МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ВАЩЕНКО СВІТЛАНА МИКОЛАЇВНА

УДК 615.37:615.611.69-002.2-02:579.853

Імунопатогенез, діагностика і нові методи імунокорекції у хворих з
хронічними запальними сечостатевими захворюваннями хламідійної етіології

14.03.08 – імунологія та алергологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

КИЇВ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті нефрології АМН України

Науковий консультант — доктор медичних наук, професор Дріянська
Вікторія Євгенівна, Інститут нефрології АМН України, заступник директора
з наукової роботи, завідувач лабораторією імунології.

Офіційні опоненти — член-кор. АМН України, доктор медичних наук,
професор Чернушенко Катерина Федорівна, Інститут фтизіатрії і
пульмонології ім. Ф.Г.Яновського АМН України, завідувач лабораторією
імунології.

доктор медичних наук, професор Бордонос Володимир Герасимович,
Науково-дослідний лабораторний центр Національного медичного
університету ім. О.О.Богомольця, завідувач лабораторією імунології.

доктор медичних наук Ромащенко Оксана Василівна, Інститут урології АМН
України, головний науковий співробітник відділу сексології та андрології

Провідна установа – Луганський державний медичний університет МОЗ
України.

Захист відбудеться “15 лютого” 2007 р. о 13.30 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.003.02 в Національному медичному
університеті ім. О.О.Богомольця МОЗ України (01023, м. Київ, вул.
Шовковична, 39/1, Центральна міська лікарня, корпус 2).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національному медичному
університеті ім. О.О.Богомольця МОЗ України (03057, м. Київ, вул.
Зоологічна, 1).

Автореферат розісланий “12” січня 2007 року.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук, професор __________________ С.Г.Свирид

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. В останні роки одним з важливих в
медико-соціальному відношенні захворювань “нового покоління”, що
передається статевим шляхом, є урогенітальна інфекція, яку викликає
C.trachomatis [Мавров Г.И., 2006; Шеремета В.В. и соавт., 2003; Everett
K.D.E. et al., 2000; Muсoz G. et al., 2004; Ojcius M. et al., 2005;
Samoff E. et al., 2005]. Частота C.trachomatis серед етіологічних
чинників інфекцій, що передаються статевим шляхом (ІПСШ) складає
14,8–82,2% [Мавров Г.И., 2006; Чинов Г.П., 2005]. За даними 3-го
Європейської наради по хламідіям, щорічно у світі хламідіозом
(сечостатевим, очним, легеневим) страждає 500 млн. хворих [Аковбян В.А.,
1997]. Наприклад, в США щорічно реєструвалось більш ніж 4 млн. нових
випадків сечостатевого хламідіозу (ССХ) [Alexander L.L., 1996], в
останні роки вдалося знизити захворюваність, яка в 2000 году, за данними
Centers for Disease Control and Prevention, складала 702093 випадки. В
Росії захворюваність ССХ підвищилася з 1993 по 1996 р. в 2,9 рази (з
37,1 до 106,1 на 100 тисяч населення) і в 2000 році складала 126,2 на
100 тисяч населення [Мавров Г.И., 2006; Тихонова Л.И., 1997].

В Україні з 1993 по 1998 рр. число інфікованих C.trachomatis чоловіків
зросло на 62%, а жінок – на 107%, за 1999-2001 рр. – відповідно на 12% і
69% (на 100 тисяч в середньому 70 хворих); і в 2001 році було
зареєстровано 34 381 хворих хламідіозом [Мавров Г.И., 2006].

Одним з найбільш складних питань в проблемі сечостатевого хламідіозу
залишаються його діагностика, розповсюдженість, особливості
імунопатогенезу, які призводять до хронізації захворювання, і підходи до
лікування. Дуже важливим залишається питання про частоту монохламідіозу,
про сполучення хламідій з іншими інфекційними агентами, про роль
дисбіозу в підтримці персистенції хламідій.

Відомо, що хламідії відносяться до облігатної внутрішньоклітинної
інфекції, і її присутність в організмі може тривалий час не проявлятися
клінічно [Башмакова М.А. и соавт., 2000; Potts J. M. and Pasqualotto F.
F., 2004; Sukumar P. et al., 2003]. До цього часу не відомо, що є
головними причинами, які призводять до інфікування і наступної
маніфестації хламідіозу. Відповідь на це питання може дати вивчення
можливої ролі імуногенетичних факторів в схильності або резистентності
організму до інфікування та наступного розвитку хламідіозу. Подібних
досліджень при хламідіозі не проводилось.

Наслідки невиявленої та нелікованої хламідійної інфекції наносять
суспільству демографічні і економічні збиткі, що оцінюються
астрономічними сумами [Лебедюк М.М. и соавт., 2001; Мавров Г.И., 2006;
Everett K.D.E. et al., 2000; Krause W. and C. Bohring, 2003; Ojcius M.,
2005]. Поряд з поширеністю та щорічним ростом числа захворівших, ця
інфекція характеризується високою частотою неблагоприємного перебігу, в
тому числі розвитком хронічних форм, загострень і рецидивів. Серед
різноманітних ускладнень урогенітальна інфекція є частой причиною
безпліддя у жінок і найбільш частим пусковим механізмом при реактивних
артритах у чоловіків, а також фактором ризику рака шийкі матки і
простати [Гастон Дж., 2001; Ключарев Г.В. и соавт., 2000; Мавров Г.И.,
2006; Muсoz G., 2004; Skowera A. et al., 2004].

В зв’язку з цим, зрозумілий інтерес клініцистів до розробки нових
ефективних методів терапії даної патології. Насьогодні в терапії ХССХ
виявились деякі протилежні тенденції. Одні автори вважають достатнім
семиденний курс лікування; інші припускають його скорочення до декількох
днів, особливо при використанні азитромиціну і аналогічних нових
препаратів; треті ж вважають за необідне тривалі 1-2 місячні курси зі
зміною антибіотиків, однак невдачі складають до 30% випадків [Айзятулов
Р.Ф., 2003; Башмакова М.А. и соавт., 2000; Глухенький Б.Т. и соавт.,
2002; Горпинченко И.И., Гибнер С.М., 2000]. Аналізуючи різні думки, на
даному етапі багато клініцистів приходять до заключення, що успіх в
лікуванні хламідіозу може бути досягнутий тільки при комбінації
загальної і місцевої терапії з обов’язковим урахуванням імунного статусу
хворих.

Не викликає сумніву, що факторами, які впливають на персистенцію
хламідій, являються особливості взаємовідношень між мікроорганізмом і
імунною системою хазяїна [Бондаренко Г.М. и соавт., 2002; Нагорний О.Є.,
2003; Anttila T. et al., 2000; Potterat J.J. et al., 1999].

Вивчення імунного статусу при хламідіозі, яке проведене деякими
дослідниками, показало, що в ряді випадків у хворих спостерігаються
порушення імунорегуляції зі зниженням рівня Т-хелперів, співвідношення
Тх:Тс, характерні деякі особливості гуморальної ланки [Гомберг М.А.,
Соловьев А.М., 2001; Земсков А. М. и соавт., 1999; Dimitracov J. et
al., 2000; Dohle G. R., 2000; Domeika M., 2002].

В останній час з’явились дані про те, що захист від хламідійної інфекції
може залежати від СD4+-Т-лімфоцитів-хелперів [Su H., Caldwell H.D.,
1995; Skowera A. et al., 2004]. Показано, що Т хелпери 1 типу (Тх1)
відповідають за захист організму від внутрішньоклітинних паразитів, в
той час як для захисту від зовнішньоклітинних необхідна комбінація
цитокінів Тх1 і Тх2 [Ярилин А.А., 1997; Stephens R.S., 1999; Sukumar P.
et al., 2003]. Можна предбачати, що від функціональної активності
хелперів по продукції ними різних медіаторів буде залежати перебіг
сечостатевого хламідіозу.

Експериментальні дані продемонстрували важливу роль такого цитокіну як
гама-інтерферон ((-ІФ) в протихламідійному імунітеті. Показано, що під
впливом хламідій Т-лімфоцити продукують (-ІФ, який, в свою чергу,
володіє здатністю інгібувати ріст хламідій не тільки в мононуклеарних
фагоцитах, але і в фібробластах, епітеліальних клітинах [Roncarolo M.G.,
2001; Samoff E. 2003]. Не тільки лімфоцити, але й епітеліальні клітини,
індуковані хламідіями, здатні до самостійної продукції (-ІФ, що
призводить до виробки NO і ураженню хламідій [Igietseme J.U. et al.,
1997]. Показаний дозозалежний ефект впливу (-ІФ на хламідії: в той час
як високі рівні повністю затримують ріст хламідій, низькі індукують
розвиток морфологічно аномальних внутрішньоклітинних форм [Stephens R.
S. et al., 1998; Yang J. et al., 2003] .

Зрозуміло, що без глибокого вивчення імунної системи з характеристикою
продукції як (-ІФ, так і взаємозв’язку його з комплексом інших
медіаторів (ІЛ-1, -2, -10, -12, ФНП) неможливо формування концепції
імунопатогенезу хламідіозу з розробкою відповідних схем лікування, в
тому числі з обов’язковою імунотерапією, що є необхідним для ефективної
боротьби з хламідіями.

Таким чином, дослідження останніх років демонструють важливість вивчення
механізмів імунної відповіді при хламідіозі для виявлення
імунопатогенезу даної патології і розробки ефективних схем терапії, в
тому числі з використанням імуномодуляторів. Важливе значення при цьому
має вивчення медіаторів міжклітинних взаємодій, продукуємих як клітинами
макрофагального ряду, так і Т-хелперами 1, 2 типів та Т-регуляторними
лімфоцитами. Немалу роль грає генетична схильність як до особливостей
імунітету, так і клінічного перебігу захворювань, обумовлена
HLA-фенотипом. Однак, комплексних досліджень стану імунітету з
характеристикою функціональної активності клітин по продукції
медіаторів та врахуванням антигенів гістосумісності HLA при хламідійній
інфекції в літературі не знайдено.

В зв’язку з вищенаведеним, очевидно, що актуальність досліджень
обумовлена наступними факторами: розповсюдженістю і соціальною
значимістю патології, що часто призводить до розвитку хронічних
запальних захворювань урогенітальної сфери та безпліддю, а також тяжкої
супутньої патології з інвалідізацією хворих; низьким терапевтичним
потенціалом препаратів (в основному, антибіотиків); сучасними
досягненнями в імунології, що дозволяють проводити дослідження
особливостей імунітету на клітинному та субклітинному рівнях; широкими
можливостями, які відкриваються завдяки останнім досягненням в галузі
виробництва імунотропних препаратів.

Зв’язок роботи з науковими планами і програмами. Робота виконана в
Інституті урології і нефрології АМН України в рамках тем по планам: МОЗ
і АМН України “Вдосконалити існуючі методи етіотропної імунодіагностики
і імунокорекції хворих з урогенітальними інфекціями, що передаються
статевим шляхом, з урахуванням механізмів розвитку захворювань” (№
держреєстрації 0199U000609); “Вивчити генеративну функцію у чоловіків
при хламідійній урогенітальній інфекції з метою покращення ефективності
діагностики лікування, профілактики неплідності” (№ держреєстрації
0101U000517); в Інституті нефрології АМН України в рамках тем “Визначити
етіозалежні механізми формування інфекцій сечової системи, їх топічну
діагностику, лікування та профілактику” (№ держреєстрації 0104U000341);
“Визначити in vitro вплив нових імунотропних препаратів на функціональну
активність моноцитарно-макрофагальної ланки і Т-хелперів І, ІІ типів та
розробити на цій основі нові підходи до імунотерапії хворих на хронічні
запальні захворювання сечостатевої системи” (№ держреєстрації
0104U002473).

Мета роботи. На основі вивчення імунних механізмів визначити особливості
імунопатогенезу хронічного сечостатевого хламідіозу і оптимізувати
діагностику, прогнозування і лікування хворих з використанням методів
імунокорекції.

Задачі досліджень.

Дослідити інформативність різних методів діагностики хламідійної
інфекції.

Вивчити частоту розповсюдженості хронічного сечостатевого хламідіозу.

Виявити особливості стану імунної системи у хворих на ХССХ за даними
стандартної імунограми з врахуванням кількості імунокомпетентних клітин,
рівня імуноглобулінів G, A, M, імунних комплексів, фагоцитарного індекса
і числа.

