структура похідних 4-амінохіназоліну; б – структура
найактивнішої сполуки 4.57

а б

Після проведення in vitro тестування виявили, що 26 сполук даного класу
в концентрації 33 µM пригнічують активність СК2 більш як на 50 %.
Значення IC50 для найактивнішої сполуки 4.57 (рис. 1) склало 7,7 мМ.

З метою вивчення взаємодій, які забезпечують інгібіторну активність
4-амінохіназолінів, досліджено комплекси активних сполук з СК2, отримані
методом молекулярного докінгу. Під час аналізу виявлено, що взаємодія
сполук із активним сайтом СК2 переважно відбувається за рахунок
гідрофобних контактів (рис. 2). Очевидно, основний внесок в стабілізацію
комплексу вносить хіназолінове ядро, яке має гідрофобні контакти з
вісьмома амінокислотними залишками АТФ-зв’язувального сайту.
Найважливішими серед цих контактів є взаємодія ліганду з Phe113, Ile174,
Val66 та Met163. Хіназоліновий гетероцикл щільно фіксується між
залишками Phe113 та Ile174, причому його контакт із Phe113 реалізується
за типом стекінг-взаємодії. Докінг не виявив утворення водневих зв’язків
між лігандом та рецептором. Але у природних умовах існування комплексу
можна припустити формування міжмолекулярних водневих зв’язків ліганду з
залишком Val116 (так, як це показано на рис. 2).

Сприятливим є гідрофобний контакт карбоксифенілу в позиції R3
найактивнішої сполуки 4.57 із залишком Val66. Серед тестованих похідних
4-амінохіназоліну найбільшу інгібіторну активність стосовно СК2
виявляють сполуки з R3 = 4- або 3-карбоксифеніл. Амінохіназоліни з R3 =
4-карбоксифеніл виявляють вищу інгібіторну активність порівняно зі
сполуками, які мають у цій позиції 3-карбоксифеніл. Можливо, це
спричинено додатковою, крім контактів з Val66 та Val116, взаємодією
4-карбоксигрупи з His115, яка не спостерігається у випадку сполук з R3 =
3-карбоксифеніл.

Замісник R1 у другій позиції 4-амінохіназоліну (на рис. 2 R1 =
3-метилфеніл), має слабкі гідрофобні контакти з Ile174 і переважно
експонується у розчинник. Тому, згідно з просторовою структурою
розрахованого комплексу, наявність у цій позиції гетероциклу
розгалужених гідрофобних замісників знижує інгібіторну активність
похідних 4-амінохіназоліну щодо СК2 в біологічних тестах.

Iiooe ?ia?a?oi??a i?ioa?ie?iace NE2 na?aae iio?aeieo 4-ai?iio?iie?io.
Aiae?coth/e результати, отримані при дослідженнях взаємодій похідних
4-амінохіназоліну з активним сайтом СК2, ми звернули увагу на хімічний
клас 4-амінохінолінів (рис. 3). Дотепер ці сполуки не досліджували як
інгібітори СК2, а їхня загальна хімічна структура є дуже подібною до
4-амінохіназолінів. З огляду на це клас 4-амінохінолінів було обрано для
наступного етапу пошуку інгібіторів СК2 та вивчення особливостей будови
їхніх комплексів. Для цього провели віртуальний скринінг наявної
бібліотеки 1565 похідних 4-амінохіноліну і відібрали 52 сполуки для
біологічного тестування.

19 похідних 4-аміно-3-карбетоксихіноліну в концентрації 33 µM
пригнічували активність CK2 більш як на 50 %. Найактивнішими виявились
сполуки 1.14 (IC50 = 19 µМ), 1.15 (IC50 = 17 µМ), 1.16 (IC50 = 19 µМ),
1.32 (IC50 = 9 µМ). Їхню хімічну структуру наведено в табл. 1.

За допомогою методу молекулярного докінгу показано, що всі перелічені
активні сполуки мають схожий тип зв’язування (рис. 4), який подібний до
зв’язування амінохіназолінів з СК2 (описано вище). Основний внесок у
стабілізацію комплексу робить хінолінове ядро, яке має гідрофобні
контакти з сімома амінокислотними залишками активного центру. Було також
виявлено фіксацію хінолінового ядра між залишками Phe113 і Ile174, та
стекінг-взаємодію з Phe113. Докінг ідентифікував водневий зв’язок між
карбетоксигрупою ліганду та залишками Lys68 (рис. 4). Атом Оксигену
карбонільної групи ліганду та атом Нітрогену б-амідної групи Asp175
знаходяться на відстані 3,04 Е. Тому можна очікувати, що між ними також
утворюється водневий зв’язок, коли комплекс існує у природних умовах.

Комплекси сполук із CK2, отримані in silico, зіставлено з даними
біологічного тестування з метою з’ясування впливу хімічної природи
замісників на біологічну активність 4-аміно-3-карбетоксихінолінів. На
їхню активність найбільший вплив має замісник R3. Активність найвища за
умови, коли R3 = СOOEt. Карбетоксигрупа ліганду має гідрофобні контакти
з Leu45, Val66, Val116, Asn118 та Met163, заміна в ній етилу на метил,
очевидно, спричинює втрату додаткових контактів з Leu45, Val116 та
Asn118 і значно зменшує інгібіторну активність сполук. Біологічні тести
показали,

Таблиця 1

Хімічна структура та інгібіторна активність сполук 1.14, 1.15, 1.16,
1.32

IC50, µM 19 17 19 9

що на активність 4-аміно-3-карбетоксихінолінів значно впливає варіація
замісника R1. У всіх комплексах активних сполук 1.14, 1.15, 1.16, 1.32
цей замісник має гідрофобні контакти із трьома амінокислотними залишками
АТФ-зв’язувального сайту Met163, Ile174 та Asp175. Значно більша
активність сполуки 1.32 (R1 = 4-ацетамідофеніл), можливо, пояснюється
тим, що навколо ацетамідної групи ліганду розташовані амінокислотні
залишки ферменту Asp175 та His160, які можуть утворювати з нею водневі
зв’язки. Отже, на наш погляд, збільшення інгібіторної активності
лігандів можна досягти варіацією радикала в позиції R1 за рахунок
утворення ним додаткових водневих зв’язків.

