.

Імунопатогенез експериментального поліомієліту з позицій гетерогенності популяцій поліовірусів: Автореф. дис… д-ра біол. наук / О.М. Корнюшенко, Нац

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 5039
Скачать документ

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ІМ.О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

Корнюшенко Ольга Миколаївна

УДК 616.988.23-092.4-092:612.014.1:615.371:578.53:575.857:578.835.15

ІМУНОПАТОГЕНЕЗ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ПОЛІОМІЄЛІТУ З ПОЗИЦІЙ ГЕТЕРОГЕННОСТІ ПОПУЛЯЦІЙ ПОЛІОВІРУСІВ

03.00.06 – вірусологія

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т
дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

Київ- 1999

Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Національному медичному університеті
ім.О.О.Богомольця МОЗ України
Науковий консультант: доктор медичних наук, професор,
заслужений діяч науки і техніки України,
член-кореспондент НАН та АМН України
Широбоков Володимир Павлович, завідувач кафедрою мікробіології, вірусології та імунології Національного медичного Університету ім.О.О.Богомольця
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук, професор Співак Микола Якович,
завідувач відділом проблем інтерферону та імуномодуляторів
Інституту мікробіології та вірусології
ім. Д. К. Заболотного НАН України
доктор медичних наук, професор Чудна Людмила Митрофанівна,
провідний науковий співробітник лабораторії керованих інфекцій
та засобів їх імунопрофілактики
Київського науково-дослідного інституту епідеміології та інфекційних
захворювань ім. Л. В. Громашевського МОЗ України
доктор медичних наук, професор Виноград Іван Андрійович
завідувач лабораторією трансмісивних вірусів
Львівського науково-дослідного інституту епідеміології
та гігієни МОЗ України
Провідна установа : Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика

Захист відбудеться “ 20 ” травня 1999 р. о 13.30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради
Д 26.003.01 Національного медичного Університету ім. О.О. Богомольця (252 057, м. Київ, просп. Перемоги 34, мед.-проф. корпус, ауд. №2)
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Національного медичного університету ім.О.О.Богомольця (вул. Зоологічна 3)
Автореферат розісланий “ 19 ” квітня 1999 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради
доктор медичних наук, професор О. П. Яворовський
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність роботи. РНК – геномні ентеровіруси відрізняються від вірусів інших таксонів широким розповсюдженням, циркуляцією в організмі людини та оточуючому середовищі (Є.Г.Гончарук у співавт., 1990; В.М.Гирин у співавт., 1993; В.І.Задорожна у співавт., 1997), поліорганним тропізмом та відповідно різноманітним значенням в інфекційній та неінфекційній патології людини (M.Voroshilova, 1989; H.A.Rotbart et al., 1995; В.П.Широбоков у співавт., 1998), значною мінливістю популяцій (D.H.Bishop, 1988; В.М.Кибардин в соавт., 1991; E.Wimmer et al., 1993; Y.Ghendon et al., 1994). Після відкриття їх типових представників – поліовірусів, імунопатогенез поліомієлітної інфекції вивчали інтенсивно та різнопланово (Г.А.Королева в соавт., 1975; Л.Г.Тулакина, 1975; И.А.Робинзон в соавт., 1978; S.Tracy et al., 1991; R.Welliver et al., 1993). Створення в 50-60 роки Себіним та Солком живої (оральної ОПВ – або ЖПВ) та інактивованої вакцини (ІПВ) та визначні успіхи в профілактиці поліомієліту (J.Salk, 1984; A.Sabin, 1985, H.Faden, 1993) передчасно зменшили увагу до експериментального вивчення поліовірусної інфекції. Ідеї ентеровірусології, імунопатології, популяційної генетики вірусів, які почали розроблятися в 80-90 роки поставили багато нових питань, що потребували продовження вивчення поліовірусів, особливостей імунітету та патогенезу поліомієліту.
По-перше, існує постійна реальна загроза виникнення внаслідок мутацій, рекомбінацій нових варіантів ентеровірусів із зміненою вірулентністю, антигенністю, при поліовірусній інфекції та вакцинальному процесі, при пасажах в лабораторних умовах або під час циркуляції поліовірусів в оточуючому середовищі, (R.Crainic et al., 1984; M.Georgescu et al., 1995; F.Friedrish et al., 1995; R.Tafes et al., 1997). Поглиблене вивчення механізмів еволюції ентеровірусів з позицій досягнень популяційної генетики вірусів було підгрунтям для відкриття явища дисоціації популяцій вірусів Коксакі В в процесі їх репродукції на генетичні варіанти з різними фізико-хімічними та біологічними властивостями (В.П.Широбоков, 1977). Дисоціація ентеровірусів є одним з факторів, що призводить до гетерогенності їх популяцій. Варіанти популяцій ентеровірусів по-різному впливають на патогенез інфекції, формування імунітету, мають різні маркери для ідентифікації (В.П.Широбоков у співавт., 1996; 1998) Особливого практичного значення феномен дисоціації ентеровірусів може мати для удосконалення вакцинних штамів вірусів поліомієліту шляхом селекції з їх популяцій дисоціантів з високою антигенною та імуногенною дією (М.В.Шилов у співавт., 1997; О.М.Корнюшенко у співавт., 1997).
По-друге, виникнення своєрідного напрямку в імунопатології – вчення про імуномодулюючі властивості вірусів (M.Bendinelli, 1988; А.Ф.Фролов в соавт., 1985; Б.Ф.Семенов, 1989; О.М.Корнюшенко у співавт., 1997), є підставою для вивчення в такому аспекті ентеровірусів. Атенуйовані штами вірусів поліомієліту серед інших ентеровірусів найбільше представлені в оточуючому середовищі та організмі людини завдяки масовій імунізації ОПВ. Їх майже постійний вплив на імунну систему, на відповідь до гетерологічних антигенів, в тому числі до інших вакцин, ставить питання про імуномодулюючі ефекти, що виникають як наслідок (О.М.Корнюшенко, 1998).