Дослідити функціональну активність клітин моноцитарно-макрофагальної
системи по продукції медіаторів імунітету – ІЛ-1, ІЛ-12 і ФНП-(.

Вивчити у хворих на ХССХ функціональний стан Т-хелперів 1 типу по
продукції цитокінів — ІЛ-2 і г-ІФ.

Дослідити функціональну активність Т-регуляторних клітин пацієнтів на
основі визначення секреції протизапального медіатора ІЛ-10.

Виявити особливості розподілу HLA-антигенів у хворих для встановлення
факторів схильності до хронічної хламідійної інфекції.

Розробити концепцію імунопатогенезу хронічного сечостатевого хламідіозу
на основі аналізу отриманих результатів.

Провести експериментальні дослідження для вивчення механізмів дії нового
препарата манакс на функціональну активність імунокомпетентних клітин з
метою встановлення доцільності його використання при хронічному
хламідіозі.

Дослідити в умовах in vitro препарат мікотон для визначення можливостей
його використання при хламідіозі.

Обгрунтувати схему лікування хворих на ХССХ з використанням
імунотерапії.

Оцінити клініко-імунологічні ефекти запропонованої комплексної терапії
у пацієнтів з хронічним сечостатевим хламідіозом і визначити оптимальні
схеми лікування при цій патології.

Об’ект досліджень – механізми імунопатогенезу та засоби лікування хворих
на хронічний сечостатевий хламідіоз.

Предмет досліджень – отримані з крові хворих на ХССХ клітини імунної
системи та цитокіни, що ними продукуються.

Методи досліджень – клінічні, лабораторні, мікробіологічні,
імунологічні.

Наукова новизна отриманих результатів

при порівняльному аналізі різних методів дослідження науково доказаний
комплекс переваг методу ПЛР для діагностики хламідіозу і об’єктивної
динаміки стану на фоні лікування, до яких відносяться: пряме визначення
збудника, висока специфічність та чутливість методу, широкий спектр
об’єктів досліджень і універсальність процедури виявлення різних
збудників, можливість діагностики латентних форм інфекції;

на основі епідеміологічних досліджень в різних регіонах (Київ,
Владивосток) показана значна етіологічна роль хламідій, трихомонад,
мікоплазм і уреаплазм в запальних процесах сечостатевих органів як у
жінок, так і у чоловіків; хламідії при цьому зустічаються в асоціації з
одним збудником в 40,85%, з двома – в 16,46%, з трьома і більше – в
3,65% випадків. Серед асоціантів одно з перших місць займає
U.urealiticum (58,20%), T.vaginalis (14,92%), G.vaginalis (11,94%);

вперше показано достовірне зниження продукції ІЛ-12 при ХССХ, що
розглядається як причина подальших порушень продукції цитокінів
імунокомпетентними клітинами;

формування ХССХ супроводжується високою спонтанною продукцією ІЛ-1 зі
зниженням індукованої;

імунна відповідь на C.trachomatis у хворих на ХССХ характеризується
високою активністю Т-хелперів 2 типа і Т-регуляторних клітин зі
зниженням функціональної активності Т-хелперів 1 типа, що можна
розцінювати як важливий фактор імунопатогенезу хронічного хламідіозу;

ХССХ достовірно частіше зустрічається у осіб, в HLA-фенотипі яких
присутні визначені антигени (А10, В27, В51, DR5,2,7), що корелює з
високою продукцією ІЛ-10 і, відповідно, низькою – г-ІФ; виявлені зв’язки
можуть бути причиною розвитку хронічного хламідіозу і дозволяють
говорити про його генетичну детермінованість;

дані досліджень in vitro продемонстрували, що новий препарат манакс
володіє імунотропною дією, одним из важливих механізмов якої є активація
неспецифічних факторів захисту, підвищення фагоцитарної і протизапальної
активності імунної системы, що послужило основою наукового обгрунтування
для використання його у пацієнтів з ХССХ;

встановлена, на основі досліджень in vitro, доцільність використання при
ХССХ препарата мікотон в зв’язку з його впливом на імунокомпетентні
клітини, який призводить до підвищення кількості фагоцитуючих клітин і
експресії рецепторів на поверхні клітин, посилення проліферативної
активності Т-клітин і продукції ІЛ-1 ;

науково-обгрунтована схема імунотерапії, і на основі отриманих
клініко-лабораторних ефектів, одним з яких була нормалізація балансу
продукції про- та протизапальних цитокінів, доказана доцільність її
використання.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблені на основі великої
кількості клініко-лабораторних спостереджень найбільш ефективні
методичні підходи до виявлення C.trachomatis і діагностики хронічного
сечостатевого хламідіоза у хворих. Для практичного лікаря рекомендується
пам’ятати, що вибір методу для діагностики хламідіозу в суттєвому
ступені залежить від клінічної форми захворювання: характера перебігу
запалення (гостре, підгостре, хронічне), топічного діагнозу, ступеня
розповсюдженості запального процесу, а також мети обстеження
(лабораторне підтвердження діагнозу або масове скринінгове обстеження
груп ризику). Показано, що використання агару з визначеними
характеристиками для детекції продуктів ампліфікації дає можливість
поширити об’єм досліджень методом ПЛР.

Аналіз великої кількості дослідженних зразків матеріалу, отриманого у
хворих з запальними захворюваннями сечостатевих органів, продемонстрував
глибину ураження, етіологічним фактором якого являються хламідії,
трихомонади. Присутність умовно-патогенної флори класу Mollicutes
(M.hominis и U.urealyticum) в урогенітальному тракті у всіх пацієнтів
розцінено як етіологічний фактор, що приймає участь в розвитку
запалення, ускладнює діагностику і ефективність лікування.

Проведена комплексна оцінка стану імунної системи у хворих на ХССХ та
визначені ланки, що потребують імунокорекції. Активація гуморальної
ланки імунітету з високими показниками ІК в сироватці крові дозволили
рекомендувати використання сорбентів, а саме, сучасного препарата
мікотон, при ХССХ.

Встановлення зниження кількісних (рівня СD4+-клітин і імунорегуляторного
індекса) та функціональних (продукції г-ІФ) показників Т-клітинної
ланки імунітету дозволило зробити висновок про доцільність використання
препаратів тимусу і рекомендувати використання тималіну.

Відмічене зниження спонтанної і стимульованої продукції г-ІФ у пацієнтів
свідчило про необхідність використання препаратів екзогенного
інтерферона для боротьби з хронічною хламідійною інфекцією, що побудило
включити в схему лікування пацієнтів лаферон (рекомбінантний (-2(
інтерферон), створений співробітниками Інститута молекулярної біології і
генетики НАН України на основі фагозалежної генноінженерної
біотехнології.

Проведені в умовах in vitro дослідження дозволили встановити, що
препарати манакс і мікотон володіють вираженим імунотропним ефектом з
впливом на показники фагоцитоза і цитокіновый профіль, що дозволило
визначити спектр їх впливу при використанні терапевтичних доз і включити
в схему імунотропної терапії у хворих на ХССХ.

На основі клініко-лабораторних і сучасних імунологічних досліджень була
розроблена науково-обгрунтована схема лікування хворих на ХССХ.
Продемонстровані позитивні клініко-імунологічні ефекти використання
запропонованої схеми терапії з участю імунотропних препаратів, які
достовірно відрізняються від стандартних підходів, що дозволяє
рекомендувати її використання для підвищення ефективності лікування
хворих з хронічним хламідіозом.

Схема комплексного лікування використовується в клініці Інститутів
урології і нефрології АМН України, урологічних клініках Владивостока
(Російська Федерація), Київському міському дермато-венерологічному
диспансері, на кафедрі клінічної імунології та алергології Національного
медичного університету ім. О.О.Богомольця. Рекомендується її
впровадження в спеціалізованих клініках і при амбулаторному лікуванні
спеціалістами відповідного профілю – урологами, гінекологами,
дермато-венерологами. Методичні підходи до діагностики дозволяють
рекомендувати їх для використання також лікарями-лаборантами,
мікробіологами, інфекціоністами, педіатрами. Для цього опубліковані,
крім статей, методичні рекомендації, інформаційний лист, посібник для
лікарів, патент.

Особистий вклад пошукача. Ідея дисертаційної роботи запропонована
провідними спеціалістами – доктором медичних наук, професором
Г.М.Дранніком; доктором медичних наук, професором І.І.Горпинченко;
доктором медичних наук, професором А.В.Руденко. Автором проведені
відбір, обстеження, лікування хворих на ХССХ зі спостереженням в
динаміці. Терапія проводилась за допомогою як традиційних, так і
запропонованих науково-обгрунтованих внаслідок проведених дисертантом
досліджень схем лікування з використанням імунотропних препаратів.
Автором проведений співставлюваний аналіз різних методів етіологічної
діагностики запальних сечостатевих захворювань і розроблений
оптимальний алгоритм; розроблена концепція імунопатогенезу хронічного
сечостатевого хламідіозу. Імунологічні, бактеріологічні, а також
інструментальні обстеження хворих проведені спільно з спеціалістами
відповідного профілю: імунологічні дослідження – зі співробітниками
лабораторії імунології, мікробіологічні – лабораторій мікробіології
Інститутів урології та нефрології АМН України (зав. – проф.
А.В.Руденко). Розробка головних напрямків досліджень, визначення мети,
задач роботи, а також аналіз отриманих результатів, положень і висновків
проведені автором спільно з науковим консультантом – доктором медичних
наук, професором В.Є.Дріянською.

Апробація результатів роботи: Основні положення дисертації докладалися
та обговорювалися на конференціях і симпозіумах: на 4 Всеукраїнській
науково-практичній конференції по актуальним питанням алергології,
клінічній і лабораторній імунології (Київ, 1999); симпозиумі
«Епідеміологія, імунопатогенез, діагностика та лікування хламідіозу»
(Київ, 2000); III Національному Конгресі патофізіологів України (Одеса,
2000); 3 Всеросійській науково-практичній конференції (Москва, 2000);
II Міждисциплінарній науково-практичній конференції “Епідеміологія,
імунопатогенез, діагностика та лікування хламідіозу” (Київ, 2001); III
Міжнародній конференції “Медицинские последствия Чернобыльской
катастрофы: итоги 15-летних исследований” (Київ, 2001);
науково-практичних конференціях “Епідеміологія, імунопатогенез,
діагностика та лікування хламідіозу та TORCH-інфекцій” (Київ,
2002-2005рр.); VI звітно-виборчій і науково-практичній конференції
Українського товариства спеціалістів по імунології, алергології і
імунореабілітації (УТІАІ) (Київ, 2002); I Всеукраїнській
науково-практичній конференції «Аутоімунні захворювання: імунопатогенез,
імунодіагностика, імунотерапія» (Киів, 2003); 1 Всеукраїнській
науково-практичній конференції “Імунотропні препарати в клінічній
практиці” (Київ, 2004); Першому з’їзді сексологів і андрологів України
(Київ, 2004); VIII Українській науково-практичній конференції з
актуальних питань клінічної і лабораторної імунології, алергології та
імунореабілітації (Київ, 2006).

На міжнародних симпозіумах і конгресах: The Annual Meeting of the
European Academy of Allergology and Clinical Immunology (Brussels,
Belgium, 1999), XIX Congr. of the European Academy of Allergology and
Clinical Immunology (Lisbon, Portugal, 2000); 56 An. Meeting AAAAI (San
Diego, California, 2000); 3 Intern. Conference “Health effects of the
Chernobyl Accident: Results of 15-year follow-up studies” (Kiev,
Ukraine, 2001); The Joint Meeting of the European Academy of Allergology
and Clinical Immunology, the Romanian society of Allergology and
Clinical Immunology (Romania, 2002); XXI EAACI Congress (Naples, Italy.
– 2002); Proc. II World Congr. of Immunopathol. & Respiratory Allergy
(Moskow, Russia, 2004); 5th Annual Meeting FOCIS (USA, 2005).

Публікації. Результати досліджень опубліковані у 24 статтях у фахових
виданнях, затверджених ВАК України (в тому числі 1 – англійською мовою),
опубліковано посібник для лікарів, 15 тез доповідей, 1 патент, 1
інформаційний лист, 1 методичні рекомендації.