Розробка нових інгібіторів СК2

на основі 3-карбокси-4-(1Н)-хінолонів. Ґрунтуючись на аналізі
взаємозв’язку хімічної структури та біологічної активності
4-амінохіназолінів та 4-амінохінолінів, для наступного етапу дослідження
взяли структурно подібний хімічний клас 4-(1Н)-хінолонів. Окрім
структурної подібності до 4-амінохіназолінів та 4-амінохінолінів, цей
клас цікавий тим, що для нього відсутні літературні дані щодо
інгібіторної активності стосовно протеїнкіназ. Тому провели віртуальний
скринінг наявної комбінаторної бібліотеки 1045 похідних 4-(1Н)-хінолону
(рис. 5). Із 81 похідних 4-(1Н)-хінолону, відібраних за результатами
докінгу, 4 сполуки (3.7, 3.9, 3.55 та 3.67) виявили високу активність у
біологічних тестах (табл. 2). Кінетичні експерименти показали, що ці
сполуки є АТФ-конкурентними.

Aeey aecia/aiiy naeaeoeaiino? ?ia?a?oi??a 3.7 oa 3.9 (aeae? ??7 oa ??9)
noiniaii СК2 ?oith ?ia?a?oi?io aeoeai?noue ia?aa??eee ia i’yoe
na?ei/o?aii?iiaeo oa aeaio oe?iceiiaeo i?ioa?ie?iacao (oaae. 3). sse
aeaeii c oaaeeoe?, ciaeaeai? ?ia?a?oi?e aeyaeythoue aenieo
niaoeeo?/i?noue ?ia?aoaaiiy NE2. ?aeeiei aeiyoeii ? i?ioa?ie?iaca
DYRK1a, caeeoeiaa aeoeai?noue yei? i?e aeiaeaaaii? ?ia?a?oi?a ??7
neeaaea? 35 %. Aa?oi cacia/eoe, ui iaea?eueo niaoeeo?/i? ?ia?a?oi?e СК2,
a?aeii? ia aeaiee iiiaio c e?oa?aoo?e, – OAA oa IQA – oaeiae nooo?ai
i?eai?/othoue aeoeai?noue DYRK1a a aeine?aeao ia 31 i?ioa?ie?iac? (?oi?
cia/aiiy IC50 neeaaeathoue 1 µI oa 6 µI a?aeiia?aeii). Ia nueiaiaei?
?ic?iaeai? iaie 3-ea?aiene-4-(1I)-o?iieiie ? iiaeie e iaeieie c
iaeaeoeai?oeo ?ia?a?oi??a СК2 ethaeeie.

Таблиця 2

Хімічна структура та інгібіторна активність сполук 3.7, 3.9, 3.55, 3.67

Ki, µM 0,06 0,28 0,48 0,15

IC50, µM 0,3 1,0 0,8 2,0

Таблиця 3

Залишкова активність низки протеїнкіназ після додавання

інгібіторів ІР7 та ІР7 у концентрації 10 µМ

Протеїн-кіназа Активність

після додавання ІР7, % Активність

при додаванні ІР9, % Протеїн-кіназа Активність

при додаванні ІР7, % Активність

при додаванні ІР9, %

CK2

JNK3

ROCK-I

p56 LCK 11

74

85

87 25

81

78

80 DYRK1a

MSK1

GSK3

CDK5 35

71

>50

>50 85

89

>50

>50

Дослідження молекулярної динаміки комплексів СК2-ІР7 та СК2-ІР9,
побудова моделі взаємодії 3-карбокси-4-(1Н)-хінолонів з
АТФ-зв’язувальним сайтом СК2. Для аналізу типів зв’язування інгібіторів
ІР7 та ІР9 із СК2 нами вперше було проведено розрахунок молекулярної
динаміки (МД) комплексів СК2–інгібітор у часовому діапазоні 2 нс. У
результаті розрахунків отримано стабільні траєкторії МД для комплексів
СК2 – ІР7, СК2 – ІР9 та не зв’язаної з АТФ чи інгібітором молекули СК2.
Отримані траєкторії МД використано для вивчення типів зв’язування
інгібіторів ІР7 та ІР9 з ферментом, а також для експериментів з
термодинамічної інтеграції.

Рис. 6. Інгібітори ІР7 та ІР9 в АТФ-зв’язувальному сайті СК2. Відмічено
водневі зв’язки, які потенційно можуть формуватись між лігандом та
рецептором, вказано їхні довжини (в ангстремах). Типи зв’язування
інгібіторів ІР7 (а) та ІР9 (б) в активному сайті СК2 отримані в
результаті розрахунку МД. в – стартові позиції ІР7 та ІР9 взяті для
розрахунку МД.

г – суперпозиція типів зв’язування інгібіторів ІР7 та ІР9 в активному
сайті СК2, що розраховані МД

Аналіз траєкторій МД показав, що загалом сполуки ІР7 та ІР9 мають
подібний тип зв’язування з СК2 (рис. 6, а, б). Вони розміщуються в
АТФ-зв’язувальному сайті СК2, взаємодіють з гідрофобними залишками
амінокислот С- та N-кінцевого доменів і утворюють водневі зв’язки з
амінокислотними залишками Lys68 та Asp175. Для сполуки ІР7 спостерігали
ще один водневий зв’язок між карбоксильною групою ліганду і
г-карбоксильною групою Glu81.

