НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

ФЕДОРЕНКО Віктор Олександрович

УДК 575.224+577.21

Генетичний контроль стійкості актиноміцетів до антибіотиків та його роль
у біосинтезі антибіотиків

03.00.15 – генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі генетики та біотехнології Львівського
національного університету імені Івана Франка

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент НАН України

Малюта Станіслав Станіславович,

Інститут молекулярної біології та
генетики НАН України,

завідувач відділу молекулярної
генетики (м. Київ);

доктор біологічних наук,

Кучук Микола Вікторович

Інститут клітинної біології та
генетичної інженерії

(м.Київ),

головний науковий співробітник;

доктор біологічних наук, професор

Позур Володимир Костянтинович,

Київський національний університет
імені Тараса

Шевченка,

завідувач кафедри мікробіології та
загальної імунології.

Провідна установа: Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К.
Заболотного

НАН України (м.Київ)

Захист дисертації відбудеться “27” січня 2005 р. о 10 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.202.01. в

Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України

за адресою: 03143, Київ-143, вул. акад. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної
біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143,
Київ-143, вул. акад. Заболотного, 148.

Автореферат разісланий “24”грудня 2004 р.

Вчений секретар

спеціалізовної вченої ради,

кандидат біологічних наук
Кравець О.А.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Антибіотики належать до числа головних продуктів
сучасної біотехнології та активно застосовуються в медицині та
ветеринарії. Більшість відомих сьогодні антибіотиків продукують
актиноміцети — одні з найчисельніших і найбільш розповсюджених
ґрунтових бактерій. Антибіотики, продуценти яких вивчалися у цій роботі
— еритроміцин, канаміцин, спіраміцин, доксорубіцин і данорубіцин, є
важливими та широко вживаними медичними препаратами [Hutchinson, 1997;
Piepersberg, Distler, 1997; Staunton, Weissman, 2001]. Однак, багато
аспектів генетичного контролю їх біосинтезу є слабко вивченими. Вимагає
вдосконалення й система селекції промислових продуцентів цих
антибіотиків. У той же час вивчення генетичного контролю біосинтезу
ландоміцинів – високоактивних протипухлинних антибіотиків, які
розглядаються як перспективні для застосування в хіміотерапії раку,
розпочалося лише в кінці 90-років минулого століття [Мацелюх і співавт.,
1998; Westrich et al., 1999; Федоренко і співавт., 2001].

Промислові продуценти антибіотиків отримані головно за допомогою
багатьох етапів індукованого мутагенезу та селекції клонів з підвищеною
антибіотичною активністю [Normansell, 1986; Berdy, 1995]. Зараз є
очевидним, що традиційна селекція актиноміцетів великою мірою вичерпала
себе. Це, насамперед, стосується штамів, які тривалий час були об’єктами
селекції, зокрема тих, що досліджувалися у цій роботі. Тому важливим та
актуальним завданням є опрацювання раціональних підходів до
вдосконалення промислових актиноміцетів, що ґрунтується як на вивченні
генетичного контролю біосинтезу антибіотиків, так і спеціальної генетики
штамів-продуцентів, а також розробки стосовно кожного з них методів
генетичної інженерії. Сьогодні показана перспективність застосування
методів генної інженерії для конструювання продуцентів нових
антибіотиків — так званий „комбінаторний” біосинтез [Khosla, Zawada,
1996; Hopwood, 1997, Mendez, Salas, 2001; Rix et al., 2002]. Для
використання цих методів необхідне розуміння генетичного контролю
кожного з етапів синтезу антибіотиків.

Актиноміцетам властива природна множинна стійкість до
антибіотиків [Даниленко и др., 1977; Федоренко и др., 1985]. У
більшості описаних випадків детермінанти стійкості актиноміцетів до
власного антибіотика та гени його біосинтезу зчеплені та координовано
регулюються [Hopwood, 1999]. Ідентифікація та клонування генів
резистентності до власного антибіотика є, зазвичай, першим кроком у
дослідженні генів біосинтезу антибіотиків [Kieser et al., 2000]. Одним
із головних чинників, що лімітують біосинтез антибіотика, є ступінь
резистентності штаму як до власного токсичного продукту, так і до інших
антибіотиків. Встановлення закономірностей генетичного контролю
стійкості актиноміцетів до антибіотиків та його ролі у біосинтезі
антибіотиків має важливе значення для глибшого розуміння механізмів
цих явищ, а також для розробки методів конструювання і селекції
промислових продуцентів антибіотиків. Крім того, досліджуючи стійкість
актиноміцетів до антибіотиків можна краще зрозуміти походження, еволюцію
і шляхи розповсюдження генетичних детермінантів
антибіотикорезистентності серед бактерій, зокрема, збудників інфекцій,
покращити антибіотикотерапію та створення нових, ефективніших
хіміотерапевтичних препаратів. Однією з особливостей актиноміцетів є їх
висока спонтанна мінливість [Baltz, 1986; Leblond et al.,1990;
Даниленко, 1991] . Гени стійкості до антибіотиків стали зручною моделлю
для вивчення механізмів нестабільності генома актиноміцетів [Федоренко,
Даниленко, 1980; Сullum et al., 1994]. Їх дослідження допомагає краще
зрозуміти закономірності організації генома актиноміцетів та його
мінливості. Воно має також важливе практичне значення, оскільки
найчастіше нестабільними є ознаки, за якими проводиться селекція
актиноміцетів. Вказані проблеми особливо актуальні для України, де у
даний час відсутнє промислове виробництво субстанцій антибіотиків за
допомогою їх біосинтезу та стоїть завдання його організації.

Зв’язок роботи з науковими програмами організації, де виконувалась
дисертація. Дисертаційна робота виконувалась у рамках наукової тематики
кафедри генетики та біотехнології а також НДЛ-45 генетики, селекції та
генетичної інженерії продуцентів антибіотиків ЛНУ ім.І.Франка, зокрема
держбюджетних та госпдоговірних тем, науковим керівником яких був
здобувач: БГ20-87 “Генетичний контроль продукції еритроміцину” (номер
держреєстрації — 01.8700.17789), БГ162Б „Вивчення генетичного контролю
біосинтезу канаміцину та одержання промислових штамів-продуцентів
канаміцину з підвищеною активністю” (номер держреєстрації —
0193U009889), БГ523Б „Генетичне та генно-інженерне конструювання штамів
актиноміцетів та дріжджів – продуцентів біологічно активних речовин”
(номер держреєстрації – 0193V03292), БГ162Б „Клонування і вивчення
генів актиноміцетів, які контролюють біосинтез антибіотика канаміцину з
метою конструювання його продуцентів” (номер держреєстрації —
0193V0033289), БГ573Б „Створення рекомбінантних штамів – продуцентів
антибіотика еритроміцину” (номер держреєстрації — 0198V033287), БГ701Б
„Вивчення механізмів генетичного контролю біосинтезу антибіотиків та
стійкості до них в актиноміцетів” (номер держреєстрації — 0196V002133),
БГ260Б „Конструювання штамів – продуцентів антибіотика канаміцину
Streptomyces kanamyceticus за допомогою методів клітинної та генної
інженерії” (номер держреєстрації – 0197U018080), БГ365Д “Конструювання і
селекція штаму Streptomyces peucetius – продуцента протипухлинного
антибіотика рубоміцину” (номер держреєстрації – 0197V015671), БГ12Б
“Розробка методів генетичного та генноінженерного конструювання штамів –
продуцентів протиракових антибіотиків” (номер держреєстрації –
0100U001442), БГ117Б „Генетичний контроль біосинтезу актиноміцетами
протипухлинних антибіотиків групи ландоміцинів” (номер держреєстрації –
0103U001916), БГ203Н „Колекція культур мікроорганізмів – продуцентів
антибіотиків Львівського національного університету імені Івана Франка”
(номер держреєстрації – 0103U008453), а також двох міжнародних
проектів: INTAS – Україна 95-20 “Біотехнологічне вдосконалення
продуцента нового потенційного протипухлинного антибіотика” та BMBF
0311308 „Резистентність до власних антибіотиків у продуцентів
полікетидів” (здобувач – співкерівник проектів). Робота також підтримана
двома індивідуальними грантами Міжнародного фонду „Відродження”
(APU054103 та APU074110).