Структура та обсяг дисертації. Загальний обсяг дисертації складає 294
сторінки, робота включає вступ, огляд літератури, 9 розділів власних
досліджень, аналіз та узагальнення отриманих результатів, висновків та
практичних рекомендацій. Список використаних джерел складають 265 робіт
кирилицею та 208 латиницею. Матеріали дисертації ілюстровано 23
таблицями та 53 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Були обстежені 1890 пацієнтів (876
чоловіків та 1014 жінок). Досліджені 2746 зразків патологічного
матеріалу — зішкрябів зі слизової уретри, цервікального каналу, піхви, а
також секрет передміхурової залози, еякулят і сеча. В м.Києві був
проаналізований 951 зразок матеріалу (з них взято у чоловіків — 495), а
в м. Владивосток – 1795 зразків (з них у чоловіків – 914).

Для етіологічної діагностики використовували методи бактеріоскопії,
прямої імунофлуоресценції (ПІФ), імуноферментного анализу (ІФА),
полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Досліджували сироватку крові на
присутність антитіл класів IgA, IgM, IgG до антигенів C.trachomatis
діагностичною імуноферментною тест-системою “Хлами-Бест C.trachomatis”,
яка представляє собою набор, головним реагентом якого є очищений
білковий антиген C.trachomatis. Досліджували епітеліальні зішкряби
уретри, цервікального каналу, секрету передміхурової залози і еякулят на
присутність в них ДНК C.trachomatis методом ПЛР з використанням
видоспецифічних праймерів C.trachomatis, M.hominis, U.urealyticum,
G.vaginalis (реактиви і обладнання фірми “ДНК-Технологія”, Москва,
Росія).

Визначено 225 пацієнтів, у яких в зразках виявлена C.trachomatis, з них
106 чоловіків і 119 жінок. 80% пацієнтів було зі змішаною інфекцією,
коли поряд з хламідями в дослідженому матеріалі виявлялись гарднерели
і/або уреаплазма, мікоплазма та ін.

Клінічно майже всі 225 пацієнтів з підтвердженим хламідіозом скаржилися
на слабкість, швидку втомлюваність; 40% — на болі внизу живота; 60% — на
болі, різі при сечовипусканні; 50% — на виділення слизу з уретри.

20% пациієнтів звернулись за медичною допомогою з приводу сечостатевого
хламідіозу вперше, 80% хворих лікувались з приводу даного захворювання
раніше, попередні методи лікування були неефективні. В анамнезі жінки в
більшості випадків були на спостереженні декілька років у гінеколога з
приводу хронічних запальних захворювань, У 76 жінок були роди, з них у
27 спостерігалися спонтанні аборти; 33 жінки (28%) лікувалися від
безпліддя, при цьому у 11 з них були в минулому зриви вагітності.

У чоловіків зареєстровано 29 випадків безплідних шлюбів,
спостергігаються у уролога на протязі останніх років. Клінічно у
чоловіків визначався гострий уретрит (12), хронічний уретрит, простатит
(81); у жінок — хронічний ендоцервіцит, кольпіт (44), хронічний
аднексит (39), ерозія шійки матки (13), генітальний герпес (8). З
супутніх захворювань у пацієнтів реєструвались: вегето-судинна дистонія
(29), хронічний холецистіт (27), виразкова хвороба 12-палої кишки в
стадії ремісії (11), хронічний пієлонефрит в стадії ремісії (8),
сечокам(яна хвороба (6). Артралгії відмічені у 17 хворих, у 7 в минулому
діагностували кон’юнктивіти.

Таким чином, діагноз “хронічний сечостатевий хламідіоз” був
веріфікований на основі скарг, анамнезу життя і хвороби, клінічного
стану, а також лабораторних методів дослідження.

В динаміці лікування під наглядом знаходилось 59 хворих на ХССХ, при
цьому 39 хворих 1 групи (17 чоловіків і 22 жінки, з них 13 одружених
пар) використовували запропоновану нами схему терапії з включенням
імунотропних препаратів. В другу (2), контрольну, групу увійшло 20
хворих, які використовували стандартні методи терапії.

При порівнянні груп з використанням критерію хі-квадрат групи не
відрізнялись за віком (в середньому — 25-35 років), статтю, клінічними
проявами і тривалістю інфекції (p<0,05). Дослідження імунного статусу проведені в лабораторії імунології Інституту урології і нефрології АМН України (зав. лаб. – д.мед.н., професор Г.М.Драннік). За допомогою стандартних імунологічних тестів було обстежено 150 хворих, в тому числі 59 – після лікування, і 180 здорових донорів. Проаналізовано 2700 показників імунітету I рівня у пацієнтів до лікування і 1062 – після, а також 3240 - у здорових осіб. Відносне число лімфоцитів, експресуючих на мембрані антигени CD3, CD4, CD8, CD19 визначали за допомогою набора діагностикумів на основі моноклональних антитіл (Витебськ, Республіка Беларусь). Рівень імуноглобулінов класів A, G, M визначали методом радіальної імунодифузії по Манчіні. Вміст імунних комплексів в сироватці крові визначали за допомогою метода преципітації в поліетиленгліколі. Кількість фагоцитуючих клітин і їх поглинальну активність визначали за їх здатністю поглинати частинки латексу. До лікування проведені дослідження спонтанної та індукованої продукції у 25 здорових донорів (контрольна группа) та у 70 хворих на ХССХ: ІЛ-1, ФНП-б, ІЛ-12, ІЛ-2, г-ІФ і ІЛ-10. Після лікування продукція цитокінів досліджена у 50 пацієнтів. Таким чином, проаналізовано 1450 зразків, що характеризують стан цитокінпродукуючої здатності імунокомпетентних клітин пацієнтів після проведеного лікування. Вивчено розподіл HLA-антигенів у 78 хворих з урогенітальною інфекцією. Групу контроля складали 350 здорових донорів – мешканців м.Києва. Антигени HLA визначали за допомогою стандартного мікролімфоцитотоксичного тесту на планшетах Терасакі з використанням спеціальної панелі анти-HLA сироваток, за допомогою якої можна визначити більше 20 антигенів локуса А і 30 – локуса В. Лімфоцити, які типували, виділяли з гепарінізованої периферичної крові шляхом центрифугування на градієнті плотності фікол-верографіну. Достовірність різниці в частоті визначення HLA-антигенів оцінювали за допомогою критерія хі-квадрат для таблиць 2х2. У випадках, коли один з показників був меньше 10, для оцінки достовірності різниці використовували метод Фішера. Величину відносного ризика захворювання (RR) визначали по коефіцієнту: RR = аб/вг, где а – кількість хворих, позитивних за даним антигеном, б – кількість осіб в контролі, негативних за даним антигеном, в – кількість хворих, негативних за даним антигеном, г – кількість осіб в контролі, позитивних за даним антигеном. При цьому достовірно значущими вважали показники RR>2,0 [Зарецкая Ю.М., 1983].

Етіологічну фракцію (атрибутивний ризик, () рахували по формулі: ( = х
– у/1 – у, де х – частота антигену у хворих, а у – частота у здорових.
Даний показник дає можливість об’єктивно оцінити причинну роль в
етіопатогенезі захворювання одного з декількох антигенів-провокаторів,
для яких RR складав >2,0. Достовірним вважали показник ( більше 0,1.

Імуноферментний метод дослідження

а) Одержання супернатантів. Виділені на стандартному градієнті
фікол-верографіну (1,076-1,078) мононуклеарні клітини периферичної крові
відмивали тричі в середовищі 199 і ресуспензували в культуральному
середовищі RPMI-1640, що містило 10% ембріональної телячої сироватки, 40
мкг/мл гентаміцину, 5х10 М 2-меркаптоетанолу та 3% L-глютаміну. Клітинну
суспензію в концентрації 1,5х106 кл/мл інкубували 24 години в
СО2-інкубаторі при t=37(С без стимулюючого агента або додавали мітогени.
По закінченні строку інкубації клітини осаджували центріфугуванням при
1600 об/хв протягом 10 хвилин, збирали супернатанти і зберігали до
тестування при t= -20( С.

Вміст цитокінів у супернатантах визначали за допомогою імуноферментного
методу. Для визначення вмісту цитокінів використовували тест системи
“DIACLON” (Франція), “IMMUNOTECH” (Франція) та “Протеїновий контур”
(Санкт-Петербург, Росія). Тестування проводилось за допомогою
імуноферментного методу на приладі Stat Fax 303 Plus.

b) Визначення вмісту цитокінів у супернатантах. До 96-лункових планшет
додавали: по 100 мкл стандартів у відповідні лунки для побудови
калібровочної кривої. В інші лунки вносили по 100 мкл супернатанту, що
досліджувався. В усі лунки додавали по 50 мкл відповідних
антицитокінових антитіл. Планшети інкубували при кімнатній температурі
протягом 2 годин, потім лунки 5 разів ретельно промивали буфером і
видаляли залишки рідини.

Далі в кожну лунку вносили по 100 мкл кон’югату
(стрептовідін-пероксидазу), включаючи “нульову” пробу. Після цього
проби інкубували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин.
Повторювали промивку планшети 5 разів та вносили до всіх лунок по 100
мкл TMB-субстрату (хромогену) агента, що утворює кольори. Після
інкубації протягом 12-15 хвилин зупиняли ферментативно-субстратну
реакцію, додаючи в кожну лунку по 100 мкл H2SO4. Далі проводили
визначення оптичної щільності стандартів та зразків супернатантів при
довжині хвилі 450 нанометрів.

Для вірогідної оцінки результатів калібрована стандартна крива при
побудові повинна бути лінійною і вказувати на прямо пропорційний
характер між рівнем концентрації цитокіну в супернатанті та оптичною
щільністю. Дані аналізу проб щодо рівня синтезу цитокінів визначали
шляхом їх інтерполяції з отриманою кривою.

Межі нормальних значень вказаних імунологічних параметрів були отримані
на основі результатів дослідження 25 умовно здорових осіб відповідно до
групи обстежених на ХССХ.

Супернатанти, отримані вищевказанною методикою, використовувалися для
тестування продукції цитокінів.

