ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ

МЕДИЦИНИ УААН

ГУНЧАК ВАСИЛЬ МИХАЙЛОВИЧ

УДК 619:615.9:636.5

Хронічний нітратно-нітритний токсикоз курей та його профілактика

16.00.04 – ветеринарна фармакологія та токсикологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора ветеринарних наук

Харків – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Львівській національній академії ветеринарної медицини
імені С.З.Ґжицького (ЛНАВМ) Міністерства аграрної політики України.

Науковий консультант: доктор ветеринарних наук, професор

Гуфрій Дмитро Федорович,

Львівська національна академія ветеринарної медицини імені
С.З.Ґжицького, завідувач кафедри фармакології та токсикології.

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН
Хмельницький Григорій Олександрович,

Національний аграрний університет, завідувач кафедри фармакології та
токсикології;

доктор ветеринарних наук, професор, член-кор. УААН Влізло Василь
Васильович,

Інститут біології тварин УААН, директор;

доктор ветеринарних наук, професор

Чорний Микола Васильович,

Харківська державна зооветеринарна академія, завідувач кафедри
зоогігієни.

Провідна установа: Державний науково-дослідний контрольний інститут
ветеринарних препаратів і кормових добавок, відділ фармакології і
імунології, Міністерства аграрної політики України, м. Львів

Захист дисертації відбудеться «22» лютого 2005 року о 930 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 в Інституті
експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою:
61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту
експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою:
61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий “19” січня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор ветеринарних наук, професор Бабкін А.Ф. ЗАГАЛЬНА
ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Одним із головних завдань ветеринарної токсикології
було і залишається вивчення біологічної дії антропогенних забруднювачів
навколишнього середовища, що є факторами ризику виникнення захворювань
різної патології. Мета таких досліджень полягає у прогнозуванні
вірогідності тих чи інших патологічних станів та в розробленні
адекватних заходів щодо їх запобігання.

Поміж речовин, що забруднюють довкілля, за обсягом застосування азотні
добрива посідають провідне місце. В Україні після деякого спаду
виробництво і застосування азотних добрив постійно збільшується (за
даними Мінекономіки України у 1995 р. – 1,5 млн. т, 2000 р. – 1,8 млн.
т, 2002 р. – 2,5 млн. т, 2003 р. – 2,8 млн. т), через що зберігається
тенденція ускладнення екологічної обстановки та зростає актуальність
досліджень, пов’язаних із цією проблемою. Надмірне накопичення
азотовмісних речовин у навколишньому середовищі призводить до підвищення
вмісту нітратів у ґрунтах, водах та кормових рослинах і, як наслідок,
збільшується надходження їх в організм тварин (Вовк Д.М. та ін., 1990;
Войтабов В.І., 1991; Запорожець М.Ф., 1992; Менькін В.К., 1993;
Шакапуров М.М., 1993; Murphy S.A. et al., 1995; Hrubec T.C. et al.,
1997; Yeruham I. et al., 1997; Духніцький В.Б., 1999; Мазуркевич А.Й. та
ін., 2001; Хмельницький Г.О., 2002; Гуфрій Д.Ф. та ін., 2002; Панько
М.Ф., 2003). Згодовування кормів із високим рівнем нітратів тваринам і
птиці призводить до виникнення отруєнь, зниження продуктивності,
погіршення санітарної якості продукції, розладів здатності тварин до
відтворення, народження нежиттєздатного приплоду та загибелі поголів’я.
У птиці, крім того, погіршується несучість та виводимість курчат
(Скородинський З.П., 1974; Хмельницький Г.О., 1990; Малінін О.О., 1990,
1992; Гуфрій Д.Ф., 1997; Влізло В.В., 2003)

Забруднення навколишнього середовища нітратами та їхній небажаний вплив
на організм тварин роблять проблему вивчення механізму їх токсичної дії,
як при роздільному, так і при комбінованому застосуванні, особливо
актуальною, що має теоретичне та практичне значення. Вивченню питань,
пов’язаних з отруєнням тварин нітратами, присвячена значна кількість
наукових робіт вітчизняних і зарубіжних дослідників. Серед них у нашій
країні найбільш фундаментальні дослідження проведені І.М.Гладенком,
С.В.Баженовим, З.П.Скородинським, Г.О.Хмельницьким, А.Й.Мазуркевичем,
О.О.Малініним, Д.Ф.Гуфрієм, О.І.Канюкою та ін. Ці вчені є засновниками
наукових напрямків із вивчення нітратно-нітритної проблеми. Ними зібрано
та узагальнено значний експериментальний і практичний матеріал та
сформулювали основні теоретичні передумови про токсичний вплив нітратів
і нітритів на організм сільськогосподарських тварин. На основі
фактичного матеріалу розроблені “Методичні рекомендації з профілактики,
діагностики та лікування тварин при отруєнні нітратами і нітритами”
(2001).

Однак, механізм токсичної дії нітратів і нітритів на організм
сільськогосподарської птиці досі вивчено недостатньо. Наявна лише
невелика кількість наукових праць, присвячених цій темі. Зауважимо, що
вони не дають цілісного уявлення про проблему, не встановлено параметри
хронічної токсичності, мало вивчені біохімічні механізми
нітратно-нітритних токсикозів (далі читати Н Н токсикоз), особливо на
клітинному рівні, а також токсикокінетика та токсикодинаміка нітратів і
нітритів в організмі птиці. Недостатньо з’ясовано вплив нітратів на
імунну систему у курчат та їх мутагенну і канцерогенну дію, що в останні
роки викликає занепокоєння гігієністів різних країн світу (Чорний М.В.,
2003).

Досі недостатньо вивчена токсична дія нітратів при хронічному токсикозі.
Як зазначає Г.О.Хмельницький (1990), гострі отруєння нітратами, хоча і з
запізненням, діагностуються порівняно легко, а хронічні токсикози,
особливо у жуйних тварин, часто проходять під іншими діагнозами. Реальну
небезпеку становлять хронічні Н Н токсикози птиці. У кормах для курей
часто буває високий рівень нітратів. У надмірних кількостях вони
знижують санітарну та біологічну якість продукції, погіршують
інкубаційні властивості яєць, а у великих дозах спричиняють масові
отруєння і загибель.

Отже, враховуючи викладене вище, необхідно відзначити, що проведення
досліджень саме в такому плані є актуальним. Згідно з повідомленнями в
іноземній літературі, ці питання мало вивчені, а в Україні так широко
розробляються вперше і мають важливе теоретичне значення для науки та
практичне значення для ветеринарної медицини в плані збереження
поголів’я птиці та отримання від них продукції високої біологічної
цінності та санітарної якості.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Представлена
наукова праця – це окремий розділ комплексної теми кафедри фармакології
та токсикології Львівської національної академії ветеринарної медицини
імені С.З.Ґжицького “Дослідження механізмів патогенезу розладів
гідролітично-транспортної функції травної системи у худоби за дії
техногенних факторів і розробки ефективних способів зменшення їх
негативної дії на продукти і здоров’я тварин та вивчення токсичної дії
нітратів на організм тварин і птиці” (номер державної реєстрації
0102U001339).

Мета і задачі досліджень. Метою наших досліджень було вивчити
особливості перебігу хронічного нітратно-нітритного токсикозу у курей,
з’ясувати вплив підвищених кількостей нітратів у кормі на метаболічні
процеси, морфологічні і біохімічні показники крові, імунну систему та
обґрунтувати застосування антиоксидантів для зниження токсичної дії
нітратів на організм птиці.

Для досягнення поставленої мети були визначені такі задачі:

вивчити у модельних дослідах на щурах та в експериментах на курчатах
механізм розвитку хронічного нітратно-нітритного токсикозу;

дослідити морфологічні і біохімічні зміни у крові та встановити
гістологічні зміни у внутрішніх органах і електронно-мікроскопічні зміни
у тканинах печінки;

встановити мутагенну дію нітратів і нітритів;

вивчити білоксинтезуючу, дезінтоксикаційну та антиоксидну функції
печінки;

провести дослідження стану імунної системи та вивчити вплив нітратів на
напруженість поствакцинального імунітету;

обґрунтувати можливість використання антиоксидантів як
гепатопротекторних засобів;

вивчити ефективність дезінтоксикаційних засобів при наявності у кормах
нітратів у субтоксичних дозах;

науково обґрунтувати доцільність використання аскорбінової кислоти,
фенарону, метіоніну та “Метіфену” для корекції морфологічних і
біохімічних показників крові та стану імунної системи при хронічному
нітратно-нітритному токсикозі.

Об’єкт дослідження: хронічний нітратно-нітритний токсикоз, гемопоез,
імуногенез, мутагенна дія, іонний гомеостаз, антиоксидна система,
окиснювальний стрес, профілактична дія антиоксидантів.

Предмет дослідження: вплив нітратів у різних дозах на біохімічні і
морфологічні показники крові, дезінтоксикаційну, білоксинтезуючу і
антиоксидну функції печінки, гістоморфоструктуру печінки і нирок та
електронно-мікроскопічні зміни у клітинах печінки, показники специфічної
і неспецифічної резистентності організму, напруженість імунітету,
мутагенну дію та ефективність профілактичної дії аскорбінової кислоти,
метіоніну, фенарону і “Метіфену”.

Методи досліджень: фармакологічні, токсикологічні, біохімічні і
серологічні дослідження крові, генетичні, гістологічні,
електронно-мікроскопічні та математичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні науково
обґрунтовано, розкрито і узагальнено нові аспекти патогенезу
нітратно-нітритного токсикозу у курей. Сформульовано теоретичні основи
токсикодинаміки нітратів в організмі курчат при хронічному токсикозі та
встановлено гепатопротекторну дію антиоксидантів (аскорбінової кислоти,
фенарону і метіоніну). Отримано нові дані стосовно дії нітратів у
субтоксичних дозах на морфологічні показники крові, рівень електролітів
і активність ферментів у сироватці крові. Вивчено вплив нітратів на
білоксинтезуючу, дезінтоксикаційну і антиоксидну функції печінки. За
динамікою біохімічних показників крові і активністю ферментів у
сироватці крові та оцінкою гістоструктури печінки, нирок і кишечника та
електронно-мікроскопічної структури тканин печінки встановлено, що у
патогенезі нітратно-нітритного токсикозу, поряд із
метгемоглобіноутворенням, вирішальну роль на рівні клітини відіграють
процеси вільнорадикального окиснення фосфоліпідів біологічних мембран
клітин із подальшим розвитком окиснювального стресу. Висунуто і
обґрунтовано положення про участь імунних механізмів у підтриманні
хімічного гомеостазу в організмі курчат при нітратно-нітритному
токсикозі. Досліджено вплив нітратів на імунну систему – встановлено
пригнічення клітинного і гуморального імунітетів та ослаблення
поствакцинальної імунної відповіді при наявності в кормі нітратів понад
максимально допустимий рівень. У дослідах на щурах за показниками
метафазного аналізу клітин кісткового мозку та за кількістю еритроцитів
з мікроядрами встановлено мутагенну дію нітратів. Представлено
принципово нову схему розвитку хронічного нітратно-нітритного
токсикозу. Запропоновано ефективні методи корекції гомеостазу та
встановлено гепатопротекторну дію антиоксидантів – аскорбінової кислоти,
фенарону, метіоніну та “Метіфену” при хронічному Н Н токсикозі.
Викладені в дисертації наукові положення розкривають нові аспекти
патогенезу нітратно-нітритних отруєнь і визначають передумови
теоретичного обґрунтування та практичного застосування антиоксидантів
для їх профілактики.

Наукова новизна отриманих результатів підтверджена рішенням про видачу
деклараційного патенту на винахід “Спосіб профілактики токсичної дії
нітратів корму і корекції обміну речовин у курей-бройлерів” (№2004604928
від 18 листопада 2004 р.).