Сполуки ІР7 та ІР9 утворюють гідрофобні контакти із низкою
амінокислотних залишків АТФ-зв’язувального сайту СК2 (рис. 6, а, б).
Контакти із залишками Phe113, Val66 і Ile174 є ключовими. Для сполуки
ІР9 спостерігали слабку гідрофобну взаємодію з Phe113 порівняно із
сполукою ІР7 (рис. 6, б).

Позиції лігандів у активному сайті СК2, розраховані програмою DOCK і
взяті як стартові для розрахунку МД, є майже ідентичними для ІР7 та ІР9
(рис. 6, в).

У процесі МД такий тип зв’язування зазнає певних змін. Протягом перших
20 пс динаміки, карбоксильна група інгібітора ІР7, обертаючись, формує
додатковий зв’язок з Glu81, і до кінця розрахунку МД спостерігали
довготривалі водневі зв’язки з Lys68, Asp175 та Glu81. Навпаки,
інгібітор ІР9 зміщується відносно початкової позиції в напрямку
шарнірної ділянки АТФ-зв’язувального сайту і втрачає стекінг-взаємодію з
залишком Phe113, але посилює контакт хінолонового ядра та конденсованого
по грані Н бензенового кільця з Leu45, Val53, Val66 та Ile174,
зберігаючи водневі зв’язки з Lys68 та Asp175 (рис. 6, г).

Аналіз співвідношення “хімічна структура-біологічна активність” у ряду
3-карбокси-4-(1Н)-хінолонів. На основі даних біологічного скринінгу та
запропонованого нами типу зв’язування похідних 4-(1Н)-хінолону з СК2
проаналізовано вплив замісників у хімічній структурі цих сполук на їхню
біологічну активність (рис. 7). Найважливішим замісником у структурі
похідних 4-(1Н)-хінолону є 3-карбоксигрупа. На відміну від похідних із
3-карбоксигрупою, похідні із 3-карбетоксигрупою мають значно нижчу
активність. Відповідно до запропонованого типу зв’язування це можна
пояснити формуванням стабільних водневих зв’язків 3-карбоксигрупи з
амінокислотними залишками АТФ-зв’язувального сайту – Lys68 та Asp175.

Значний вплив на інгібіторну активність сполук має варіація замісників у
позиціях R4 та R5 4-(1Н)-хінолону. Найбільшу активність виявляють
сполуки, які в цих позиціях мають гідрофобні замісники. Варіація
замісників у позиціях R2 та R3 4-(1Н)-хінолону менше впливає на
біологічну активність сполук, що пояснюється незначною взаємодією
замісників у цьому регіоні АТФ-зв’язувального сайту з амінокислотними
залишками.

Визначення відносної енергії зв’язування нових інгібіторів СК2 методом
термодинамічної інтеграції. Для розрахунку відносної вільної енергії
нових інгібіторів СК2 – 3-карбокси-4-(1Н)-хінолонів, а також для
передбачення їх більш активних похідних використано метод
термодинамічної інтеграції (ТІ).

ТІ розраховано як для інгібіторів зі встановленою нами активністю, так і
для “віртуальних сполук”, отриманих за рахунок варіацій позицій атомів
Хлору в гетероциклі ліганду. Напрямок проведених мутацій X ? Y та
результати розрахунків наведено в таблиці 4.

Результати розрахунків ТІ показали, що підвищення активності нового
класу інгібіторів СК2 3-карбокси-4-(1Н)-хінолонів можна досягти через
уведення до їхньої структури додаткових гідрофобних замісників,
наприклад атомів Хлору. Причому, такі групи повинні локалізуватись у
сприятливих зонах активного сайту СК2 (позиції R5, R4, R3 гетероциклу).
Очевидно, що ефект буде зростати пропорційно величині гідрофобності
замісників, тому вірогідно, що бромо- та йодо-заміщені похідні
3-карбокси-4-(1Н)-хінолонів будуть мати більшу активність, ніж
хлоропохідні. У процесі розрахунку ТІ IP7 ? ІР9 для ІР9 показано зміну
типу зв’язування. При значенні параметра л = 0,75 на 85 пс розрахунку
стартова позиція, що відповідала розрахованому типу зв’язування
інгібітора ІР7, починала змінюватись на таку, що відповідає типу
зв’язування інгібітора ІР9 (описано вище), і остаточно сформувалась
протягом наступних значень л. Таким чином, отримані результати
розрахунку загалом підтверджують експериментальні дані з біологічної
активності інгібіторів ІР7 та ІР9, а також ще раз вказують на існування
відмінностей у типах зв’язування інгібіторів ІР7 та ІР9.

Таблиця 4

Напрямок проведених мутацій

ІР7

Ki = 0,06 мM ?

ІР9

V \ ^ ¦ ® ? E ?

A

:

$

l

?

?

?

th

l

„@

„Ao^„@

„@

^„@

„@

^„@

„@

„Ao^„@

a

j`

oe

oe

oe

1/4

1/4

\

ІР7

Ki = 0,06 мM ?

ІР67

ІР7

Ki = 0,06 мM ?

ІР55

ІР7

Ki = 0,06 мM ?

ІР7

Ki = 0,06 мM ?

ІР7

Ki = 0,06 мM ?

ІР7

Ki = 0,06 мM ?