Отримані дані оброблені статистично на персональному комп’ютері за
допомогою пакета програм “SPSS for Windows. Версія 11” та “MedStat”.
Математична обробка одержаних результатів проводилася з урахуванням
перевірки показників на нормальний розподіл та порівняння груп за
ознаками статі та віку з використанням тесту Колмогорова-Смірнова та
критерію хі-квадрат. Для статистичної обробки використовувались
параметричні критерії статистики — тест Ст’юдента і метод Шеффе або
непараметричні – критерій Уілкоксона, аналіз Крускала-Уолліса.
Достовірною вважали різницю при р<0,05. Отримані результати та їх обговорення. Порівняльна характеристика методів (бактеріоскопії, ПІФ, ІФА і ПЛР), які використовуються для визначення C.trachomatis, показала значні переваги методу ПЛР, чутливість якого склала 97,8%, а частота виявлення хламідіоза досягала 10,6%; в той же час чутливість методу ПІФ була 86,9%, а частота виявлення – 6,9%. Бактеріоскопічний метод не має діагностичної цінності для етіологічної діагностики хламідіоза. Однак за допомогою мікроскопії мазків вдається получити уявлення про склад мікрофлори і ступеня запалення. Метод ІФА є виключно цінним для постановки етіологічного діагнозу у випадках локалізації інфекції в "високих відділах" урогенітального тракту (особливо, при наявності спайок в маточних трубах), коли при збиранні біологічного матеріалу методом зішкрябів збудник хламідіоза виявляється недоступним для методів прямої детекції. Дослідження показали, що самим інформативним матеріалом для дослідження на хламідії у жінок являється уретра, у чоловіків еякулят. Вперше проведено співставлення результатів досліджень по виявленню частоти збудників інфекцій, що передаються статевим шляхом, у осіб, звернувшихся до медичних закладів м. Києва і м. Владивостока при використанні метода полімеразної ланцюгової реакції з використанням тест-систем однієї фірми. Отримані дані дозволили визначити структуру збудників інфекційно-запального процесу геніталій: було показано, що найбільша вага приходиться на хламідійну, трихомонадну інфекції і інфекцію, обумовлену папіломавірусом людини. Аналіз проведених досліджень показав, що хламідії зустрічаються в асоціації з одним збудником в 40,85%, з двома – в 16,46%, з трьома і більше – в 3,65% випадків. Серед асоціантів одно з перших місць займає U.urealiticum (58,20%), T.vaginalis (14,92%), G.vaginalis (11,94%). Частота виявлення хламідій у чоловіків Владивостока складала: в уретрі 15,4%, секреті передміхурової залози - 13,3% і в еякуляті – 16,7%; у чоловіків Києва цей показник виявився суттєво вище – відповідно 35,9%, 18,5% та 34,6% (р<0,05). В цервікальному каналі у жінок Владивостока ДНК хламідій виявлена рідше, ніж у жінок Києва, а також значно рідше, ніж в уретрі у чоловіків. В цервікальному каналі трихомонади виявлені частіше у обстежених киянок, а G.vaginalis – у жінок Владивостока. Звертає увагу високий показник виявлення ДНК папіломавіруса в зішкрябах із слизової цервікального каналу і піхви у киянок – 63,6% (у 49 з 77 обстежених). Цей показник викликає тривогу, тому що за даними останніх років вірус папіломи людини являється фактором ризику розвитку рака шійки матки. Висока частота виявлення гарднерел, мікоплазм, уреаплазм у мешканок як Києва, так і Владивостока, свідчать про розвиток дисбіозу біотопа піхви у жінок і уретри у чоловіків. Порушення складу нормальної мікрофлори того чи іншого біотопа (якісні або кількісні) можуть ініціювати і/або підтримувати патологічні процеси, сприяючи зниженню захисних функцій слизових оболонок і підтримуючи персистенцію збудників у хворих. Питання про роль зниження захисних сил організму, дисбалансу в роботі імунної системи в останні роки все частіше звучить при обговоренні причин, що сприяють хронізації хламідійно інфекції. Тому в роботі були вивчені особливості стану імунної системи у хворих на ХССХ. По-перше, досліджувались за допомогою стандартних методів показники клітинного і гуморального імунітету. Обтежено 150 хворих; контролем служили 180 здорових донорів. Проведені дослідження показали, що у хворих має місце активація гуморальної ланки з достовірним підвищенням рівня В-лімфоцитів та циркулюючих імунних комплексів, на фоні високих показників фагоцитарної ланки. Навпаки, Т-ланка імунітету, особливо кількість Т-лімфоцитів хелперів - CD4+-клітин, а також імунорегуляторний індекс знижені у половини хворих. В останні роки розвивається такий напрямок досліджень як вивчення функціональної активності клітин і їх кооперативної взаємодії за результатами аналізу продукції цитокінів, які грають роль медіаторів, що забезпечують всі міжклітинні взаємодії. Однак, досліджень комплексу цих медіаторів при хламідійній інфекції в літературі ми не знайшли. В зв’язку з цим, були проведені дослідження функціонільної активності: 1) моноцитарно-макрофагальної ланки – за продукцією ІЛ-1, ФНП-б; 2) Т-хелперів 1 типу - за спонтанною та стимульованою секрецією ІЛ-2 і (-ІФ; 3) Т-регуляторних клітин – за спонтанніою та стимульованою секрецією ІЛ-10. 1) Аналіз супернатантів, отриманих у здорових, показав, що в нормі продукція ІЛ-1 коливалась незначно (96,7–180,2 пкг/мл) і в середньому складала 116,9(7,0 пкг/л. Активація мононуклеарів продигіозаном призводила до підвищення продукції монокіну на 30-75%, що в середньому складало 211,8(15,2 пкг/мл (p<0,05). Середній показник спонтанної продукції ІЛ-1 у хворих достовірно вище, ніж у здорових – 206,0(24,0 пкг/мл (p<0,05). При індивідуальному аналізі звертає на себе увагу варіабельність вмісту ІЛ-1 в супернатантах від 117 до 600 пкг/мл. При аналізі індивідуальних показників виявили, що у більшості пацієнтів з комбінованим хламідіозом спонтанна продукція ІЛ-1 відповідає рівню контроля – 107,0(17,1 пкг/мл, тоді як у пацієнтів з моноінфекцією вони перевищують навіть індуковану продукцію у здорових – 270,0(18,0 пкг/мл (р<0,05). Активація імунокомпетентних клітин хворих призводила до зниження продукції монокіну в порівнянні як зі спонтанною, так і з індукованою продукцією у здорових і складала в середньому 158,6(24,2 пкг/мл, при цьому ступінь пригнічення значно відрізняється у окремих хворих. Аналіз показників не виявив залежності між ступенем пригнічення та вихідним рівнем продукції або характером хламідійної інфекції – моно- або мікст. Можливо, має значення тривалість захворювання (встановити яку можна не завжди), яка призводить до зниження компенсаторних можливостей клітин. Дослідження ФНП-( продемонстрували, що продукція цього цитокіну у здорових коливається від 14 до 27 пкг/мл і в середньому складає 17,32±1,01 пкг/мл. При активації клітин продигіозаном вміст ФНП-( в супернатантах підвищується в 1,5 рази і в середньому складає 26,63(2,40 пкг/мл (р<0,05). Аналіз продукції ФНП-( у хворих на ХССХ показав, що середні цифри спонтанної і стимульованої секреції достовірно не відрізняються як від донорів, так і в порівнянні між собою – відповідно 22,30±2,25 та 26,1±1,74 пкг/мл (р>0,05).

Індивідуальний аналіз дозволив відмітити, що за спонтанною продукцією
ФНП-( пацієнтів можна поділити на дві групи – з високим і низьким рівнем
секреції цитокіну. Висока продукція характерна для хворих зі змішаною
урогенітальною інфекцією, коли наряду з хламідіями виявлялись гарднерели
і/або уреаплазма, мікоплазма. Вміст ФНП-( в супернатантах таких
пацієнтів в декілька разів перевищував показники у здорових і складав в
середньому 32,21±2,61 пкг/мл, що перевищувало стимульовану продукцію в
нормі (p<0,05). Додаткова активація імунокомпетентних клітин у пацієнтів цієї групи, як правило, призводила до зниження продукції ФНП-(. В підгрупу хворих з низьким рівнем продукції ФНП-( увійшли пацієнти, у яких були виявлені тільки хламідії, активація клітин продигіозаном в цій підгрупі викликає підвищення продукції цитокінов, однак в меньшому ступені, ніж в контрольній групі – від 11,23±0,87 до 18,54±1,03 пкг/мл (р<0,05). Таким чином, у хворих на ХССХ, при відсутності достовірних відмінностей від здорових за даними середніх показників продукції ФНП-(, відмічений низкий рівень спонтанної секреції при монохламідіозі і висока спонтанна продукція зі зниженням мітоген-індукованої при мікст-інфекції. Отримані дані можно пояснити як різноманітністю спектра антигенів-збудників при змішаній інфекції, так і участю в секреції цього цитокіна, крім моноцитів-макрофагів, додатково Т-хелперів 1 типа. Проведені дослідження показали, що у здорових донорів середня спонтанна продукція ІЛ-12 складала 302,0±20,0 пкг/мл, при стимуляції відбувається підвищення продукції до 386,6±22,7 пкг/мл (р<0,05). При обстеженні хворих на ХССХ виявлено достовірне зниження продукції ІЛ-12, як спонтанної – 201,0±11,4 пкг/мл (р<0,05), так і стимульованої – 268,5±25,8 пкг/мл (р<0,05). Достовірне зниження продукції ІЛ-12, який є одним з ключових цитокінів, що впливають як на аутокринну регуляцію активності Т-клітин і природних кілерів (ПК), так і на секрецію ними такого важливого прозапального цитокіна як г-ІФ, являється важливим фактором, що сприяє порушенню функціональної активності Т-хелперів 1, продукцію цитокінов якими (ІЛ-2, (-ІФ) вивчали в роботі. 2) Як показали проведені дослідження продукції ІЛ-2, вміст цього цитокіну в супернатантах неактивованих клітин у практично здорових знаходиться в межах 217-597 пкг/мл, а в середньому складає 364,1(27,6 пкг/мл; при активації клітин ФГА продукція ІЛ-2 підвищується, в середньому в 1,5 рази, що складає 548,8(36,4 пкг/мл (р<0,05). У хворих з хламідіозом спонтанна продукція ІЛ-2 коливається від 60,7 до 400,1 пкг/мл, середній показник дорівнює 232,8(17,0 пкг/мл, що достовірно нижче, ніж у здорових донорів (р<0,05). У 70% хворих спонтанна продукція не перевищує мінімального показника в групі здорових і в 1,5 рази нижче середнього значення норми. При активації клітин хворих за допомогою мітогену не відмічалось достовірного підвищення продукції ІЛ-2. В середньому індукована продукція у пацієнтів складала 266,6(14,7 пкг/мл в порівнянні з показником спонтанної секреції - 232,8(17,0 пкг/мл (р>0,05) і була значно нижче, ніж в нормі у здорових — 548,8(36,4 пкг/мл
(р<0,05). Дослідження продукції (-ІФ показали, що його рівень у здорових в середньому складає 22,9(0,4 пкг/мл, при активації клітин ФГА продукція підвищується в 2 рази, що відповідає 42,34(3,1 пкг/мл (р<0,05). У хворих з сечостатевим хламідіозом спонтанна продукція (-ІФ в середньому складає 12,8(0,58 пкг/мл (р<0,05), що майже в 2 рази меньше, ніж у здорових (р<0,05). Активація клітин хворих призводить до посилення синтезу (-ІФ до 29,9(2,7 пкг/мл (р<0,05), тобто мітогеніндукована продукція підвищується майже в 2 рази, як і у здорових донорів. Однак, незважаючи на підвищення, показник не досягає значень норми, тобто двократне підвищення при стимуляции клітин не може компенсувати первинне зниження спонтанної здатності клітин до секреції цього медіатора. Індивідуальний аналіз показав, що зниження спонтанної и стимульованої продукції (-ІФ мало місце відповідно у 93% та 87% хворих на ХССХ. Таким чином, рівень спонтанної секреції (-ІФ у пацієнтів в 2 рази нижче, ніж в контрольній групі, однак, на відміну від ІЛ-2, при додатковій активації мітогеном відбувається значне підвищення синтезу цього медіатора, що вказує на задовільні резервні можливості клітин за його продукцією. Зважаючи на те, що в той час як високі рівни (-ІФ повністю пригнічують ріст хламідій в клітинних культурах, його низькі концентрації індукують розвиток аномальних внутрішньоклітинних форм, здатних до тривалої персистенції з наступною трансформацією в типові морфологічні форми, можно вважати, що (-ІФ при низькому рівні продукції не тільки не ефективний як медіатор імунної реакції, але навіть являється фактором, що сприяє підтримці існування хламідійної інфекції. З іншого боку, тривала присутність в організмі інтерферон-індукуючого фактору, наприклад, при хронізації інфекції, може призводити до розвитку фази рефрактерності (гіпореактивності), яка проявляється в нездатності клітин продукувати (-ІФ у відповідь на індуктор. Вважаємо, що це необхідно враховувати при призначенні імунотропної терапії хворим з хронічною хламідійною інфекцією. 3) Важливим цитокіном, який продукується Т-регуляторними клітинами і називається “супресорним”, є ІЛ-10. Відомо, що він володіє здатністю пригнічувати синтез і секрецію цитокінів Тх1 лімфоцитами, активованими моноцитами і ПК-клітинами. У моноцитів під впливом ІЛ-10 пригнічується також експресія на мембрані білків МНС-II і зв’язана з цими білками здатність моноцитів представляти антигени Т-хелперам. В зв”язку з цим, важливою частиною роботи було встановити особливості продукції даного лімфокіну. Дослідження показали, що спонтанна продукція ІЛ-10 в групі здорових коливається від 90,7 до 287,7 пкг/мл, а середній показник дорівнює 151,4(15,7 пкг/мл. При активації імунокомпетентних клітин мітогеном спостерігається підвищення вмісту ІЛ-10 в супернатантах більш ніж в 10 разів, що в середньому складає 1613,3(114,0 пкг/мл. < O i ? - † ? ? 8 d a$ d d d < >

@

B

D

F

O

?

d

a?cfe~i8i|i?ooooeeeaUUaIIUIA???II

dh`„»

dh`„A

$a$

Iфекції, резервні ж можливості цієї секреції нижче, ніж у здорових
донорів.

Таким чином, представлені нами дані по вивченню ролі продукції цитокінів
в патогенезі хронічного хламідіозу дозволяють відмітити підвищену
активність клітин моноцитарно-макрофагальної системи по продукції такого
важливого індуктора імунної відповіді на інфекцію як ІЛ-1. Крім того,
отримані результати показали, що для хворих на ХССХ характерно зниження
функціональної активності Т-лімфоцитів хелперів 1 типу. Найбільш суттєво
пригнічується секреція ?-ІФ, тому що і спонтанна і стимульована майже
в 2 рази нижче норми, тоді як зниження спонтанної продукції ІЛ-2
виражено не так суттєво.