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати дали
можливість поглибити уявлення про патогенетичні механізми токсичної дії
нітратів та розробити ефективні методи корекції порушень, які виникають
при хронічній нітратно-нітритній патології у курей. Комплексна оцінка
інтенсивності наслідків ендогенної інтоксикації дає змогу всебічно
оцінити ступінь ураження організму та вибрати адекватні способи
профілактики токсикозу.

На основі проведених досліджень із вивчення хронічної дії нітратів на
організм курей визначені теоретичні аспекти та розроблені практичні
методи застосування аскорбінової кислоти, фенарону, метіоніну і
“Метіфену” для профілактики розвитку токсикозу при наявності у кормі
нітратів у кількостях, що перевищують максимально допустимий рівень
(МДР). Встановлені зміни активності амінотрансфераз у сироватці крові
курей використовуються як тест ранньої діагностики скритого Н Н
токсикозу.

Окремі положення дисертаційної роботи ввійшли до “Методичних
рекомендацій з профілактики, діагностики та лікування тварин при
отруєнні нітратами і нітритами”, затверджених Державним департаментом
ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України (2000 р.).
Отримані результати досліджень були основою для розробки Технічних умов
України (ТУ-У 24.4.-31003546-001-2004) на препарат “Метіфен”,
затверджених Державним департаментом ветеринарної медицини України та
Настанови щодо його застосування (2004). Результати експериментальних
досліджень з вивчення Н Н токсикозів використовуються у навчальних
закладах І-ІV рівнів акредитації при вивченні курсу “Ветеринарна
токсикологія”.

Спеціалісти ветеринарної медицини західних областей України для
запобігання нітратно-нітритних токсикозів у курей застосовують
аскорбінову кислоту, фенарон і метіонін за розробленим нами методом та
препарат “Метіфен”. При наявності в кормах для птиці нітратів у
кількостях понад МДР, для профілактики Н Н токсикозу до корму додають
антиоксиданти з розрахунку на 1 т: аскорбінової кислоти – 50 г,
метіоніну – 80 г, фенарону – 200 г або “Метіфену” 280 г. Антиоксиданти
можна включати до складу мінерально-вітамінних преміксів. Вони захищають
жири корму та жиророзчинні вітаміни від окиснення та підвищують
несучість курей.

Особистий внесок здобувача. Автор особисто обґрунтував наукову концепцію
розвитку хронічного Н Н токсикозу, яка покладена в основу дисертаційної
роботи, сформулював мету і основні етапи досліджень, здійснив пошук та
аналіз літератури, організував досліди і провів експериментальні
дослідження. Аналіз та інтерпретацію одержаних результатів, викладення
висновків та пропозицій автор здійснив з методичною допомогою наукового
консультанта.

Гістологічні та електронномікроскопічні дослідження внутрішніх органів
курчат проведені нами спільно із співробітниками лабораторії
гістоморфології Ольштинської аграрної академії (Республіка Польща).

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи
доповідалися і отримали загальне схвалення на щорічних наукових звітах і
конференціях викладацького складу і аспірантів Львівської національної
академії ветеринарної медицини імені С.З.Ґжицького у 1995-2004 рр.;
Міжнародній науковій конференції, присвяченій 50-річчю заснування
зооінженерного факультету ЛДАВМ (Львів, 1999); І-ому національному
з’їзді фармакологів України “Сучасні проблеми фармакології”, Київ, 1995;
І та ІІ-ій науково-практичній конференції “Неінфекційна патологія тварин
(Біла Церква, 1995, 1998); І та ІІ-ій Всеукраїнських науково-методичних
конференціях ветеринарних фармакологів і токсикологів (Київ, 1998,
2003); І, ІІ та ІІІ-ому міжнародних симпозіумах “Україна-Австрія”
(Львів, 1996; Відень, 2000; Чернівці, 2002); Міжнародній науковій
конференції до 100-річчя ЛДАВМ імені С.З. Ґжицького (Львів, 2000);
науково-практичній конференції “Проблеми зооінженерії і ветеринарної
медицини”, присвяченій 150-річчю заснування Харківського
зооветеринарного інституту (Харків, 2001); науково-практичній
конференції, присвяченій 100-річчю від дня народження проф. Солярова
Я.П., „Механізми фізіологічних функцій в експерименті і клініці” (Львів,
2001); науково-практичній конференції “До 75-річчя зооінженерного
факультету Полтавської державної аграрної академії” (Полтава, 2002);
VІІ-ій міжнародній науково-практичній конференції “Проблеми
ветеринарного обслуговування дрібних домашніх тварин” (Київ, 2002);
VІІІ-ому українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002); ІІІ-ій
Міжнародній науково-практичній конференції “Молоді вчені – майбутнє
вітчизняної ветеринарної медицини” (Суми, 2004); V-ій українській
конференції з птахівництва з міжнародною участю (Алушта, 2004).

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи опубліковані у 30
наукових працях, з яких 21 публікація у фахових виданнях (13
одноосібних), що входять до переліку, затвердженого ВАК України;
методичні рекомендації, навчальний посібник, технічні умови та настанова
на препарат “Метіфен”.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 299
сторінках комп’ютерного тексту, містить 51 таблицю і 50 рисунків (які
займають 25 сторінок) та складається з таких розділів: “Вступ”, “Огляд
літератури”, “Матеріал та методи досліджень”, “Результати власних
досліджень”, “Аналіз і узагальнення результатів досліджень”, “Висновки”,
“Практичні рекомендації”, „Додатки”. Список використаних літературних
джерел, містить 613 найменувань, у тому числі 292 іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Експериментальна частина роботи виконана
у 1995-2003 роках на кафедрі фармакології та токсикології ЛНАВМ і у
клініці академії за схемою, представленою на рис. 1.

Модельні досліди проведені на 186 нелінійних білих щурах, а
експериментальні дослідження на 400 курчатах відповідно до методичних
рекомендацій “Токсикологічний контроль нових засобів захисту тварин”
(1997).

методом М.А.Петрунь (1970); загальні ліпіди у реакції з фосфованіловим
реактивом (А.А.Пентюк, 1987), фосфоліпіди – фотоколориметрично (Пентюк
А.А., 1987), триацилгліцероли і гідроперекиси ліпідів – за методикою
А.В.Мірошниченко (1984), швидкість перекисного окиснення ліпідів – за
А.П.Владіміровим і В.С.Арчаковим (1984); БАСК і ЛАСК —
фотоколориметрично (Чумаченко В.Е., 1991); ФАЛ – тестом із суспензією
стафілококів (Чумаченко В.Е., 1991); титр комплементу в сироватці крові
за гемолізом еритроцитів (Лефковіте І., 1981); активність лізоциму у
сироватці крові за В.Е.Чумаченко (1991); кількість Т-лімфоцитів методом
спонтанного розеткоутворення (Єськов А.П., 2002); мутагенну дію нітратів
і нітритів визначали за метафазним аналізом клітин кісткового мозку та
кількістю еритроцитів з мікроядрами (Schmid W., 1973); гістологічні та
електронно-мікроскопічні дослідження проводили за загальноприйнятими
методиками.

Цифрові величини результатів досліджень виражали у міжнародних одиницях
системи СІ. Результати досліджень піддавали статистичному аналізу
біометрично з використанням комп’ютерної техніки.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

ДОСЛІДИ НА ЛАБОРАТОРНИХ ТВАРИНАХ

Вивчення токсичності нітратів і нітритів за умов хронічного досліду.
Модельні досліди на щурах проведені з метою вивчення токсичної дії
нітрату натрію (100 мгNO3?/кг м.т. (далі читати 100 мг/кг м.т.) – 2
група) і нітриту натрію (1 мгNO2?/кг м.т. (далі читати 1 мг/кг м.т.) – 3
група) окремо та при сукупній дії обох препаратів (4 група). Упродовж 30
діб щурам з кормом давали нітрати у вказаних дозах. На 31-у добу їх
піддавали евтанзії, відібрали кров для дослідження морфологічних та
біохімічних показників (рис. 2).

Рис. 2. Вміст нітратів, нітритів і метгемоглобіну у крові щурів при
хронічному нітратно-нітритному токсикозі

Встановлено, що після тривалого згодовування щурам корму, до якого
додавали нітрат натрію (100 мг/кг м.т.) на 30- у добу рівень нітратів у
сироватці крові підвищився на 34 %. За цих умов рівень нітритів
збільшився удвічі, а метгемоглобіну на 16%. Загальна кількість
еритроцитів та вміст гемоглобіну крові зменшилися, відповідно, на 7 і
10%. Еритроцити мали меншу величину та знижений вміст гемоглобіну, що,
поряд із зменшенням величини кольорового показника, вказує на
пригнічення кровотворної функції кісткового мозку.

При наявності в кормі курчат нітриту натрію в дозі 1 мг/кг м.т. на 30-у
добу досліду рівень нітратів був на 60%, нітритів у 7 разів, а
метгемоглобіну крові у 22 рази вищим за показники контролю. У дослідних
щурів при зниженні вмісту гемоглобіну на 11% зменшилась кількість
еритроцитів на 24%. Останні мали менший об’єм та знижений вміст
гемоглобіну, внаслідок чого зменшувалася величина кольорового показника,
що свідчить про розвиток макроцитарної гіпохромної анемії.

Констатуємо, що при додаванні щурам до корму нітрату натрію (100 мг/кг
м.т.) сукупно з нітритом натрію (1 мг/кг м.т.) у крові встановлено
високий рівень нітратів, нітритів та метгемоглобіну. Підтвердженням
пригнічення кровотворної функції кісткового мозку була макроцитарна
гіпохромна анемія і лейкопенія. При сукупній дії нітратів і нітритів їх
токсичність проявляється різними метаболічними шляхами та призводить до
виразніших розладів метаболічних процесів ніж кожного препарату зокрема.
Нітрити біологічно менш активні, але значно токсичніші порівняно з
нітратами. Проте при сукупній дії настає сумація токсичної дії обох
препаратів. Першопричиною цих процесів є активне метгемоглобінутворення,
яке спричиняє тканинну гіпоксію, наслідком якої є окиснювальний стрес,
що призводить до пригнічення кровотворної функції кісткового мозку та
сповільнення окисно-відновних процесів. У наших дослідах встановлено, що
при високому рівні нітратів у крові щурів настає лейкопенія, зменшується
кількість лімфоцитів, еозинофілів та зростає кількість гранулоцитів, що
вказує на наявність в організмі щурів запальних процесів.

Вплив нітратів на дезінтоксикаційну функцію печінки. Вплив нітратів і
нітритів на дезінтоксикаційну функцію печінки визначали за рівнем
загального білка та його фракцій, концентрацією ліпідів, холестеролу,
триацилгліцеролів, сечовини, активністю ферментів у сироватці крові та
за гексеналовою пробою (рис. 3,4,5).

При наявності в кормі нітрату натрію у дозі 100 мг/кг м.т. у сироватці
крові щурів на 15% підвищився рівень загальних ліпідів, на 24%
тригліцеролів та на 16% сечовини. У щурів вірогідно вищою була
активність АсАТ, АлАТ і ЛФ, відповідно на 16%, 15% і 11% порівняно з
контролем. У межах нормальних величин був рівень загального і вільного
холестеролу та білків. Отже, нітрати у вказаній дозі не зменшували
дезінтоксикаційну функцію печінки. Встановлена підвищена активність
амінотрансфераз і фосфатаз та рівня ліпідів і триацилгліцеролів на тлі
нормального рівня загального білка у сироватці крові вказує на
посилення метаболічних процесів у відповідь на дію нітратів.