ІРТ3

Пошук інгібіторів СК2 серед похідних
тетрагалогено-1,3-діоксо-2,3-дигідроізоіндолу. Для пошуку нових
інгібіторів CK2 проводили також рецептор-орієнтований віртуальний
скринінг великої бібліотеки низькомолекулярних органічних сполук, яка
налічувала понад 70000 структур. Комбінаторна бібліотека мала значну
диверсійність (різноманітність), оскільки складалася з багатьох хімічних
класів. Серед сполук, відібраних за даними розрахунків, виявились три

похідні тетрагалогено-1,3-діоксо-2,3-дигідроізоіндолу (TID) (рис. 8).
Цей клас сполук раніше не досліджувався як інгібітори CK2. Але з
літератури відомо, що галогеновані похідні інших класів сполук –
бензотріазолу та бензімідазолу – є селективними інгібіторами CK2. У
зв’язку з цим було вирішено ретельніше вивчити галогеновані
1,3-діоксо-2,3-дигідроізоіндоли.

Біологічне тестування показало, що ці сполуки значно пригнічують
активність CK2. В табл. 5 наведено дані біологічного тестування для
цього класу сполук. Як видно з таблиці, найактивнішим інгібітором є
сполука 2.46 (IC50 = 0,15 мM).

Для дослідження механізму дії знайдених інгібіторів 2.43 та 2.46
проведено кінетичні експерименти при різних концентраціях інгібітора та
АТФ, константи інгібування склали 0,2 мM та 0,1 мM відповідно. Отримані
дані вказують на те, що ці інгібітори конкурують із АТФ за сайт
зв’язування СК2.

.

Таблиця 5

Хімічні структури активних похідних

тетрагалогено-1,3-діоксо-2,3-дигідроізоіндолів та їхні значення IC50

1,5

За даними докінгу, всі активні похідні TID мають однаковий тип
зв’язування з СК2 (рис. 9). Тетрагалоген-заміщений гетероцикл сполук
розташовується в АТФ-зв’язувальному сайті СК2 аналогічно до
місцерозташування тетрабромо-заміщеного кільця
4,5,6,7-тетрабромобензотріазолу (ТВВ) у комплексі ТВВ–СК2, структура
якого визначена методом рентгеноструктурного аналізу. Найважливішою є
взаємодія TID з Val53, Val66, Ile174 та Phe113. Слід зазначити, що TID
може утворювати два водневі зв’язки, які формуються між карбоксильною
групою ліганду й атомами Нітрогену б-амідної групи Trp176 і е-аміногрупи
Lys68. ТВВ, у свою чергу, утворює два водневі зв’язки із амінокислотними
залишками Lys68 та Glu81 за допомогою містка з двох молекул води.

На основі даних біологічного скринінгу та запропонованого нами типу
зв’язування похідних TID проаналізовано вплив їхніх хімічних замісників
на інгібіторну активність. Інгібіторні властивості цих сполук суттєво
зменшуються у ряду тетраІ >> тетраBr > тетраCl. З цього можна зробити
висновок, що гідрофобні взаємодії є найважливішими для інгібіторної
активності TID.

На інгібіторну активність сполук значно впливає варіація замісника R, за
участю якого утворюються два водневі зв’язки. Найбільш оптимальним
замісником R є 2-іл-пропіонова кислота (сполука 2.46, IC50 = 0,15 мM).
Заміна 2-іл-пропіонової кислоти на ацетил дещо зменшує активність
(сполука 2.43, IC50 = 0,3 мM). Запропонована нами модель пояснює цей
факт зменшенням гідрофобної взаємодії ліганду 2.43 з амінокислотними
залишками Phe113, Ile95 через відсутність метильної групи (порівняно з
лігандом 2.46). З іншого боку, збільшення об’єму замісників, що
локалізуються в цій ділянці активного сайту, очевидно, спричинює
стеричні ускладнення, дестабілізує комплекс в цілому та, як наслідок,
зменшує активність інгібіторів (сполуки 2.47, 2.49 та 2.44, IC50 = 1,25
мM, 2 мM та 6,5 мM відповідно). Подовження карбонного ланцюга замісника
R ізоіндолу (рис. 8) також зменшує активність сполук (R = ацетил, IC50 =
0,3 мM; R = 3-іл-пропіонова кислота, IC50 = 0,75 мM).

Інгібіторна активність похідних TID стосовно СК2 на сьогодні є однією з
найвищих. Ці інгібітори можуть бути використані для подальшої
структурної оптимізації та біологічних досліджень.

Рис. 10. Схематичне зображення спільних ознак інгібіторів СК2. HA –
акцептор водню, HD – донор водню. Вказано ключові хімічні групи
“оптимального” інгібітора СК2

Характеристика “оптимального” інгібітора СК2. Підсумовуючи отримані
результати та опираючись на дані із структури раніше відомих інгібіторів
СК2, можна зробити висновок, що для активного сайту СК2 найбільш
“сприятливими” є сполуки, які характеризуються низкою спільних ознак
(рис. 10). По-перше, це наявність жорсткого ароматичного ядра, що
локалізується між гідрофобними залишками Phe113, Ile174 та Val66.
Ароматичне ядро, як мінімум, повинно складатися з двох конденсованих
кілець. По-друге, у ділянці локалізації кластера залишків Lys68, Asp175,
Glu81 повинні бути донорно-акцепторні групи ліганду, за рахунок чого
можуть утворюватись міжмолекулярні водневі зв’язки. По-третє, кількість
обертальних зв’язків у структурі інгібітора повинна бути обмеженою до
2-3, інгібітор не повинен мати розгалужених та об’ємних замісників.
По-четверте, з огляду на сприятливу орієнтацію донорно-акцепторних груп
амінокислотних залишків шарнірної ділянки (таких як Val116 та Glu114)
вони можуть утворювати міжмолекулярні водневі зв’язки. Отже є
перспективним уведення відповідних замісників у структуру ліганду для
того щоб ініціювати утворення водневих зв’язків у цій ділянці активного
сайту.

ВИСНОВКИ

Використовуючи методи гнучкого докінгу та молекулярної динаміки,
знайдено нові інгібітори протеїнкінази СК2 людини та досліджено
особливості їхньої взаємодії з амінокислотними залишками активного
центру ферменту. Запропоновано моделі зв’язування цих інгібіторів в
активному центрі СК2, вироблено рекомендації для подальшої оптимізації
їхньої структури.