По-третє, нагальні потреби удосконалення поліомієлітних вакцин, особливо ОПВ, а також схем вакцинації, щеплення імунодефіцитних осіб, асоціації вакцин ОПВ, ІПВ з іншими, наприклад з асоційованою кашлюково-дифтерійно-правцевою вакциною – АКДП, можливих сполучень з лікарськими препаратами (J.Grabstein, 1990; WHO Drug Int., 1995; R.Vetter et al., 1997; H.Wyatt, 1997) потребує дослідження імуномодулюючої дії атенуйованих штамів поліовірусів на рівні їх популяцій та вакцин в цілому.
Асамблея ВООЗ прийняла резолюцію про ліквідацію поліомієліту в світі до 2000 року, зважаючи на епідемічність інфекції, велике соціальне значення інвалідізації внаслідок перенесення поліомієліту та можливості керованого впливу на цей процес вакцинами ОПВ та ІПВ (Expanded Programme on Immunization, WHO, 1997; Vaccine Weekly, 1997; J.Nossal, 1997). З 1995 року під егідою ВООЗ в світі проводяться дні Національної масової імунізації дітей перших років життя в епідемічних по поліомієліту країнах. Україна підключилася до цієї програми в 1996 році, близько 2 млн. дітей від 3-х місяців до 3-х років одержали по дві дози ОПВ.В світі триває дискусія про переваги та недоліки ОПВ-ІПВ (J.Modlin, 1995; D.Henderson et al., 1995; D.Greco et al., 1997).Деякі дослідники віддають перевагу для рішення проблеми ліквідації поліомієліту ІПВ, тому що ця вакцина має більш високу антигенну дію ніж ОПВ, перешкоджає виникненню вакциноасоційованого паралітичного поліомієліту (ВАПП), не призводить до циркуляції поліовірусів.(P.Ogra, 1994; S.Plotkin, 1997). Відносно ОПВ головними перевагами вважають легкий спосіб введення, меншу вартість, утворення загального та локального імунітету. Недоліками є не достатньо високий рівень імунітету, можлива інтерференція між поліовірусами різних типів, виникнення ВАПП (J.Melnik, 1993; M.Georgescu et al., 1994; F.Friedrich et al., 1995), такі випадки найчастіше пов”язані з поліовірусами ІІ, ІІІ типів. В середньому показник захворювань на ВАПП складає 1 на 1 млн. 200 тис. доз вакцини (M.Georgescu et al., 1997). В Україні в останні роки також спостерігаються випадки ВАПП (Л.О.Трішкова у співавт., 1995) у вакцинованих ОПВ дітей, особливо вакцинованих із запізненням, або у контактних осіб. В практиці не має сенсу протиставляти обидва типи вакцин, стратегія вакцинації повинна бути гнучкою, в залежності від епідеміологічної ситуації, контингенту, регіону. Зважаючи на незадовільний колективний імунітет до поліомієліту, епідемічну ситуацію в Україні , були проведені дослідження по використанню ІПВ для вакцинації дітей, з наступною ревакцинацією ОПВ (В.И.Задорожная в соавт., 1997). Показано, що після ревакцинації всі діти мали вищі антитіла до поліовірусів, що свідчить про доцільність використання ІПВ в Україні. За прийнятим в Україні та деяких інших країнах календарем щеплень одночасно з введенням ОПВ проводиться вакцинація дітей АКДП. Післявакцинальні ускладнення в таких випадках можуть бути пов”язані із взаємною імуномодюючою дією обох вакцин, антигенним перенавантаженням організму, утворенням ушкоджуючих компонентів (Э.В.Гурвич в соавт., 1991; В.Г.Дорофейчук в соавт., 1991; О.М.Корнюшенко у співавт., 1997). Взаємодія вакцин між собою є ще далеко не вирішеним питанням для теорії та практики. Для комбінованого застосування вакцин, наприклад ЖПВ та АКДП, або ІПВ з АКДП необхідно переконання в відсутності інтерференції між дифтерійним , правцевим токсоїдами в складі DTP- АКДП та поліовірусами. Найчастіше в світі для запобігання неврологічних ускладнень, енцефалопатій, обумовлених АКДП (DTP), а також провокації розвитку паралітичного поліомієліту у дітей застосовують ІПВ (D.Miller et al., 1981; R.Lagos et al., 1988; H.Wyatt, 1997). В умовах сучасної дійсності в Україні на фоні поширених епізодів імунодефіциту у населення проведення одночасної імунізації дітей 3-х – 5-ти місячного віку або дорослих вакцинами ЖПВ та АКДП стає важливою проблемою(В.И.Бондаренко в соавт., 1991; 1998; Л.М.Чудна у співавт.,1996). Ерадикація поліомієліту в Україні, ефективна імунізація населення, досконала дігностика поліовірусної інфекції вимагають відповідного теоретичного обгрунтування з урахуванням процесів дисоціації, яка відбувається під час репродукції ентеровірусів (В.П.Широбоков, 1977; 1989; 1996). Вище наведене надає актуальності проблемі глибокого вивчення імунопатогенезу експериментального поліомієліту з позицій гетерогенності популяцій поліовірусів та біологічних властивостей їх варіантів-дисоціантів. Цим визначаються актуальність, мета та завдання даної роботи.