При задаванні щурам нітриту натрію (1 мг/кг м.т.) у сироватці крові
встановлено підвищену, у порівнянні з контролем, активність АлАТ, АсАТ і
ЛФ — відповідно, на 42%, 58% і 23% та зростання рівня ліпідів на 39% і
загального білка на 8%. Натомість, рівень вільного і загального
холестеролу, триацилгліцеролів і сечовини був, відповідно, на 6%, 24%,
24% і 23% (Р < 0,025) нижчим, ніж у тварин контрольної групи. Рис. 3. Вміст загальних ліпідів і триацилгліцеролів у крові щурів при хронічному нітратно-нітритному токсикозі Отже, нітрити спричиняють токсичне ураження печінки, що супроводжується вивільненням із гепатоцитів внутрішньоклітинних ферментів та пригніченням метаболічних процесів, на що вказує зниження рівня триацилгліцеролів, холестеролу і сечовини. Рис. 4. Вміст холестеролу у крові щурів при хронічному нітратно-нітритному токсикозі При сукупній дії нітратів і нітритів знижується дезінтоксикаційна функція печінки, що виникає внаслідок сумації токсичних ефектів обох препаратів і призводить до ураження печінки, деструкції мембран клітин гепатоцитів та активації перекисного окиснення фосфоліпідів. Рис. 5. Вміст загального білка і сечовини у крові щурів при хронічному нітратно-нітритному токсикозі Пригнічення функціонального стану печінки при нітратно-нітритному токсикозі підтверджено методом гексеналової проби. Для цього у щурів викликали експериментальний фармакологічний сон внутрішньочеревним введенням гексеналу (60 мг/кг м.т.) на тлі Н Н токсикозу ( 0,5 і 0,2 г/кг м.т., що відповідає 1/2 і 1/5 ЛД50). Встановлено, що через 1, 3, 5 і 24 год. після додавання до корму нітратів (1/2 ЛД50) час біотрансформації гексеналу в печінці (тривалість сну) був на 46, 52, 65 і 27 хв. тривалішим, ніж у щурів контрольної групи. Нітрати у перші 5 год. різко пригнічували дезінтоксикаційну функцію печінки, яка не відновлювалась упродовж 24 год. У дозі 1/5 ЛД50 нітрати незначно і лише на короткий час продовжували тривалість експериментального гексеналового сну. Отже, пригнічення дезінтоксикаційної функції печінки є результатом впливу нітратів на мікросомальні ферменти гепатоцитів, що беруть участь у біотрансформації токсичних сполук. Вивчення мутагенної дії нітратів і нітритів. Віддалені ефекти побічної дії нітратів визначали після введення нітратів і нітритів щурам у субтоксичних дозах за метафазним аналізом клітин кісткового мозку та кількістю еритроцитів з мікроядрами у периферичній крові. Критерієм цитогенетичної дії нітратів був спонтанний рівень хромосомних і хроматичних аберацій у ядрі клітин (рис. 6). Встановлено, що при хронічному Н Н токсикозі нітрати у дозі 0,8 г/кг м.т. упродовж 30 діб не викликали мутагенної дії. У субтоксичній дозі (1,6 г/кг м.т.) нітрати не спричиняють змін у клітинах кісткового мозку, проте кількість еритроцитів з мікроядрами на 10 і 20-у добу досліду збільшилась на 44 і 76%, а на 30-у добу їх число було вдвічі більшим, ніж в контролі. При гострому Н Н токсикозі після одноразового введення щурам нітриту натрію (1/2 ЛД50) у клітинах кісткового мозку встановлено порушення мітозу, на що вказує збільшення на 5-7% кількості хромосомних і хроматидних аберацій. Зростання числа еритроцитів з мікроядрами на 24, 48 і 72 годину, відповідно на 54%, 67%, 43%, свідчить про вплив нітритів на генетичний апарат клітин. У дозі (1/5 ЛД50) нітрити не викликали мутагенних змін в еритроцитах. За оцінкою мутагенного аналізу клітин кісткового мозку та кількістю еритроцитів з мікроядрами встановлено, що за генотоксичністю нітрати належать до препаратів слабкої мутагенної дії. Небезпеку становлять нітрити. Вони уражають генний апарат клітин і можуть бути індукторами канцерогенезу. Підтвердженням цього є роботи А.Д.Дурнєва і С.В.Середенін (1981), Г.А.Хмельницького і Б.Л.Рубенчик (1986), які відзначають канцерогенну дію нітрозамінів – проміжних продуктів відновлення нітратів у нітрити та високу кореляцію мутагенності із канцерогенезом і тератогенезом. Рис. 6. Хромосомні і хроматидні аберації у кістковому мозку щурів при нітратно-нітритному токсикозі Мутагенна дія нітратів становить небезпеку в тому плані, що в шлунково-кишковому каналі тварин під впливом ферментів декарбоксилюванння кишкової мікрофлори утворюються ендогенні нітрозосполуки, які з амідами утворюють канцерогенні нітрозаміни. Вони порушують процеси мітозу і спричиняють розлади “розшивання” ДНК на стадії реплікації за типом делецій і змінюється молекулярна структура хромосом. Порівнюючи результати наших досліджень із повідомленнями в літературі, відзначаємо, що характер мутацій, які спричиняють нітрити, такий як і при дії інших генотоксичних чинників, і вони не відрізняються від спонтанних природних мутацій, встановлених у дослідах інших авторів. Вважаємо, що механізм мутагенної дії нітратів необхідно інтерпретувати з позиції мутагенезу подібних до них окислів азоту. Враховуючи, що мутагенну дію проявляють агресивні форми кисню і продукти окиснення ліпідів, всі сполуки, що сприяють їх утворенню, можна вважати потенційно мутагенними (Дурнєв А.Д., 1981). Вплив нітратів на імунну систему щурів. Стан імунної системи у лабораторних тварин оцінювали за величинами біохімічних показників крові, що відображають клітинний і гуморальний імунітети, зокрема, за бактерицидною та лізоцимною активністю сироватки крові, лізоцимною активністю лейкоцитів та фагоцитарною активністю. Нами встановлено, що при наявності в кормах білих щурів нітрату натрію в дозі 0,8 г/кг м.т. у сироватці крові на 30-у добу вірогідно знизилась, порівняно з контрольною групою тварин, лізоцимна активність до 36,1±0,6 % (P<0,05) та бактерицидна активність до 70,8±3,0 % (Р<0,05). Значно нижчим був показник лізоцимної активності лейкоцитів – 7,9±0,5 % (Р<0,001). Натомість збільшилась величина фагоцитарного числа та фагоцитарного індексу нейтрофілів, відповідно, до 50,0±0,7 та 2,7±0,08 (Р<0,001). У межах нормальних величин знаходилась комплементарна активність сироватки крові. При тривалому навантаженні організму щурів нітратом натрію в субтоксичній дозі (1,6 г/кг м.т.) на 30-у добу у сироватці крові встановлено зниження активності комплементу на 26 %, лізоцимної активності на 27 % та бактерицидної активності – на 22 %. Активність лізоциму у лейкоцитах підвищилась на 15 %. Фагоцитарне число нейтрофілів було на 23 %, а їхній фагоцитарний індекс на 40 % більшим, ніж у тварин контрольної групи. Отже, нітрати у дозі, вдвічі більшій за допустиму добову, при надходженні в організм щурів упродовж 30-и діб знижують захисні властивості організму. В якості компенсаторної реакції організму у відповідь на зниження окремих показників, що характеризують імунний статус (бактерицидна, лізоцимна активність сироватки крові), підвищується лізоцимна активність лейкоцитів, збільшується фагоцитарне число нейтрофілів та їхній фагоцитарний індекс. Вірогідно зростає кількість фагоцитарних макрофагів. Зниження комплементарної активності сироватки крові свідчить про деградацію гепатоцитів, оскільки основні компоненти системи комплементу синтезуються в печінці. ДОСЛІДИ НА КУРЧАТАХ Результати, отримані у модельних дослідах на щурах, стали підставою для проведення подальших експериментальних досліджень на курчатах. Метою досліджень було вивчити вплив нітратів при хронічному Н Н токсикозі на морфологічні і біохімічні показники крові, функціональний стан печінки, імунну систему та напруженість поствакцинального імунітету, дослідити можливість застосування антиоксидантів для профілактики згаданого вище токсикозу. Курчатам упродовж 30 діб із кормом задавали нітрати відповідно із схемою досліджень (0,4 гNO3?/кг м.т. (далі читати 0,4 г/кг м.т.). – максимально допустимий добовий рівень нітратів у кормах для курей; 0,8 і 1,6 гNO3?/кг (далі читати 0,8 і 1,6 г/кг м.т.) – кількість нітратів що, відповідно, в 2 і 4 рази більша за МДР). На тлі хронічного нітратно-нітритного токсикозу (1,6 г/кг м.т.) вивчали профілактичну дію аскорбінової кислоти (50 мг/кг), метіоніну (80 мг/кг), фенарону (200 мг/кг) та “Метіфену” – 280 мг/кг корму. Кров для досліджень відбирали на 1, 10, 20 і 30 доби. Вплив нітратів на морфологічні і біохімічні показники крові курчат. При додаванні до корму курчат нітрату натрію в дозі 0,4 г/кг м.т. у сироватці крові упродовж досліду встановлено незначне підвищення рівня нітратів (9-10%), нітритів (6-8%) та метгемоглобіну крові – на 7-12%. На тлі нормального рівня білка, вміст альбумінів у сироватці крові був на 10-17% нижчим. Крім того, встановлено вірогідне збільшення кількості еритроцитів (14-25%) та підвищення рівня гемоглобіну крові (на 9-10%). Отримані результати свідчать про посилення метаболічних процесів та подразнення кровотворної системи. При наявності в кормах нітратів у кількості, що вдвічі перевищує МДР, у крові на 10 добу на 34% підвищилась концентрація нітратів та на 31% – нітритів, рівень метгемоглобіну збільшився на 29%. Встановлено вірогідне зниження на 11% рівня загального білка і на 16% – альбумінів. Кількість еритроцитів зменшилася на 9%, а рівень гемоглобіну – на 13%. На 20 і 30-у доби досліду рівень нітратів підвищився, відповідно, на 70% і 74%, а нітритів на 52% і 43%. Високою була концентрація метгемоглобіну та вміст сечовини, відповідно, на 20% і 16%. За показниками середньої величини одного еритроцита та вмісту в ньому гемоглобіну і за величиною кольорового показника встановлено наявність мікроцитарної гіпохромної анемії. Активність каталази на 10, 20 і 30-у доби підвищилася, відповідно, на 26%, 19% і 14%, на 7-19% була вищою активність лактатдегідрогенази, на 6-8% ? лужної фосфатази, на 7% ? АлАТ і 28% – АсАТ. Отримані результати свідчать про високу активність метаболічних процесів за участю вказаних ферментів. Рівень сечовини у крові курчат за дослідний період підвищився на 8,5-9,3%, що підтверджує посилення метаболічних процесів, оскільки сечовина є кінцевим продуктом обміну білків. Встановлені зміни морфологічного і біохімічного складу крові та активності ферментів необхідно розцінювати як наслідок захисної реакції та включення адаптативно-компенсаторних процесів в системі гомеостазу у відповідь на токсичну дію нітратів. Вони протікають з участю електролітів, тому на 30-у добу рівень кальцію, фосфору і хлору у сироватці крові був нижчим порівняно з контролем. У травному каналі курчат під впливом нітратредуктази наявні в кормі нітрати відновлюються до нітритів і активно всмоктуються. Рівень нітрат- і нітрит-іонів перебуває у прямій залежності від кількості їх у кишечнику. Встановлено, що найбільш інтенсивно нітрати всмоктуються у перші 10 діб, їх рівень досягає максимуму на 20-у добу і дещо знижується на 30-у добу (рис. 7). При наявності в кормі курчат нітратів у субтоксичній дозі (1,6 г/кг м.