.

Хіміко-токсикологічне дослідження лоратадину (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 2689
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

РАССОХА ІРИНА ВІКТОРІВНА

УДК611.0133/8.08:576367:616.72-002.77

Вплив кріоконсервованих продуктів ембріофетоплацентарного комплексу на
процеси апоптозу при аутоімунних захворюваннях

03.00.19. — кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2005

Дисертацiєю є рукопис.

Робота виконана в Iнститутi проблем крiобiологii i крiомедицини НАН
Украiни

Науковий керiвник: член-кореспондент НАН Украiни,

доктор медичних наук, професор

Гольцев Анатолiй Миколайович, Iнститут проблем крiобiологii i
крiомедицини НАН Украiни, заст. директора з наукової роботи ІПКіК НАН
України, м. Харків

Офiцiйнi опоненти: доктор бiологiчних наук, професор

Жегунов Геннадiй Федорович, Харкiвська

державна зооветеринарна академiя МАП Украiни, завiдувач кафедри хiмii i
бiохiмii, м. Харків

доктор медичних наук, професор

Кайдашев Iгор Петрович,Українська медична

стоматологічна академія МОЗ України, завiдувач Центральноi науково –
дослідної лабораторії та кафедри внутрішніх хвороб з доглядом за
хворими, м. Полтава

Провiдна установа: Нацiональний медичний унiверситет iм. О.О.
Богомольця МОЗ України, відділ експери-ментальноi та клiнiчноi
iмунологii, м. Киiв.

Захист вiдбудеться “- 24—-” ——–травня——— 2005 року о
-1330-годинi на засiданнi спецiалiзованоi вченоi ради Д 64.242.01. при
Iнститутi проблем крiобiологii i крiомедицини НАН Украiни,61015, Харкiв
– 15, вул. Переяславська, 23

З дисертацiєю можна ознайомитися у бiблiотецi ІПКiК НАН Украiни за
адресою: 61015, Харкiв – 15, вул. Переяславська, 23

Автореферат розiсланий “—-23——” ———-квiтня————-
2005 р.

Вчений секретар

спецiалiзованоi вченої ради,

член-кореспондент НАН України
Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення протягом тривалого часу властивостей і
характеристик продуктів ембріофетоплацентарного комплексу (ПЕФПК)
продемонструвало широкий спектр їхньої біологічної активності та
затребуваність для лікування рiзноманiтних патологій людини [Грищенко
В.И. и др., 1996, 2002; Гольцев А.Н. и др., 2003]. Гідне місце у цих
роботах займає кріобіологічний вектор, у якому можна виділити два
ключових моменти: по-перше, розробка ефективних методів
кріоконсервування зазначених біооб’єктів та, по-друге, вивчення
особливостей механізмів реалізації їхнього терапевтичного ефекту після
кріоконсервування.

Усе менше викликає сумнівів той факт, що традиційне застосування
імуносупресивних препаратів при аутоімунних захворюваннях (АІЗ) є
малоефективним методом їх лікування. Механізми зриву імунологічної
толерантності при АІЗ, зокрема при ревматоїдному артриті (РА), до цього
часу до кінця не з’ясовані, однак вже зараз очевидна необхідність
перегляду стратегії лікування цієї патології. У патогенезі РА істотною є
зміна балансу регуляторних популяцій імунокомпетентних клітин (ІКК) i
експансія запальних цитокінів внаслідок дисфункції кооперативно
реалізуємого Т-клітинно-моноцитарно-макрофагального механізму [Dinarello
C.A. et al., 2000; Насонов Е.Л., 2001; Koshy P.J. et al., 2002]. Лише
нещодавно пригорнула до себе увагу як одна з можливих причин розвитку РА
проблема генетичних та метаболічних порушень ініціації й реалізації
апоптозу [Burger D., 2000; Eguchi K., 2001; Catrina A.I. et al., 2002].