Зв”язок роботи з науковими програмами, планами, темами
Результати досліджень (1981-1998 років) здійснених за програмами МОЗ України, Державного комітету з науки та техніки, Державного комітету боротьби із СНІДом, ввійшли до тем: “Популяційна мінливість ентеровірусів, її значення в патології та профілактиці ентеровірусних інфекцій” № держеєстрації 0193V19803; “Особливості імунопатогенезу поліомієліту при бактеріально-вірусних асоціаціях” № держеєстрації 0193 V019817; ”Вплив живої поліомієлітної вакцини на імунну систему” № держеєстрації 0194V025378;”Одержання моноклональних антитіл для диференціації вакцинних та вірулентних вірусів поліомієліту” № держеєстрації0193V019812; ”Інтерференція між ентеровірусами та ретровірусами як можливий шлях профілактики СНІДу та СНІД-асоційованих інфекцій”№ держеєстрації 0195V019537;”Удосконалення методології вакцинації та календарю щеплень проти поліомієліту, кашлюку, дифтерії, правцю. Створення шляхом кріоконсервування музею культур клітин, гібридом, вірусів для профілактики поліомієліту” № держеєстрації0195V014159.
Мета роботи: На основі дослідження імунопатогенезу експериментального поліомієліту та біологічних властивостей поліовірусів на рівні вірусних популяцій обгрунтувати шляхи удосконалення імунопрофілактики поліомієліту.
Завдання дослідження:
1. Провести вивчення гетерогенності популяцій вакцинних та вірулентних вірусів поліомієліту на прикладі дисоціації. Порівняти основні біологічні властивості – вірулентність, антигенність, імуногенність дисоціантів поліовірусів.
2. Дослідити імунопатогенетичні особливості експериментального поліомієліту з урахуванням дисоціації поліовірусів.
3. Оцінити імуномодулюючі властивості генетичних варіантів популяцій поліовірусів, розкрити можливі механізми їх імуномодулюючої дії.
4. Виявити та охарактеризувати зміни ультраструктурної організації імунокомпетентних органів, обумовлені імуномодулюючою дією генетичних варіантів поліовірусів або поліомієлітних вакцин.
5. Вивчити взаємну імуномодулюючу дію вакцин ЖПВ та АКДП, експериментально обгрунтувати удосконалення схеми імунізації проти поліомієліту, дифтерії, правцю.
6. Оцінити на обмеженому контингенті дітей ефективність зменшення взаємної імуносупресії вакцин ЖПВ та АКДП шляхом роздільної імунізації.
Наукова новизна отриманих результатів. Робота відноситься до теоретичної вірусології, в ній дістали продовження ідеї професора В.П. Широбокова, який відкрив феномен дисоціації популяцій ентеровірусів(В.П.Широбоков,1977,1996), на моделі Коксакі В вірусів охарактеризував закономірності явища дисоціації та властивості дисоціантів. Під його керівництвом науковці розвивали в дисертаційних роботах різні аспекти вчення про дисоціацію, в цих дослідженнях не були вивчені питання гетерогенності популяцій поліовірусів, біологічні характеристики дисоціантів, особливо вакцинних штамів, імунопатогенез експериментального поліомієліту з позицій гетерогенності їх популяцій. Віруси поліомієліту як імуномодулятори були вперше вивчені автором на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології НМУ, наукові ідеї цих досліджень є власними, перші публікації маємо з 1983 року. В нашій роботі вперше було проведено глибоке порівняльне вивчення важливих для імунопатогенезу біологічних характеристик вакцинних та вірулентних штамів вірусів поліомієліту на рівні популяції:
• Було встановлено, що генетичний варіант – дисоціант Абент+, який закономірно виділяється при репродукції як вакцинних, так і вірулентних вірусів поліомієліту, обумовлює найбільший прояв кардинальних біологічних властивостей: вірулентності, антигенності та імуногенності.
• Виявлено, що віруси поліомієліту мають виразні імуномодулюючі властивості, притаманні як вірулентним, так і вакцинним штамам. На рівні популяцій імуносупресія в значній мірі пов’язана з генетичним варіантом Абент.
• Вперше на моделі мишей виявлено, що вакцинні штами вірусів поліомієліту мають здатність швидко проникати в органи імунної системи та розмножуватися в них, цю властивість було названо імуноорганотропізмом. Генетичний варіант Абент індукує апоптоз в лімфоцитах селезінки.
• Показано,що жива поліомієлітна вакцина, на відміну від інактивованої, спричиняє супресію імунної відповіді до дифтерійного та правцевого анатоксинів. Вакцина АКДП інтенсивно пригнічує гуморальний та клітинний противірусний імунітет при одночасній імунізації з ЖПВ.
• На експериментальних моделях обгрунтована можливість корекції взаємної імуносупресивної дії вакцин ЖПВ та АКДП шляхом роз’єднання імунізації в часі (першою вводиться ЖПВ).
• Ефективність запропонованої схеми роз”єднаної в часі вакцинації проти поліомієліту, дифтерії та правцю була доведена в процесі імунізації дітей м. Прилуки.
Практичне значення одержаних результатів
• Генетична неоднорідність популяцій вакцинних штамів вірусів поліомієліту, дисоціація їх в процесі репродукції на варіанти Абент+ та Абент, висока антигенна та імуногенна активність варіанта Абент+, імуносупресивна дія варіанту Абент дають підстави для удосконалення ЖПВ. В умовах майбутнього створення ЖПВ в Україні доцільно впровадити селекцію із популяцій вакцинних штамів варіантів Абент+, більш – біологічно активних та наділених протективними властивостями.
• З метою зменшення взаємної імуносупресії двох вакцин:ЖПВ та АКДП_-доцільно розпочинати цикл імунізації дітей вакциною ЖПВ, потім послідовно, з інтервалом 1 місяць імунізувати по черзі АКДП та ЖПВ. Після таких імунізацій створюється більш виражений гуморальний імунітет ніж при одночасних вакцинаціях ЖПВ – АКДП.