На основі молекулярних комплексів, розрахованих методом гнучкого
докінгу, запропоновано модель взаємодії похідних 4-амінохіназолінів та
4-амінохінолінів з сайтом зв’язування АТФ протеїнкінази СК2. Згідно
моделі, зв’язування інгібіторів цих класів сполук з СК2 відбувається в
основному за рахунок гідрофобних взаємодій із залишками Phe113, Val66,
Ile174 активного центру.

Використовуючи методи молекулярного докінгу та молекулярної динаміки,
для нових класів інгібіторів СК2 – 3-карбокси-4-(1Н)-хінолонів та
тетрагалогено-1,3-діоксо-2,3-дигідроізоіндолів розроблено моделі їхньої
взаємодії з активним центром ферменту. Показано, що ці класи інгібіторів
взаємодіють з CK2 формуючи водневі зв’язки з амінокислотними залишками
Lys68, Asp175, Glu81, Trp176, та утворюючи гідрофобні контакти з
залишками Phe113, Val66, Val53, Ile174.

Для отриманих інгібіторів СК2 – 4-амінохіназолінів, 4-амінохінолінів,
3-карбокси-4-(1Н)-хінолонів та
тетрагалогено-1,3-діоксо-2,3-дигідроізоіндолів встановлена залежність
“хімічна структура – біологічна активність”.

За допомогою методу термодинамічної інтеграції спрогнозовано структуру
та активність низки похідних 3-карбокси-4-(1Н)-хінолонів in silico.
Показано, що похідні з вищою інгібіторною активністю in vitro можна
отримати за рахунок варіації числа та положень атомів Хлору хінолонового
ядра.

Запропоновано критерії структури “оптимального” інгібітора СК2,
основними з яких є наявність жорсткого ароматичного ядра, присутність
донорно-акцепторних груп у ділянці локалізації кластера залишків Lys68,
Asp175, Glu81 та обмежена кількість ротабельних зв’язків. Розроблені
критерії можуть бути використані для дизайну нових інгібіторів СК2.

Ідентифіковано низку нових інгібіторів СК2 серед комбінаторних бібліотек
4-амінохіназолінів (ІC50 = 7,7 мМ) та 4-амінохінолінів (ІC50 = 9 мМ), а
також два нових специфічних класи інгібіторів СК2 –
тетрагалогено-1,3-діоксо-2,3-дигідроізоіндоли (ІC50 = 0,15 мМ) та
3-карбокси-4-(1Н)-хінолони (ІC50 = 0,3 мМ). На основі цих інгібіторів
можуть бути створені біологічно активні сполуки для використання в
молекулярно-біологічних дослідженнях та медичній практиці.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ,

ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Сапелкін В.М., Голуб А.Г., Яковенко О.Я., Бджола В.Г., Ярмолюк С.М.
Пошук інгібіторів казеїнкінази 2 серед похідних 4-амінохіназоліну //
Ukrainica Bioorganica Acta. – 2004. – Т. 1, № 1-2. – С.74-79.

Особистий внесок здобувача — віртуальний скринінг похідних
4-амінохіназоліну, аналіз залежності “хімічна структура-біологічна
активність”, власноруч написано основну частину статті.

Сапелкін В.М., Голуб А.Г., Яковенко О.Я., Бджола В.Г., Ярмолюк С.М.
Пошук інгібіторів протеїнкінази CK2 серед похідних
3-карбетокси-4-амінохіноліну // Ukrainica Bioorganica Acta. – 2005. – Т.
2, № 1. – С.28-32.

Особистий внесок здобувача — віртуальний скринінг похідних
3-карбетокси-4-амінохіноліну, розробка моделі їхнього зв’язування в
активному сайті СК2, аналіз залежності активності
3-карбетокси-4-амінохінолінів від їх структури.

Golub A.G., Yakovenko O.Y., Bdzhola V.G., Sapelkin V.M., Zien P.,
Yarmoluk S.M. Evaluation of 3-Carboxy-4(1H)-quinolones as Inhibitors of
Human Protein Kinase CK2 // J. Med. Chem. – 2006. – Vol. 49, № 22. –
P.6443-6450.

Особистий внесок здобувача — параметризація програм докінгу та
молекулярної динаміки, докінг та розрахунок молекулярної динаміки
похідних 3-карбоксихінолонів, побудова моделі їхнього зв’язування в
активному сайті СК2, аналіз залежності “хімічна структура – біологічна
активність”, власноруч написано основну частину статті.

Сапелкін В.М., Лукашов С.С., Голуб А.Г., Бджола В.Г., Яковенко О.Я.,
Ярмолюк С.М., Дубініна Г.Г. Застосування 4-заміщених 3-карбоксихінолінів
як інгібіторів протеїнкінази СК2. Пат. UА68984 А, C07D215/00,
2004-08-16.

Особистий внесок здобувача — планування стратегії пошуку інгібіторів
СК2, віртуальний скринінг похідних 3-карбоксихінолінів, аналіз
залежності “хімічна структура-біологічна активність”.

Приходько А.О., Голуб А.Г., Яковенко О.Я., Бджола В.Г., Дубиніна Г.Г.,
Ярмолюк С.М. Застосування 4,5,6,7-тетрагалогено-1,3-ізоіндоліндіонів як
інгібіторів протеїнкінази СК2. Пат. UA69165 А, С07D215/00, 2004-08-16.

Особистий внесок здобувача — віртуальний скринінг похідних
тетрагалогеноізоіндолів, аналіз залежності “хімічна структура-біологічна
активність”.