Апоптоз є універсальним фізіологічним процесом, що відіграє
фундаментальну роль у підтримці структурно-функціональної сталості як
окремих органів та тканин, так і організму в цілому [Kerr J. F et al.,
1972; Afford S. et al., 2000; Райхлин Н.Т. и др., 2002; Ярилин А.А. и
др., 2004]. Порушення механізмів клітинної загибелі є патогенетично
значною ланкою розвитку багатьох патологічних станів [Чехун В.Ф., 1999;
Lenardo M. еt al., 2002; Жданов А. В. и др., 2003]. Ілюстрацією щодо
важливості апоптозу для підтримки нормального рівня функціонування
організму можуть бути імунопатології, при яких аутореактивні ІКК
“уникають” його [Eguchi K., 2001]. У зв’язку з цим виникає питання, що
має як теоретичну, так і практичну значущість, а саме: наскільки
змінюється при РА збалансоване співвідношення проліферації й апоптозу?
Не менш важливою є також оцінка структурно-функціональних характеристик
лімфогемопоетичного комплексу (ЛГПК), оскільки за умов зміни
цитокінового профілю при РА існує висока вірогідність модифікації
мембранних маркерів, що відповідають за каскадні про- та протизапальні
процеси, які мають безпосереднє відношення до апоптозу. До актуальних
задач сучасної медицини відноситься розробка ефективних технологій
корекції імунокомпетентної сфери під час розвитку АІЗ, зокрема
застосування імуномодулюючих препаратів. До них, безумовно, можна
віднести ПЕФПК, які, виступаючи у ролі природних біомодуляторів,
здійснюють корекцію міжсистемних взаємодій та надсистемну регуляцію
нейроімуноендокринної сфери [Гольцев А.Н. и др., 1999; Грищенко В.И.,
2002]. Здатність ПЕФПК коригувати стан регуляторних субпопуляцій клітин
імунної системи, що забезпечують становлення та підтримку толерантності
[Гольцев А.Н., 2000], теоретично обґрунтовує можливість керування як
загальним станом ІКК при аутоімунних патологiях у цілому, так і окремих
механізмів їх розвитку, тобто апоптозом. Однак особливості проявлення та
реалізації цих процесів за умов розвитку АІЗ до і після застосування
ПЕФПК потребують подальшого вивчення. Виходячи з того, що при АІЗ
виникають умови, які призводять до пригнічення апоптозу, особливий
інтерес представляє інформація щодо здатності ПЕФПК відтворювати баланс
між проліферацією й апоптозом. Ці дані дозволять у більшому ступені
розкрити патогенетичні основи розвитку та підтримки АІЗ, зокрема РА, а
також оптимізувати методи терапії цієї патології.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
у відділі кріопатофізіології в рамках планових тем НДР ІПКіК НАН
України: № 2.2.6.76. “Вивчення патофiзiологiчних основ застосування
нативних та крiоконсервованих продуктiв фетоплацентарного комплексу
(ПФПК) в лiкуваннi аутоiмунних захворювань” № держреєстрації 0202U000832
і теми № 2.2.6.6. “Вивчення механiзмiв коригуючоi дii продуктiв
фетоплацентарного комплексу на лiмфогемопоетичну систему в умовах
розвитку аутоiмунних захворювань при старiннi” № держреєстрації
0102U002023.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи – встановити особливості впливу
кріоконсервованої й нативної суспензії плаценти (КСП, НСП), на
виразність апоптозу в ІКК і модифікацію стану структур ЛГПК при
розвитку АІЗ у вигляді ад’ювантного артриту (АА).

Для досягнення мети були поставлені такі задачі:

Провести порівняльне вивчення структурно-функціональної організації
центральних та периферичних органів ЛГПК при АА до i після застосування
КСП і НСП.

Вивчити виразність апоптотичних та антиапоптотичних процесів у ІКК
органiв ЛГПК експериментальних тварин за фізіологічних умов, а також за
умов розвитку АА.

Дослідити у порівняльному аспекті вплив КСП і НСП на ступiнь розвитку
апоптотичних та антиапоптотичних процесів у ІКК тварин з АА.

Оцінити особливості впливу різних режимів кріоконсервування на
апоптоз-індукуючий потенціал суспензії плаценти та зіставити його зі
зміною її клітинного складу.