• Розроблені методичні підходи до корекції календарю щеплень вакцинами ЖПВ та АКДП зможуть в значній мірі сприяти підвищенню ефективності профілактики поліомієліту, дифтерії, правцю та збереженню здоров’я дітей в Україні.
• Планується розвинути запропоновану концепцію корекції вакцинації в широких епідемічних дослідженнях. Одержані результати впровадити при створенні нового удосконаленого календарю щеплень дітей в 2000 році.
Основні положення дисертації, що виносяться на захист
• Дисоціація популяцій вірусів поліомієліту в процесі їх репродукції є базисом для селекції із вихідних популяцій генетичних варіантів з потрібними властивостями. Для створення якісних вакцин, діагностичних препаратів корисними є дисоціанти популяції поліовірусів– варіанти Абент+. В імунопатогенезі поліомієліту варіанти Абент+. мають домінуючу роль, як найбільш вірулентні та антигенні.
• Віруси поліомієліту є потужніми модуляторами імунної відповіді до гетерологічних антигенів. Проявами імуномодуляції може бути імуностимуляція, або імуносупресія в залежності від виду антигенів. Атенуація поліовірусів не відміняє імуномодуляції. В проявах імуносупресії домінує генетичний варіант Абент. На моделі мишей він індукує апоптоз імунокомпетентних клітин селезінки.
Особистий внесок здобувача. У дисертації викладено результати теоретичних та експериментальних досліджень, переважно проведених автором особисто. Фрагменти планових та грантових НДР виконані пошукувачем як виконавцем та відповідальним виконавцем вищеназваних наукових тем: Електронно-мікроскопічні дослідження були проведені на базі лабораторії електронної мікроскопії НДЛЦ разом з д.б.н., проф. Стеченко Л.О., деякі імунологічні дослідження були здійснені в лабораторії імунології Інституту молекулярної біології та генетики НАН України сумісно з к.м.н. Сенюк О.Ф. Висловлюємо їм щиру подяку. Всі положення та висновки дисертаційної роботи належать автору. Автор самостійно написав та проаналізував всі друковані матеріали
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені доповідями та стендами на VI,VII з”їздах Українського мікробіологічного товариства, 1984,1989р., IV національній конференції по алергології та інфекційній імунології, Варна, 1984, Всесоюзній конференції “ Ентеровіруси. Загально теоретичні та медичні аспекти.”, 1991р., IV конгресі Світової федерації українських лікарських товариств, 1992р., міжнародній конференції до 150-річчя з дня народження І.І.Мечнікова, 1995р., 10-му інтернаціональному конгресі з вірусології, 1996 р., міжнародній науковій конференції “Морфологія-практичній ветеринарії та медицині”, 1998 р.
Публікації. За темою дисертації опубліковано 30 статей в наукових журналах та збірниках праць, глави в монографії, 1 патент на винахід, 1 методичні рекомендації, 29 робіт у матеріалах з”їздів та конференцій.
Впровадження в практику. Одержані результати знайшли застосування при виданні методичних рекомендацій “Применение бентонита для выявления энтеровирусов у человека и во внешней среде”, під. ред. В.П.Широбокова, Київ, 1986, МОЗ УРСР, в педагогічному процесі на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології НМУ. Удосконалена нова схема імунізації дітей проти поліомієліту, дифтерії та правцю впроваджувалася в роботу дитячої лікарні м.Прилуки. Матеріали дисертації були використані при підготовці наказу МОЗ України “Про посилення заходів щодо попередження захворюваності на поліомієліт в Україні” № 196 від 14.07.1998 року.
Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, 5 глав власних досліджень, заключення, висновків, практичних рекомендацій та списку використаної літератури. Роботу викладено на 333 стор. машинописного тексту, ілюстрованого 32 табл., 40 рис. Бібліографія складається з 487 джерел, серед яких 143 україно- та російськомовних і 344 іноземних авторів.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ.
Головними об”єктами були вакцинні та виробничі штами вірусів поліомієліту І, ІІ та ІІІ типів, отримані з Інституту поліомієліту та вірусних енцефалітів АМН СРСР в 1982 році. Вакцинні штами: Picornaviridae, Enterovirus, Polio; тип І, штам LSс2аb, атенуйований Себіним 1956-1957р. Походить від дикого вірусу Магоней. Picornaviridae, Enterovirus, Polio; тип ІІ, штам P-712,ch 2аb, виділений Гельфандом, Фоксом з фекалій здорової дитини,. атенуйований Себіним в 1957р. Picornaviridae, Enterovirus, Polio; тип ІІІ, штам Leon12 а,b, був атенуйований Себіним в 1956-1957р., походить із штама Leon, виділений із мозку дитини, померлої від поліомієліту. Пасажі вакцинних штамів проводили при температурі +340С, зберігали при температурі -200C. Вірулентні штами: Picornaviridae, Enterovirus, Polio; тип І, штам Mahoney,. Picornaviridae, Enterovirus, Polio; тип ІI, штам MEF-1, Picornaviridae, Enterovirus, Polio; тип IIІ, штам Saukett.
Культури клітин: перещеплювані культури клітин типів Vero – клітини нирок африканської зеленої мавпи, HЕp-2- клітини карциноми гортані людини, L-929- малігнізована підшкірна сполучна тканина мишей лінії С3Н..
Вакцинні та діагностичні препарати: вакцина поліомієлітна пероральна І, ІІ, ІІІ типів – тривалентний препарат із атенуйованих штамів Себіна вірусів поліомієліту, серія №451. Москва ИПВЭ ім. М.П.Чумакова РАМН.Poliovirus vaccine inactivated – IPOL. Produced by Pasteur Merieux Serums & Vaccins S.A..Adsorbed diphtheria, tetanus and pertussis vaccine. Produced by Pasteur Merieux Serums & Vaccins. Lot: 5429. Сироватки діагностичні поліовірусні типоспецифічні сухі для реакції нейтралізації, типи – І, ІІ, ІІІ. Москва ИПВЭ.им. М.П.Чумакова РАМН. Діагностичний комплект “мікроаналіз – дифтерія, правець”. Містить дифтерійний антигенный (анатоксинний) еритроцитарний діагностикум, правцевий антигенний (анатоксинний) еритроцитарний діагностикум. Створений в Ростовському-на-Дону медичному інституті, центральному НДІ епідеміологіі МЗ СРСР.