Sapelkin V.M., Lukashov S.S., Golub A.G., Yakovenko O.Ya., Bdzhola V.G.,
Dubinina G.G., Yarmoluk S.M. Search of protein kinase CK2 inhibitors
among combinatorial library of quinasoline and quinoline derivatives //
Conference for students, PhD students and young scientists, Institute of
Molecular Biology and Genetics. – Kyiv (Ukraine), 2003. – P. 206.

Особистий внесок здобувача — віртуальний скринінг похідних амінохіноліну
та амінохіназоліну, аналіз залежності “хімічна структура-біологічна
активність”.

Sapelkin V.M., Lukashov S.S., Golub A.G., Yakovenko O.Ya., Bdzhola V.G.,
Dubinina G.G., Yarmoluk S.M. Development of protein kinase CK2
inhibitors among the combinatorial libraries of quinazoline and
quinoline derivatives // CNCH-2003. – Kharkiv (Ukraine), 2003. – P. 257.

Особистий внесок здобувача — віртуальний скринінг похідних амінохіноліну
та амінохіназоліну, аналіз залежності “хімічна структура-біологічна
активність”.

Golub A.G., Yakovenko O.Ya., Bdzhola V.G., Yarmoluk S.M. Study of Casein
kinase II inhibitory activity of 4-aminoquinoline and 4-aminoquinazoline
derivatives by combined docking-molecular dynamics approach // 3rd
International conference “Inhibitors of Protein kinases 2003”. – Warsaw
(Poland), 2003. – P. 584.

Особистий внесок здобувача — віртуальний скринінг похідних амінохіноліну
та амінохіназоліну, аналіз залежності “хімічна структура-біологічна
активність”.

Kostenko O.M., Yakovenko O.Y., Golub A.G., Bdzhola V.G., Sapelkin V.M.,
Yarmoluk S.M. 3-Carboxy-4-(1H)-quinolones as inhibitors of Human Casein
Kinase 2 (CK2) // Wold Conference on Magic Bullets. — Nurenberg
(Germany), 2004.– P. 273.

Особистий внесок здобувача — параметризація програми докінгу, докінг
похідних 3-карбоксихінолонів, аналіз особливостей їхнього зв’язування в
активному сайті СК2.

Sapelkin V.M., Lukashov S.S., Makovenko I.E., Golub A.G., Yakovenko
O.Ya., Bdzhola V.G., Kostenko A.M., Yarmoluk S.M. Search of CK2 kinase
inhibitors among quinoline and quinazoline derivatives // XX Українська
конференція з органічної хімії. – Одесса (Україна), 2004. – С. 563.

Особистий внесок здобувача — докінг похідних амінохіноліну та
амінохіназоліну, побудова моделі їхнього зв’язування в активному сайті
СК2, аналіз залежності “хімічна структура-біологічна активність”.

Golub A.G., Bdzhola V.G., Yakovenko O.Ya., Sapelkin V.M., Yarmoluk S.M.
Evaluation of 3-carboxy-4-(1H)-quinolones as inhibitors of human protein
casein kinase 2 // 4rh International conference ”Inhibitors of Protein
kinases-2005”. – Warsaw (Poland), 2005. – P. 102.

Особистий внесок здобувача — віртуальний скринінг та розрахунок
молекулярної динаміки похідних 3-карбоксихінолонів, розробка моделі
їхнього зв’язування в активному сайті СК2, аналіз залежності “хімічна
структура-біологічна активність”.

Golub A.G., Bdzhola V.G., Yakovenko O.Ya., Sapelkin V.M., Yarmoluk S.M.
Evaluation of 3-carboxy-4-(1H)-quinolones as novel inhibitors of human
protein kinase CK2 // International Symposium on Advanced Science in
Organic Сhemistry. – Sudak (Ukraine), 2006 – C-200.

Особистий внесок здобувача — параметризація програм докінгу та
молекулярної динаміки, докінг та розрахунок молекулярної динаміки
похідних 3-карбоксихінолонів, побудова моделі їхнього зв’язування в
активному сайті СК2, аналіз залежності “хімічна структура – біологічна
активність”, власноруч написано основну частину статті.

Golub A.G., Bdzhola V.G., Yakovenko O.Y., Sapelkin V.M., Yarmoluk S.M.
Evaluation of 3-carboxy-4-(1H)-quinolones as novel inhibitors of human
protein kinase CK2 // The 5th Annual IIR Protein Kinases Congress. –
Zurich (Switzerland), 2006.

Особистий внесок здобувача — параметризація програм докінгу та
молекулярної динаміки, докінг та розрахунок молекулярної динаміки
похідних 3-карбоксихінолонів, побудова моделі їхнього зв’язування в
активному сайті СК2, аналіз залежності “хімічна структура – біологічна
активність”.

АНОТАЦІЯ

Голуб А. Г. In silico дизайн інгібіторів протеїнкінази СК2. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.03 – молекулярна біологія. – Інститут молекулярної
біології та генетики, Київ, 2007.

Метою дисертаційної роботи була розробка нових низькомолекулярних
інгібіторів СК2 людини та дослідження їхньої взаємодії з амінокислотними
залишками активного центру СК2 методами комп’ютерного моделювання. За
допомогою методу гнучкого докінгу знайдено низку нових інгібіторів СК2
серед комбінаторних бібліотек 4-амінохіназолінів та 4-амінохінолінів, а
також два нових класи високоактивних специфічних інгібіторів СК2 –
3-карбокси-4-(1Н)-хінолони та
тетрагалогено-1,3-діоксо-2,3-дигідроізоіндоли. На основі результатів
гнучкого докінгу та розрахунків молекулярної динаміки, для отриманих
інгібіторів розроблено моделі їхньої взаємодії з активним сайтом СК2 та
пояснено вплив хімічних замісників їхньої структури на біологічну
активність. Досліджена специфічність нових інгібіторів щодо СК2.
Проведено порівняльний аналіз їхніх типів зв’язування з типами
зв’язування відомих інгібіторів СК2. На основі аналізу отриманих
комплексів “СК2-інгібітор”, аналізу співвідношення “хімічна
структура – біологічна активність” та розрахунків термодинамічної
інтеграції спрогнозовано напрямки подальшої хімічної оптимізації нових
інгібіторів СК2.