Об’єкт дослідження. Апоптотичні й антиапоптотичні процеси у ІКК органів
ЛГПК тварин з АА до и після застосування КСП і НСП.

Предмет дослідження. Кріоконсервована та нативна суспензія плаценти.

Методи дослідження. У роботі було використано імунологічні,
морфологічні, цитологічні та біохімічні методи дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше встановлено, що за умов
розвитку АА як КСП, так й НСП знижують рівень експресії
антиапоптотичного білка Bcl-2 та підсилюють апоптоз ІКК. На підставі
морфологічної оцінки, кількісного урахування Хехст+-клітин і
електрофоретичного аналізу фрагментації ДНК, показано, що у період
маніфестації основних клінічних проявiв АА відзначається виразне
пригнічення апоптозу ІКК як у центральних – тимусі, так і периферичних
– пахових лімфовузлах, перитонеальній порожнині та периферичній крові,
компартментах iмунноi системи.

У результаті виконаних досліджень отримані нові дані, що свідчать про
особливості коригуючої активності КСП і НСП щодо апоптотичних та
антиапоптотичних процесів у ІКК. Істотним є встановлений факт більш
виразного апоптоз-індукованого потенціалу КСП у порівнянні з НСП. Однак
у віддалені строки посттрансплантаційного періоду проапоптозна
активність КСП знижувалась. Встановлено, що така феноменологія
проявлення функціональної активності КСП детермінується зміною її
клітинного складу після кріоконсервування, а саме зниженням вмісту
клітин Кащенко-Гофбауера (ККГ).

Уперше в порівняльному аспекті оцінено імунокоригуючий ефект КСП і НСП.
Показано, що у динаміці розвитку АА застосування суспензії плаценти
купірує у мишей-реципієнтів клінічні ознаки артриту, стимулює гемопоез
та інгібує розвиток гіперплазії тимусу, селезінки і лімфатичних вузлів.

Практичне значення одержаних результатів. Використання різних режимів
кріоконсервування продемонструвало роль компонентного складу суспензії
плаценти (СП) у проявленні її багатовекторної функції. Розроблено метод
кріоконсервування СП, що забезпечує високе збереження її клітинного
складу. Кріоконсервована у відповідності до цього методу СП виявляла
пролонгований апоптоз-індукований потенціал в організмі реципієнта та
зберігала імунокоригуючий ефект. Одержані дані доповнюють знання щодо
молекулярних механізмів розвитку АІЗ, реалізації апоптозу, а також
сприяють розшифровці терапевтичної дії ПЕФПК. Представлені результати
можуть бути використані при розробці нових та оптимізації існуючих
методів ефективного лікування патологій, у розвитку яких патогенетичну
значущість мають порушення процесів апоптозу. Встановлені факти
підкреслюють перспективність застосування СП як препарату-коректору
імунокомпетентної сфери організму при патологічних станах аутоімунної
природи, а саме аутоімунних артритах.

Особистий внесок здобувача полягає в розробці методів, ініціюванні та
здійсненні усієї представленої серії досліджень щодо вивчення
особливостей впливу КСП і НСП на виразність апоптозу в ІКК і модифікацію
стану структур ЛГПК при розвитку АІЗ у вигляді АА.

В опублікованих із співавторами працях особистий внесок здобувача
полягає:

у роботах [1, 8, 9, 13] в участі у теоретичній та практичній розробці
методів вивчення стану органів ЛГПК експериментальних тварин при АА до
та пiсля введення нативних і кріоконсервованих препаратів плаценти; в
обґрунтуванні можливості використання ПЕФПК як коректорів АІЗ;

у роботах [2, 3, 5, 6,] в оцінці рівня фагоцитарної активності клітин
та зміни гематологічних показників у тварин на етапах розвитку АА;
здiйснено криоконсервування СП та iп введення експериментальним
тваринам;

у роботах [4, 7, 10] в проведенні аналізу апоптозу ІКК методами
світлової мікроскопії шляхом фарбування цитологічних препаратів
азур-еозином-ІІ та методом люмінесцентної мікроскопії з використанням
ДНК-тропного барвника Хехст-33342; у вивченні інтенсивності
апоптотичних процесів за допомогою аналізу міжнуклеосомної фрагментації
ДНК тимоцитів методом пульс-електрофорезу та аналізу антіапоптотичних
процесів за рівнем експресії антиапоптотичного білка Вс1-2;

у роботах [9, 11, 12] у здійсненні індукції АА та аналізу
структурно-функціональних показників тимусу до та після введення НСП i
КСП тваринам з патологією; у проведенні узагальнення результатів
дослідження.