Експериментальні тварини: миші ліній BALB/с, СBA, С57Bl, самці та самиці, масою 18 – 20 грамів, одержані із розпліднику віварію Інституту експериментальної онкології та радіології ім.Є.Р.Кавецького НАН України, Інституту мікробіології та вірусології ім.Д.К.Заболотного НАН України. Карантин періоду акліматизації, утримання тварин під час експерименту, мікроклімат, температура, вологість, світловий режим, об`єм повітря, тип клітин, відповідали загальноприйнятим нормативам утримання тварин відповідно Європейської конвенції по захисту хребтових тварин, що використовуються з експериментальною метою. Всього використано 1770 мишей.
Методи вірусологічних досліджень in vitro. Пасажі клітин проводили за загальноприйнятими методами, моношари клітин одержували в скляних флаконах або матрасах при використанні середовища росту( суміші з рівних частин середовищ 199 та Ігла з доданням 8%-10% сироватки великої рогатої худоби або 7% ембріональної сироватки з антибіотиками пеніциліном та стрептоміцином -100 од.на мл). Клітини культивували при 36,60С , при пасажах (через 2-3 доби) моношари обробляли 0,02% розчином Версену для відділення від скла. Пасажи вірусів проводили з вірусвмісним матеріалом в кількості, що забезпечувала високу множинність інфікування моношарів клітин. Адсорбція вірусів-30 хвилин, інкубація при -36,60С для вірулентних та -340С, для вакцинних штамів, 48-72 години до настання повного цитопатогенного ефекту.
Одержання концентрованих препаратів вірусів проводили за методом (В.П. Широбоков, 1973; 1977) із застосуванням природного сорбенту бентоніту. Принцип полягяє у використанні властивості ентеровірусів адсорбуватися на гелі бентоніту при кислих рН (4,5-5,0). При лужних рН (8,0-9,0) та відсутності двухвалентних катіонів ентеровіруси здатні десорбуватися в елюючий розчин. Таким чином із об”ємів -500 – 1000 мл вірусвмісного матеріалу можна одержати значно менші 5 – 10 мл, концентрація вірусів зростає на два-три логарифми.
Титри вірусів визначали: за бляшкоутворенням під бентонітовим покриттям (В.П. Широбоков, 1973) та мікрометодом за ЦПЕ (Руководство по вирусологическим методам, Москва, 1996; Manual for the virological investigation of polio, WHO, 1997), принцип методів: інфекційні віруси під час репродукції спричиняють видимий ЦПЕ – повну деструкцію клітин, руйнування моношару. При застосування гелю бентоніту утворюються зони деструкції моношару клітин- бляшки, вважають, що бляшка є результатом репродукції одного вірусу, кількістіь вірусів виражали в бляшкоутворюючих одиницях-БУО.
Ідентифікація типів вірусів поліомієліту. Для підтвердження належності до серотипів І, ІІ, ІІІ вірусів поліомієліту використовували реакцію нейтралізації вірусів (РНВ) (Manual for the virological investigation of polio, WHO, 1997), принцип методу полягає в тому, що при контакті вірусів з специфічними антитілами віруси втрачають свою інфекційну активність. Це перевіряють при інфікуванні культур клітин, ефект нейтралізації вірусів проявляється як відсутність ЦПЕ, відсутність бляшок.
Селекцію бентонітових генетичних варіантів вірусів здійснювали за оригінальним методом (В.П.Широбоков, 1977), розробленим при відкритті феномену дисоціації ентеровірусів та досліджені його закономірностей. Принцип методу полягає в тому, що частина популяцій ентеровірусів має високий афінітет до сорбенту, тому адсорбуються при нейтральних та слаболужних рН, такий варіант популяції одержав символ Абент+, інша, найчастіше мінорна частина популяції, – віруси з низьким афінітетом до бентоніту – варіант Абент.Здатність ентеровірусів до адсорбції на бентоніті рекомендована для визначення бентонітового маркеру вірулентності поліовірусів.(М.К.Ворошилова, 1979).
Вірусологічні та імунологічні дослідження in vivo. Визначення нейровірулентності вірусів поліомієліту ІІ типу проводили титруванням вірусів в мозку мишей. Принцип методу: при зараженні мишей різними дозами вірусів за проявами інфекції та летальністю знаходять мінімальну кількість вірусів, яка спричиняє 50% загибелі тварин – LD50 або 95% – DLM, підраховують за методом Ріда та Менча кумулятивні дані летальності та середньої тривалості життя (З.А.Пшеничнов в соавт., 1974; Н.М.Ральф в соавт., 1982). Виділення вірусів поліомієліту із органів мишей проводили для доказу їх репродукції в різних органах. Матеріалом для вірусологічного дослідження були шматочки органів, в яких визначали кількість вірусів методом титрування на культурі клітин НЕр-2, виражали БУО на 1 гр. тканини.
Оцінку антигенності вірусів поліомієліту здійснювали при внутрішньочеревинній імунізації мишей однаковими дозами вірусів. Тут і далі термін імунізація умовно використовували для визначення процесів, що виникають внаслідок введення в організм диких поліовірусів або живих поліовірусних вакцин. На 3, 5, 7 дні після імунізації мишей забивали, брали кров, виділяли сироватку, визначали наявність противірусних антитіл та їх титри за допомогою РНВ (індекс нейтралізації 80%). Для порівняння рівнів віруснейтралізуючих антитіл в різних групах експериментальних тварин розраховували середні геометричні величини титрів, виражали їх у логарифмах при основі 2, також виражали титри в середніх величинах зворотніх розведенням сироваток (О.П.Минцер в соавт., 1982).