т.) на 10, 20 і 30-у доби досліду рівень нітратів був вищим, відповідно, на 79%, 76%, 70%, а нітритів удвічі. Рівень метгемоглобіну в крові упродовж досліду на 37-59% перевищував показники контрольної групи курчат. У сироватці крові за дослідний період рівень білка знизився на 8%, а вміст альбумінів на 26%. Максимальний рівень метгемоглобіну в крові сягав 28%, проте клінічного проявлення Н Н токсикозу не встановлено. Однак, це спричиняло розвиток тканинної гіпоксії та зниження дезінтоксикаційної функції печінки. Кількість еритроцитів та рівень гемоглобіну упродовж досліду поступово знижувались на 13-19%. Середня величина одного еритроцита була більшою, а вміст і концентрація гемоглобіну в еритроциті меншими, порівняно з контролем, що вказує на наявність у крові молодих формених елементів крові. Встановлено розлади іонного гомеостазу з вивільненням у кров іонів натрію, високою утилізацією іонів кальцію і фосфору та виведенням з організму іонів калію і хлору. Рис. 7. Концентрація нітратів, нітритів і метгемоглобіну в крові курчат залежно від дози нітрату натрію Поступове зниження рівня сечовини у сироватці крові (на 11-17%) свідчить про зниження активності метаболічних процесів в організмі курчат та пригнічення функціональної здатності печінки синтезувати білки. На 10, 20 і 30-у доби на 32-42% підвищилась активність каталази, на 34-74% ? креатинфосфокінази і на 12-13% ? лужної фосфатази, що вказує на високу активність процесів фосфорилювання. Активність АлАТ упродовж досліду була на 23-38% вищою, ніж у контролі. Активність АсАТ на 20-у добу підвищилася на 10%, а на 30-у добу на 19%, що вказує на деструкцію гепатоцитів і вивільнення з них внутрішньоклітинних ферментів – цитоплазматичної АлАТ та мітохондріальної АсАТ. При метгемоглобінутворенні звільняється значна кількість вільнорадикальних форм кисню, які спричиняють деструкцію цитоплазматичних мембран, і в першу чергу, їхнього фосфоліпідного шару. Деструкцію клітинних мембран гепатоцитів нами підтверджено при електронно-мікроскопічних дослідженнях печінки, а зменшення кількості рибосом на ендоплазматичному ретикулумі свідчить про пригнічення білоксинтезуючої функції печінки. Нітрати у субтоксичній дозі при тривалому надходженні в організм курчат, пригнічують еритропоетичну функцію кісткового мозку, знижують білоксинтезуючу функцію печінки, сповільнюють перебіг процесів фосфорилювання і переамінування та спричиняють деструкцію клітинних мембран гепатоцитів і вивільнення з них внутрішньоклітинних ферментів. Зміни морфологічного і біохімічного складу крові при наявності в кормі нітратів вказують на скритий токсикоз. Його можна діагнозувати за зниженням рівня загального білка і альбумінів та підвищенням активності АлАТ і АсАТ у сироватці крові курей. Отже, у наших дослідах встановлено, що чим більша кількість нітратів у кормі, тим вищий їх рівень у крові курчат. Проте пропорційної залежності між цими показниками не встановлено. Так, за наявності у кормі нітратів (0,4 г/кг м.т.) їх рівень у крові на 10, 20 і 30-у доби досліду, порівняно з контрольною групою курчат, підвищився, відповідно, на 4,4%, 9,8% і 1,5%. При зростанні в кормі кількості нітратів удвічі, їх рівень у крові за вказані періоди збільшився, відповідно, на 33,8%, 69,7% і 74,6%. При збільшенні кількості нітратів у кормі в 4 рази, їх концентрація у крові зростала, відповідно, на 79,4%, 78,8%, 70,1%. У дослідах також встановлено, що рівень нітратів у крові різко збільшувався на 10-у добу досліду, досягав максимального рівня на 20-у добу, відтак стабілізувався і на 30-у добу навіть знизився. Відповідно до зміни рівня нітратів аналогічно змінювалася динаміка рівня нітритів як у кормі, так і у сироватці крові дослідних курчат. А від концентрації нітрит-іонів напряму залежить рівень метгемоглобіну, що і визначає ступінь розладу гомеостазу. За наявності в кормі курчат нітратів у кількості 0,4 г/кг м.т. (МДР), максимальний рівень метгемоглобіну складав 12,3%. За наявності нітратів, що удвічі перевищує МДР – 21,7%. При субтоксичній дозі (1,6 г/кг м.т.) максимальний рівень метгемоглобіну складав 28%. Проте, клінічного прояву токсикозу у курчат не встановлено. Отримані нами результати досліджень свідчать, що кури менш чутливі до метгемоглобінемії, у них в меншій мірі проявляються розлади гомеостазу, зумовлені тканинною гіпоксією. Профілактична дія антиоксидантів при нітратно-нітритному токсикозі. У наших дослідженнях встановлено, що у субтоксичній дозі нітрати не виявляють прямої гепатотоксичної дії. Проте, опосередковано, через переокиснення фосфоліпідів біологічних мембран агресивними формами кисню, що звільняються при метгемоглобіноутворенні, нітрати пригнічують білоксинтезуючу та знижують дезінтоксикаційну функції печінки. З метою профілактики скритого нітратно-нітритного токсикозу у курчат ми вивчили можливість застосування антиоксидантів. Упродовж 30-и діб курчатам, які отримували з кормом нітрат натрію в дозі 1,6 г/кг м.т., додатково задавали аскорбінову кислоту (0,05 г/кг), метіонін (0,08 г/кг) та фенарон 0,2 г/кг корму. Кров досліджували на 10, 20 і 30-у доби досліду (рис. 8). Рис. 8. Вплив антиоксидантів на рівень нітратів, нітритів і метгемоглобіну в крові курчат У крові курчат, яким додавали нітрати і аскорбінову кислоту, на 10, 20 і 30-у доби досліду рівень нітратів підвищився, відповідно, на 19%, 39%, 28% а нітритів – на 17%, 23% та 18%. Концентрація метгемоглобіну упродовж досліду була на 12-15% вищою. Проте ці величини у 10-20 разів менші порівняно з курчатами, яким при нітратному навантаженні до корму не додавали аскорбінову кислоту. У дослідних курчат у сироватці крові не встановлено вірогідного зниження вмісту загального білка, а рівень альбумінів був на 6-7% меншим при зростанні на 6-13% рівня глобулінів. Концентрація сечовини була такою, як у інтактних курчат, що вказує на високий функціональний стан печінки. На 10-у добу встановлено незначне (7%) зменшення кількості еритроцитів та зниження на 5% рівня гемоглобіну крові. На 20 і 30-у добу величини досліджуваних показників були такими, як у курчат контрольної групи. При застосуванні аскорбінової кислоти активність креатинфосфокінази та лактатдегідрогенази упродовж досліду була в межах нормальних величин. Активність каталази на 10-39% а лужної фосфатази на 10-20% була вищою, що вказує на високу активізацію окиснювальних процесів. Аналогічні зміни морфологічних і біохімічних показників крові встановлені у курчат, яким разом із нітратами задавали метіонін і фенарон. У курчат цих двох груп рівень метгемоглобіну в крові був на 38-43% вищим, порівняно з курчатами, яким із профілактичною метою задавали аскорбінову кислоту. Внаслідок посиленого метгемоглобіноутворення у сироватці крові встановлено підвищення рівня сечовини: у дослідах з метіоніном на 5%, з фенароном – на 7% та зменшення рівня альбумінів, відповідно, на 6 і 8%. Встановлено, що антиоксиданти підтримують іонну рівновагу в крові та підвищують активність ферментів (каталази і лужної фосфатази), які беруть участь у дезінтоксикації ендогенних токсикантів та нормалізують електролітний склад крові. За участі антиоксидантів знижуються всмоктування нітратів і нітритів із травного каналу та зменшуються процеси метгемоглобінутворення. Встановлено, що аскорбінова кислота, порівняно з метіоніном і фенароном, при нітратно-нітритному токсикозі проявляє кращу профілактичну дію. При вивченні впливу антиоксидантів на інтактних курчатах встановлено, що додавання до корму аскорбінової кислоти, метіоніну та фенарону сприяє збільшенню кількості еритроцитів на 6-12% та на 5-7% підвищується рівень гемоглобіну крові, що є результатом посилення гемопоезу; на 10-13% підвищується рівень сечовини, на 6-9% зростає вміст загального білка та на 7-12% ? концентрація альбумінів, що вказує на посилення білоксинтезуючої функції печінки. Антиоксидна функція печінки при нітратно-нітритному токсикозі та профілактичний вплив антиоксидантів. У курчат, до корму яким задавали нітрат натрію в дозі 1,6 г/кг м.т., встановлено зниження антиоксидної функції печінки. Зокрема, на 10-у добу досліду у сироватці крові на 81% підвищувався рівень гідроперекисів ліпідів, на 26% ? швидкість перекисного окиснення ліпідів, на 21% ? активність глутатіонпероксидази та удвічі зросла активність каталази. На 20-у добу досліду встановлено подальше зниження антиоксидного стану печінки. Високою була активність каталази і глутатіонпероксидази, посилено утворювалися гідроперекиси ліпідів та збільшувалася швидкість перекисного окиснення ліпідів. На 30-у добу, порівняно з 20-ю, величини показників крові, які відображають стан антиоксидної функції печінки, дещо стабілізувалися, проте залишались на високому рівні. Проведені дослідження вказують на напруженість антиоксидної функції печінки та проявлення адаптативно-компенсаторних механізмів, що нейтралізують токсичну дію нітратів. Результати досліджень свідчать, що при скритому Н Н токсикозі природна система антиоксидного захисту печінки не забезпечує повної нормалізації патологічного процесу і, при подальшій дії нітратів, внаслідок надмірного напруження захисних механізмів може бути “зрив адаптації”. Нами підтверджено, що за наявності в кормі курчат високого рівня нітратів аскорбінова кислота запобігає розвитку згаданого вище отруєння. У сироватці крові курчат швидкість перекисного окиснення ліпідів була в межах фізіологічної норми, хоч у перші 10 діб концентрація гідроперекисів ліпідів була на 19% більшою та вірогідно підвищилась активність каталази (30%) і глютатіонпероксидази (9%). Це є результатом участі мікросомальних ферментів печінки у процесах окиснення ендогенних токсинів. Підвищення антиоксидного стану печінки встановлено і після застосування метіоніну та фенарону на тлі високого рівня нітратів у кормі курчат. Імовірно, що при Н Н токсикозі аскорбінова кислота, метіонін та фенарон виконують функцію ендогенних антиоксидантів і в такий спосіб доповнюють фізіологічну антиоксидну систему печінки, яка стабілізує вільнорадикальне окиснення при надмірному метгемоглобіноутворенні. Результати досліджень свідчать, що в антиоксидному захисті вищу ефективність проявляє аскорбінова кислота, меншу – фенарон і метіонін. Гістоморфологічні зміни у внутрішніх органах курчат. У печінці курчат, яким упродовж 30 діб до корму додавали нітрат натрію в дозі 0,8 г/кг м.т., встановлено застійну венозну гіперемію та слабко виражену зернисту дистрофію гепатоцитів. При збільшенні дози нітрату натрію до субтоксичної (1,6 г/кг м.т.) у просвіті капілярів виявлено скупчення еритроцитів, венозні стази. Це зумовило деформацію печінкових балок. На тлі циркуляторних розладів кровозабезпечення встановлено дистрофічні процеси в печінкових клітинах. Контури гепатоцитів були розмиті. Їхня цитоплазма мутна, неоднорідно забарвлена, місцями просвітлена. Клітини щільно прилягали одна до одної. Ядра у окремих гепатоцитів зменшені у розмірі з чисельними зернятками хроматину, гіперхромні, у інших – лізовані. Необхідно відзначити, що кількість клітин із гіперхромними, соковитими, великими ядрами з інтенсивно забарвленою цитоплазмою була великою, що вказує на підвищену функціональну активність гепатоцитів. У стромі, навколо тріад, спостерігається круглоклітинна інфільтрація. , x ¬   c E @ hi,IEHuyOJPJQJ ???труктура дещо відрізнялися. У цитоплазмі проглядались дрібнозернисті електроннощільні скупчення глікогену. Після згодовування курчатам нітрату натрію у субтоксичній дозі в клітинах печінки виступали більш виражені ультраструктурні зміни. При цьому цитоплазма гепатоцитів була просвітленою. Ядра клітин округлої форми, однак оболонка мала слабо виражені випинання. Дрібнозернистий хроматин нерівномірно розподілений по всій каріоплазмі, а біля каріолеми формувався у брилки. Електроннощільні ядерця розміщувались у центрі ядра. Порівнюючи з попередньою групою курчат, число рибосом на ендоплазматичній сітці було меншим, що свідчить про зниження білоксинтезуючої функції печінки. За наявності в кормі нітратів у субтоксичній дозі (1,6 г/кг м.