Апробація результатів диссертації. Основні положення дисертаційної
роботи доповідалися та обговорювалися на конференціях молодих учених
ІПКіК НАН України “Холод у бiологii i медицинi” (м. Харків, 2002 і 2003
рр.), міжнародній науково-практичній конференції “Наука і соціальні
проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія ”, (м. Харків,
2003 р.), науково-практичній конференції “Сучасні напрямки розвитку
ендокринології (Другі Данілевські читання)” (м. Харків, 2003 р.),
науково-практичній конференції “Фундаментальнi питання експериментальноi
та клiнiчноi ендокринологii (Четвертi Данiлевськi читання)”, (м. Харків,
2005 р.).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опублiковано 6 статтей у
фахових виданнях, 6 тез, отримано патент на корисну модель.

Об’єм та структура дисертації. Матеріали викладено на 141 стор., з яких
116 стор. основного змісту. Дисертаційна робота складається зі вступу,
огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів
власних досліджень та їхнього обговорення, аналізу і узагальнення
результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел літератури
у кількості 230 на 25 стор. Роботу проілюстровано 22 рисунками, 6
таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження

Експериментальні дослідження проведено на мишах-самцях лінії СВА вагою
18-20 г, що утримувалися за стандартних умов віварію ІПКіК НАНУ. Тварини
були розподілені на 5 груп. Контролем служила 1-а група здорових мишей.
У тварин 2, 3, 4 та 5-ї групи індукували АА. Мишам 3 та 4-ї групи
внутрішньовенно уводили відповідно НСП і КСП. У якості контролю
специфічної дії СП тваринам 5-ї групи вводили клітини печінки дорослих
тварин (КДП).

Усі маніпуляції з тваринами здійснювали згідно з положенням
„Європейської конвенції захисту хребетних тварин, які використовуються з
експериментальною та іншою науковою метою” (м. Страсбург, 1985).

Ад’ювантний артрит, що є експериментальною формою РА, індукували за
методом Пiрсона субплантарним уведенням повного ад’юванту Фрейнда
[Pearson C.M., 1963]. Уведення НСП і КСП 19-ї доби гестації проводили в
день ініціації патології внутришньовенно в об’ємі 0,2 мл, що містив
1х106 кл/мл. КДП уводили в аналогічному СП об’ємі і концентрації клітин.

Суспензію плаценти готували згідно методичним рекомендаціям [Грищенко
B.I. та ін., 1997]. Для цього виділену за стерильних умов плаценту,
тричі відмивали від слизу та крові фізіологічним розчином, після чого
отримували СП методом механічної дисоціаціі у гомогенізаторі Поттера у
співвідношенні 1:2 (плацента: фізіологічний розчин) до отримання
гомогенної маси. Одержану суспензію пропускали через капроновий фільтр
та голки діаметру, що зменшуюється. Кількість клітин у суспензії
підраховували у камері Горяєва. Для визначення морфологічного складу
клітин плаценти робили мазки, фіксували їх метанолом та фарбували за
методом Романовського [Меньшиков В.В., 1987].

Згідно даних літератури [Грищенко B.I. та ін., 1997], швидкість 10С/хв є
оптимальною для заморожування СП. Виходячи з цього, у першій серії
експериментів після 20 хв еквілібрації СП із кріопротектором при
кімнатній температурі зразок заморожували зі швидкістю 10С/хв до –400С з
подальшим занурюванням в рідкий азот (режим К1). У другій серії
експериментів було використано аналогічний режим заморожування з деякими
модифікаціями процесу підготовки зразку до кріоконсервування:

Замість перемішування клітини СП „нашаровували” на кріопротектор.