Мета та завдання дослідження. Метою цієї роботи є встановлення
закономірностей генетичного контролю стійкості актиноміцетів до
антибіотиків, визначення його ролі у біосинтезі антибіотиків, а також
створення на цій основі підходів до конструювання та селекції штамів —
продуцентів цих сполук.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

1) охарактеризувати актиноміцети – продуценти полікетидних антибіотиків
Saccharopolyspora erythraea, Streptomyces peucetius subsp. caesius,
Streptomyces ambofaciens, Streptomyces globisporus, Streptomyces
coelicolor A3(2) та продуцент аміноглікозидного антибіотика канаміцину
Streptomyces kanamyceticus за ознаками стійкості до антибіотиків;

2) вивчити мутаційні зміни ознак стійкості до антибіотиків у вказаних
штамів;

3) картувати мутації генів, що змінюють антибіотикорезистентность та
біосинтез антибіотиків у досліджуваних штамів;

4) дослідити вплив мутацій стійкості актиноміцетів до антибіотиків на
біосинтез полікетидів та канаміцину та оцінити перспективність їх
використання у селекції продуцентів;

5) провести генетичний аналіз синтезу канаміцину та розробити методи
перенесення рекомбінантних ДНК у S. kanamyceticus;

6) клонувати та секвенувати генетичний детермінант стійкості S.
kanamyceticus до аміноглікозидів;

7) клонувати і вивчити кластер генів біосинтезу ландоміцину Е
(lnd-генів) S. globisporus 1912, розробити методи клонування ДНК у цьому
штамі та спрямованої інактивації lnd-генів;

8) на основі отриманих даних про генетичний контроль біосинтезу
антибіотиків та стійкості до них опрацювати способи генетичного та
генно-інженерне конструювання штамів з підвищеним синтезом антибіотиків
та зміненим спектром синтезованих сполук.

Об’єкт дослідження: генетичний контроль стійкості актиноміцетів до
антибіотиків та синтезу антибіотиків. У роботі використано штами
актиноміцетів – продуценти антибіотиків медичного призначення
еритроміцину – Sacch. erythraea, канаміцину – S. kanamyceticus,
доксорубіцину та даунорубіцину – S. peucetius subsp. caesius,
спіраміцину – S. ambofaciens, S. globisporus — продуцент протипухлинного
антибіотика ландоміцину Е, а також S. сoelicolor A3(2) та S. lividans
66, які є модельними об’єктами генетики актиноміцетів.

Предмет дослідження: гени, що контролюють стійкість актиноміцетів до
антибіотиків та гени біосинтезу цих сполук.

Методи дослідження: мікробіологічні (культивування штамів актиноміцетів
та аналіз їхніх ознак), біохімічні (очищення, кількісний та якісний
аналіз антибіотиків), генетичні (отримання та генетичне картування
мутацій, генетична трансформація клітин Escherichia coli та протопластів
актиноміцетів, кон’югаційні схрещування між E. coli та актиноміцетами),
генно-інженерні (виділення та рестрикційний аналіз сумарної та
плазмідної ДНК, конструювання рекомбінантних молекул ДНК,
гель-електрофорез ДНК, ДНК-ДНК гібридизація, полімеразна ланцюгова
реакція, cеквенування ДНК).

Наукова новизна отриманих результатів. Показано, що актиноміцетам
притаманна множинна зміна ознак резистентності до антибіотиків. У геномі
модельного об’єкту генетики актиноміцетів S. coelicolor A3(2) вперше
виявлено послідовності ДНК, здатні до ампліфікації. Отримано та вивчено
колекції мутантів продуцента еритроміцину Sacch. erythraea, стійких до
рифампіцину (RifR), хлорамфеніколу (CmlR), тіострептону (TsrR) та
стрептоміцину (StrR) та вивчено вплив цих мутацій на біосинтез
еритроміцину. Показано хромосомну локалізацію мутацій стійкості Sacch.
erythraea до рифампіцину та хлорамфеніколу. Виділено та вивчено колекцію
мутантів продуцента даунорубіцину та доксорубіцину S. peucetius
subsp.сaesius, стійких до власних антибіотиків (DnrR та DxrR).
Досліджено вплив цих мутацій на біосинтез антрациклінових антибіотиків
та здатність мутантів до перетворення екзогенного даунорубіцину у
доксорубіцин. Створено бібліотеку геному продуцента протипухлинного
антибіотика ландоміцину Е S. globisporus 1912, клоновано та секвеновано
кластер генів біосинтезу ландоміцину Е (lnd-кластер), в якому
ідентифіковані 30 генів та визначено їхні ймовірні функції. Виявлено
регуляторний ген lndI, що кодує активатор транскрипції структурних генів
біосинтезу ландоміцинів. На основі кон’югативної інтегративної плазміди
pSET152 створено векторну систему для „нокаутів” генів lnd-кластера або
ж заміщення цих генів їх мутантними алелями. У дослідах з інактивації
гена lndA отримано прямі докази участі lnd-генів у контролі синтезу
ландоміцину Е у S. globisporus 1912. Сконструйовано штами S. globisporus
1912, що синтезують нові ландоміцини F, G та H зі змінами у агліконовій
частині молекули та показано залежність протипухлинної активності
ландоміцинів від їх структури.

Вперше отримано і досліджено колекції генетично маркованих штамів
продуцента канаміцину S. kanamyceticus та його мутантів з порушеннями
різних етапів біосинтезу канаміцину, а також зі зміненою стійкістю до
аміноглікозидних антибіотиків. Ідентифіковано п’ять класів мутацій
окремих генів, що контролюють продукцію канаміцину. Продемонстровано
генетичну рекомбінацію після злиття протопластів S. kanamyceticus та
показано зчепленість мутацій, що порушують різні етапи синтезу
канаміцину з мутаціями стійкості S. kanamyceticus до деяких
антибіотиків. Клоновано та секвеновано ген ймовірної метилази 16S рРНК
kmrB, що визначає стійкість штаму S. kanamyceticus до канаміцину,
гентаміцину, тобраміцину та сизоміцину. Визначено розміри хромосомної
ДНК S. kanamyceticus та виявлено її перебудови у мутантів, стійких до
аміноглікозидів. Розроблено систему перенесення реплікативних та
інтегративних плазмід у клітини продуцента канаміцину S. kanamyceticus
за допомогою кон’югаційних схрещувань з E. coli. Клоновано та
секвеновано ділянки хромосоми S. kanamyceticus, що прилягають до сайтів
інтеграції кон’югативної векторної плазміди pSET152.