т.) на 30-у добу досліду у нирках встановлено набухання цитоплазми епітеліальних клітин проксимального відділу звивистих канальців з наявністю ознак зернистого переродження. Виявлені зміни гістологічної структури характерні для нефротоксичного синдрому, що розвивається внаслідок глибоких гемодинамічних змін та розладів кисневого забезпечення паренхіми нирок. У кишечнику наявна лімфоїдна інфільтрація слизової оболонки та десквамація окремих епітеліальних клітин. У печінці встановлено застійну гіперемію і білково-жирову дистрофію різного ступеня вираженості та лімфоїдно-гістіоцитарну інфільтрацію навколо тріад. Електронно-мікроскопічними дослідженнями печінки підтверджено деструкцію біологічних мембран гепатоцитів і мітохондрій та жирову дистрофію цитоплазми клітин. В патогенезі цих змін у гепатоцитах лежить вільнорадикальне окиснення ліпідів біологічних мембран агресивними формами кисню, що звільняються в процесі метгемоглобінутворення. У наших дослідженнях встановлено, що основні гістологічні зміни, які лежать в основі дії гепатотоксичних отрут, розвиваються в мембранах ендоплазматичного ретикулуму гепатоцитів. Власне тут, з участю мікросомальних ферментів, відбувається біотрансформація нітратів і вільнорадикальні продукти метаболізму взаємодіють із біологічними структурами і, в першу чергу, з фосфоліпідами мембран гепатоцитів. Вони є одними із найбільш лабільних внутрішньоклітинних структур і першими при дії токсикантів зазнають морфологічних змін. У наших дослідах встановлено, що нітрати і нітрити не є специфічними нефротоксичними чи гепатотоксичними отрутами. Зміни, що виникають у вказаних органах, є вторинними. Комплекс змін, що відбуваються у печінці під впливом нітрату натрію в субтоксичній дозі, необхідно розцінювати як наслідок розладів метаболічних процесів. Наявна патологія у печінці є результатом посиленого метгемоглобінутворення і токсичної дії звільнених за цих умов вільнорадикальних агресивних форм кисню, що порушують окисно-відновні процеси та спричиняють деструкцію і деградацію цитоплазматичних мембран. Виявлені зміни у внутрішніх органах курчат є проявом адекватної реакції організму на дію нітратів. Вплив нітратів на систему імунітету. Імунологічну реактивність організму курчат при нітратному навантаженні оцінювали за величинами показників клітинного та гуморального імунітетів, а специфічну резистентність ? за функціональною активністю нейтрофілів та напруженістю поствакцинального імунітету. При наявності в кормі курчат нітратів у дозі 0,4 г/кг м.т. упродовж 30-и діб досліду вірогідних змін імунологічної резистентності організму не встановлено. При наявності у кормі курчат нітратів у дозі, вдвічі більшій за МДР, величини показників гуморального імунітету були збільшені, а неспецифічної резистентності організму – нижчими, порівняно з курчатами контрольної групи. Зокрема, на 14 добу БАСК, ЛАСК і ФАЛ знизилися, відповідно, на 11%, 16% і 8%, фагоцитарне число - на 9%, фагоцитарний індекс - на 20% та вміст лізоциму в сироватці крові – на 11%. Кількість лейкоцитів на 14-у добу збільшилася на 21%, на 21-у добу ? на 24%. За вказаний період, відповідно, на 7% і 13% збільшилось число Т-лімфоцитів. При наявності в кормі нітратів понад МДР у курчат підвищується активність гуморальної ланки імунітету, зокрема збільшується кількість лейкоцитів і Т-лімфоцитів та знижується неспецифічний захист організму (БАСК, ЛАСК, ФАЛ). Пригнічення імунного захисту настає на 7-у добу, досягає максимального рівня на 14-у добу і стабілізується на 21-у добу (рис. 9). Рис. 9. Показники імунного стану курчат при нітратному навантаженні Імуносупресивна дія нітратів зумовлена окиснювальним стресом, що настає внаслідок активного метгемоглобінутворення. За цих умов пригнічується білоксинтезуюча функція печінки, в тому числі знижується рівень імуноглобулінів та настає функціональна недостатність системи комплементу. При цьому порушується цілісність мембран імуноцитів. При розладах гомеостазу пригнічується диференціація Т-лімфоцитів. Встановлено прямий зв’язок між ураженням печінки хімічними токсикантами та зменшенням у ній синтезу імунокомпетентних білків, що веде до зниження функціонального стану імунної системи, а саме – пригнічення БАСК, ЛАСК і ФАЛ та розвитку імунодефіциту. При додаванні до корму з високим рівнем нітратів аскорбінової кислоти, метіоніну та фенарону посилюються метаболічні процеси в організмі курчат і підвищується неспецифічна резистентність організму. У дослідах на інтактних курчатах підтверджено, що аскорбінова кислота підвищує бактерицидну (на 14-16%) і лізоцимну активність сироватки крові та фагоцитарну активність лейкоцитів на 9-11%. Вона проявляє імуностимулюючу дію та підвищує активність гуморальної ланки імунітету. Роль аскорбінової кислоти особливо важлива в імунному захисті. Адже вона входить до складу лейкоцитів. Тому вони більше поглинають кисень і менше утворюють молочну кислоту із глюкози, що сприяє диханню та активізує фагоцитоз. Слабше виражену імуностимулюючу дію на організм курчат, за нашими даними, проявляють метіонін та фенарон. Для вивчення впливу антиоксидантів на формування поствакцинального імунітету курчатам до корму упродовж 20-и діб додавали нітрат натрію у дозі 0,8 г/кг м.т. На 20-у добу встановлено посилення гуморальної ланки імунітету (збільшення кількості лейкоцитів та Т-лімфоцитів) та пригнічення неспецифічної резистентності організму (БАСК, ЛАСК, ФАЛ). На 21-у добу курчат вакцинували проти хвороби Ньюкасла та досліджували у них показники гуморального і клітинного імунітету, а за титрами антигемаглютинінів і антитіл визначали напруженість поствакцинального імунітету. Контролем були вакциновані курчата, до корму яких нітратів не додавали. Встановлено, що у сироватці крові інтактних курчат, яких вакцинували проти хвороби Ньюкасла (контроль), на 7-у добу кількість лейкоцитів збільшилася на 6%, Т-лімфоцитів – на 7%. Вірогідно підвищилися показники неспецифічної резистентності імунного захисту: БАСК на 9%, ЛАСК-6% і ФАЛ-12%. Фагоцитарне число та фагоцитарний індекс збільшувалися, відповідно, на 15 і 25% та на 8% підвищився рівень лізоциму у сироватці крові. Подальше підвищення величин показників гуморального імунітету та неспецифічної резистентності організму курчат встановлено на 14-у добу, які стабілізувалися на 21-у добу досліду. У цей період титр антигемаглютинінів складав 8,43±0,22 ОД., а титр антитіл 4,27±0,04 ОД. (Р<0,001). У курчат, вакцинованих проти хвороби Ньюкасла на тлі нітратного навантаження, кількість Т-лімфоцитів, БАСК, ЛАСК і ФАЛ підвищились аналогічно до показників у курчат контрольної групи. Проте, титр антигемаглютинінів був меншим на 7-у добу на 15%, 14-у добу – на 19% і 21-у добу ? 17%. Титр антитіл також був на 52% нижчим, порівняно з курчатами, які нітратів з кормом не отримували. Результати досліджень свідчать, що нітрати знижують напруженість поствакцинального імунітету. При додаванні до корму з високим рівнем нітратів аскорбінової кислоти з одночасною вакцинацією курчат проти хвороби Ньюкасла величини показників фагоцитарної системи (фагоцитарна активність, фагоцитарне число, фагоцитарний індекс лейкоцитів) на 21 добу були такі, як у курчат контрольної групи та високою була концентрація лізоциму в сироватці крові (5,25±0,25 мкг/л). Титр антигемаглютинінів складав 8,20±0,04 ОД., а титр антитіл 4,30±0,05 ОД. Отже, аскорбінова кислота запобігає прояву пригнічуючої дії нітратів на імунну систему та забезпечує адекватну імунну відповідь на вакцину. Це відбувається внаслідок її впливу на клональну проліферацію і диференціацію імунокомпетентних клітин а також покращення анаеробного дихання і глюкогенезу в лейкоцитах. Вплив антиоксидантів на метаболічні процеси в інтактних курчат. У наших дослідах встановлено, що при наявності у кормі нітратів понад МДР антиоксиданти запобігають проявленню Н Н токсикозу. Для вивчення механізмів профілактичної дії антиоксидантів досліджували їх вплив на морфологічні і біохімічні показники крові інтактних курчат при відсутності нітратів у кормі. Упродовж 30-и діб до корму додавали аскорбінову кислоту (50 мг/кг), метіонін (80 мг/кг) і фенарон 200 мг/кг корму. Встановлено, що антиоксиданти стимулюють гемопоетичну функцію кісткового мозку. Упродовж досліду кількість еритроцитів збільшувалася після введення аскорбінової кислоти на 6-9%, метіоніну на 5-6% і фенарону на 8-12%. За аналогією змінювався також рівень гемоглобіну крові. У дослідних курчат встановлено підвищення рівня загального білка у сироватці крові після застосовування аскорбінової кислоти на 9%, метіоніну на 5% і фенарону – 6%. Рівень альбумінів зростав, відповідно, на 25%, 17% і 20%, що вказує на активізацію антиоксидантами білоксинтезуючої функції печінки внаслідок посилення метаболічних процесів в організмі курчат. На тлі дії антиоксидантів у сироватці крові зростає активність ферментів. Зокрема, на 10, 20 і 30 доби досліду під впливом аскорбінової кислоти активність каталази підвищується у порівнянні з показниками контрольної групи курчат, відповідно, на 58%, 43% і 46%; метіоніну – на 39%, 43% і 33%; фенарону – на 32%, 29% і 27%. Активність лактатдегідрогенази при застосуванні аскорбінової кислоти зростає на 21-24%, метіоніну на 16-17% і фенарону на 19-21%. Аскорбінова кислота і фенарон підвищують у сироватці крові активність лужної фосфатази, відповідно, на 11% і 5%, а метіонін такого впливу не проявляє. Активність амінотрансфераз на тлі застосування вищезазначених антиоксидантів вірогідно не змінюється. Фармако-токсикологічна доцільність та економічна ефективність застосування “Метіфену”. У дослідах встановлено, що кожен із вивчених нами антиоксидантів при нітратно-нітритному токсикозі має свої особливості позитивної дії. З метою поєднання фармакологічної дії окремих компонентів нами створено препарат “Метіфен”. До складу останнього в оптимальних дозах введено метіонін (80 мг), фенарон (200 мг) і наповнювач – до 1 г. Компоненти препарату сумісні за фізико-хімічними властивостями та проявляють у складі “Метіфену” синергізм фармакологічної дії. У дослідах на курчатах встановлено, що при нітратному навантаженні (1,6 г/кг м.т.) додавання до корму препарату “Метіфен” сприяє зниженню у сироватці крові рівня нітратів і нітритів на 7-9% порівняно з курчатами, яким до корму “Метіфен” не задавали. У дослідженнях Б.