Приготований „сендвіч” клітини-кріопротектор без попередньої
еквілібрації при кімнатній температурі поміщували до програмного
заморожувача “Cryoson” (Німеччина), та охолоджували до 00С. При цьому
швидкість охолодження підбиралася таким чином, щоб час проходження цього
температурного інтервалу співпадав з рекомендованим терміном
еквілібрації клітин СП із кріопротектором (режим К2).

Відігрівання СП здiйснювали у водяній бані при температурі 420С протягом
45-50 с при постійному перемішуванні до повного зникнення кристалів
льоду.

Збереження клітин СП після гомогенізації та кріоконсервування оцінювали
загальноприйнятим експрес-методом за допомогою 0,2% водного розчину
трипанового синього [Костенко Е.А., 1968].

Для вивчення апоптозу було використано морфологічні та біохімічні методи
дослідження. Апоптоз клітин перитонеальної порожнини та периферичної
крові оцінювали за методом світлової мікроскопії [Меньшиков В.В., 1987].
Апоптотичні клітини в тимусі та пахових лімфовузлах вивчали за методом
люмінесцентного аналізу, для чого клітини інкубували з ДНК-тропним
барвником – Хехст 33342 [Belloc F. еt al., 1994]. Паралельно з
зазначеними, для виявлення апоптотичних клітин було використано метод
пульс-електрофорезу, який дозволяє визначити міжнуклеосомну фрагментацію
ДНК [Allen P.D. еt al., 1998]. Електрофоретичне розділення фрагментів
ДНК виконували в 1% агарозному гелі при напруженні 75 В протягом 8
годин. Візуалізацію результатів розділення ДНК, що було забарвлено
етидіумом бромідом, проводили за допомогою ультрафіолетової лампи
“Флускоп” при довжині хвилі 360 нм із подальшим виведенням інформації на
монітор через відеокамеру “Panasonic”. Для кількісної оцінки вмісту
апоптотичних клітин у тимусі, лімфовузлах, перитонеальній порожнині та
периферичній крові використовували індекс апоптозу (ІАп), який
розраховували за формулою:

[Фильченков А.А. и др., 1999].

Антиапоптозний потенціал ІКК визначали за рінем експресії в клітинах
білка Вcl-2 за допомогою методу люмінесцентної мікроскопії [Hockenbery
D., et a1. 1990].

Оцінку тяжкості перебігу АА проводили за клінічними ознаками (зміна ваги
тіла тварин, динаміка набряку суглобів) на 7-у (гостра фаза) і 21-у
(хронічна фаза) добу розвитку патології. Розмір набряку характеризував
індекс артриту (ІА), що є відношенням кола дослідного суглобу до кола
контрольного суглобу.

Дослідження ЛГПК експериментальних тварин проводили за допомогою
імунологічних методів, а саме: вивчення адгезивної здатності та
фагоцитарної активності клітин перитонеальної порожнини [Лобасенко Н.П.,
1979], а також фагоцитарної активності клітин периферичної крові
[Меньшиков В.В., 1987]. Стан гуморальної ланки імунітету оцінювали за
концентрацією циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) у сироватці крові
[Стручков П.В. и др., 1985]

Також було використано гематологічні методи дослідження, що включають
вивчення швидкості осідання еритроцитів (ШОЕ), кількості лейкоцитів,
еритроцитів та вмісту гемоглобіну [Меньшиков В.В., 1987].

Як додаткові методи оцінки стану ЛГПК застосовували індекси лімфовузлів,
селезінки та тимусу, які розраховували за формулою:

Для об’єктивної оцінки терапевтичної ефективності КСП і НСП
застосовували індекс сумарного ступеня відхилення показників (ССВ)
[Гольцев А.Н. и др., 2004] та показник ступеня пригнічення запалення
(СПЗ) [Саратиков А.С. и др., 1983].

Статистичну обробку отриманих експериментальних даних проводили за
методом Ст’юдента-Фішера.

Результати власних досліджень та їх обговорення.