Ключові слова: протеїнкіназа СК2, віртуальний скринінг, гнучкий докінг,
інгібітор, тип зв’язування, активний сайт.

АННОТАЦИЯ

Голуб А. Г. In silico дизайн ингибиторов протеинкиназы СК2. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.03 – молекулярная биология. – Институт молекулярной
биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2007.

Oeaeueth ?aaiou auea ?ac?aaioea iiauo ieceiiieaeoey?iuo eiaeaeoi?ia
i?ioaeieeiacu NE2 /aeiaaea, enneaaeiaaiea eo acaeiiaeaenoaey n
aieiieeneioiuie inoaoeaie aeoeaiiai naeoa NE2 iaoiaeaie eiiiuethoa?iiai
iiaeaee?iaaiey. Eniieuecoy iaoiae aeaeiai aeieeiaa, iaeaeaii ?yae iiauo
eiaeaeoi?ia NE2 n?aaee eiiaeiaoi?iuo aeaeeioae 4-аминохиназолинов и
4-аминохинолинов, а также два новых класса высокоактивных специфичных
ингибиторов СК2 – 3-карбокси-4-(1Н)-хинолоны и
тетрагалогено-1,3-диоксо-2,3-дигидроизоиндолы. На основе результатов
гибкого докинга и расчетов молекулярной динамики, для полученных
ингибиторов предложена модель взаимодействия с активным сайтом СК2 и
объяснено влияние их химических заместителей на биологическую
активность. Изучена специфичность новых ингибиторов по отношению к СК2.
На основе анализа полученных комплексов “СК2-ингибитор”, анализа
соотношения “химическая структура – биологическая активность” и расчетов
термодинамической интеграции спрогнозированы направления дальнейшей
химической оптимизации новых ингибиторов СК2.

Ключевые слова: протеинкиназа СК2, виртуальный скрининг, гибкий докинг,
ингибитор, тип связывания, активный сайт.

SUMMARY

Golub A. G. In silico design of protein kinase CK2 inhibitors. –
Manuscript.

Thesis for Philosophy Doctor (PhD) degree in Biology, speciality
03.00.03 – molecular biology. – Institute of Molecular Biology and
Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2007.

CK2 is a ubiquitous, constitutive, essential serine/threonine kinase
whose physiological function remains unclear, but it has been implicated
as a regulator of fundamental cellular processes. CK2 is involved in the
phosphorylation of a large variety of different cellular proteins, among
which are the factors of cell growth and transcription, as well as the
regulators of cell cycle and apoptosis. The CK2 holoenzyme is a
heterotetramer consisting of 2 catalytic subunits (б and б’) and 2
identical regulatory в-subunits. Interestingly, CK2 demonstrates “dual
co-substrate specificity”, using both GTP and ATP as a phosphate donor.
CK2 can phosphorylate tyrosine in addition to classic serine/threonine
residues, thus this kinase possesses also dual-substrate specificity.

Abnormal CK2 expression and function is associated with a number of
pathologies, including inflammatory, infectious and carcinogenic
processes. It has been reported that the overexpression of CK2 is
associated with cell transformation and neoplasia. It has also been
revealed that some viruses use CK2 to phosphorylate functionally
critical proteins encoded in their genome; consequently, the important
role of CK2 in the development of viral infections has been shown. These
studies evoke strong interest in this enzyme as a target for anticancer,
anti-inflammatory and anti-infectious drugs. Therefore, small organic
CK2 inhibitors, besides of their application in scientific research, may
have therapeutic significance.

The goal of the work was to develop novel small molecule inhibitors of
CK2 and to study their interactions with amino acid residues of the CK2
ATP binding site by molecular modeling methods.

At the first stage, using flexible docking and molecular dynamics
simulation techniques, a number of new CK2 inhibitors were identified
among combinatorial libraries of 4-aminoquinazoline and 4-aminoquinoline
derivatives. 75 compounds from combinatorial library of
4-aminoquinazoline derivatives have been selected using receptor-based
virtual screening technique to study their CK2 inhibitory activity. It
has been shown that 26 substances inhibit CK2 activity by more than 50
%. IC50 of these compounds ranged from 7 µM to 20 µM. The most potent
inhibitor, 4.57 (2-(3-methylphenyl)-4-(4-carboxyphenylamino)quinazolin,
has IC50 7.7 µM. To study the binding mode of the most active
4-aminoquinazoline derivatives, their binding modes in CK2 ATP-binding
site obtained with docking have been analyzed. It has been revealed,
that the most important interactions are formed between quinazoline core
and CK2 residues Phe113, Ile174, Val66, Met163. Especially, the stacking
interaction of the core and Phe113 should be emphasized. The
carboxyphenile substituents in position R3 contribute much to the
inhibitory activity, while bulk substituents in position R1 are not
favourable.