І. Назара (2003) повідомляється, що фенарон у складі корму проявляє високі окиснювальні властивості. Ймовірно, що завдяки окисненню нітрати у менших кількостях відновлюються у нітрити і надходять у кров. Тому рівень метгемоглобіну крові у дослідних курчат був у межах 7-12%, у той час, як у курчат, що “Метіфен” не отримували, цей показник становив 18-19%. На тлі невисокої концентрації нітритів і метгемоглобіну “Метіфен” підвищував білоксинтезуючу функцію печінки – рівень загального білка і альбумінів у сироватці крові курчат упродовж досліду був високим. Отже, “Метіфен” активізує метаболічні процеси в організмі курчат та діє гепатопротекторно, що особливо важливо при наявності у кормі нітратів понад максимально допустимий рівень. Поряд з дослідженнями профілактичної дії “Метіфену” при Н Н токсикозі ми також визначали економіко-господарські показники діяльності Самбірської птахофабрики, де було проведено апробацію препарату. Встановлено, що у курчат, у кормі яких був високий рівень нітратів, добові прирости маси тіла складали 22 г, а при додаванні до корму “Метіфену” – 26 г. Включення до корму інтактних курчат “Метіфену” сприяло отриманню середньодобових приростів 34 г. Вважаємо, що “Метіфен” необхідно застосовувати не лише при наявності у кормі високого рівня нітратів для профілактики токсикозу, а також для покращення росту та підвищення продуктивності курей. Економічні показники господарської діяльності птахофабрики при застосуванні “Метіфену” значно покращилися, а рентабельність складала 43,2% проти 31,4% без застосування “Метіфену”. Узагальнюючи результати наших досліджень і повідомлень у літературі з вивчення механізмів токсичної дії нітратів, представляємо схему патогенезу хронічного нітратно-нітритного токсикозу у курей (рис. 10). У травному каналі курчат, під впливом денітрифікуючих бактерій нітрати відновлюються до нітритів, відтак до нітрозамінів і аміаку. Після резорбції нітрати порушують іонну рівновагу крові, але швидко виводяться з організму, не проявляючи токсичної дії. Нітрозаміни є індукторами мутагенезу та канцерогенезу, що може проявлятися за умов тривалої дії у субтоксичних дозах. Аміак діє подразнююче на хеморецетори кишечника, нирок та кровоносної системи. У патогенезі такого токсикозу вирішальна роль належить нітритам. Основними “мішенями” токсичної їх дії є кров і печінка. Нітрити є класичними метгемоглобінутворювачами. За цих умов у крові накопичуються вільнорадикальні агресивні форми кисню – NО2, О2, ОН, НО2. Вони спричиняють перекисне окиснення ліпідів. При утворенні надмірного рівня гідроперекисів, руйнуються захисні антирадикальні механізми, внаслідок чого настає деструкція біологічних мембран гепатоцитів та проникнення в кров внутрішньоклітинних ферментів. Отже, метгемоглобіноутворення є першим етапом токсикозу, який відразу переходить у другий – окиснювальний стрес, наслідком якого є зниження білоксинтезуючої, дезінтоксикаційної та антиоксидної функцій печінки та проявлення синдрому ендогенної інтоксикації. Порушення Мутагенез Подразнення іонної рівноваги Канцерогенез хеморецепторів НІТРАТИ НІТРИТИ НІТРОЗАМІНИ АМІАК Розвиток гемічної гіпоксії Зниження енергозабезпечення МЕТГЕМОГЛОБІНОУТВОРЕННЯ Вільнорадикальні форми кисню Перекисне окиснення ліпідів ОКИСНЮВАЛЬНИЙ СТРЕС Деструкція цитоплазматичних мембран Вивільнення внутрішньоклітинних ферментів Деградація мембран гепатоцитів Токсичний гепатоз (пригнічення функцій) Білоксинтезуючої Дезінтоксикаційної Антиоксидної Імунної Рис. 10. Схема хронічного нітратно-нітритного токсикозу у курей Поряд із розладами морфологічного і біохімічного складу крові необхідно відзначити вплив нітратів на імунну систему. Встановлено прямий зв’язок між ураженням печінки нітратами та імунним гомеостазом. Адже, власне у печінці відбувається синтез імунорегуляторних білків. Нітрати знижують бактерицидну і фагоцитарну активність сироватки крові та рівень в ній лізоциму, зменшується кількість Т-лімфоцитів та знижуються титри антитіл при вакцинації внаслідок пригнічення процесів імуногенезу. Імуносупресивна дія нітратів проявляється опосередковано через деструкцію гепатоцитів, у яких синтезуються імунні білки системи комплемента, деструкцію мембран імунокомпетентних клітин та зміни гомеостазу в організмі. У наших дослідженнях встановлено, що при тривалому надходженні в організм нітратів у субтоксичних дозах у курчат із часом настає звикання. Це біологічна форма адаптації організму до отруйних речовин. Вона характеризується тим, що після відповідного періоду прояву функціональних і морфологічних змін в організмі настає стадія відносної нормалізації. Звикання курчат до нітратів розвивається у три фази. Фаза первинної реакції – це період становлення адаптації організму до дії нітратів. Нами доведено, що на цьому етапі відбувається функціональна активація антиоксидної системи печінки, яка бере участь у біотрансформації нітратів та зменшенні агресивної дії продуктів метгемоглобінутворення. Дана фаза характеризується суттєвими змінами морфологічного складу крові, підвищенням активності ферментів окиснення, фосфорилювання та переамінування, лейкоцитозом та еозинофілією. Друга фаза звикання характеризується зниженням реакції організму на дію нітратів і нітритів. У цей період найбільш інтенсивно нейтралізуються продукти метгемоглобіноутворення, в напруженому ритмі функціонує печінка і в такий спосіб досягається максимальне зниження токсичної дії нітратів. Третя фаза звикання проявляється не завжди. Вона може бути при “зриві” звикання внаслідок надмірного напруження адаптивних механізмів, коли вони змінюються компенсаторними процесами. Описані фази звикання курчат до дії нітратів не були обмежені відповідним проявом у часі. Встановлено, що перша фаза звикання досить рано проявляється змінами гематологічних показників. У пізніші періоди були встановлені зміни активності ферментів окиснення, фосфорилювання та переамінування. Конкретним результатом наших досліджень є експериментальне підтвердження ефективності антиоксидантів в якості засобів, що запобігають “зриву” адаптації. Розкриття механізмів нітратно-нітритного токсикозу стало основою розробки цілеспрямованого антиоксидного захисту із застосуванням препаратів, що проявляють антиоксидну, мембраностабілізуючу та гепатопротекторну дію. Антиоксиданти – аскорбінова кислота, метіонін та фенарон активізують мікросомальні ферменти гепатоцитів і підвищують метаболічні процеси, спрямовані на дезінтоксикацію чужерідних агентів екзогенного і ендогенного походження, у тому числі нітратів і нітритів. Ендогенні антиоксиданти характеризуються тісним зв’язком із процесами вільнорадикального окиснення ліпідів. Введені в організм в оптимальній дозі, вони вступають у взаємодію із радикалами жирних кислот, підвищують стійкість ліпідів біологічних мембран і запобігають розвитку ланцюгової реакції перекисного окиснення ліпідів. Особливо слід відзначити стимулюючу дію аскорбінової кислоти на активність каталази і пероксидази, адже саме цим ферментам належить основна роль у запобіганні окиснювального стресу. Вони розщеплюють перекиси – найбільш агресивні кисневі метаболіти метгемоглобінутворення, доповнюють фізіологічну антиоксидну систему печінки та проявляють гепатопротекторну дію. Поєднання позитивних фармакологічних якостей метіоніну та фенарону знайшло своє відображення у створенні нового препарату “Метіфен” для профілактики Н Н токсикозу. У проведених нами дослідженнях встановлено, що при наявності в кормі нітратів понад МДР, у курчат настає скритий хронічний натратно-нітритний токсикоз. Він проявляється пригніченням еритропоезу, зниженням білоксинтезуючої функції печінки, деструкцією мембран гепатоцитів та проникненням з них у кров внутрішньоклітинних ферментів – АлАТ, АсАТ, ЛФ. Для профілактики токсикозу застосовували аскорбінову кислоту, метіонін та фенарон. Кожен із вказаних антиоксидантів відповідно до фармакологічної дії у більшій чи меншій мірі нормалізує відповідні ланки гомеостазу. Аскорбінова кислота найбільш інтенсивно забезпечує окисно-відновні процеси і бере участь у системі антирадикального захисту печінки проти агресивних форм кисню. Як антиоксидант, вона біологічно і хімічно найбільш активна сполука, входить до складу біологічних мембран клітин і ефективно захищає їх від перекисного окиснення та стабілізує сульфгідрильні групи ферментів. Аскорбінова кислота стимулює активність ферментів окиснення – каталази, пероксидази і лактатдегідрогенази, а тому запобігає окислювальному стресу, проявляючи гепатопротекторну дію. Метіонін є амінокислотою – донатором метильних груп для утворення біологічно активних речовин, необхідних для метаболічних процесів. Активізуючи перетворення нейтральних жирів у фосфоліпіди метіонін стабілізує субклітинні мембрани і забезпечує їх антиоксидний захист, підвищує стійкість гепатоцитів до токсичної дії нітратів та запобігає розвитку жирової дистрофії печінки. Фенарон як комплексна сполука, що містить фенозан-кислоту і захищає жири від окиснення, вступає у взаємодію із радикалами жирних кислот та попереджує розвиток ланцюгової реакції окиснювального стресу і посилює дезінтоксикаційну функцію печінки. Отже, на основі проведених досліджень розкриті механізми вільно радикальних реакцій та їх кінетика при Н Н токсикозі, вивчені процеси переокиснення ліпідів, що стали основою для цілеспрямованого пошуку засобів антиоксидного захисту та активації дезінтоксикаційної системи і розробки ефективних методів профілактики токсикозу. Встановлено виключно важливу роль антиоксидантів у забезпеченні адаптативного антиоксидного захисту організму при Н Н токсикозі. ВИСНОВКИ 1. У дисертації представлено науково-теоретичне узагальнення і нове практичне вирішення поставленого завдання, що полягає у з’ясуванні особливостей токсикодинаміки та стану захисних систем печінки при хронічному нітратно-нітритному токсикозі курей. Підтверджено провідну роль метгемоглобіноутворення та розкрито нові наукові аспекти токсикозу, які проявляються посиленням вільнорадикальних процесів окиснення ліпідів та пригніченням антиоксидної функції печінки, що призводить до окиснювального стресу. Розв’язання поставленої проблеми здійснено шляхом вивчення морфологічних і біохімічних показників крові, дослідження гістологічної і електронно-мікроскопічної структури внутрішніх органів, встановлення білоксинтезуючої, дезінтоксикаційної і антиоксидної функцій печінки та визначення стану імунної системи. Вперше встановлено корегуючий вплив аскорбінової кислоти, метіоніну, фенарону та “Метіфену” на морфологічні і біохімічні показники крові курей при наявності в кормах високого рівня нітратів. Запропоновано застосування вказаних антиоксидантів для корекції гомеостазу та профілактики нітратно-нітритного токсикозу. 2. За наявності в кормах курчат допустимої добової дози нітратів (0,4 г/кг маси тіла) впродовж 30 діб вірогідних змін морфологічних і біохімічних показників крові не встановлено. Це вказує на стабільність метаболічних процесів в організмі. 3. За тривалого експериментального нітратного навантаження (0,8 г/кг маси тіла) в організмі курчат встановлені зміни біохімічних та морфологічних показників крові, збільшення кількості еритроцитів та підвищення рівня гемоглобіну, високу активність ферментів фосфорилювання і переамінування, які вказують на порушення гомеостазу, що виникають на тлі захисної реакції організму на надмірну кількість нітратів та включення компенсаторно-пристосувальних механізмів. 4. За наявності у кормах нітратів у кількості, вдвічі більшій за добову допустиму дозу, на 9% зменшується кількість еритроцитів та на 13% знижується рівень гемоглобіну, у сироватці крові підвищується активність ферментів окиснення (лактатдегідрогенази на 7-11%), фосфорилювання (лужної фосфатази на 13%; креатинфосфокінази на 33%) і переамінування (АсАТ і АлАТ, відповідно, на 19 % і 30%) та на 9-11% знижується синтез білка в печінці. 5. За тривалого надходження до організму курчат нітратів у субтоксичній дозі (1,6 г/кг м.