Субплантарне введення повного ад’юванту Фрейнда викликало у мишей
дослідних груп розвиток експериментального АА, основними клінічними
симптомами якого є поява еритематозності та набряку регіональних до
місця введення ад’юванта суглобів [Давыдова Т.В. и др.,1978; Мiщенко
О.Я. и др., 2001]. Перший максимальний пік набряку спостерігався на 6-у
добу після ініціації патології (IА=1,6±0,10), що співпадало з гострим
періодом перебігу захворювання; другий пік був більш виразним та
приходився на 12-у добу (IА=1,7±0,12), характеризуючи початок хронічної
фази запального процесу [Копьева Т.Н., 1973].

Аналіз динаміки зміни клініко-лабораторних показників дав можливість
встановити, що поряд зі збільшенням виразності клінічних проявів
захворювання, а саме, з підвищенням ІА, у тварин з АА спостерігались
закономірні зміни гематологічних показників. Так, на 7-у добу після
індукції патології на тлі лейкоцитозу, який було зумовлено підвищенням
кількості сегментоядерних нейтрофілів, відзначалося достовірне у
порівнянні з контролем збільшення ШОЕ та ЦІК. У перитонеальній порожнині
дворазове підвищення загальної кількості клітин супроводжувалось майже
дворазовим збільшенням проценту адгезивних клітин. Виявлено активацію
клітин моноцитарно-фагоцитарної системи перитонеальної порожнини i
периферичної крові. На 14 та 21-у добу розвитку патології лейкоцитоз у
крові зберігався, але відзначалась тенденція до зменшення його
виразності та появлення ознак гіпохромної анемії. Зміни вмісту клітин у
перитонеальній порожнині, їх фагоцитарної активністі та адгезивного
потенціалу, а також динаміка фагоцитарної активності клітин периферичної
крові відображали зниження активності запального процесу. Вміст ЦІК у
сироватці крові залишався на високому рівні, як у гострий, так і у
хронічний періоди розвитку захворювання.

Уведення повного ад’юванту Фрейнда індукувало імунопатологічні процеси,
що призводили до структурних змін в органах імуногенезу. Так, на 7-14
доби розвитку АА відзначалась гіпоплазія тимусу, що характерно для
постстресорного стану органу [Горизонтов П.Д. и др., 1983; Цейликман
О.Б. и др., 2005]. На 21-у добу розвитку АА в тимусі розвивалась
гіперплазія. У селезінці та лімфовузлах вона мала місце протягом усього
терміну спостереження. Аналіз динаміки змін індексів цих органів
дозволив встановити, що їх гіперплазія є наслідком розростання
з’єднувально-тканинних структур строми органів.

Трансплантація мишам-реципієнтам препаратів плаценти призводила до
нормалізації якісних і кількісних характеристик досліджених показників.
На тлі зменшення ІА з’явилась тенденція до зниження загальної кількості
лейкоцитів, підвищення кількості еритроцитів та вмісту гемоглобіну, а
також зменшення рівня ЦІК. Поряд з цим, наприкінці дослідного періоду
спостерігалась нормалізація фагоцитарної активності клітин
моноцитарно-фагоцитарної системи. Трансплантація КСП і НСП попереджувала
розвиток гіперплазії досліджених органів. При цьому треба відзначити, що
дія КСП за низкою характеристик відрізнялась від дії НСП. Так, на 21-у
добу спостерігання терапевтичний ефект КСП трохи знижувався у порівнянні
з НСП, зокрема СПЗ після введення НСП складала на 21-у добу 13±0,99%, а
після введення КСП 7,4±0,82%. Очевидно, що КСП и НСП реалізують свій
функціональний потенціал не тільки по-різному в залежності від органу,
але й у різному ступені в одному і тому ж органі ЛГПК. У першу чергу, це
може свідчити про дозозалежний ефект регуляції стану органо-тканинних
структур ЛГПК при розвитку в них патологічного процесу, а отже, про
присутність різних концентрацій активних речовин у КСП і НСП.