Отримані дані свідчать також про високий рівень продукції ІЛ-10 при
хламідійній інфекції, тобто про активацію Т-регуляторних лімфоцитів зі
зниженням їх резервних можливостей. Виявлені особливості свідчать про
важливу роль дисбалансу функціональної активності Т-хелперів в
імунопатогенезі ХССХ.

Відомо, що регуляція імунної відповіді являється однією з головних
фізиологічних функцій організма, і велика роль в виконанні цих функцій
належить генам главного комплексу гістосумісності. Молекули антигенів
HLA забезпечують презентацію, тобто представлення імунодомінантних
пептидів, які являються продуктом внутрішньоклітинного протеолізу
чужорідних антигенів, проти яких і буде індукована імунна відповідь.

Серед теорій, пояснюючих схильність до захворювання в залежності від
носійства того чи іншого антигену гістосумісності, у випадку інфікування
хламідіями і генерализації процесу, привертає увагу теорія мімікрії
антигенів. Згідно з цензорною роллю HLA I класу в збереженні гомеостазу,
ця теорія передбачає факт нерозпізнавання клітинами СD8+ ендогенного
пептиду: інформація про змінені (внаслідок персистенції хламідій в
епітелії слизових) цитозольні білки не сприймається антигенрозпізнаючим
рецептором СD8+-Т-лімфоцитів. Це обумовлено тим, що змінені під впливом
хламідій цитозольні білки недостатньо відрізняються від нормального
пептиду і тому мають низьку імуногенність. Таким чином, внаслідок
недостатної стимуляції чужерідними антигенами клон сенсібілізованих
Т-кілерів не формується і хламідія не стає об’ектом для усунення. Можна
передбачати, що при деяких HLA-А, В, С антигенах індивідуума феномен
мімікрії проявляється повною мірою, це призводить до вільного
розповсюдження мікроорганізмів з недостатньою імуногенністю специфічних
антигенів. В зв”язку з цим, представлялось важливим дослідити схильність
пацієнтів до хронічного сечостатевого хламідіозу в залежності від
HLA-фенотипа за локусами А, В і DR.

Результати дослідження HLA-фенотипів 78 хворих в порівнянні з даними 350
здорових донорів свідчать, що за локусом А відносний ризик інфікування
був достовірно вище у носіїв А10 (RR 2,6), A26 (RR 2,7) і A33 (RR 11,9)
(табл. 1). Однак, етіологічну фракцію складав антиген А10 (( 0,61);
антиген А26, який фактично також входить до етіологічної фракції ((
0,1), являється “сплітом” А10. Таким чином, А10 можна вважати головним
провокатором хронізації хламідіозу за локусом HLA-А. Протективну функцію
в даній виборці хворих проявив антиген А24.

Таблиця 1

Розподіл HLA-антигенів (%) у хворих на ХССХ в порівнянні з здоровими
донорами

HLA-А Частота Аг у здоро-вих

n=350 Часто-та Аг у хворих

n=78 RR ( HLA-B Частота Аг у здоро-вих

n=350 Частота Аг у хво-рих

n =78 RR (

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 28 15,4* 0,46

5 16,0 12,3

2 49,4 29,5* 0,43

7 20,8 17,9

3 17,1 19,2

8 13,4 3,8* 0,25

9 20,0 15,4

12 20,8 10,25* 0,43

Продовження таблиці 1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

10 17,1 34,6* 2,6 0,65* 13 17,4 8,97

11 16,3 16,7

14 7,1 7,69

19 4,8 5,1

15 9,7 6,4

23 2,3 6,4

16 9,4 1,3* 0,12

24 6,3 1,3* 0,2

17 14,3 15,4

25 9,1 10,25

18 8,3 10,25

26 6,3 15,4* 2,7 0,1* 21 5,7 6,4

28 8,0 8,97

22 5,1 5,1

29 0,3 3,8

27 8,3 17,9* 2,42 0,1*

30 0,6 0

35 17,1 17,9

31 0 0

38 0,8 2,5

32 2,6 0

39 0,3 0

33 0,6 6,4* 11,9* 0,06 40 10,3 8,97

34 1,7 1,3

41 0,8 8,97* 11,4 0,08

36 0 0

44 0,3 0

45 0,3 6,4 23,9 0,06

47 0 1,3

49 0,3 1,3

50 0,3 2,5

51 1,4 20,5* 17,8 0,2*

52 0,6 0

53 0,3 0

56 0 2,5

62 0,3 0

Примітка: * — різниця статистично достовірна

Дослідження антигенів гістосумісності II класу показали суттєве
підвищення відносного ризику інфікування у носіїв антигенів В27, 41, 45,
51 (табл. 1). Однак, атрибутивний ризик обумовлений тільки В27 и В51,
оскільки етіологічна фракція зв’язана тільки з ними. Це не дивно, тому
що частота інших антигенів (HLA-В 41,45) у здорових складає меньше 1%.
HLA-В51 також у здорових зустрічається рідко (1,4%), однак, те, що він
входить до етіологічної фракції, підтверджує його провокаційну роль.

Особливе значення має факт достовірного підвищення у обстежених
пацієнтів частоти HLA-В27, що співпадає з даними Якубовича А.И. и соав.
(2000), які обстежували мешканців Іркутська з хронічною хламідійною
інфекцією, а також Lange U. et al. (1999). Антиген В27 відомий найбільш
високими асоціаціями зі схильністю до розвитку таких тяжких патологій як
хвороба Бехтерєва (анкілозуючий спонділоартрит; частота В27 достигает
90-95%), болезнь Рейтера (триада – іридоцикліт, ірит або увеїт, уретрит
і/або простатит, синовіїт; частота В27 досягає 60-80%) (Lechler R.,
1994). При цьому найбільш важливим мoментом являється схильність таких
хворих до інфікування хламідіями, які в більшості випадків реалізують
етіопатогенез цих захворювань.

Результати досліджень показали, що у хворих на сечостатевий хламідіоз
HLA-В8 являється антигеном-протектором (табл. 1), що співпадає з даними
Кошкина С.В. і Зайцева Г.А. (1998).

Аналіз розподілу HLA-DR продемонстрував, що у хворих на хронічний
сечостатевий хламідіоз частіше зустічаються DR5 (23,8%), DR 2 (21,4%) і
DR7 (21,4%) (табл. 1). Інші антигени цього сублокуса (DR 52, 1, 6, 4),
виявлялись значно рідше. Проміжне становище у HLA-DR3, частота якого
складає 11,9% (табл. 1).

З метою пошуку взаємозв’язку між здатністью до синтезу г-ІФ і
HLA-фенотипом хворі були розподілені на 2 групи: в 1-й концентрація
цитокіна була вище 12 пкг/мл, в 2-й — рівень (-ІФ був нижче 12 пг/мл.
Аналіз HLA-фенотипів свідчить, що в 1-й групі носіями антигенів ризику
хламідіоза являлись 38,46%, а в 2-й 50% (р>0,05). Оскільки ця різниця
недостовірна, а зниження синтезу цитокіна відмічалось абсолютно у всіх
обстежених, важко передбачати, що особливості HLA-фенотипа можуть
впливати на інтенсивність синтезу г-ІФ при хламідіозі. З метою аналізу
взаємозв’язку між активністю синтезу ІЛ-10 і фенотипом HLA хворі були
розподілені на 2 групи: в 1-й концентрація ІЛ-10 досягала 300 пг/мл і
більше, в 2-й – з більш низькою концентрацією. Індивідуальний аналіз
показав, що у 83,33% хворих 1 групи в HLA-фенотипі представлені
антигені ризику хламідіозу, у хворих з помірним або незначним
підвищенням рівня синтезу ІЛ-10 тільки у 12,5% виявлений “ризиковий”
антиген А10 (р<0,001). Можна зробити висновок, що активність синтезу ІЛ-10 суттєво вище у носіїв антигенів ризику хламідіоза А10, В27 и 51, і ці два фактори (HLA і рівень ІЛ-10) лежать в основі розвитку захворювання і його хронізації. В подальшому синтез цитокіна обумовлений, можливо, тривалістю захворювання, чутливістю до терапії, а також схемою лікування. Отримані дані дозволяють запропонувати свою концепцію імунопатогенезу ХССХ. Так, в умовах генетично детермінованої високої продукції ІЛ-10, який в літературі отримав назву “супресивний” цитокін, пригнічується функція моноцитів-макрофагів і Тх1. Перш за все, страждає продукція ІЛ-12, який є необхідним для переходу Тх0 в Тх1. Крім порушеного процесу созрівання, новоутворені Тх1 підлягають супресивному впливу ІЛ-10. Це пригнічує їх функцію по продукції ІЛ-2 і (-ІФ. Ці ключові цитокіни необхідні як для созрівання природних кілерів (ПК), так і для активації внутрішньоклітинного оксиду азоту (NO). В результаті порушуються, як мінімум, два відомих механізма імунного захисту: руйнування інфікованих хламідіями клітин за рахунок ПК і внутрішньоклітинне руйнування хламідій під впливом NO. Аналізуючи виявлені особливості імунопатогенезу ХССХ, зрозумілі труднощі, з якими стикаються клініцисти при лікуванні цієї патології. Автори багатьох публікацій роблять висновки, що лікування сечостатевого хламідіозу без корекції імунних порушень являється недостатньо ефективним, особливо при хронічній і рецидивуючій інфекції, тому намагаються доповнити терапію призначенням імуномодуляторів, інтерферонових препаратів, ензимотерапією [Горпинченко И.И., Гибнер С.М., 2000; Исаков В.А., Аспель Ю.В., 2004; Мавров Г.И., 2006]. Систематизуючи вже отриманий досвід, була розроблена, з урахуванням отриманих даних про особливості імунітету у хворих на ХССХ, схема комплексної терапії, яка складається з антибіотиків, імунотропних препаратів в визначених співвідношеннях та поступовості прийому. При розробці нової схеми враховувались отримані дані щодо досліджень препарата манакс. Дослідження in vitro з клітинами здорових донорів показали, що манакс чинить виражений вплив на імунокомпетентні клітини, викликаючи достовірне покращення функціонування моноцитарно-макрофагальної системи, що проявляється підвищенням % фагоцитуючих клітин і фагоцитарного числа, клітинного метаболізму по оцінці рівнів НСТ-тесту і NO. Продемонстрована динаміка цих показників, а також достовірне підвищення продукції ІЛ-1 і ФНП-б (рис. 1-2) при відсутності впливу на секрецію (-ІФ (рис. 3) під впливом в умовах in vitro доз манакса, відповідних терапевтичним (20 мкг/мл), вказує на те, що препарат володіє вираженою імунотропною дією, одним из важливих механізмів якого являється активація неспецифічних факторов захисту, підвищення фагоцитарної и протизапальної активності імунної системи. Рис. 1. ІЛ-1-продукуюча здатність імунокомпетентних клітин здорових осіб під дією різних доз манаксу in vitro. Рис. 2. ФНП-б-продукуюча здатність імунокомпетентних клітин здорових осіб під впливом різних доз манаксу in vitro. Рис. 3. г-ІФ-продукуюча здатність імунокомпетентних клітин здорових осіб під впливом різних доз манаксу in vitro. У здорових осіб в середній терапевтичній дозі манакс впливає на активність Тх2, підвищуючи продукцію ІЛ-4 від 22,6±2,1 до 96,2±3,3 пкг/мл (р<0,001) і не впливає на секрецію ІЛ-10. Враховуючи отримані результати, вважали доцільним включити данний препарат в терапевтичних дозах (3 таблетки на добу) в схему лікування хворих на ХССХ. Проведені дослідження in vitro по вивченню вітчизняного препарату мікотон дозволили встановити, що препарат безпосередньо впливає на імунокомпетентні клітини, підвищуючи кількість фагоцитуючих клітин, посилюючи проліферативну активність Т-клітин і продукцію ІЛ-1 від 158±6,42 до 188,24±6,5 пг/мл (р<0,005). Особливе місце в запропонованій схемі займає вітчизняний препарат “Лаферон”, враховуючи, що у обстежених хворих з ХССХ низька продукція (-ІФ не тільки неефективна в боротьбі з інфекцією, але й сприяє хронізації процесу, і тривала присутність збудника в організмі призводить до розвитку гіпореактивності, що перешкоджає використанню індукторів інтерферону. Запропонована схема терапії включає 3 послідовних етапа (підготовчий, етіопатогенетичний і імунореабілітаційний): 1 етап: після 2-х тижнів дієти і прийому полівітамінів рекомендується препарат мікотон – на протязі 10 днів по схемі: по 1 чайній ложці в 0,5 стакана води; утром - за 1 час до сніданку, на протязі дня - між прийомами їжі ( через 2,5 часа до або після обіду); увечері - через 2,5-3 часа після вечері. Далі тималін на протязі 5 днів - 1 флакон препарату розвести в 2 мл фізиологічного розчину, вводити в\м 1 раз на добу, щовечора, перед сном. 2 етап: По черзі: 1.Сумамед на протязі 5 діб за схемою: 1 день- 1 грам (2 табл.), 2-5 день- по 0,5 г (1 табл.) 1 раз на добу за 1 годину до їжи або 2 години після їжи. 2. Лаферон 5 днів - 1 флакон препарату (1 млн. МО) розвести в 1 мл фіз. розчину, вводити в\м 1 раз на добу, увечері, перед сном. 3. Доксициклін - 0,1, Офлоксацин (таривід) - 0,2: курс - 10 днів; обидва препарати - по 1 табл. 2 рази на день після їжи. В час прийому антибіотиків хворим призначали карсіл по 1 табл. 4 рази на день, ністатин по 1 табл. 4 рази на день. 4. Лаферон 5 днів – повторний курс. 3 етап: Манакс по 1 табл. 3 рази на день на протязі 20 днів. Приймати за півгодини до їжи. Вперше запропонований етап імунореабілітації являється дуже важливим, тому що відомо, що прийом антибіотиків (на 2-му етапі терапії) супроводжується додатковими негативними змінами імунітету на фоні вже виявлених особливостей. Під наглядом в процесі лікування знаходились 59 хворих на ХССХ, 39 хворих 1 групи (17 чоловіків і 22 жінки, з них 13 одружених пар) використовували запропоновану схему терапії з використанням імунотропних препаратів. В другу (2), контрольну, групу увійшло 20 хворих, які використовували стандартні методи антибіотикотерапії (сумамед, доксициклін, офлоксацин). Групи практично не відрізнялись за віком (в середньому - 25-35 років), статтю, клінічними проявами і тривалістю інфекції (р>0,05).
Клініко-лабораторні дослідження проводились на початку лікування і через
1,5 місяці після закінчення курсу лікування. Такі строки враховували той
факт, що середній строк елімінації “уламків” хламідій з клітин і тканин
складає 4-6 тижнів.