т.) настає скритий нітратно-нітритний токсикоз. Він розвивається в два етапи. На першому ? відбувається посилене метгемоглобіноуворення. Максимальний рівень метгемоглобіну досягає 29%. На другому етапі продукти метгемоглобіноутворення ? агресивні форми кисню (NO2, НО2, НО, О2) – спричиняють перекисне окиснення ліпідів. За цих умов утворюється надмірна кількість ендогенних перекисів жирних кислот (75-90%), які знижують антиоксидний захист печінки, що призводить до окиснювального стресу, рівень гідроперекисів ліпідів підвищується на 90%, а швидкість перекисного окиснення ліпідів зменшується на 31%. Вони спричиняють деструкцію біологічних мембран гепатоцитів та еритроцитів, що супроводжується вивільненням у кров АлАТ, АсАТ, ЛФ та на 9-11% знижується білоксинтезуюча функція печінки. Високу активність ферментів на тлі гіпопротеїнемії слід вважати тестом ранньої діагностики нітратно-нітритного токсикозу у курей. 6. За токсичної дії нітратів порушується інтрацелюлярний гомеостаз, внаслідок чого у сироватці крові на 26 % підвищується концентрація кальцію. Посилений його вихід з ендоплазматичного ретикулуму гепатоцитів через мембрани, деструковані агресивними формами кисню, зумовлює активацію кальцій-залежних фосфатаз. Інтенсивне виведення з організму хлору (26%) та зниження рівня фосфору (45%) свідчить про посилену утилізацію їх у процесах фосфорилювання та тканинного дихання. 7. За нітратно-нітритного токсикозу встановлено зниження у сироватці крові рівня загального білка на 11% і альбумінів на 20%, що є результатом пригнічення білоксинтезуючої функції печінки (підтверджено електронно-мікроскопічними дослідженнями) та посиленої утилізації альбумінів для пластичних процесів (на що вказує висока активність амінотрансфераз і фосфатаз у сироватці крові). 8. Нітрити не виявляють прямої гепатотоксичної дії, але опосередковано, внаслідок переокиснення фосфоліпідів біологічних мембран клітин продуктами метгемоглобіноутворення, пригнічують білоксинтезуючу та знижують дезінтоксикаційну функції печінки. При нітратно-нітритному токсикозі у сироватці крові на 75 % збільшується рівень гідроперекисів ліпідів, підвищується активність глутатіонпероксидази і каталази; відповідно, на 17 % і 79 % та на 15 % збільшується швидкість перекисного окиснення ліпідів, що є результатом токсичного ураження печінки та зниження її антиоксидної функції. 9. При гістологічних дослідженнях у печінці курчат за токсичної дії нітратів встановлено розлади мікроциркуляції крові, білкову дистрофію і вакуолізацію гранулярної ендоплазматичної сітки та деструкцію мітохондрій гепатоцитів. У нирках настає зернисте переродження епітелію видільних канальців. 10. У дослідах на щурах за кількістю еритроцитів з мікроядрами встановлено, що нітрит натрію в дозі 1/2 ЛД50 за умови гострого досліду проявляє мутагенну дію. У дозі 1/5 ЛД50 мутагенної дії нітратів не виявлено. У хронічному експерименті нітрат натрію діє мутагенно лише у субтоксичній дозі (1,6 г NО3- /кг м.т.) і сприяє збільшенню кількості хромосомних та хроматидних аберацій у клітинах кісткового мозку на 5-7%. 11. Нітрати у кількості, вдвічі більшій за МДР у кормах, пригнічують систему імунітету. Вони знижують бактерицидну і лізоцимну активність сироватки крові, відповідно, на 20 % і 8 %, зменшують фагоцитарну активність лейкоцитів на 13 %. При цьому знижується неспецифічна резистентність організму та зменшується напруженість поствакцинального імунітету (титр антигемаглютинінів на 15-18%, титр антитіл на 8-17%). Імуносупресивна дія нітратів і нітритів є наслідком окиснювального стресу, токсичної дії продуктів метгемоглобінутворення та зниження білоксинтезуючої функції печінки. 12. Антиоксиданти (аскорбінова кислота, метіонін, фенарон і “Метіфен”) при нітратно-нітритному токсикозі проявляють гепатопротекторну дію. Вони нормалізують розлади гомеостазу, підвищують неспецифічну резистентність організму, стабілізують цитоплазматичні мембрани та підвищують стан гуморального і клітинного імунітетів, сприяють посиленню активності комплементу та здатності нейтрофілів до фагоцитозу. Гепатопротекторна дія антиоксидантів зумовлена нормалізацією процесів перекисного окиснення ліпідів, сповільненням процесів утворення активних вільнорадикальних сполук, що запобігає розвитку окиснювального стресу. 13. При наявності в кормі нітратів понад максимально допустимий рівень для профілактики токсикозу необхідно до корму додавати аскорбінову кислоту в дозі 50 мг/кг, метіонін – 80 мг/кг, фенарон – 200 мг/кг або “Метіфен” – 280 мг/кг. ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ Методичні рекомендації з профілактики, діагностики та лікування тварин при отруєнні нітратами // Затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини України 4 грудня 2000р. – Харків, 2001. – 58 с. Технічні умови України ТУ У 24.4-31003546-001-2004 “Метіфен” // Затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини України. Термін введення в дію із 2004. – 10 с. Настанова по застосуванню препарату “Метіфен” / Затверджена Державним науково-дослідним контрольним інститутом ветеринарних препаратів і кормових добавок. – Львів, 2004. – 2 с. Довідник сучасних лікарських препаратів для практики ветеринарної медицини. – Львів, 2002. – 239 с. Розроблені методичні рекомендації та нормативні документи рекомендується включити до курсів ”Ветеринарна фармакологія” і “Ветеринарна токсикологія” для студентів вищих навчальних закладів I-IV рівнів акредитації за спеціальністю “Ветеринарна медицина”. Список основних праць, опублікованих за темою дисертації Гунчак В.М. Імунодепресантна дія нітрату натрію на білих щурів // Вісник Білоцерківського державного аграрного університету ”Проблеми неінфекційної патології”. – Біла Церква, 1998. – В. 5, Ч. 1. – С. 38-42. Зміни процесів обміну у дослідних тварин під впливом сполук амонію/Гунчак В.М., Харів І.І., Коваленко П.П., Кравчук Л.М. // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З.Ґжицького. – Львів, 1999. – В. 3, Ч. І. – С. 31-33. (Дисертант опрацював літературні дані і результати власних досліджень, йому належить участь в їх аналізі та написанні статті). Метгемоглобінемія – як тест ранньої діагностики нітратно-нітритної інтоксикації / Гуфрій Д.Ф., Скорохід В.Й., Гунчак В.М., Хомик Р.І. // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З.Ґжицького. – Львів, 2000. В. 1, Ч. І. – С. 33-37. (Дисертант брав участь у виконанні експериментальних досліджень, аналізі результатів та написанні статті). Гунчак В.М. Окремі аспекти впливу нітрату натрію на організм птиці // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З.Ґжицького. – Львів, 2000. – Т. 2, № 3-4. – С. 110-112. Вплив окремих вітамінних препаратів на нагромадження нітритних сполук у крові і сечі / Гунчак В.М., Васів Р.О., Гуфрій Д.Ф., Скорохід В.Й., Хомик Р.І. // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З.Ґжицького. – Львів, 2000. – Т. II, № 2, Ч. І. – С. 47-51. (Дисертант є співавтором ідеї, покладеної в основу статті. Йому належить участь в опрацюванні робочої схеми експерименту, отриманні та аналізі результатів і написанні статті). Гунчак В.М. Морфологічні показники крові птиці за експериментального нітратного навантаження // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З.Ґжицького. – Львів, 2001. – Т. 3, № 4, В. 3. – С. 38-42. Гунчак В.М., Гуфрій Д.Ф., Скорохід В.Й. Особливості сучасних тлумачень токсикодинаміки нітратно-нітритних інтоксикацій в організмі щурів за умов навантаження його свинцем // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З.Гжицького. – Львів, 2001. – Т. 3, № 3. – С. 34-38. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, участь у проведенні досліджень, аналізі результатів та написанні статті). Гунчак В.М. Вплив нітратного навантаження організму курчат на активність окремих ферментів крові // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З.Гжицького. – Львів, 2001. – Т. 3, № 1. – С. 82-83. Гунчак В.М. Вплив нітратів на дезінтоксикаційну функцію печінки // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З.Ґжицького. – Львів, 2002. – Т. 4, № 1. – С. 5-7. Гунчак В.М. До вивчення питання про мутагенну дію нітратів і нітритів в організмі щурів // Науковий вісник Національного аграрного університету. – Київ, 2002. – В. 55. – С.46–49. Гунчак В.М., Гунчак А.В. Вплив нітратів на поствакцинальний імунітет у курчат // Вісник Полтавської державної аграрної академії. – Полтава, 2002. – № 5-6. – С. 44-45. (Дисертант провів експериментальні дослідження, брав участь в інтерпретації отриманих результатів та написанні статті). Вплив солей кадмію на окремі показники крові щурів на тлі нітратного навантаження / Гуфрій Д.Ф., Скорохід В.Й., Гунчак В.М., Канюка О.І. // Вісник Полтавської державної аграрної академії. – Полтава, 2002. – Т. 2(21). – С. 295-297. (Дисертант є співавтором ідеї, що покладена в основу статі. Брав участь у проведенні експериментів, обґрунтуванні отриманих результатів і написанні статті). Гунчак В.М., Гунчак А.В. Вплив нітрату натрію та ацетату свинцю на деякі ланки обміну речовин в організмі щурів // Укр. біохім. журнал. – 2002. – Т. 74, № 4 /додаток 2/. – С. 218. Гунчак В.М. Вплив метіоніну на антиоксидантний статус курчат-бройлерів при нітратно-нітритному токсикозі // Ветеринарна медицина. Міжвід. темат. наук. зб. – Харків, 2003. – В. 81. – С. 112-115. Гунчак В.М. Гістоморфологічні зміни у внутрішніх органах курчат за умов хронічного нітратного токсикозу // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З.Ґжицького. – Львів, 2003. – Т. 5, № 4. – С. 27-30. Гунчак В.М. Рівень електролітів у крові курчат при нітратно-нітритному токсикозі // Вісник Білоцерківського державного аграрного університету. – Біла Церква, 2003. – В. 25, Ч. ІІ. – С. 59-64. Фактори, що впливають на забруднення продуктів харчування та продовольчої сировини нітратами / Д.Ф. Гуфрій, В.Й.Скорохід, В.М.Гунчак, О.І. Канюка // Науковий вісник Львівської національної академії ветеринарної медицини ім. С.З.Гжицького. – Львів, 2003. – Т. 5(4), Ч. 1. – С. 106-114. (Дисертант брав участь в аналізі літературних та власних досліджень, їх інтерпретації та написанні статті). Гунчак В.М. Застосування фенарону для зменшення токсичної дії нітратів // Вісник Сумського національного аграрного університету – Суми. 2004. – № 2(ІІ). – С. 153-154. Гунчак В.М. Профілактична дія аскорбінової кислоти при наявності нітратів у кормі // Птахівництво. Міжвід. темат. наук. зб. – Алушта, 2004. – В. 55. – С. 232-234. Гунчак В.М. Застосування метіоніну для зменшення токсичної дії нітратів // Науковий вісник Львівської національної академії ветеринарної медицини ім. С.З.Ґжицького. – Львів, 2004. – Т. 6, № 3, Ч. 1. – С. 84-88. Гунчак В.М. Новий антиоксидант “Метіфен” та його застосування для профілактики нітратно-нітритного токсикозу у курей // Сільський господар. – 2004. – № 7. – С. 13-15. Вплив фенарону на дезінтоксикаційну функцію печінки при нітратно-нітритному токсикозі у курчат / Гунчак В.М., Гуфрій Д.Ф., Канюка О.І., Хомик Р.І. // Науковий вісник Львівської національної академії ветеринарної медицини ім. С.З.Ґжицького. – Львів, 2004. – Т. 6, № 3, Ч. 3. – С. 38-41. (Дисертанту належить ідея, покладена в основу статті, він розробив схему експерименту, брав участь в отриманні результатів і написанні статті). Patogenesis of nitrat and nitrite roisonong of the introduction of nitrates into their organism with fodded or water./ Skorochid V., Hunchak V., Khomyk R., Guphrij D. //Ukrainian-Austrian symp. "Agriculture: Science and Practice". – Lviv, 1996. – P. 113. Huntschak W. Unspezifische zellimmunitat bei der adaption zum einfluss der kleinen dosen des Natriumnitrits // 2 Symposium Osterreich – Ukraine / Landwirtschaft. – Wien, 2000. – Р. 34-35. Гунчак В.