Запальний процес при АА є відображенням причинно-наслідкових зв’язків,
що проявляються у визначеному ланцюгу послідовних патологічних змін.
Отже, розуміння того, що у даному випадку є причиною, а що наслідком,
дозволить розкрити сутність тих патологічних процесів, які обумовлюють
ті або інші показники. Таким чином, наступним етапом роботи з’явилось
вивчення у порівняльному аспекті динаміки змін структурно-функціональних
характеристик ЛГПК і механізму реалізації про- та антиапоптотичного
каскаду в ІКК. Оскільки деструктивні зміни хряща при АА у першу чергу
обумовлені лейкоцитарною інфільтрацією [Копьева Т.Н., 1980], нас цікавив
ступінь залучення до апоптозу нейтрофільних гранулоцитів у периферичній
крові та моноцитів/макрофагів у перитонеальній порожнині. Було
відзначено, що на 7, 14 та 21-у добу після індукції патології у тварин
із АА на тлі достовірного (у порівнянні з контролем) підвищення
кількості нейтрофільних гранулоцитів у периферичній крові та
моноцитів/макрофагів у перитонеальній порожнині відбувається дворазове,
а іноді триразове зниження їх ІАп (рис.1). При цьому, на тлі зменшення
ІАп дослідних клітин спостерігалось підвищення IА, відсотка адгезивних
клітин та загальної кількостi лейкоцитів.

Трансплантація КСП і НСП достовірно підвищувала ІАп у порівнянні з
нелікованими тваринами. У той же час зменшувалась активність запального
процесу, що проявлялось у зниженні IА, проценту адгезивних клітин у
перитонеальній порожнині та виразності лейкоцитозу.

Рис. 1. Динаміка запального процесу та апоптотичної активності клітин
перитонеальної порожнини та периферичної крові при АА до та після
введення КСП і НСП.

Примітки: 1. За 100% прийнято показники контрольної групи; 2. 1-АА,

2-АА+НСП, 3-АА+КСП, 4-АА+КДП.

Встановлено, що у перитонеальній порожнині та периферичнiй крові
протягом перших двох тижнів після введення КСП спостерігався максимально
виразний апоптоз-індукований ефект препарату. Суттєвим є й те, що
ступінь активності кріоконсервованого матеріалу у цей період був вище у
порівнянні з НСП. Це підкреслює, що після кріоконсервування СП набуває
більш виразної проапоптозної активності. Однак, вже на 21-у добу
спостерігання КСП виявилась менш ефективною щодо індукції апоптозу
досліджених клітин. Згідно з думкою авторів [Гольцев А.Н. и др., 2003],
це може бути наслідком, по-перше, модифікації антигенного спектру та
імуногенних властивостей клітин СП після циклу заморожування-відігріву,
по-друге, селективного впливу факторів кріоконсервування на клітини СП,
та, відповідно, спектр продукованих ними регуляторних медіаторів.

?

?

?

1/4

3/4

I

?