52 compounds from combinatorial library of 4-amino-3-carbethoxyquinoline
derivatives have been selected using receptor-based virtual screening
technique for studying their CK2 inhibition activity. It has been shown
that 19 substances inhibit CK2 activity by more than 50 %. IC50 of these
compounds ranged from 9 to 19 µM. The most potent inhibitor, 1.32
(3,6-dicarbethoxy-4-(4-acetamidophenylamino)quinoline, has IC50 9 µM.
The model of binding of 4-amino-3-carbethoxy-quinoline derivatives to
CK2 active site have been developed on the base of docking results.
According to the model, the active 4-amino-3-carbethoxyquinolines have
almost identical binding mode which is similar to the one for
4-aminoquinazolines. The clamping of the quinoline core between CK2
residues Phe113 and Ile174 has been observed. Moreover, the hydrogen
bond between carbethoxy group of the inhibitors and residue Lys 68 was
identified by docking engine. An additional hydrogen bond with residue
Asp175 also could be potentially formed. Analyzing the
structure-activity relationships of the obtained
4-amino-3-carbethoxyquinoline derivatives it was revealed that the
position R3 is most critical for their inhibitory activity. The activity
is highest when R3 = COOEt. The substituents in position R1 are also
make significant contribution to the activity due to their ability to
form hydrogen bonds with CK2 active site residues.

At the next stage of the investigations, using receptor-based virtual
screening, a new class of highly-active and selective CK2 inhibitors —
3-carboxy-4-(1H) quinolones was identified. It has been revealed that
the most active compounds of the class,
5,6,8-trichloro-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxylic acid (IP7) (IC50
= 0.3 µM) and 4-oxo- 1,4-dihydrobenzo[h]quinoline-3-carboxylic acid
(IP9) (IC50 = 1 M), are ATP competitive (Ki values are 0.06 and 0.28 µM,
respectively). Evaluation of the inhibitors on seven serine/threonine
and tyrosine kinases shows their considerable selectivity toward CK2.

For the most active 3-carboxy-4-(1H) quinolone derivatives, IP7 and IP9,
molecular dynamics of their complexes with CK2 were studied, and their
binding mode models have been proposed. Molecular dynamics simulation
revealed, that their binding modes in CK2 active site are somewhat
different. The binding mode of IP7 characterized by set of hydrophobic
contacts, among them the stacking interaction with Phe113 and contacts
with Val66, Ile174 are the most crucial. The hydrogen bonds with
residues Lys68, Asp175 and Glu81 were observed in case of IP7. The
binding mode of IP9 is distinguished by the absence of stacking
interaction with Phe113 and by formation of the hydrogen bonds only with
Lys68 and Asp175. The obtained binding modes were compared with those of
known CK2 inhibitors (IQA, TBB and its derivatives). The role of
carboxyl group and other substituents was explained for these novel CK2
inhibitors. On the base of docking complexes analysis,
structure-activity relationships and thermodynamic integration
calculations, further directions of 3-carboxy-4-(1H) quinolones
structure optimization were predicted.

With the virtual screening of large and diverse compound library (70,000
compounds) the other new class of CK2 inhibitors,
tetrahalogeno-1,3-dioxo-2,3-dihydroisoindoles (TID), has been
identified. In vitro tests revealed that among TID, the most active
compounds are
2-(4,5,6,7-tetrabromo-1,3-dioxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl)propanoic
acid (2.46) and
2-(4,5,6,7-tetrabromo-1,3-dioxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl)acetic acid
(2.43) (IC50 are 0,15 µM and 0,3 µM respectively). The inhibitors are
ATP competitive and they only minimally inhibit the activity of protein
kinases DYRK1a, MSK1, GSK3 and CDK5. On the base of docking technique,
the binding mode of the TID in CK2 active site has been proposed.
According to the binding mode, the most critical contacts are hydrogen
bonds of the TID with residues Lys68, Trp176 and hydrophobic contacts
with Val53, Val66, Ile174 and Phe113. The proposed model agrees with
X-ray data on complexes CK2-TBB and TBB derivatives.

The new CK2 inhibitors and their derivatives obtained during this
investigation could be used for further structural optimization and
biological testing. On the base of these inhibitors, new biologically
active substances could be developed and implemented in biological
research and clinical practice.

Key words: proteinkinase СК2, virtual screening, flexible docking,
inhibitor, binding mode, active site.

PAGE 1

Рис. 2. Сполука 4.57 в ATФ-зв’язувальному сайті CK2 (модель комплексу,
отримана методом молекулярного докінгу). Відмічено водневий зв’язок,
який потенційно може формуватись між лігандом та рецептором, зазначено
його довжину (в ангстремах). Стрілками вказано ключові міжмолекулярні
гідрофобні контакти

R1=Alk, Ar

R2=H

R3=H, Alk, OAlk

Ar, COOAlk, Hal

R4=H, Hal

R5=H, Alk, OAlk, Hal, CF3

R4, R5=benzo

Рис. 3. Хімічна структура похідних 4-амінохіноліну

R1=H, Alk

R2=H, Alk, Hal

R3=H, Alk, OAlk, Hal,

OAr COOAlk, Hal

R4=H, Hal, CF3, Het, Alk

R5=H, Alk, OAlk, Hal

R4, R5=benzo

R6=H, Et

Рис. 5. Загальна хімічна структура похідних 3-карбокси-4-(1Н)-хінолонів

Рис. 4. Сполука 1.32 в ATФ-зв’язувальному сайті CK2 (модель комплексу,
отримана методом молекулярного докінгу). Відмічено водневі зв’язки, які
потенційно можуть формуватись між лігандом та рецептором, зазначено їхні
довжини (в ангстремах). Стрілками вказано ключові міжмолекулярні
гідрофобні контакти

A

Рис. 7. Схематичне зображення впливу хімічних замісників у позиціях R1,
R2, R3, R4, R5 хінолонового ядра на біологічну активність
3-карбокси-4-(1Н)-хінолонів

R=Alk

Рис. 8. Хімічна структура
тетрагалогено-1,3-діоксо-2,3-ди-гідроізоіндолів

Б

A

Рис. 9. Комплекс СК2–2.46, отриманий методом молекулярного докінгу.
Вказано водневі зв’язки, які потенційно можуть формуватись між лігандом
та рецептором, зазначено їхні довжини (в ангстремах). Стрілками вказано
ключові міжмолекулярні гідрофобні контакти

Похожие записи