Аналіз клінічного стану через 1,5 місяці після проведеного лікування
показав, що клінічне одужання при задовільному загальному стані з
елімінацією збудника відмічене у 90±4,5% хворих, в той час в контрольній
групі – у 65±10,7 % (р<0,05). Серед жінок у 82% після лікування з використанням імунотропної терапії зникли набряк і гіперемія шийки матки, відмічалась відсутність виділень з цервікального каналу, а у 6 пацієнток з ерозією шийки матки спостерігалася повна епітелізація ерозії. Практично у всіх жінок в дослідженій групі зникли різі і зуд, дизурія, болі внизу живота. У 95% чоловіків досліженої групи після проведеного лікування зникли скарги на болі і виділення з уретри, часте сечовипускання. При об’ективному дослідженні урологами відмічено відсутність набряку, гіперемії, виділень з уретри; не виявлена наявність інфільтратів сечовипускного каналу. В контрольних сперматограмах 85% пацієнтів відмічено підвищення кількості сперматозоїдів, значне покращення їх рухливості і зникнення підвищеного вмісту лейкоцитів. Вивчення показників імунітету у хворих на ХССХ після лікування з використанням запропонованої схеми терапії продемонструвало наступні особливості в порівнянні з стандартною терапією: 1) знизился середній відносний рівень CD19+-клітин (В-лімфоцитів) від 40,2(2,1 до 31,8(3,4% (р<0,05); 2) спостерігалось зниження числа пацієнтів з високими рівнями ІК, IgG і IgM в порівнянні з контрольною групою, що свідчить про зниження високої функціонільної активності гуморальної ланки імунітету, яка була у хворих на ХССХ до лікування; 3) відмічені, при достовірному підвищенні числа осіб з нормальним рівнем, більш високі середні показники % фагоцитуючих клітин і фагоцитарного числа у пацієнтів досліджуємої групи. Виявлені позитивні зміни функціонільної активності імунокомпетентних клітин по продукції цитокінів (табл. 2). Таблиця 2 Динаміка функціональної активності клітин імунної системи у здорових (2) хворих до (3) и після проведеної комплексної терапії (4) Параметри продукції (пкг/мл) Норма До лікування Після лікування 1 2 3 4 ІЛ-1 спонтанна стимульована 116,9±7,00 211,8±15,2 206,0±24,8( 158,1±24,2( 138,0±9,0* 203,0±18,0* ІЛ-2 спонтанна стимульована 364,1±27,6 548,8±36,4 232,8±17,0( 266,6±14,7( 315,0±20,7* 275,1±16,2 ?-ІФ спонтанна стимульована 22,90(0,40 42,34(3,10 12,80(0,58( 29,90(2,70( 19,80( 1,53* 22,10( 3,22 ФНП-б спонтанна стимульована 17,32(1,00 26,63(2,41 22,31(2,25 26,10(1,74 25,10(1,58 22,10(1,86 ІЛ-10 спонтанна стимульована 151,43(15,71 1613±114,0 374,00(28,50( 295,71±24,12( 239,00(13,90* 214,70±22,11* Примітка: ( різниця достовірна між показниками у здорових і хворих до лікування; * різниця достовірна між показниками до и після лікування. Можна зробити висновки, що проведене комплексне лікування сприяло наступній динаміці показників: 1) достовірно знизилась висока активність клітин моноцитарно-макрофагальної системи за продукцією ІЛ-1; регуляторні і захисні функції при цьому не страждають в зв’язку з тим, що показники активності ІЛ-1 знизились до нормального рівня; 2) зросла функціональна активність Тх1 за даними спонтанної продукції ІЛ-2 і ?-ІФ; стимульована секреція медіаторів не змінювалась, мабуть, в зв’язку з недостатнім інтервалом часу для відновлення резервних можливостей клітин; 3) відмічено достовірне зниження високої активності Т-регуляторних клітин по продукції протизапального цитокіна ІЛ-10. Таким чином, використання запропонованої комплексної схеми лікування дозволило добитися більш вираженого ефекту, достовірно підвищуючи результати етіологічного і клінічного виліковування хворих на ХССХ. Можна вважати, що покращення клінічного стану хворих і успішна елімінація збудника пов’язані з виявленою позитивною динамікою імунного статусу – підвищенням рівня цитотоксичних клітин, активності прозапальних Тх1 і фагоцитарної активності, ліквідацією гіперактивності гуморальної ланки імунітету і Т-регуляторних клітин, в тому числі здебільшого завдяки використанню засобів імунотерапії. Необхідно підкреслити важливість етапу імунореабілітації при лікуванні хронічного хламідіозу, при цьому його тривалість повинна бути достатньою і оптимальною для усунення як збудників, так і негативних для імунної системи наслідків використання антибіотиків. ВИСНОВКИ В дисертації наведено теоретичне узагальнення та практичне вирішення актуальної наукової проблеми – визначення ролі імунної системи в розвитку хронічного сечостатевого хламідіозу; на підставі виявлених особливостей імунопатогенезу науково обгрунтовані підходи до імунокорекції та імунореабілітації хворих на ХССХ, що сприяло підвищенню ефективності лікування та нормалізації стану імунітету. 1. Порівняльні дослідження методів - бактеріоскопічного, прямої імунофлуоресценції, імуноферментного аналіза і полімеразної ланцюгової реакції показали, що найбільш інформативним матеріалом для досліджень є зашкряби з уретри у жінок і еякулят у чоловіків. Доказано, що підвищенню достовірності результатів при проведенні ПЛР сприяє 10-кратне підвищення розведення проб в процесі їх підготовки до виділення ДНК, а також використання геля з високою розрішаючою здатністю при розподіленні фрагментів ДНК. 2. Вперше проведене співставлення результатів досліджень по виявленню частоти збудників інфекцій, що передаються статевим шляхом у осіб, звернувшихся до медичних закладів м.Києва і м.Владивостока при використанні методу ПЛР з використанням тест-систем однієї фірми показало відсутність суттєвих регіональних особливостей, при цьому хламідійна інфекція за частотою (34%) займає друге місце після трихомонадної (60%). Змішана урогенітальна інфекція реєструється найбільш часто (80%), хламідії виявляються: з одним збудником – в 40,8%, з двома – в 16,5% і з трьома – в 3,7% випадків. Висока частота виявлення гарднерелл, мікоплазм, уреаплазм свідчить про розвиток дисбіозу піхви у жінок і слизової урогенітального тракту у чоловіків, що ускладнює перебіг хронічного процесу. 3. У хворих на хронічний сечостатевий хламідіоз відмічені наступні особливості імунограми: активація гуморальної ланки з достовірним підвищенням середнього відносного рівня В-лімфоцитів (40,0(2,1 в порівнянні з 27,0(2,7%, р<0,05) і імунних комплексів (0,13(0,03 в порівнянні з 0,07(0,01 од.опт.щ., р<0,05), високі рівні імуноглобулінів А, G і М у 54%; зниження у більшості пацієнтів (62%) кількості Т-лімфоцитів хелперів і імунорегуляторного індексу; підвищення фагоцитарної активності за показниками фагоцитарного числа. 4. Вперше вивчена функція клітин моноцитарно-макрофагального ряду по продукції ними ІЛ-1, ФНП-б, ІЛ-12 дозволила встановити: а) достовірне зниження продукції ІЛ-12 як ключового цитокину, що впливає як на аутокринну регуляцію активності Т-кітин і природних кілерів, так і на диференцировку Т-хелперів 0 в Т-хелпери 1 типу; б) підвищений рівень продукції ІЛ-1, особливо при моноінфекції, що свідчить про високу функціональну активність клітин моноцитарно-макрофагальної ланки як відповіді імунної системи на персистенцію збудника при хронічному хламідіозі; відсутність підвищення продукції ІЛ-1 при додатковій активації in vitro у хворих зі смішаною інфекцією вказує на порушення ІЛ-1-синтезуючої здатності імунокомпетентних клітин (“дефіцит резерву”); в) при відсутності достовірних відмінностей від здорових за даними середніх показників продукції ФНП-б - низьку спонтанну секрецію при монохламідіозі і високу (зі зниженням мітоген-індукованої) при мікст-інфекції. 5. Вивчення функціонального стану Т-хелперів 1 типу при ХССХ виявило: а) знижений рівень спонтанної секреції ІЛ-2; додаткова стимуляція не призводить до підвищення продукції цього лімфокіну, що свідчить про зниження як ІЛ-2 продукуючої здатності клітин, так і їх компенсаторних можливостей по секреції цього медіатора; б) зниження рівня спонтанної секреції (-ІФ у пацієнтів, однак, на відмінув від ІЛ-2, при додатковій активації мітогеном відбувається значне підвищення синтезу цього медіатору, що вказує на задовільні резервні можливості клітин за його продукцією. 6. Вперше виявлено підвищення функціональної активності Т-регуляторних клітин, що проявляється високою спонтанною продукцією ІЛ-10, яка не залежить від характера (моно або мікст) інфекції, резервні можливості цієї секреції нижче, ніж у здорових донорів. 7. Проведені вперше імуногенетичні дослідження виявили схильність до хронічної хламідійної інфекції сечостатевої системи, обумовлену наступними антигенами гістосумісності - HLA-А10, HLA-В27, -В51, HLA-DR5,-2,-7 (антигени-провокатори). Показано генетично детерміноване підвищення функціональної активності Т-регуляторних лімфоцитів по продукції ІЛ-10, що являється однією з важливих ланок імунопатогенезу. 8. Висока функціональна активність Т-регуляторних клітин по продукції протизапального медіатора ІЛ-10, обумовлена HLA-фенотипом, являється первинним фактором в імунопатогенезі і причиною зниження функції Т-хелперів 1 типа по продукції (-ІФ і ІЛ-2. Виявлені в фенотипі пацієнта антигени-провокатори можуть бути використані для прогнозування розвитку хронічної персистуючої хламідійної інфекції. 9. Запропонована концепція імунопатогенезу хронічного сечостатевого хламідіозу: в умовах генетично детермінованої високої активності Т-регуляторних лімфоцитів по продукції ІЛ-10 пригнічується функція моноцитів-макрофагів (ІЛ-12) і Т-хелперів 1 типу (ІЛ-2, гама-ІФ). Через низьку продукцію ІЛ-12 порушуються як процес созрівання Тх1, так і їх активність внаслідок супресорного впливу ІЛ-10. В результаті виникають умови для порушення, як мінімум, двох відомих інтерферон-залежних механізмів імунного захисту від хламідій, по-перше, пов’язаних з активністю природних кілерів по руйнуванню інфікованих хламідіями клітин і, по-друге, з порушенням внутрішньоклітинного руйнування хламідій під впливом оксиду азоту. 10. Дослідження in vitro показали, що а) препарат манакс надає вираженого впливу на імунокомпетентні клітини, викликаючи достовірне покращення функціонування моноцитарно-макрофагальної системи, що проявляється підвищенням % фагоцитуючих клітин і фагоцитарного числа, клітинного метаболізму за оцінкою рівнів НСТ-тесту і NO, продукції ІЛ-1 і ФНП-б; зниження високої продукції ІЛ-10 при відсутності впливу на секрецію (-ІФ; б) препарат мікотон впливає на фагоцити і Т-лімфоцити, підвищуючи, відповідно, кількість фагоцитуючих клітин і продукцію ІЛ-1, а також проліферативну відповідь клітин на ФГА. 11. Виявлені особливості імунопатогенезу ХССХ і отримані в умовах in vitro дані щодо можливостей впливу на ці механізми свідчать про доцільність включення в комплексну схему лікування хворих таких імунотропних препаратів як мікотон, тималін, лаферон і манакс. 