Оцінку імуногенної( протективної при інфекції) дії вірусів поліомієліту визначали для вакцинних штамів вірусів поліомієліту ІІтипу та їх генетичних варіантів. Для цього мишей імунізували внутрішньочеревинно дозами вірусів – 1х106БУО. Через 3 доби проводили інтрацеребральне зараження вірулентним для мишей штамом поліовірусу ІІ типу – MEF-1 – в LD50.В кожній групі мишей визначали середню тривалість життя, летальність порівнювали їх з величинами в контрольній групі та розраховували протективну дію вакцинних поліовірусів.
Вивчення гуморального імунітету проводили в процесі імунізації мишей вірусами поліомієліту. На 3, 5, 7, 14, 21 день досліджували сироватки крові за допомогою РНВ для виявлення противірусних типоспецифічних антитіл та їх титрів.
Клітинний імунітет оцінювали за функціональною активністю імунокомпетентних клітин селезінки (J.Robinson et al., 1975; В.Тессенов, 1979; Г.Фримель, 1987). Селезінки мишей забирали на різні терміни після імунізації вірусами поліомієліту або вакцинами .Спленоцити виділяли в градієнті щільності фіколл-верографіну з показником 1,076-1,078, культивували в поживному середовищі RPMI 1640 з 10% вмістом ембріональної телячої сироватки, 2мМ глутаміну, стрептоміцину та пеніциліну по 100 од/мл, в присутності 5%СО2 .Використовували мітогени ФГА та ЛПС в концентрації 5 мкг/мл, або інактивовані формаліном поліовіруси за методом (B.Montagon et al., 1985) 3Н-тимідін додавали за 4 години до закінчення культивування з розрахунку 2 мкКі на лунку, клітини осаджували на нітроцелюльозні фільтри(діаметр пор 0,45мкм). Функціональну активність лімфоцитів визначали за включенням 3Н-тимідіну в ДНК за допомогою сцинтіляційного лічильника.
Пасивний перенос імунітету з сироватками крові (антитілами):мишей імунізували тричі внутрішньочеревинно вірусами поліомієліту ІІ типу штамами MEF-1 та P-712ch2ab в дозі 1х106. На 14 день після останньої імунізації у мишей забирали кров, одержували сироватку, визначали в ній противірусні антитіла та їх титри в РНВ. Одержані сироватки з антитілами в титрі 512 вводили в хвостову вену в об`ємі 0,2 мл.
Адоптивний перенос імунітету з лімфоцитами: у імунізованих вірусами поліомієліту ІІ типу мишей одержували спленоцити (як описано вище), 5х107 клітин вводили внутрішньочеревинно мишам-донорам.
Вивчення імуномодулюючої дії вірусів поліомієліту: мишей імунізували вірусами поліомієліту І, ІІ, ІІІ типів та їх генетичними варіантами, вакцинними та вірулентними штамами, в однакових дозах – 1х106, внутрішньочеревинно. На фоні вірусної імунізації здійснювали імунізацію мишей гетерологічними антигенами, потім визначали зміни імунної відповіді до них, обумовлені імуномодулюючою дією поліовірусів.
Оцінка впливу імунізації вірусами полімієліту на антитілоутворення до гетерологічних еритроцитів: на фоні імунізації поліовірусами проводили імунізацію еритроцитами барана. Кількість антитілоутворюючих клітин (АУК) до еритроцитів барана визначали методом локального гемолізу в гелі (N.Jerne et al., 1963), принцип якого полягає в тому, що лімфоцити імунізованих гетероеритроцитами тварин продукують антитіла-гемолізини. Реакцію оцінювали по кількості зон гемолізу еритроцитів з АУК в центрі.
Оцінка впливу імунізації вірусами поліомієліту на клітинну реакцію підвищеної чутливості сповільненого типу до гетерологічних тимоцитів: на фоні імунізації вірусами поліомієліту моделювали алергічну реакцію на гетерологічні тимоцити. Для цього обрали метод відтворення та оцінки реакції підвищеної чутливості сповільненого типу (ПЧСТ) in vivo (Э.В.Гюллинг в соавт., 1981). Принцип цієї реакції полягає в тому, що у мишей, сенсибілізованих тимоцитами пацюків, на дозволяючу дозу тимоцитів розвивається реакція ПЧСТ, яка чітко реєструється по зміні маси регіонарних лімфатичних вузлів. Імунізованих мишей сенсибілізували тимоцитами пацюків (1х104, в подушечки обох задніх лап). Через 4 доби вводили дозволяючу дозу тимоцитів – 1х106, в праву лапу – дослід, в ліву лапу – 1х106 тимоцитів морської свинки – контроль. Через 1 добу мишей забивали, вилучали підколінні лімфатичні вузли, визначали різницю в масі дослідних та контрольних в %, що свідчило про ступінь прояву ПЧСТ.
Вивчення взаємного впливу імунізації поліомієлітними вакцинами та АКДП на утворення гуморального антитоксичного та противірусного імунітету. Мишей імунізували ЖПВ або ІПВ одночасно з вакциною АКДП внутрішньочеревинно, по одній дозі кожної вакцини. На 7, 14 добу мишей забивали, брали кров, одержували сироватки, в яких визначали антитіла до окремих компонентів вакцин. Віруснейтралізуючі антитіла виявляли за допомогою РНВ. Дифтерійні та правцеві антитоксини виявляли в РНГА (Использование иммунологических исследований в профилактике инфекций, управляемых вакцинацией,-Москва, 1991; Recommendations of the Immunization Practices Advisory committee, 1991).