Практичне значення отриманих результатів полягає у можливості їх
використання у конструюванні та селекції актиноміцетів – продуцентів
антибіотиків. Показано, що отримання мутантів, резистентних до
антибіотиків (RifR-, CmlR-, TsrR- та StrR- мутантів у Sacch. erythraea,
DnrR- та DxrR-мутантів S. peucetius subsp.сaesius, гентаміцин-стійких
мутантів S. kanamyceticus) є ефективним методом селекції цих
продуцентів. Визначено класи стійких мутантів, найбільш перспективні
для селекції, та способи їх підтримуючої селекції. Показано, що злиття
протопластів та відбір рекомбінантів, що поєднують мутації стійкості до
антибіотиків рифампіцину, стрептоміцину та тіострептону може
використовуватися в селекції штамів Sacch. erythraea. Встановлено, що
мутанти з порушеною глюкозною репресією є перспективними для селекції
S. peucetius subsp.сaesius та S. kanamyceticus, що скерована на
підвищений синтез антрациклінів та канаміцину, відповідно. Отримані у
роботі DnrR – мутанти а також рекомбінантні штами S. peucetius
subsp.caesius з клонованими генами dnrI та cpx можуть бути використані
для трансформації даунорубіцину в більш цінний протипухлинний
антибіотик –доксорубіцин (на цей спосіб отриманий патент України на
винахід 50047А, здобувач – співавтор винаходу). Штами S. globisporus, в
яких клоновані додаткові копії регуляторного гена lndI можуть
використовуватися як надпродуценти ландоміцинів (на цей спосіб отриманий
патент України на винахід 62200А, здобувач – співавтор винаходу).
Клоновані lnd-гени S. globisporus та розроблена у роботі система їх
спрямованої інактивації, може бути використана у комбінаторному
біосинтезі нових ландоміцинів та інших ангуциклінів з поліпшеними
протипухлинними властивостями. Розрахункова модель виробництва
ландоміцину Е на основі отриманих в роботі штамів, опрацьована спільно
із спеціалістами НУ „Львівська політехніка” [Сидоров та ін., 2003],
показала високу рентабельність цього виробництва та значно меншу
вартість продукту порівняно з імпортними аналогами протипухлинних
ароматичних полікетидних антибіотиків.

Штами актиноміцетів та інших бактерій, які були об’єктами дисертаційної
роботи, стали основою Колекції культур мікроорганізмів – продуцентів
антибіотиків ЛНУ ім. І.Франка (здобувач – науковий керівник Колекції).
Згідно розпорядження Кабінету міністрів України від 19 серпня 2002 року
за №472-р вона включена до Державного реєстру наукових об’єктів, що
становлять національне надбання України. Розроблені у ході виконання
роботи методи, сконструйовані штами та плазміди використовуються у
навчальному процесі на кафедрі генетики та біотехнології на великому
практикумі з генетики та генетичної інженерії бактерій, а також під час
виконання студентами дипломних та курсових робіт.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота була спланована та
виконана автором в основному самостійно. Ідеї, гіпотези та теоретичні
концепції роботи належать здобувачеві. Ряд штамів та плазмід,
використаних у роботі, сконструйовано автором самостійно, або ж отримано
іншими співробітниками та аспірантами за схемами, запропонованими
автором. Дослідження генетичного контролю біосинтезу еритроміцину у
Sacch. erythraea та стійкості його до антибіотиків проводилось у
співпраці з співробітниками НДЛ-45, кандидатами біологічних наук
Настасяком І.М., Басілією Л.І. та Кириченко Н.В., генетичної
нестабільності у S. coelicolor A3(2) та Sacch.erythraea – з асп. (тепер
– канд.біол.наук) Заворотною С.А., генетичного контролю біосинтезу
канаміцину у S. kanamyceticus – зі здобувачем (тепер – канд.біол.наук)
Голець Л.М., генетичного контролю стійкості S. kanamyceticus до
антибіотиків – з асп. (тепер – канд.біол.наук) Демидчук Ю.О.,
генетичного конструювання та селекції продуцента антибіотиків
доксорубіцину та даунорубіцину S. peucetius subsp.caesius — з асп.
(тепер – канд.біол.наук) Дубицькою Л.П., генетичного контролю синтезу
ландоміцину Е у S.globisporus та його стійкості до антибіотиків – з асп.
(тепер – канд.біол.наук) Осташем Б.О., м.н.с. Громиком О.М., асп.
Панькевич К.О, та асп. Ребцем Ю.В., з розробки систем клонування генів у
штамах S. kanamyceticus та S. globisporus – з асп. (тепер –
канд.біол.наук) Лужецьким А.М. Дослідження генетичної нестабільності у
S. coelicolor A3(2) та Sacch. erythraea проводилося у співпраці з проф.
Даниленком В.М. (ДНЦ антибіотиків, Москва, Росія). Секвенування генів
біосинтезу ландоміцину Е S. globisporus проводилося у співпраці з д-ром
Крюгелем Г. (Ганс Кноль Інститут дослідження природних сполук, Ієна,
ФРН), проф. Бехтольдом А. (Фрайбурзький університет, ФРН) та проф.
Саласом Х.А. (Університет м.Ов’єдо, Іспанія). Структурний аналіз та
визначення протипухлинної активності ландоміцинів здійснювався у
співпраці з проф. Рором Ю. (Університет штату Кентуккі, США).

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались на
таких вітчизняних та міжнародних конференціях, симпозіумах, з’їздах та
конгресах: Всесоюзній конференції “Новые направления биотехнологии”
(Пущино-на-Оці, 1984), V, VI та VII з’їздах Українського товариства
генетиків і селекціонерів ім.М.Вавилова (Умань, 1986; Полтава, 1992;
Пісочне, АРК, 2002), Всесоюзному семінарі „Современные проблемы
антибиотикорезистентности” (Москва, 1988); Всесоюзній конференції
„Результаты и перспективы научных исследований по биотехнологии и
фармакологии” (Ленінград, 1989); Міжнародному симпозіумі “Genetics and
product formation in Streptomyces” (Ерфурт, 1990); 7 Національній
конференції з виробництва та застосування антибіотиків (Разград,
1990); VI та VII Міжнародних симпозіумах з генетики промислових
мікроорганізмів (Страсбург, 1990; Монреаль, 1994); VIII, IX, X та ХІІ
Міжнародних симпозіумах з біології актиноміцетів (Медісон, 1991; Москва,
1994; Пекін, 1997; Ванкувер, 2001); І та ІІ Всесоюзній планово-звітній
конференції “Генная и клеточная инженерия” (Пущино-на-Оці, 1991,1992);
Конференціях виконавців НТП Держкомітету СРСР з народної освіти „Новая
медицинская техника и медицинские препараты” (Ленінград, 1990, Харків,
1990, Львів, 1991), І Установчому (VIII) та ІІ з’їздах Українського
мікробіологічного товариства (Одеса, 1993; Чернігів, 2000), VII та VIII
Європейських біотехнологічних конгресах (Ніцца, 1995; Будапешт, 1997);
Конференції “Beijerinck centennial microbial physiology and gene
regulation: emerging principles and application” (Гаага, 1995), VAAM
Workshop “Biologie der Actinomyceten” (Ієна, 1994; Мюнстер, 1995;
Дрезден, 1998); Kонференції керівників наукових проектів, що входять до
координаційного плану Міністерства освіти України (Харків, 1999);
Науково-практичній конференції „Проблеми винахідництва та
раціоналізаторства в Україні” (Львів, 2001), 36 Загальнопольському
симпозіумі „Aktywno?? drobnoustrojow w ro?nych ?rodowiskach” (Краків,
2001); VAAM Workshop “Biologie bacteriellen Naturstoffproducenten”
(Фрайбург, 2002), VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці,
2002); І Всеукраїнській науково-практичній конференції „Біотехнологія.
Наука. Освіта” (Киів, 2003); Міжнародній Вейглівській конференції
„Microorganisms in pathogenesis and their drug resistance” (Львів,
2003), ІІ Крайовому біотехнологічному конгресі (Лодзь, 2003), 16
Мікробіологічному симпозіумі “Advance of microbial science and control
of infectious diseases” (Кіото, 2003), 76 Конференції Японського
біохімічного товариства (Йокогама, 2003), Наукових конференціях ЛНУ
ім.І.Франка.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 91 роботу, у тому числі 38
статей в фахових наукових журналах, 3 статті в збірниках наукових праць,
3 патенти України та 48 тез доповідей на конгресах, конференціях,
симпозіумах та з’їздах.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду
літератури, експериментальної частини (матеріалів і методів досліджень,
результатів та їх обговорення) та списку використаних джерел (490
найменувань). Робота викладена на 512 сторінках машинописного тексту та
проілюстрована 109 рисунками та 73 таблицями. Основна текстова частина
включає 254 сторінки.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури дається характеристика актиноміцетів як об’єктів
генетичних досліджень, висвітлюється сучасний стан проблеми генетичного
контролю біосинтезу антибіотиків, зокрема, полікетидів та
аміноглікозидів. Розглядаються основні механізми стійкості актиноміцетів
до антибіотиків актиноміцетів та їх генетичний контроль. Аналізуються
дані про взаємозв’язок між стійкістю до антибіотиків та їх синтезом а
також шляхи використання генетичних детермінантів
антибіотикорезистентності у селекції актиноміцетів.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