М. Нітратно-нітритний токсикоз у тварин і птиці, шляхи його усунення та отримання якісної продукції від них // Інформаційний листок. – Львів. – 2001. – 6 с. (Дисертант брав участь у підготовці інформаційного листка). Методичні рекомендації з профілактики, діагностики та лікування тварин при отруєнні нітратами та нітритами // Розробники: співробітники кафедри фармакології і токсикології Національного аграрного університету, Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З.Ґжицького та Центральної лабораторії ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України /Затверджено науково-технічною радою Державного департаменту ветеринарної медицини України. – Харків, 2001. – 58 с. (У цих рекомендаціях використані матеріали експериментальних досліджень автора). Довідник сучасних лікарських препаратів для практики ветеринарної медицини // Авторський колектив за заг. ред. Гунчака В.М. – Львів. – 2003. – 239 с. Гунчак В.М., Гуфрій Д.Ф., Канюка О.І. Технічні умови України ТУ У 24.4 – 31003546-001-2004 “Метіфен” // Затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини Мінагрополітики України 29 вересня 2004. Термін введення в дію із 2004 р. – 10 с. (Дисертант на основі проведених досліджень оформив технічні умови на препарат). Гунчак В.М. Настанова по застосуванню препарату “Метіфен” // Затверджена Державним науково-дослідним контрольним інститутом ветеринарних препаратів та кормових добавок. – Львів, 2004. – 2 с. Гунчак В.М., Гуфрій Д.Ф., Канюка О.І. Спосіб профілактики токсичної дії нітратів корму і корекції обміну речовин у курей-бройлерів// Рішення про видачу деклараційного патенту на винахід (Реєстр. номер 2004604928 від 18 листопада 2004). Анотації Гунчак В.М. Хронічний нітратно-нітритний токсикоз курей та його профілактика. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.04 - ветеринарна фармакологія та токсикологія. – Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, Харків, 2005. Дисертація присвячена вивченню хронічного нітратно-нітритного токсикозу у курчат та застосуванню антиоксидантів для зниження токсичної дії нітратів на організм птиці. Вперше розкрито нові аспекти патогенезу нітратно-нітритного токсикозу. Встановлено, що у цьому процесі поряд із метгемоглобіноутворенням вирішальну роль на клітинному рівні відіграють процеси вільнорадикального окиснення фосфоліпідів біологічних мембран клітин із подальшим розвитком окиснювального стресу, а також пригнічується гуморальний імунітет та ослаблюється поствакцинальна імунна відповідь. Досліджено морфологічні і біохімічні зміни у крові та гістологічні зміни у внутрішніх органах, встановлено пригнічення білоксинтезуючої, дезінтоксикаційної, антиоксидної функцій печінки у птиці при наявності в кормах нітратів і нітритів понад допустиму добову дозу. Запропоновано ефективні методи корекції гомеостазу за допомогою антиоксидантів. У модельних дослідах на щурах за показниками метафазного аналізу клітин кісткового мозку і кількістю еритроцитів з мікроядрами встановлено мутагенну дію нітритів у дозі 1/2 ЛД50. Комплексна оцінка інтенсивності наслідків ендогенної інтоксикації дає змогу всебічно оцінити ступінь ураження організму та вибрати способи корекції метаболічних процесів при наявності в кормах для птиці нітратів у дозах зверх допустимого добового рівня. Для профілактики токсикозу до корму необхідно додавати антиоксиданти з розрахунку на 1 т: аскорбінової кислоти – 50 г, метіоніну – 80 г, фенарону – 200 г або “Метіфену” – 280 г. Антиоксиданти можна включати до складу мінерально-вітамінних преміксів для захисту жирів корму та жиророзчинних вітамінів від окиснення та підвищення продуктивності курей. Ключові слова: хронічний нітратно-нітритний токсикоз, імунітет, антиоксиданти, аскорбінова кислота, метіонін, фенарон, “Метіфен”, мутагенність, гомеостаз, метаболічні розлади. Гунчак В.М. Хронический нитратно-нитритный токсикоз кур и его профилактика. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук по специальности 16.00.04 - ветеринарная фармакология и токсикология. – Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины УААН, Харьков, 2005. Диссертация посвящена изучению хронического нитратно-нитритного токсикоза цыплят и применению антиоксидантов для снижения токсического действия нитратов на организм птицы. В модельных опытах на крысах, за показателями метафазного анализа клеток костного мозга и количеством эритроцитов с микроядрами в периферической крови установлено, что нитрит натрия проявляет мутагенное действие в дозе 1/2 ЛД50, а нитрат натрия в субтоксической дозе (1,6 г/кг м.т.) при длительном воздействии на организм. При наличии в кормах нитратов в дозе 1,6 г/кг м.т. у животных угнетается лизоцимная, комплементарная и бактерицидная активность сыворотки крови и повышается лизоцимная активность лейкоцитов, увеличилось фагоцитарное число нейтрофилов и их фагоцитарный индекс. Впервые раскрыты новые аспекты патогенеза нитратно-нитритного токсикоза птиц. Установлено, что совместно с метгемоглобинообразованием решающую роль на клеточном уровне имеет свободнорадикальное окисление фосфолипидов биологических мембран клеток и развитие окислительного стресса. При этом угнетается клеточный и гуморальный иммунитеты, снижается поствакцинальный иммунный ответ. Нитраты снижают бактерицидную и лизоцимную активность сыворотки крови и фагоцитарную активность лейкоцитов, что приводит к снижению резистентности организма. Установлены морфологические и биохимические изменения в крови, а также гистологические и электронно-микроскопические изменения во внутренних органах. Установлено деструкцию ультраструктурного строения митохондрий гепатоцитов, что вызывает расстройства внутриклеточного гомеостаза и выхождение в кровь внутриклеточных ферментов. Изучение влияния нитратов на активность ферментов в сыворотке крови цыплят показало, что в допустимой суточной дозе – 0,4 г/кг м.т. нитраты повышают активность ферментов окисления. В дозе, превышающей у 2 раза допустимую суточную дозу – 0,8 г/кг м.т., нитраты усиливают метаболические процессы, в результате чего в сыворотке крови повышается активность ферментов окисления, фосфорилировання и переаминирования. В субтоксической дозе – 1,6г/кг м.т. нитраты вызывают деструкцию биологических мембран гепатоцитов и эритроцитов, что сопровождается выходом внутриклеточных ферментов в сыворотку крови. Установлено, что в субтоксической дозе нитраты угнетают белоксинтезирующую, дезинтоксикационную и антиоксидную функции печени. Они снижают иммунную резистентность организма и напряженность поствакцинального иммунитета. Предложены эффективные методы коррекции гомеостаза и процессов метаболизма при нитратно-нитритном токсикозе с помощью антиоксидантов. Установлено, что при высоком уровне нитратов в кормах профилактическое действие проявляет аскорбиновая кислота, метионин и “Метифен”, несколько меньшее – фенарон. Антиоксиданты нормализуют морфологический и биохимический состав крови, повышают активность ферментов, нормализуют уровень электролитов, активность каталазы и пероксидазы, что предотвращает окислительный стресс. Они расщепляют перекиси – наиболее агрессивные кислородные метаболиты метгемоглобинобразования. Метионин снижает процессы перекисного окисления липидов, повышает активность каталазы и пероксидазы. При наличии в корме цыплят нитрата натрия в субтоксической дозе фенарон снижает токсическое действие нитратов, повышает бактерицидную и лизоцимную активность сыворотки крови, усиливает фагоцитарную активность лейкоцитов, активизирует белоксинтезирующую функцию печени, усиливает эритро- и гемопоэз, повышает активность каталазы и пероксидазы. Комплексная оценка интенсивности эндогенной интоксикации дает возможность всесторонне оценить степень поражения организма и выбрать способы коррекции метаболических процесов. При наличии в кормах для птицы нитратов в дозах выше допустимой суточной дозы с целью профилактики проявления скрытого токсикоза к корму необходимо добавлять антиоксиданты на 1 т: аскорбиновой кислоты – 50 г, метионина – 80 г, фенарона – 200 г или “Метифена” 280 г. Антиоксиданты можно включать в состав минерально-витаминных премиксов для защиты жиров корма и жирорастворимых витаминов от окисления и повышения яйценоскости кур. Ключевые слова: хронический нитратно-нитритный токсикоз, антиоксиданты, аскорбиновая кислота, метионин, фенарон, “Метифен”, мутагенез, гомеостаз, эритропоез. V.Gunchak Chronic nitrate and nitrite toxicosis chickens – Manuscript. Thesis presented for the scientific degree of the doctor of veterinary sciences on speciality 16.00.04 – veterinary pharmacology and toxicology. – Institute of experimental and clinical veterinary medicine UAAS, Kharkiv, 2005. Thesis is devoted to the study of experimental nitrate and nitrite toxicosis of chickens and usage of antioxidants to reduce toxic effect of nitrates on the bodies of poultry. New aspects of pathogenesis of nitrate and nitrite toxicosis were revealed for the first time. It was stated that along with methemogbin formation the main role is given to processes of immune phospholipids of biological membranes of cells with the oxidation stress, also depression of humoral immunity, weakness of postvaccinational immune reaction are quite esident. Morphological and biochemical changes in the blood and histological changes in the internal organs were investigated; the depression of proteinsynthesizing, desintoxication, antioxidant functions of liver in poultry when it was given feeds supplied with nitrates and nitrites over maximum level were stated. Effective methods of correction of homeostasis disturbances with the help of antioxidants were offered. In model experiments on rats according to the metaphase analysis of the cells of the brain and quantity of micronuclear erythrocytes the mutagen effect of nitrates in the doze of 1/2 LD50 was stated. Complex evaluation of intensity in endogenic intoxication gives possibility to measure the degree of vulnerability of organism and select the ways of metabolic disturbances correction when feeds are supplied with nitrates in dozes over maximum level. For the prophylaxis of toxicosis it is necessary to add antioxidants (per 1 tablet): ascorbic acid – 50 gr, methionine – 80 gr, phenarone – 200 gr, methiphene – 280 gr. It is advisable to add to mineral and vitamin premixes antioxidants to protect fats of the feed and fat soluble vitamins against oxidation and to raise productivity of hens. Key words: experimental nitrate and nitrite toxicosis, immunity, antioxidants, ascorbic acid, methionine, phenarone, methiphene, mutagen, homeostasis, metabolic disturbances. Підписано до друку 11.ХІ.2004р. Формат 60х901/16. Умов. арк. 1,9 Папір офсетний. Тираж 100 прим. Віддруковано на різографі в лабораторії комп’ютерних технологій Львівської національної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Ґжицького м. Львів, вул. Пекарська, 50. PAGE \* Arabic 45 NO3? NO3? NO3? NO3?

Похожие записи