12. Розроблений спосіб лікування, який складається з 3 поступових етапів (підготовчий, етіопатогенетичний і імунореабілітаційний), використання якого сприяло зменшенню високої функціональної активності гуморальної ланки імунітету по продукції імуноглобулінів з підвищенням рівня цитотоксичних СD8+-лімфоцитів, нормалізації вісокої активності клітин моноцитарно-макрофагальної системи за продукцією ІЛ-1 і Т-регуляторних клітин за продукцією ІЛ-10, підвищенню функціональної активності Т-хелперів 1 типу за продукцією прозапальних цитокінів ІЛ-2 і ?-ІФ. 13. Використання запропонованої 3-етапної схеми лікування хворих дозволило добитися виліковування, підтвержденого лабораторними методами, у 90% пацієнтів в порівнянні з 65% контрольної групи (р<0,05) і клінічного виліковування у 95% в порівнянні з 80% (р<0,05), що дозволяє рекомендувати її як найбільш ефективну для використання в клініці. ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ Для підвищення ефективності лікування хворих на ХССХ рекомендується 3-х етапна схема з використанням імунотерапії: 1 етап – підготовчий: дієта, полівітаміни і мікотон на протязі 10 днів по схемі: по 1 чайній ложці в 0,5 стакані води тричі на день; тималін 5 днів в\м 1 раз на день. 2 етап - етіопатогенетичний: 1.Сумамед 5 днів по схемі: 1 день- 1 грам (2 табл.), 2-5 день- по 0,5 г (1 табл.) 1 раз на день. 2. Після сумамеду лаферон 5 днів в\м 1 раз на день. 3. Після цього - доксіциклін-0,1, офлоксацин-0,2: курс - 10 днів; обидва препарати - по 1 табл. 2 рази на день; 4. Знову лаферон - той самий курс 5 днів. На протязі часу прийому антибіотиків - карсил по 1 табл. 4 рази на день, ністатин по 1 табл. 4 рази на день, полівітаміни. 3 етап - імунореабілітаційний: манакс по 1 табл. 3 рази на день - 20 днів. Вперше запропонований етап імунореабілітації рекомендується в зв”язку як з отриманими даними про стан імунітету у хворих на ХССХ до лікування, так і тому що прийом антибіотиків (на 2-му етапі терапії) супроводжується додатковими негативними змінами імунітету на тлі вже тих, що були. СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Использование полимеразной цепной реакции в диагностике урогенитального хламидиоза. Пособие для врачей / Ващенко В.В., Дранник Г.Н., Горпинченко И.И., Ващенко С.Н. и соавт. – Владивосток: Рея, 2002. – 80 с. (Автором проведені клінічні обстеження хворих жінок, дана оцінка інформативності методів, що використовуються для діагностики хламідіозу, проведений аналіз власного досвіду використання ПЛР). Ващенко С.Н., Дриянская В.Е., Фесенкова В.И., Дриянская В.В., Дранник Г.Н. Продукция ИЛ-12 и гамма-интерферона у больных хроническими воспалительными заболеваниями мочеполовой системы хламидийной этиологии // Проблеми екології та медицини. – 2002. – Т.6, № 6. – С. 10-12. (Проведений відбір хворих для обстеження, аналіз продукції цитокінів). Руденко А.В., Ващенко В.В., Ващенко С.М., Іванець Т.О., Поліщук В.Є. Сучасна діагностика збудників інфекцій, що передаються статевим шляхом // Лаб. діагностика. – 2002. - № 3. – С. 36-42. (Проведений аналіз сучасних підходів до етіологічної діагностики сечостатевих інфекцій, написана частина статті). Драннік Г.М., Дріянська В.В., Ващенко С.М., Папакіна В.С. Результати лікування хворих на урогенітальний хламідіоз з використанням імунотропної терапії // Імунологія та алергологія. – 2002. - № 3. – С.29-31. (Визначено контингент хворих та проведений огляд в динаміці, рекомендована терапія, проаналізовані клініко-лабораторні результати, написана стаття). Ващенко С.Н. Сравнительная характеристика методов полимеразной цепной реакции и прямой иммунофлюоресценции в диагностике хламидийной и уреаплазменной инфекции // Імунологія та алергологія. – 2002. - № 4. – С. 12-15. Дріянська В.Є., Драннік Г.М., Горпінченко І.І., Фесенкова В.Й., Ващенко С.М. Продукція інтерлейкіну-1 і оксиду азоту у хворих на хронічний сечостатевий хламідіоз та вплив ербісолу на ці показники в умовах in vitro // Імунологія та алергологія. – 2003. - № 1. – С. 5-7. (Протестовано та проаналізовано активність ІЛ-1 та NO в супернатантах хворих на ХССХ). Ващенко С.Н., Дранник Г.Н., Дриянская В.Е., Руденко А.В. Анализ клинико-иммунологических эффектов и обоснование целесообразности применения комплексной терапии у больных хроническим мочеполовым хламидиозом // Імунологія та алергологія. – 2003. - № 2. – С. 48-52. (Здобувачем визначені групи хворих, що підлягали лікуванню, запропонована 3-етапна схема імунотерапії та проведений аналіз її використання). Фесенкова В.Й., Драннік Г.М., Дріянська В.Є., Папакіна В.С., Ващенко С.М. Дослідження in vitro впливу препаратів “ербісол” та “супер ербісол” на продукцію ІЛ-2 та гамма-інтерферону Т-хелперами 1 типу здорових донорів // Лаб. діагностика. – 2003. - № 2. – С. 37-40. (Досліджена активність ІЛ-2 та гама-ІФ в супернатантах, зроблені висновки щодо цих показників). А.Ф.Возианов, Г.Н.Дранник, Т.С.Монтаг, В.Е.Дриянская, С.Н.Ващенко, В.В.Дриянская. HLA-фенотип и состояние иммунной системы у больных с хроническим мочеполовым хламидиозом. // Дерматологія та венерологія. – 2003. – № 1 (19). – С. 3-7. (Проведений аналіз стану імунної системи у хворих на ХССХ, кореляція з наявністю HLA-антигенів в фенотипі). Драннік Г.Н., Монтаг Т.С., Ващенко С.М., Дріянська В.Є. Аналіз активності синтезу цитокінів (ІЛ-1,-2, ФНП-б) та особливостей HLA-фенотипу у хворих на хронічний сечостатевий хламідіоз. - Імунологія та алергологія. – 2003. - № 3. - С. 56-59. (Досліджено рівень ІЛ-1 і- 2 в супернатантах, проведений аналіз їх активності і особливостей фенотипу). Возіанов О.Ф., Драннік Г.М., Дріянська В.Є., Руденко А.В., Ващенко С.М., Фесенкова В.Й., Папакіна В.С. Аналіз показників імунітету за даними імунограми та цитокінового статусу у хворих на хронічний сечостатевий хламідіоз в залежності від характеру (моно- чи мікст-) інфекції. - Імунологія та алергологія. – 2003. - № 4. – С. 39-42. (Досліджено активність деяких цитокінів, розподіл хворих на групи в залежності від етіологічних чинників захворювання, проведена кореляція між показниками). С.Н.Ващенко. Частота выявления возбудителей у лиц, обратившихся в специализированный медицинский центр по поводу воспалительных урогенитальных заболеваний. – Дерматологія та венерологія. – 2003. - № 3 (21). – С. 56-60. Драннік Г.М., Ващенко С.М., Дріянська В.Є., Фесенкова В.Й., Папакіна В.С. Функціональна активність імунокомпетентних клітин за продукцією ІЛ-1 та ФНП-( хворих на хронічні запальні сечостатеві захворювання хламідійної етіології // Таврический медико-биологический вестник. – 2003. – Т. 6, № 2. – С. 42-45. (Відбір хворих для обстеження, дослідження активності монокінів). Ващенко С.Н. Анализ информативности данных микроскопического исследования in situ у пациентов с воспалительными заболеваниями мочеполовой системы // Таврический медико-биологический вестник. – 2003. – Т. 6, № 3. – С. 27-31. Ващенко С.М., Драннік Г.М., Дріянська В.Є. Результаты дослідження імунної системи у хворих на хронічні запальні захворювання сечостатевої системи хламідійної етіології // Проблеми екології та медицини. – 2003. – Т. 7, № 3-4. - С. 21-25. (Дисертант провела аналіз літератури та отриманих даних, спільно зі співробітниками лабораторії імунології Інституту урології АМН України визначала показники стандартної імунограми). Возианов А.Ф., Ващенко С.Н., Руденко А.В., Дранник Г.Н., Дриянская В.Е. Сопоставительный анализ частоты выявления возбудителей инфекций, передаваемых половым путем, у жителей Киева (Украина) и Владивостока (Россия) // Український журнал дерматології, венерології, косметології. – 2003. - № 4. – С. 71-76. (Здобувач проводила огляд хворих, формування груп, що підлягають обстеженню, аналіз особливостей сечостатевої інфекції в залежності від чинників в різних регіонах). Дріянська В.Є., Драннік Г.М., Ващенко С.М., Фесенкова В.Й., Папакіна В.С. Спонтанна та мітогеніндукована продукція прозапальних цитокінів - інтерлейкіну-1 та фактору некрозу пухлин-( у хворих на хронічні запальні сечостатеві захворювання хламідійної етіології // Лікарська справа / Врачебное дело. – 2004. - № 2. – С. 35-39. (Відбір хворих для обстеження, дослідження активності ІЛ-1, ФНП в супернатантах хворих та здорових). Драннік Г.М., Дріянська В.Є., Ващенко С.М., Папакіна В.С., Фесенкова В.Й., Дріянська В.В. Вплив манаксу на продукцію цитокінів (г-ІФ, ІЛ-4, ІЛ-10) in vitro лімфоцитами здорових донорів і хворих на хронічний сечостатевий хламідіоз // Імунологія та алергологія. – 2004. - № 1. – С. 15-17. (Дослідження активності лімфокінів в супернатантах хворих на ХССХ). Драннік Г.М., Дріянська В.Є., Ващенко С.М., Степанова Н.М., Фесенкова В.Й., Дріянська В.В. Дисбаланс продукції гама-інтерферону та інтерлейкіну-10 як один з факторів патогенезу хронічного сечостатевого хламідіозу // Імунологія та алергологія. – 2004. - № 2. – С. 66-67. (Здобувачем проведений аналіз активності супернатантів, висловлена думка, що дисбаланс Тх1/Тх3 є однією з ланок імунопатогенезу ХССХ). Ващенко С.М., Драннік Г.М., Дріянська В.В., Папакіна В.С. Функціональна активність Т-хелперів 1 типу за продукцією цитокінів (ІЛ-2 та г-ІФ) у хворих на хронічний сечостатевий хламідіоз // Дерматологія та венерологія – 2004. - № 1 (23). – С. 26-30 (Проведені дослідження активності лімфокінів в супернатантах, аналіз стану Т-хелперів 1 у хворих, написана стаття). Дранник Г.Н., Гибнер С.М., Ващенко С.Н., Дриянская В.Е., Папакина В.С. Особенности продукции цитокинов как важный фактор иммунопатогенеза хронического мочеполового хламидиоза и обоснования целесообразности использования иммунотерапии // Здоровье мужчины. – 2004. - № 3 (10). – С. 238-241. (Проведені дослідження активності інтерлейкінів і гама-ІФ, аналіз їх особливостей, зроблені висновки щодо їх дисбалансу як фактору імунопатогенезу і запропоновані шляхи використання засобів для імунокорекції). Drannik G.N., Driyanskaya V.E., Rudenko A.V., Vaschenko S.N., Drannik A.G., Driyanskaya V.V., Stepanova N.M. Some cytokines production as a function of immunocompetent cells by with urogenital chlamydiosis patients // Український журнал нефрології та діалізу. – 2004. - № 2. – С. 32-34. (Проведений аналіз стану цитокінової ланки у хворих на ХССХ і написана стаття). Савченко В.С., Ващенко С.М., Фесенкова В.Й., Драннік Г.Г., Дріянська В.В. Вплив Манаксу на продукцію оксиду азоту та ФНП-б імунокомпетентними клітинами здорових донорів та хворих на хронічний сечостатевий хламідіоз // Імунологія та алергологія. – 2004. - № 4. – С. 12-14. (Відбір хворих, дослідження активності NO і ФНП у хворих на ХССХ, написання статті). Ващенко С.