У роботі використали штами Escherichia coli DH5?, KW251, ET12567 та 180
штамів актиноміцетів, у тому числі мутантних, що належать до 19 видів
Streptomyces, Saccharopolysopora та Micromonospora а також 50 плазмід.
Вони отримані автором та його співпрацівниками з кафедри генетики та
біотехнології ЛНУ ім.І.Франка, де виконувалась робота, а також люб’язно
надані колегами з інших установ.

Стійкість штамів актиноміцетів до антибіотиків визначали, як описано в
роботах [Федоренко и др.,1989; Настасяк и др., 1990; Демидчук и др.,
1996].

Антибіотичну активність досліджуваних штамів визначали методом дифузії в
агар із використанням тест-культур Bacillus mycoides HB2 та
Streptomyces albus CEST113.

Тонкошарову хроматографію (ТШХ) та кількісне визначення антибіотиків
проводили за такими методиками: канаміцинів [Голец и др., 1997],
еритроміцинів [Weber et al., 1985], спіраміцинів [Richardson et al.,
1990], антрациклінів [Segura et al., 1997]. ТШХ, високоефективну
рідинну хроматогафію (ВЕРХ) та спектральний аналіз ландоміцинів
проводили згідно [Henkel et al., 1990; Мацелюх та співавт., 1999].

Визначення ефективності перетворення екзогенного даунорубіцину в
доксорубіцин проводили згідно [Dickens et al.,1996].

Концентрацію білку визначали за методом Лоурі [Lowry, 1951].

Утилізацію глюкози штамами актиноміцетів визначали ферментативним
методом за допомогою діагностичного набору „Діаглюк” виробництва
Львівського заводу лікарських препаратів.

Штами актиноміцетів обробляли ультрафіолетом (УФ),
N-метил-N’-нітро-N-нітрозогуанідином (НГ), N-етил-N-нітрозосечовиною,
N-метил-N-нітрозо-сечовиною (МНС), 5,8-динітробензпериленом за
методиками [Hopwood et al., 1985; Настасяк и др., 1990; Голец и др.,
1995].

Виділення й аналіз ауксотрофних мутантів актиноміцетів та мутантів з
порушеннями біосинтезу антибіотиків проводили за методиками [Hopwood et
al., 1985; Kieser et al., 2000], а здатність мутантів до косинтезу
антибіотиків перевіряли за методам [Weber et al., 1985]. Мутанти
актиноміцетів зі зміненою стійкістю до антибіотиків виділяли за
методами, описаними в роботах [Федоренко, Даниленко, 1980; Настасяк и
др., 1990, Заворотная и др., 1990]. Мутанти актиноміцетів, стійкі до
2-дезокси-D-глюкози, виділяли за методом [Hodgson, 1982].

Виділення, регенерацію та злиття протопластів актиноміцетів проводили
за методами [Hopwood et al., 1985; Kieser et al., 2000]

Кон’югаційні схрещування актиноміцетів, їх схрещування за
допомогою злиття протопластів та аналіз отриманих рекомбінантів
проводили за методиками [Hopwood et al., 1985; Kieser et al., 2000].

Кон’югаційні схрещування між E. coli та штамами Streptomyces проводили
згідно методики, описаної в роботі [Лужецький та співавт., 2000].

Трансформацію протопластів актиноміцетів виконували за методикою
[Hopwood et al., 1985; Kieser et al., 2000].

Отримання компетентних клітин E. coli та їх трансформацію проводили за
методикою [Sambrook et al., 1999].

Генно-інженерні маніпуляції з ДНК (виділення сумарної та плазмідної
ДНК, е л е к т р о ф о р е з Д Н К в а г а р о з н о м у г ел і т
а е л ю ю в а н н я ф р а г м е н т і в Д Н К, рестрикційний
аналіз ДНК та обробку ДНК фрагментом Кленова, лужною фосфатазою та
Т4-ДНК-полімеразою а також лігування ДНК-лігазою фага Т4, ДНК-ДНК
гібридизацію, полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР), визначення
послідовності нуклеотидів у ДНК проводили згідно методик [Hopwood et
al., 1985; Kieser et al., 2000; Sambrook et al., 1999].
Пульс-електрофорез хромосомної ДНК штамів S. kanamyceticus проводили,
як описано в роботі [Федоренко и др.,1998]. Аналіз нуклеотидних та
ймовірних амінокислотних послідовностей виконували за допомогою
комп’ютерних програм BLAST 2.0, CODONPREFERENCE, REFLECTION, NEBCUTTER,
TRANSLATE, PILEUP BOXSHADE та CLUSTAL W [Altschul et al.,1997].

Статистичну обробку результатів здійснювали за допомогою програми
STATGRAFIC та електронних таблиць Мicrosoft Excel 2000. Кореляційний
аналіз виконували, як описано [Жукова и др., 1978; Лакин, 1980].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Генетичний контроль стійкості до антибіотиків та його вплив
на антибіотикоутворення в актиноміцетів – продуцентів полікетидів.
Визначено спектри та рівні стійкості до антибіотиків 16 штамів
актиноміцетів — продуцентів полікетидних антибіотиків актинородину (S.
coelicolor A3(2), S. lividans 66), макролідів (Sacch. erythraea
NRLL2338, S. ambofaciens ATCC23877, S. fradiae B-45, S. antibioticus
OL71), антрациклінів (S. peucetius subsp.caesius АТСС27952, S. peucetius
ATCC29050, S. nogalater IMET43360 та S. galilaeus НKI022), ангуциклінів
(S. globisporus 1912, S. cyanogenus S136 та S. fradiae Tu2717),
тетрациклінів (S. rimosus 183, S. aureofaciens 019(8) та мітоміцину С
(S. caespitosus IMET43411). Більшості з них властива природна стійкість
як до власного, так і інших антибіотиків переважно у невисоких
концентраціях. Для кожного виду актиноміцетів характерний певний спектр
множинної антибіотикорезистентності. Виявлено спільні особливості
спектрів резистентності, властиві для переважної більшості вказаних
штамів. Вони стійкі до ?-лактамних антибіотиків та поліміксину, помірно
чутливі до тетрацикліну та макролідів. Найбільшу чутливість актиноміцети
виявляють до аміноглікозидів, антрациклінів, тіострептону та
ристоміцину. Великою є різниця між дослідженими штамами за стійкістю до
рифампіцину (у 40 – 100 разів) та хлорамфеніколу (у 10 – 20 разів).
Серед штамів виявлено як стійкі до високих концентрацій власного
антибіотика (наприклад, Sach. erythraea), так і чутливі до власних
антибіотиків (наприклад, S. peucetius subsp.caesius) (рис.1). У різних
похідних одного виду, що отримані у результаті селекції на підвищену
продукцію антибіотиків, або ж мутантів, що їх не синтезують, а також у
морфологічних варіантів одного виду спостерігаються відміни у вияві
ознак стійкості як до власного, так і до інших антибіотиків (різниця у
рівнях стійкості, зміна конститутивного характеру вияву
антибіотикорезистентності на індуцибельний). Це вказує на важливість
індивідуального аналізу ознак резистентності до антибіотиків кожного з
досліджуваних штамів актиноміцетів.