Принцип РНГА полягає в тому, що специфічні антитоксичні антитіла спричиняють гемаглютинацію еритроцитів барана, використаних в ролі носіїв відповідних антигенів- дифтерійних або правцевих анатоксинів Досліджувані сироватки розводили в 5 разів ізотонічним розчином хлоріда натрія (рН=7,2), потім інактивували при 560С 30 хвилин, обробляли формалінізованими еритроцитами барана (50,0%) для видалення гетерофільних антитіл. Готували відповідні розведення сироваток від 1:10 до 1:1280, в кожне розведення додавали по 0,025 мл відповідного діагностикуму. Контролі: діагностикумів на відсутність спонтанної аглютинації, сироватки на відсутність аглютинінів до еритроцитів барана. Результати оцінювали за ступенем аглютинації еритроцитів. Активність еритроцитарних діагностикумів : 1-дифтерійний (для РНГА) – із стандартною сироваткою 1:3200- 1:6400; 2- правцевий (для РНГА)– із стандартною сироваткою 1:1280- 1:2560. При дослідженні сироваток в РНГА активність дифтерійного діагностикуму -1:3200, правцевого – 1:1280. Це дає можливість переводити одержані в розведеннях результати в міжнародні одиниці (МО), а саме: титр 1:10- 0,03 МО/мл; 1:20- 0,06МО/мл, 1:40- 0,12МО/мл, 1:80- 0,24МО/мл, 1:160- 0,48МО/мл, 1:320- 0,96МО/мл. При оцінці антитоксичного імунітету у дітей вважали, що групу серонегативних складали особи, у яких не виявляли відповідних антитіл в сироватках. Групу незахищених складали особи з титром нижче захисного, враховували також серонегативних. Протективним для дифтерії вважається титр 1:40, для правцю- 1:20.
Створення моделей вакцинального процесу з використанням поліомієлітних вакцин та АКДП. З метою експериментального обгрунтування підвищення ефективності вакцинації проти поліомієліту, дифтерії та правцю були створені різні схеми імунізації: 1-Одночасна імунізація ЖПВ та АКДП. 2-Одночасна імунізація ІПВ та АКДП. 3-Імунізація ЖПВ – інтервал 7 діб – імунізація АКДП. 4-Імунізація ЖПВ – інтервал 14 діб – імунізація АКДП. 5-Імунізація ЖПВ – інтервал 21 доба – імунізація АКДП. Контрольні групи- імунізація окремо ЖПВ, ІПВ, АКДП. Всі вакцини вводили в одній дозі, через 7-14 днів після останньої імунізації мишей забивали, брали кров та досліджували її на наявність антитіл та їх титрів.
Електронно-мікроскопічні методи дослідження ультраструктури імунокомпетентних клітин мишей. Використовували класичну методику приготування електронномікроскопічних препаратів із шматочків тимусу, селезінки. Матеріал фіксували у 2% розчині OsO4 по Колфільду на протязі 2 годин при температурі +4oС. Зразки зневоднювали в етанолі зростаючої концентрації, починаючи з 700 спирту, ацетону та заливали у суміш епону та аралдіту за загальновідомою схемою (В.Я.Карупу, 1984). Зрізи виготовляли на ультратомах LKB-Ш та Reichert і контрастували 2% розчином уранілацетату у 70% етанолі та цитратом свинця та вивчали в електронних мікроскопах ЕМВ-100Б, ЕМВ-100БР. Оцінку змін морфофункціональної організації клітин, ознаки апоптозу в лімфоцитах проводили згідно методам (Р.Исмаилов, 1979; А.П.Сорокин, 1989; R.Duke et al., 1996; S.Bergese et al., 1997).
Вивчення впливу імунізації живою поліомієлітною вакциною на перебіг стафілококової інфекції у мишей. Модель стафілококозу з клінічними проявами відтворювали при інфікуванні Staphylococcus aureus Cowan 1, в дозі 109 бактерій, адаптованих до мишей ( штам отримали з колекції Державного контрольного інституті медичних та біологічних препаратів ім. Л.А.Тарасевича, Росія). Мишей забивали шляхом цервікальної дислокації, проводили розтин та взяття в асептичних умовах крові та шматочків органів. Для оцінки патогенетичних особливостей стафілококозу на фоні імунізації поліовірусами оцінювали мікробне обсім`яніння крові, серця, легенів, печінки, селезінки в динамиці. Для уніфікації кількість мікроорганізмів переводили в показник, що характеризував мікробне обсім`яніння на 1 г органу чи 1 мл крові Бактерії при висівах ідентифікували за класичними методами. У заражених стафілококами мишей визначали фагоцитарну активність ядровмісних клітин крові за класичним методом (Ю.Аиба, 1989).
Оцінка інтерфероногенної активності ЖПВ та АКДП. Використовували 2 підходи до визначення ІФН: (Ф.И.Ершов, 1996) 1-Виявлення ендогенного сироваткового ІФН, індукованого вакцинами..2-Виявлення синтезованого спленоцитами під дією індукторів: конканаваліну А- -ІФН та вірусу хвороби Ньюкастла – -ІФН. Принцип методу полягає в тому, що ІФН має протективну дію по відношенню до клітин, інфікованих вірусами. Цей ефект спостерігали по нейтралізації ЦПЕ мінімум на 50%., використовували загальноприйняту систему: культуру клітин L-929 та вірус везікулярного стоматиту (ВВС).
Методи статистичної обробки одержаних результатів. Аналіз результатів досліджень проводили з використанням методів математичної варіаційної статистики на ПК 486 DX 2 – 66 AMD при використанні програмних продуктів фірми Microsoft.. Основною ознакою до висновку про різницю між двома сукупностями був ступінь розходження їх середніх величин. Для оцінки достовірності різниці показників визначали t-критерій Стьюдента. Також застосовували метод оцінки різниці між частотами появи ознаки в окремих серіях спостережень (Г.Крамер, 1975; О.П.Минцер в соавт., 1982).
РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ
Гетерогенність популяцій вірусів поліомієліту на прикладі дисоціації. Базою для проведення досліджень і реалізації поставлених завдань, пов’язаних із вивченням імунопатогенезу та біологічних властивостей вірусів поліомієліту на популяційному рівні було одержання шляхом селекції з вихідних популяцій вірулентних та атенуйованих штамів вірусів поліомієліту І, ІІ, ІІІ типів генетичних бентонітових варіантів. Проведена селекція продемонструвала гетерогенність популяцій поліовірусів та дозволила одержати дисоціанти вірулентних та вакцинних вірусів поліомієліту Абент+ та Абент (табл.1).

Таблиця 1
Селекція генетичних бентонітових варіантів із популяцій вірусів поліомієліту
Типи та штами вірусів
Титри вірусів до адсорбції на бентоніті (n=20) Титри вірусів після адсорбції на бентоніті (n=20) Вміст варіантів Абентв % Вміст варіантів Абент+ в %
Вірулентні віруси поліомієліту (клітини HEp-2)
Ітип–Mahoney (9,85+0,012) х105 (9,65+0,01) х105 97,911,9 2,090,02
ІІ тип MEF-1 (9,61+0,017) х106 (3,5+0,015) х104 0,360,03 99,641,4
ІІІ тип Saukett (9,54+0,026) х105 (3,33+0,011) х103 0,390,01 99,610,35
Атенуйовані віруси поліомієліту (музейні штами, клітини Vero)
І тип LSC2ab (6,0+0,033) х105 (1,38+0,011) х103 0,230,02 99,770,49
ІІ тип P712ch2ab (4.5+0,014) х105 (2,25+0,09) х102 0,050,001 99,950,27
III тип Leon12ab (1,0+0,027)х107 (9,98+0,031) х103 0,10,002 99,90,18
Атенуйовані віруси поліомієліту (вакцинні виробничі штами, клітини Vero)
І тип LSC2ab (6,0+0,044) х105 (4,3+0,015) х103 0,710,05 99,290,33
ІІ тип P712ch2ab (7.5+0,029) х106 (4,2+0,016) х104 0,570,004 99,430,09
ІІІ тип Leon12ab (1,0+0,042) х106 (1,24+0,051) х104 1,250,01 98,750,12
Атенуйовані віруси поліомієліту (вакцинні виробничі штами, клітини HEp-2)
Ітип – LSC2ab (1,1+0,019) х105 (6,5+0,026) х103 5,90,02 94,11,13
ІІтип
P712ch2ab (8,6+0,063) х107 (1,72+0,013) х104 0,020,001 99,980,76
ІІІ тип Leon12ab (2,4+0,059) х106 (1,68+0,018) х104 0,700,05 99,30,45
Примітка: при порівнянні титрів вірусів до та після адсорбції на бентоніті р0,001
В табл.1 наведена узагальнена інформація про селекцію генетичних бентонітових варіантів вірусів поліомієліту, яку ми постійно здійснювали на протязі 15 років. Для інтерпретації були використані факти про вміст в популяціях генетичних варіантів Абент, які найбільш закономірно повторювалися. Серед вірулентних штамів надзвичайна кількість варіанту Абент була зареєстрована для вірусів поліомієліту І типу, штаму Mahoney – 97,91%, тобто цей вірус практично існує в “мінусовій”формі. Популяції ІІ та ІІІ серотипів містять практично однакову кількість варіантів Абент-0,36 та 0,39% відповідно. Атенуйовані музейні віруси поліомієліту, які протягом десяти років проходили пасажі в культурах клітин Vero при 37о, відрізнялися значно меншим вмістом варіантів Абент в порівнянні із аналогічним набором виробничих вакцинних штамів, пасажі яких проводили при 34оС. Типи культур клітин (Vero та HEp-2) для репродукції вірусів практично не впливали на вміст дисоціантів в популяціях. Домінуючими компонентами популяцій трьох типів атенуйованих вірусів поліомієліту, незалежно від виду клітин, були віруси з високим афінітетом до бентоніту – Абент+. Селекціоновані генетичні бентонітові варіанти популяцій вакцинних та вірулентних вірусів поліомієліту використовували для подальшого порівняльного аналізу їх біологічних властивостей.
Нейровірулентність генетичних варіантів вірусів поліомієліту. Значна увага до вивчення популяційної мінливості ентеровірусів обумовлена виявленням генетичної нестабільності вакцинних штамів вірусів поліомієліту (J. Drake et al., 1993; R.Duggal.et al., 1997). З метою адекватної оцінки процесів мінливості поліовірусів були створені маркери нейровірулентності, які перевіряють in vitro та in vivo. Існує кореляція між нейровірулентністю вірусів поліомієліту для мишей та людей (М.К.Ворошилова,1979). Ідеї проведення наведених експериментів були підпорядковані: 1-порівняльному вивченню нейровірулентності генетичних варіантів популяції Абент+ та Абент у вірулентних штамів вірусів поліомієліту ІІ типу, 2- визначенню впливу умов культивування на можливість виникнення реверсії нейровірулентності у атенуйованих поліовірусів ІІ типу. Оцінка нейровірулентності наведена за середньою тривалістю життя та летальністю у мишей (табл.2).
Таблиця 2
Нейровірулентність генетичних варіантів вірусів поліомієліту ІІ типу MEF-1
Групи мишей (n=28),
інфікованих: Летальність
в % Середня тривалість життя (дні)
популяцією поліовірусів 96,24  1,1 р10,01
97,8  0,3 р2

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020