i

”$:@BJLPRXZ? c?. R T r t ? ? ?   ? ? ® ° ¶ ? @ @ $ @ @ b ??????b ? ? ? ? 1/4 i i @ @ ??????i †??. aAeAe aY& @ hEVaeCJ @ @ - @ ¤" @ @ @ @ @ CJ ph @ @ @ @ @ L ? ? [email protected] B /ронізація запального процесу при АА є наслідком зміни нормального співвідношення проліферації та апоптозу, а нечисленні спроби встановити механізми, з якими пов’язана стійкість клітин до апоптозу, не призвели до однозначних висновків, ми дослідили ступінь і характер апоптотичних та антиапоптотичних процесів у ІКК тимусу та лімфовузлів (табл.1). Згідно даних, що представлені у табл. 1, у тварин із АА відзначалося достовірне у порівнянні з контролем зниження вмісту Хехст+– клітин (клітини, з характерним для апоптозу світінням) у тимусі на 7 і 14-у добу майже у 2 рази, на 21 добу – у 6 разів. У лімфоцитах лімфовузлів – відповідно у 3, 1,5 та 3 рази. Тобто, разом з хронізацією запального процесу кількість клітин, у яких розвивається апоптоз, значно знижувалась як у тимусі, так й у лімфовузлах, незважаючи на те, що динаміка та виразність цього процесу мали різницю у досліджених органах у різні строки. Якщо у тимусі спостерігалась чітка тенденція до мінімізації виразності апоптозу під час пролонгації терміну розвитку АА, то у лімфовузлах такої тенденції не відзначалося. Зниження кількості Хехст+–клітин у досліджених органах супроводжувалось підвищенням рівня клітин, що експресують білок Bcl-2. Цей факт свідчить на користь того, що пригнічення апоптозу у тестованих клітинах при АА відбувається на тлі активації антиапоптотичного каскаду, що підтверджується збільшенням вмісту антиапоптотичного білка Bcl-2. Можливо, що за цієї причини під час гель-електрофорезу нами не було виявлено фрагментації ДНК тимоцитів у тварин із АА. Разом з цим, зіставлення кількісного вмісту в досліджених органах клітин у стані апоптозу при розвитку АА та виразності в них ступеня експресії Bcl-2 свідчить про відсутність чітких корелятивних зв’язків між цими показниками. Іншими словами, зниження вмісту Хехст+– клітин у тимусі з 7-ї по 21–у добу не співпадало з такою ж динамікою кількості клітин у лімфовузлах, більш того, не корелювала зі ступенем активації експресії Bcl-2 білка в клітинах цих органів. Даний факт, можливо, свідчить про те, що, по-перше, при аутоімунній патології, зокрема при АА, розвиваються різного ступеня порушення балансу між про- і антиапоптоз-індукованими сигнальними системами в різних органо-тканинних субстратах iмунноi системи. По-друге, відсутність зазначеної кореляції підтверджує існування альтернативних шляхів індукції та реалізації процесу апоптозу, так саме як й антиапоптотичних каскадів, крім участі Bcl-2 білка. Таблиця 1 Динамика зміни кількості Хехст+- клітин і клітин, що експресують Bcl-2 при ад’ювантному артриті до и після введення НСП і КСП доба Досліджений показник Досліджені клітини 1-а група 2-а група 3-я група 4-а група 5-а група 7 доба Кількість Хехст+-клітин тимоцити 100±4,6 # 56±2,3 * 120±5,4 *#" 83±3,8 *# 61±5,6 * лімфоцити лімфовузлів 100±5,1 # 33±1,2 * 75±4,3 *#" 90±8,8 # 35±2,5 * Кількість Bcl-2+- клітин тимоцити 100±7,4 # 150±11,2 * 93±4,4 #" 120±5,3 *# 148±6,6 * лімфоцити лімфовузлів 100±3,2 # 178±7,4 * 102±3,1 #" 89±7,6 *# 180±2,4 * 14 доба Кількість Хехст+-клітин тимоцити 100±5,4 # 53±2,4 * 92±4,7 #" 80±5,6 *# 56±3,1 * лімфоцити лімфовузлів 100±2,5 # 66±3,8 * 130±9,2 *#" 150±7,1 *# 69±1,5 * Кількість Bcl-2+- клітин тимоцити 100±4,8 # 125±2,6 * 110±6,3 # 110±7,8 # 125±5,3 * лімфоцити лімфовузлів 100±3,2 # 118±5,4 * 98±2,5 # 95±6,2 # 119±6,7 21 доба Кількість Хехст+-клітин тимоцити 100±8,2 # 17±1,1 * 90±5,4 # 81±3,6 *# 20±1,9 * лімфоцити лімфовузлів 100±2,7 # 34±2,8 * 107±4,3 #" 60±3,0 *# 38±2,6 * Кількість Bcl-2+- клітин тимоцити 100±4,7 # 138±8,6 * 120±5,5 *# 110±6,3 # 139±4,3 * лімфоцити лімфовузлів 100±6,6 # 136±8,2 * 102±6,3 # 112±5,4 # 134±5,8 * Примiтки: *- різниця достовірна у порівнянні з контрольною групою (1-а група), що було прийнято за 100%; # - різниця достовірна у порівнянні з показниками 2-ї групи; " - різниця достовірна між 3 і 4-ю групами; при р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020