Показано, що для S. coelicolor A3(2) та S. ambofaciens
характерна множинна зміна ознак резистентності до антибіотиків,
асоційована з нестабільністю фенотипу природної хлорамфенікол-стійкості
(CmlR). Визначено особливості генетичної нестабільності ознак стійкості
до антибіотиків у досліджених актиноміцетів. Мутанти за однією ознакою
(хлорамфенікол-чутливі, CmlS) та CmlSRmnS –мутанти (чутливі також й до
ристоміцину) можуть виявлятися з близькими частотами. Незалежні CmlS- та
CmlSRmnS-мутанти значно різняться між собою за рівнем чутливості до
антибіотиків та частотою утворення резистентних ревертантів. У
ревертантів повернення до вихідного фенотипу резистентності не
спостерігається (CmlR*-фенотип). У спонтанних CmlS-мутантів S.
coelicolor A3(2) підвищена нестабільність зчепленого детермінанта
стійкості до ристоміцину (мутанти CmlSRmnS виникають з частотою 5-7%).
Це властиве й для CmlR*-ревертантів. Нестабільність може виявлятися
також й в появі з високою частотою спонтанних мутантів із підвищеною
стійкістю, які отримуються за допомогою ступінчастого відбору на
середовищах із зростаючими концентраціями антибіотика. Опромінення
ультрафіолетом (УФ) індукує нестабільність генетичного детермінанта
хлорамфенікол-резистентності S. coelicolor A3(2). У присутності кофеїну
– інгібітора систем репарації бактерій, схильних до помилок [Coyne et
al.,1984; Hromic, Kirby, 1989] значно знижується частота появи
CmlS-мутантів. Ці факти свідчить про те, що системи репарації
УФ-пошкоджень можуть бути складовою частиною механізмів генетичної
нестабільності актиноміцетів. Отримано дані про стабілізацію рівня
синтезу спіраміцину в CmlR-мутантів і перспективність їх використання у
селекції S.ambofaciens.

Рестрикційний аналіз сумарної ДНК дозволив виявити в геномах
CmlR* -мутантів S. coelicolor A3(2) (наприклад cmlR103, рис.2) дві
послідовності, здатні до ампліфікації: AUD-ScI (близько 15 т.п.н. та 50
копій на геном) й AUD-ScII (близько 20 т.п.н. та 40 копій на геном).
Вісім ампліфікованих послідовностей ДНК розміром від 2,8 до 25 т.п.н.
виявлено в геномах штамів S.ambofaciens. Ці дані показують, що
нестабільність ознак резистентності актиноміцетів до антибіотиків може
супроводжуватися значними перебудовами їхніх геномів.

+2?. Порівняно з окремими клонами штаму 5, незалежні StrR-мутанти мають
вищий (на 22,7%) середній рівень біосинтезу. Значно зросла (на 12%)
частка «плюс»-варіантів серед StrR-мутантів. 57% досліжених
CmlR–мутантів (стійкі переважно до 20-40 мкг/мл хлорамфеніколу)
синтезують більше еритроміцину, ніж вихідний штам. Натомість найвищий
середній рівень синтезу еритроміцину (140,6±8,9%) та найбільша частка
„плюс”-варіантів (20,0%) спостерігається у спонтанних TsrR – мутантів,
відібраних на середовищі з 2,5 мкг/мл тіострептону (табл.1).

Це свідчить, що отримання RifR-, CmlR-, TsrR- та StrR- мутантів може
бути одним з етапів селекції Sacch. erythraea. Лише певні класи
стійких мутантів перспективні для селекції. Важливе значення має те, що
відбір таких резистентних мутантів ефективний стосовно тих
продуцентів еритроміцину, які вже проходили численні мутагенні обробки
та етапи селекції на підвищений синтез антибіотика, як, наприклад, штам
Sacch. erythraea 5. Фенотипи CmlR-, TsrR- та StrR є нестабільними. Існує
кореляція між втратою у неселективних умовах ознак підвищеної стійкості
до антибіотиків та підвищеного синтезу еритроміцину. Визначені умови
підтримуючої селекції RifR-, CmlR-, TsrR- та StrR – мутантів з високим
рівнем синтезу антибіотика.

Виділено та вивчено колекцію мутантів продуцента даунорубіцину та
доксорубіцину S. peucetius subsp.сaesius, стійких до власних
антибіотиків. Серед них є мутанти, що перевищують вихідний штам за
рівнем біосинтезу антибіотиків, а також й такі, в яких змінений спектр
утворюваних антрациклінів. Отримані дані свідчать про можливість
використання мутантів,

Таблиця 1.

Мінливість рівня синтезу еритроміцину у мутантів Sacch. erythraea,
стійких до тіострептону

-2()

Контроль – 100,0 3,9 36,1 0,9(0,02 0,3(0,03

Контроль + 88,1(3,0 4,0 40,6 2,9(0,8 16,2(3,5

2,5 – 140,6(8,9 3,8 26,7 20,0(3,7 0

2,5 + 113,9(2,9 3,6 31,3 3,2(0,4 1,9(0,1

5,0 + 125,7(6,9 3,2 25,8 4,0(0,9 0

стійких до даунорубіцину (DnrR) i доксорубіцину (DxrR), у селекції S.
peucetius subsp.сaesius. Встановлено, що серед DnrR-мутантів доцільно
вести пошук штамів із підвищеною продукцією доксорубіцину, а
DxrR-мутанти перспективні для відбору продуцентів обох антибіотиків.