М. Особливості функціональної активності Т-хелперів 1 і 3 типу (імунорегуляторних клітин) по продукції лімфокінів у хворих на хронічні інфекції сечостатевої системи хламідійної етіології // Імунологія та алергологія. – 2006. - № 1. – С. 65-67. Драннік Г.М., Федорук Г.В., Ващенко С.М. Спосіб лікування хронічного урогенітального хламідіозу // Патент 34873 А Україна МКІ G 01N 33/53 № 99074048; Опубл. 15.03.2001; Бюл.№2. Драннік Г.М., Федорук Г.В., Дріянська В.Є., Ващенко С.М., Сухін Р.Є. Метод лікування хронічного урогенітального хламідіозу лафероном - інформаційний лист № 97 від 2001 р. Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза (методические рекомендации) / А.Ф.Возианов, С.Н.Ващенко, Г.Н.Дранник, и соавт. – К.: 2002. – 18 с. V.V.Driyanskaya, G.N.Drannik, S.N.Vaschenko, V.I.Fesenkova, V.S.Papakina, N.M.Stepanova. Expression of activation marcers (CD95+, CD54+) and production of cytokines in patients with chronic urogenital Chlamydiosis // Int. Journal of Immunorehabilitation. – 2002. – V. 6, N 2. – 108, P. 262. АНОТАЦІЯ Ващенко С.М. “Імунопатогенез, діагностика і нові методи імунокорекції у хворих з хронічними запальними сечостатевими захворюваннями хламідійної етіології” – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук по спеціальності 14.03.08 – імунологія та алергологія. - Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця, Київ, 2006. У хворих на хронічний сечостатевий хламідіоз (ХССХ) виявлено активацію гуморальної ланки зі зниженням показників клітинного імунітету. Дослідження цитокінової ланки імунітету дозволили запропонувати концепцію імунопатогенезу ХССХ: в умовах генетично детермінованої високої продукції протизапального цитокіну ІЛ-10 пригнічується функція моноцитів-макрофагів і Т-хелперів 1 типа. Внаслідок цього знижена продукція ІЛ-12, необхідного для переходу Т-хелперів нульових в Т-хелпери 1 типа. Крім порушеного процесу созрівання, новоутворені Тх1 підлягають супресивному впливу ІЛ-10, наслідком чого є продемонстроване зниження продукції ІЛ-2 і (-ІФ, необхідних для активації таких факторів протихламідійного імунітету як NO і ПК для руйнування, відповідно, хламідій та інфікованих ними клітин. Проведені in vitro дослідження впливу препаратів манакс і мікотон свідчать про доцільність їх використання у хворих на ХССХ. Патогенетично обгрунтоване та впроваджене в клініку 3-етапне лікування хворих з використанням, крім антибіотиків, імунотропних препаратів (тималін, мікотон, лаферон, манакс) було більш ефективним, за даними клініко-лабораторних показників, в порівнянні з традиційною терапією, що дозволяє рекомендувати запропонований підхід для використання в клініці. Ключові слова: цитокіни, Т-хелпери, імунотропні препарати, сечостатевий хламідіоз. АННОТАЦИЯ Ващенко С.М. “Иммунопатогенез, диагностика и новые методы иммунокоррекции у больных с хроническими воспалительными мочеполовыми заболеваниями хламидийной этиологии” – Рукопись. Диссертация на соискание научной степени доктора медицинских наук по специальности 14.03.08 – иммунология и аллергология. - Национальный медицинский университет им.А.А.Богомольца, Киев, 2006. Работа посвящена решению актуальной проблемы – установлению особенностей состояния иммунитета у больных хроническим мочеполовым хламидиозом и повышению эффективности лечения пациентов путем использования иммунотропных препаратов. Было обследовано 1890 пациентов (876 мужчин и 1014 женщин). Исследованы 2746 образцов различного патологического материала, собранных путем соскобов со слизистой уретры, цервикального канала, влагалища, а также секрет предстательной железы, эякулят и моча. В г.Киеве был проанализирован 951 образец материала, а в г.Владивостоке – 1795 образцов. Выявлено 225 пациентов, у которых в образцах при исследовании с помощью ПЦР обнаружена C. trachomatis, из них 136 мужчин и 119 женщин. 80% пациентов было со смешанной инфекцией, когда наряду с хламидями в исследуемом материале определялись гарднереллы и/или уреаплазма, микоплазма и др. У этих больных с подтвержденным диагнозом “хронический мочеполовой хламидиоз” проведено исследование особенностей иммунитета. У больных хроническим урогенитальным хламидиозом отмечены особенности стандартной иммунограммы: активация гуморального звена с повышением уровня В-лимфоцитов, ИК, Ig А, G и М; снижение у большинства пациентов количества Т-лимфоцитов хелперов и иммунорегуляторного индекса; повышение фагоцитарной активности. Впервые изученная функция клеток моноцитарно-макрофагального ряда по продукции ими ИЛ-1, ФНО-б, ИЛ-12 позволила установить снижение спонтанной и стимулированной продукции ИЛ-12 и стимулированной – ИЛ-1 и ФНО-б. Исследования функциональной активности Т-хелперов 1 типа продемонстрировали сниженный уровень спонтанной секреции ИЛ-2; дополнительная стимуляция не приводит к повышению продукции этого лимфокина, что свидетельствует о снижении как ИЛ-2 продуцирующей способности клеток, так и их компенсаторных возможностей по секреции этого медиатора. На фоне снижения уровня спонтанной секреции (-ИФ у пациентов при дополнительной активации, в отличие от ИЛ-2, происходит повышение его синтеза, что указывает на удовлетворительные резервные возможности клеток по продукции. Изучение показателей стандартного иммунитета с факторами межклеточной кооперации – продукцией цитокинов и г-интерферона, позволило сформулировать концепцию иммунопатогенеза хронического мочеполового хламидиоза. Так, в условиях детерминированной наличием в фенотипе антигенов HLA-А10, HLA-В27, -В51, HLA-DR5,-2,-7 высокой продукции противовоспалительного ИЛ-10 подавляется функция моноцитов-макрофагов и Т-хелперов первого типа. Выявлено, что прежде всего страдает продукция ИЛ-12, который необходим для перехода Т-хелперов нулевых в Т-хелперы 1, которые затем продолжают испытывать супрессивное влияние ИЛ-10. Это подтверждает показанное в работе снижение продукции ИЛ-2 и (-ИФ как ключевых цитокинов, необходимых для механизма иммунной защиты против хламидий - созревания ЕК–клеток и активации внутриклеточного оксида азота. Отмеченные особенности состояния иммунитета показали целесообразность и необходимость использования иммунотропных препаратов, способных внести коррекцию в нарушенную работу иммунной системы у больных ХМПХ. При изучении влияния препарата манакс на клетки доноров в дозе, соответствующей терапевтической, in vitro показано достоверное улучшение функционирования моноцитарно-макрофагальной системы, выражающееся в повышении фагоцитарного индекса и числа, клеточного метаболизма по оценке уровней НСТ-теста и NO, продукции ИЛ-1 и ФНО; микотон в этих условиях повышал количество фагоцитирующих клеток и продукцию ИЛ-1, а также пролиферативный ответ клеток на ФГА. Проведенные in vitro исследования влияния препаратов манакс и микотон на функциональную активность клеток иммунной системы свидетельствуют о целесообразности их использования у больных хроническим хламидиозом. Разработана и внедрена в клинику 3-этапная схема лечения больных с ХМПХ, включающая, кроме антибиотиков, такие иммунотропные препараты как тималин, микотон, лаферон, манакс. В динамике лечения под наблюдением находилось 59 больных с ХМПХ, при этом 39 больных 1 группы (17 мужчин и 22 женщины, из них 13 супружеских пар) применяли предложенную схему терапии с использованием иммунотропных препаратов. Во вторую (2), контрольную, группу вошло 20 больных, которые использовали стандартные методы терапии. Комплексное лечение с использованием иммунотропных препаратов было более эффективным при анализе клинико-лабораторных показателей по сравнению с традиционной терапией и способствовало уменьшению высокой функциональной активности гуморального звена иммунитета по продукции иммуноглобулинов с повышением уровня СD8+-клеток (цитотоксических Т-лимфоцитов), что сопровождалось нормализацией продукции ИЛ-1, повышением функции Тх1 по продукции ИЛ-2 и (-ИФ и снижением уровня противовоспалительного цитокина ИЛ-10. Полученные данные о более выраженном клиническом излечении, подтвержденном лабораторными методами, позволяет рекомендовать предложенный подход к терапии хронического хламидиоза, основанный на коррекции выявленных нарушений иммунитета, как наиболее эффективный для использования в клинике. Ключевые слова: цитокины, Т-хелперы, иммунотропные препараты, мочеполовой хламидиоз. SUMMARY Vaschenko S.N. Immunopathogenesis, diagnosis and methods of immunocorrection in patients with chronic inflammatory urogenital of chlamydial etiology. – Manuscript. The dissertation for scientific degree of doctor of medical sciences on speciality 14.03.08 – immunology and allergology. – National Medical University named after O.O.Bogomolets, Ministry of Public Health of Ukraine, Kyiv, 2006. Patients with chronic urogenital chlamydiosis (CUGCh) demonstrated the activation of humoral link with the decrease in quotients of cellular immunity. The studies of the immunity cytokine link allowed to suggest a conception of CUGCh immunopathogenesis: under conditions of genetically determined high production of anti-inflammatory cytokine IL-10, the function of monocyte-macrophages and T-helpers, type 1 is inhibited. In consequence of this, the production of IL-12, necessary for T-helpers 0 to transform in t-helpers1, was lowered. Besides the disturbed process of maturation, the new-formed Th1 undergo the suppressive effect of IL-10, the results of which is the demonstrated decrease in IL-2 and г-IFN production, necessary for activation of such factors of anti-chlamydial immunity like NO and NK to destruct, respectively, chlamydia and cells infected by them. The in vitro studies on the effect of medicaments manaxx and mycoton testify to their expedient usage by CUGCh patients. The pathogenetically grounded and implemented into practice. Key words: cytokines, T-helpers, immunomodulators, chronic urogenital chlamydiosis. ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ Т-л В-л ІЛ ІПСШ ІФ ІФА НСТ ПІФ ПЛР ТФР-в Тх1 (2,3) ФГА ФНП ХССХ CD HLA Ig NO - - - - - - - - - - - - - - - - - - Т-лімфоцити В- лімфоцити інтерлейкін інфекції, що передаються статевим шляхом інтерферон імуноферментний аналіз нітросиній тетразолій пряма імунофлуоресценція полімеразна ланцюгова реакція трансформуючий фактор росту-бета Т-хелпери 1 (2,3) типу фітогемаглютинін фактор некрозу пухлин хронічний сечостатевий хламідіоз кластер диференціювання антигени гістосумісності імуноглобулін оксид азоту

Похожие записи