2. Клонування і вивчення кластера генів біосинтезу
ландоміцину Е S. globisporus 1912. Для конструювання геномної
бібліотеки S. globisporus 1912 його сумарну ДНК піддали частковому
розщепленню ендонуклеазою рестрикції BamHI. Отримані фрагменти клонували
у вектор ?Gem11, а рекомбінантні ДНК пакували in vitro у фагові
частинки, якими інфікували штам E.coli KW251. Скринінг бібліотеки за
допомогою гібридизації з зондом (250 п.н., отриманий як продукт ПЛР —
фрагмент гена ?-кетоацилсинтази S. globisporus 1912), „прогулянки” по
хромосомі та „short-gun” – секвенування дозволили виявити кластер генів
біосинтезу ландоміцину Е (lnd-генів). У ньому ідентифіковано 30 генів та
визначені їх ймовірні функції (рис.4). Виходячи з даних множинного
порівняння нуклеотидних послідовностей, ми припустили, що гени
мінімальної ПКС lndA, lndB, lndC та ген голо-АПБ-синтази lndZ6
контролюють синтез лінійного полікетидного ланцюга. Гени lndF та lndL
кодують полікетидциклази, що забезпечують згортання та циклізацію
полікетиду. Гени редуктаз lndD, lndN, lndO, lndV, lndZ4 контролюють
відновлення ландоміцинону. Гени оксигеназ lndE, lndM та lndZ5
контролюють окиснення циклізованого попередника ландоміцинону, а гени
lndG, lndH, lndQ, lndR, lndS, lndT, lndZ1 та lndZ3 кодують білки
біосинтезу дезоксицукрів. Приєднання цукрів до ландоміцинону
контролюється генами lndGT1, lndGT2, lndGT4. Ген lndJ кодує ймовірний
детермінант стійкості до ландоміцину Е, а lndI – транскрипційний
активатор lnd-генів. Ген lndP кодує декарбоксилазу, що може брати участь
у декарбоксилюванні залишків малоніл-КоА під час кетосинтазної реакції,
або відщепленні карбоксильної групи ландоміцинону. Роль генів lndU та
lndX у синтезі ландоміцину не зрозуміла. Кластер фланкований генами
tmk1, prx1, stk1, які, очевидно, беруть участь у процесах первинного
метаболізму. Повністю секвеновані гени lndI, lndF, lndM і lndGT4. Ген
lndI ідентифікований як ORF розміром 783 п.н. Його ймовірний продукт
LndI подібний до ряду білків — транскрипційних регуляторів, що входять
до родини SARP. У мутантів S. globisporus LND900 та LND901 із делеціями,
що захоплюють ген lndI, повністю припиняється синтез антибіотика. Крім
того, спрямована його інактивація має такий самий ефект, а
комплементація отриманих мутантів клонованим lndI або ж його гомологом
lanI з S. cyanogenus S136 відновлює біосинтез. Ген lndF локалізований
між генами lndЕ та lndА як orf завдовжки 330 п.н. Його продуктом є
циклаза 3-го та 4-го кілець ландоміценону. Виявлено дуже висока
подібність (більше 80%) білка LndF до гомологічних циклаз, задіяних у
біосинтезі інших ангуциклічних антибіотиків. Стартовий кодон гена lndM
(ATG) відділений від стоп-кодону гена lndL лише 1 п.н. Перший
“стоп”-кодон у рамці зчитування (TGA) локалізований на віддалі 1539 п.н.
у 3?-напрямі від ініціаторного кодону. З результатів множинного
порівняння з генами інших оксигеназ випливає, що його продукт
гідроксилює карбон С6 третього кільця попередника ландоміцинону. Кодуюча
частина гена lndGT4 розпочинається “старт”-кодоном ATG, якому передує
ймовірний рибосомозв’язуючий сайт (AGAA), за 5 п.н. до “старт”-кодону.
Перший “стоп”-кодон у рамці зчитування (TGA) локалізований на віддалі
1251 п.н. в 3?-напрямі від ініціаторного кодону. Продуктом гена є
родинозил-трансфераза, що каталізує приєднання залишку L-родинози під
час синтезу ландоміцину Е. Цей висновок підтверджений даними отриманими
за допомогою заміщення гена lndGT4 на його мутантний алель lndGT4::aadA
(aadA — ген стійкості до спектиноміцину). На основі кон’югативної
інтегративної плазміди pSET152 pозроблена векторна система для заміщення
чи інсерційної інактивації генів lnd-кластера. Сконструйовано плазміду
pNKN, що містить дві ділянки гомології до lnd-генів розміром по 2,7
т.п.н., які оточують ген канаміцин-стійкості aphII. Цю плазміду
перенесли у штам S. globisporus та виділили похідні із заміщенням гена
lndA на aphII. Це призвело до припинення синтезу ландоміцину Е. У такий
спосіб отримано прямі докази участі клонованого кластера у контролі
біосинтезу ландоміцину Е (рис.5).

3. Генетичне та генно-інженерне конструювання актиноміцетів –
продуцентів полікетидів. Результати, наведені вище, дозволили розробити
ряд генетичних та генно-інженерних підходів до конструювання
актиноміцетів – продуцентів полікетидів, які були об’єктами нашого
дослідження. До них належать: а) отримання генетичних рекомбінантів
Sacch. erythraea з підвищеним рівнем синтезу еритроміцину за допомогою
злиття протопластів; б) виділення та використання у селекції продуцента
доксорубіцину S. peucetius subsp.caesius мутантів з порушеною глюкозною
репресією; в) отримання штамів S. peucetius subsp.caesius з підвищеною
здатністю до перетворення даунорубіцину в доксорубіцин; г) виділення
штамів S. globisporus — продуцентів нових ландоміцинів за допомогою
спрямованого руйнування певних генів їхнього біосинтезу.

Ми порівняли утворення генетичних рекомбінантів у кон’югаційних
схрещуваннях та після злиття протопластів двох штамів Sacch. erythraea:
1346 leu1 ura1 та 2407 met1 trp3 phe1. Частота гаплоїдних рекомбінантів,
отриманих у кон’югаційних схрещуваннях, варіює від (6,4(0,2)(10-6 до
(2,1(0,5)(10-3. Частота рекомбінантів усіх виділених класів, які виникли
внаслідок злиття протопластів, значно вища (в 10 — 460 разів для різних
класів рекомбінантів), порівняно з кон’югацією. Більшою є й
різноманітність їхніх генотипів. Як генетичні маркери для схрещування
штамів Sacch. erythraea, які вже пройшли селекцію на підвищений синтез
еритроміцину, ми використали мутації стійкості до антибіотиків
рифампіцину (rif), тіострептону (tsr) та стрептоміцину (str). Показано,
що злиття протопластів та відбір рекомбінантів, що поєднують rif-, str-
та tsr-мутації є ефективним методом селекції штамів Sacch. erythraea з
підвищеним рівнем синтезу еритроміцину. Найбільша мінливість за рівнем
синтезу еритроміцину спостерігається серед рекомбінантів, отриманих
після злиття протопластів мутантів, що походять від штамів, які пройшли
незалежну селекцію – strR31 та rifR621. Серед них й найбільша частка
клонів із високим рівнем ((180% від контролю) синтезу еритроміцину —
40%.

$

:

P

¦

u

>

@

b

f

6

8

:

T

¦

O

U

Ue

TH

a

o

ue

ue

@

®

a$

?

?

?

?

¬

1/4

3/4

iaaaa*C···aaaa§§›

A АТСС 27952-2 пригнічується у присутності 2% глюкози в повноцінних
середовищах, що містять альтернативні джерела вуглецю. Виділені та
досліджені мутанти цього штама, здатні рости в повноцінних середовищах з
2% глюкози (glr-мутанти). Ці мутанти утилізують глюкозу повільніше, ніж
вихідний штам, а біосинтез антрациклінів у них менше підлягає глюкозній
репресії. Показано, що виділення glr-мутантів може бути одним з етапів
селекції S.peucetius subsp. сaesius, скерованої на підвищений синтез
антрациклінів.

Отримані трансформанти та S. peucetius subsp.caesius ATCC 27952-2, що
містять у висококопійній плазміді pIJ486 гени dnrI (гомолог гена —
активатора біосинтезу антрациклінів у S. peucetius ) та cpx (гомолог
гена doxA S. peucetius, що кодує цитохром Р450-вмісну гідроксилазу
даунорубіцину) з іншого продуцента антрациклінів S. griseus IMET3339. Ці
трансформанти синтезують більше антрациклінів та мають підвищену
здатність до перетворення екзогенного даунорубіцину в доксорубіцин. Така
здатність властива також й DnrR-мутантам S. peucetius subsp.caesius.
Показано, що ці мутанти, як й трансформанти pIJ486 dnrIcpx+, можуть
використовуватися для перетворенння даунорубіцину у більш цінний у
терапевтичному відношенні доксорубіцин.

На основі нереплікативного вектора pTNK сконструйована плазміда pTGT4.3,
що несе зруйнований алель гена lndGT4::aadA (aadA – ген стійкості до
спектиноміцину) та ділянки гомології, що його фланкують, розміром 4,7 та
4,4 т.п.н. За допомогою кон’югації pTGT4.3 ввели в клітини S.
globisporus 1912 та виділили штам GT4.1 в якому ген lndGT4 заміщений на
його мутантний алель. Інактивація гена lndGT4 зумовлює продукцію
рекомбінантним штамом нових ландоміцинів F та H (містять, відповідно,
моно- та дисахаридний залишки). Експресія генів lndGT4 або lаnGT4 у
мутанті GT4.1 призвела до продукції ландоміцину G (містить
трисахаридний залишок) (рис.6). У цих сполуках відсутня гідроксильна
група у положенні С11. У 3(-напрямі від lndGT4 розташовані гени
редуктази lndZ4, гідроксилази lndZ5 та голо-АПБ-синтази lndZ6. У
комплементаційних тестах з(ясовано, що експресія генів lndGT4Z4Z5 є
достатньою для відновлення синтезу мутантом GT4.1 ландоміцину E.
Експресія генів lndZ4Z5 в ньому відновлює синтез ландоміцину D (містить
лише два залишки D-оливози). Експресія lndZ5 у GT4.1 не змінює спектру
синтезованих ним сполук. Отже, у мутанті GT4.1 пошкоджена експресія
також й генів lndZ4, lndZ5 (очевидно, за рахунок полярного ефекту
мутації в lndGT4). Зроблено висновок, що ген lndGT4 контролює приєднання
залишку L-родинози, а гени lndZ4Z5 — гідроксилювання першого кільця
ландоміцинів. Ландоміцини G, F та H є першими ландоміцинами зі зміненим
агліконом. Ці нові сполуки відрізняються за антибактерійними та
протипухлинними властивостями від раніше відомих ландоміцинів.
Проведені дослідження закладають основу для розвитку комбінаторного
біосинтезу ландоміцинів та встановлення взаємозв’язків між їх структурою
та біологічною дією.

Розроблені підходи доповнюють традиційні схеми селекції вказаних
продуцентів і дозволяють більш раціонально проводити селекцію,
враховуючи особливості генетичного контролю біосинтезу антибіотиків та
стійкості продуцентів до них.

4. Генетичний контроль біосинтезу канаміцину та стійкості до
аміноглікозидних антибіотиків (АГ) у S. kanamyceticus. Нами
створено колекцію генетично маркованих штамів S. kanamyceticus, яка
нараховує 43 мутанти, з яких 14 мають по два генетичних маркери
ауксотрофності та стійкості до антибіотиків рифампіцину, еритроміцину та
гентаміцину. Це дозволило розпочати генетичний аналіз S. kanamyceticus.
Для ідентифікації генів, які контролюють біосинтез канаміцину, отримані
мутанти S.kanamyceticus з порушеннями цього процесу (Kan-).
Проаналізовано 19555 незалежних клонів S. kanamyceticus, що пройшли
різні мутагенні обробки та виділено 44 Kan- -мутанти. Їх розділили на
три групи: 1) нестабільні мутанти (65% від загальної кількості
отриманих), які у наступних генераціях розщеплюються, утворюючи
Кan- та Кan+-клони; 2) мутанти, які починають синтезувати незначні
кількості канаміцину (до 24 мкг/мл) на 8-12 добу, на відміну від
вихідної культури, яка починає продукувати його на 3-4 добу (10%); 3)
cтабільні Кan—мутанти (25%). За результатами тестів на косинтез
Kan—мутанти віднесено до 4 груп: kanA (I група), kanB (II група),
kanC (III група), kanD (IV група). У всіх досліджених парах
kanD-мутанти є секреторами, тобто шлях біосинтезу канаміцину у них
пошкоджений на пізніших етапах, ніж у їхніх партнерів. Мутанти kanC
є секреторами для мутантів I i II груп, kanB — для мутантів I групи.
Мутанти kanA виступають як конвертори стосовно всіх інших Kan—
штамів. У них порушені більш ранні етапи біосинтезу антибіотика, ніж в
інших мутантів. Біосинтез канаміцину відновлюється у мутантів kanB781,
kanC782, kanB47, якщо додавати у середовище 2-дезоксистрептамін (2-ДОС),
а у kanA472 і kanA106 — D-глюкозамін. У решти штамів біосинтез
канаміцину не відновлюється після додавання обох попередників. У цих
мутантів пошкоджені стадії біосинтезу після утворення 2-ДОС.
Хроматографічний аналіз показав, що стабільні Кan- -штами дійсно не
продукують канаміцину А. Мутант kanC782 не синтезує 2-ДОС, тоді як
kanB47 i kanA106, утворюють його у слідових кількостях. Мутанти kanD131,
kanD581 i kanD38 синтезують в 1,7 — 2,4 разів більше 2-ДОС, ніж штам
дикого типу 1375. Отже, нагромаджуючи 2-ДОС, вони не здатні
перетворювати його у метаболіти, що володіють антибіотичною
активністю. Підтверджено висновок про те, що Кan- -фенотип мутанта
kanA106 зумовлений порушенням синтезу D-глюкозаміну. На відміну від усіх
досліджених Кan- — штамів, у культуральній рідині мутанта kan7 не
виявлено D-канозаміну. На основі отриманих результатів ідентифіковано
п’ять класів мутацій, які виникли в генах, що контролюють продукцію
канаміцину (рис.7). Мутації kanA порушують здатність культури
синтезувати D-глюкозамін, kanB та kanC – 2-ДОС, kanD — перетворювати
2-ДОС у метаболіти, що мають антибіотичну активність, ймовірно,
паромамін, а kanG – синтезувати D-канозамін.

Виділені та вивчені мутанти S. kanamyceticus зі зміненою
регуляцією біосинтезу канаміцину джерелами вуглецю. Штам S.
kanamyceticus 1, якому властивий підвищений синтез антибіотика та
мутант dgr1, стійкий до 2-дезокси-D-глюкози, використовують глюкозу з
поживного середовища повільніше, ніж низькопродуктивний штам 1375.
Біосинтез канаміцину у штама 1 менше підлягає глюкозній репресії, ніж у
штаму дикого типу 1375. Такі ж властивості, але більшою мірою,
властиві мутанту dgr1, який, як й штам 1, має високий рівень синтезу
антибіотика. Ці дані свідчать про перспективність використання мутантів
із порушеною катаболітною репресією у селекції штамів S.
kanamyceticus з підвищеним синтезом канаміцину (рис.8)

У S. kanamyceticus не виявлено природних систем
генетичного обміну. Ми отримали рекомбінанти S. kanamyceticus за
допомогою злиття протопластів. Визначено оптимальні умови утворення та
регенерації протопластів 6 штамів цієї культури – вирощування їхнього
міцелію протягом 60 год у середовищі ST або STM з 0,1-1% гліцину,
використання 2% лізоциму для лізису міцелію та середовища R2YE для
регенерації протопластів. Частоти утворення гаплоїдних рекомбінантів
після злиття протопластів коливалися від 0,4*10-4 до 6,7*10-3.
Проаналізовані схрещування: 1) 781met10 cys2 kanB781 * 92 ade1 eryR1
(232 гаплоїдні рекомбінанти, що належать до 10 генотипових класів); 2)
781met10 cys2 kanB781 * 21ilv1 genR1 (241 рекомбінант, 11 класів); 3)
131his1 tyr1 kanD131 * 4thr1 rifR1 (176 рекомбінантів, 10 класів).
Аналіз рекомбінації між маркерами та сегрегації неселективних алелів
дозволив встановити їх взаємне розташування на генетичній карті.
Спостерігається позитивна кореляція між сегрегацією маркерів kan та ery+
(rA=0,75), kan та rif+ (rA=0,80), kan та gen+ (rA=0,70). Отримані дані
вказують на зчепленість мутацій kanB781 та kanD131, що порушують синтез
канаміцину, з мутаціями стійкості до еритроміцину, гентаміцину та
рифампіцину.

Штами S. kanamyceticus 1375 (дикий тип), 1 (з підвищеним синтезом
канаміцину) та 5 Кan- — мутантів досліджені за ознаками стійкості до
антибіотиків. Їх резистентність до канаміцину є значно вищою, ніж до
інших АГ. Рівень АГ-стійкості штамів корелює з рівнем синтезу
антибіотика та є найвищим у штаму 1. Резистентність S. kanamyceticus до
канаміцину зростає під час росту культури в повноцінних середовищах за
умов, сприятливих для біосинтезу антибіотика. Екзогенні АГ у
концентраціях 10-250 мкг/мл не викликають індукції стійкості S.
kanamyceticus до АГ. Не виявлено глюкозної репресії вияву ознак
резистентності штамів S. kanamyceticus до АГ. Водночас мутанти з
порушеною глюкозною репресією більш чутливі до АГ, ніж вихідний штам
1375.

Створено колекцію АГ-резистентних мутантів S. kanamyceticus 1,
індукованих МНС. Вона нараховує 115 штамів, відібраних як
канаміцин-стійкі (KanR), 105 – як неоміцин-стійкі (NeoR), 100 – як
гентаміцин-стійкі (GenR) та 90 — як апраміцин-стійкі (AprR) мутанти.
Незалежно від способу відбору всі досліджені мутанти мають збільшену
перехресну резистентність й до інших АГ, зокрема, до канаміцину.
Стійкість до гентаміцину GenR-мутантів є конститутивною. Порівняно з
штамом 1 у мутантів змінений вияв стійкості до АГ залежно від
концентрації глюкози у середовищі. Варіабельність рівня синтезу
канаміцину у GenR-, NeoR-, AprR-мутантів вища, ніж у клонів штаму 1,
отриманих після обробки МНС без відбору за ознакою резистентності до АГ.
Для GenR-штамів, на відміну від інших груп АГ-резистентних мутантів,
характерний найвищий середній рівень синтезу канаміцину (108,2% від
рівня штаму 1), найбільша частка (60,6%) таких, що синтезують більше
антибіотика, ніж вихідний штам 1, а також «плюс»-варіантів (9,5%).
Досліджені АГ-резистентні мутанти відрізняються від штаму 1 динамікою
біосинтезу канаміцину.

Ген канаміцин-резистентності з штаму S. kanamyceticus 1 та його GenR
-мутанта genR10 був клонований у висококопійному векторі pIJ702 у S.
lividans 66. У результаті отримали два штами S. lividans з
рекомбінантними плазмідами: а) pIJK12, що несе фрагмент ДНК штаму 1; б)
pIJG31 — ДНК genR10. Рестрикційне картування показало, що обидві
плазміди містять гомологічні гени, позначені як kmrB, у ділянках ДНК
розмірами 4,2 та 6,1 т.п.н., відповідно (рис.9). Ген kmrB зумовлює
стійкість до канаміцину, гентаміцину, тобраміцину та сизоміцину (табл.2)
За рівнем АГ-резистентності трансформанти перевищують штам-донор S.
kanamyceticus 1. Секвенування гена kmrB показало, що він складається з
831 п.н. (стартовий кодон – ATG, термінуючий кодон – TGA). Стартовому
кодону передує потенційна RBS – послідовність (GAGGA), комплементарна
3’-кінцю 16S рРНК S.lividans. Частка G+C пар у першій, другій та третій
позиціях кодонів у гені становить, відповідно, 70, 52 та 92%. Ймовірним
продуктом гена kmrB є метилаза 16S рРНК, оскільки він має високий рівень
гомології з відомими генами метилаз з інших актиноміцетів – продуцентів
АГ. Порівняння ймовірної амінокислотної (ак) послідовності продукту гена
kmrB із вже відомими білками показало, що найвищий ступінь гомології є
з метилазою 16S рРНК продуцента небраміцинового комплексу S. tenebrarius
(ступінь ідентичності ак-послідовностей становить 53,9%, а подібності —
77,9%). Спостерігається подібність визначеної ймовірної ак-послідовності
з метилазами 16S рРНК інших актиноміцетів — продуцентів АГ. Експерименти
з ДНК-ДНК гібридизації за Саузерном клонованого гена kmrB та сумарної
ДНК різних штамів S. kanamyceticus виявили ампліфікації ділянки ДНК, що
містить ген kmrB, у геномі мутантів genR10, genR8, genR8.1. Рівні
ампліфікації та рівні стійкості корелюють. Ампліфікація гена kmrВ
виявлена також й в одного з нестабільних Kan—мутантів — kаn12
(рис.10). Отже, однією з причин підвищеної резистентності мутантів S.
kanamyceticus до АГ є ампліфікація гена kmrB. Ділянки ДНК, що оточують
цей ген, мають гомологію з фрагментами сумарної ДНК продуцента неоміцину
S. fradiae та продуцента сизоміцину Micromonospora zionensis.

Проведено аналіз макрофрагментів хромосомної ДНК 5 штамів S.
kanamyceticus за допомогою пульс-електрофорезу. Показана доцільність
використання протопластів S. kanamyceticus у приготуванні препаратів ДНК
для пульс-електрофорезу. Ідентифіковані 16 AseI- та 12 DraI-фрагментів
хромосомної ДНК штаму 1, розміри яких коливаються від 40 до 1800 т.п.н.
Розміри хромосомної ДНК вивчених штамів S. kanamyceticus становлять від
7715 до 8217 т.п.н.. Виявлені перебудови нуклеотидних послідовностей у
хромосомах мутантів kan12, genR8 та genR10. Порівняно з ДНК вихідного
штаму 1 у kan12 відсутні два AseI-фрагменти – D (98 т.п.н.) та J (220
т.п.н.), натомість є фрагменти J’(297) та K’(450 т.п.н.). У мутантів
genR10 та genR8 відсутній фрагмент К (420 т.п.н.), але з’являється
фрагмент К’. У мутантів kan12, genR10 та genR8 більші розміри
хромосомної ДНК (8217 та по 7818 т.п.н., відповідно), порівняно з
штамом 1 (7788 т.п.н.), що узгоджується з даними про ампліфікацію в них
гена kmrB. Ці результати є вихідними для подальшого фізичного картування
хромосоми S. kanamyceticus, а також вивчення механізмів нестабільності
генома цієї культури.

Таблиця 2.

Стійкість штамів-донорів S. kanamyceticus та штамів-реципієнтів S.
lividans до аміноглікозидних антибіотиків

Штам Плаз-міда

Концентрація антибіотика

у середовищі, до якої

стійкий штам, мкг/мл

Кm Gm Тm Sn Nm Ap Sm Pm

S. kanamyce-

ticus 1

genR10

S. lividans 66

S. lividans 66

S. lividans 66

S. lividans 66

pIJ702

pIJK12

pIJG31

100

1000

<5 <5 1000 >1000

2

100

2

<2 100 >100

15

40

10

10

20

40

5

100

5

5

100

>100

50

50

<10 10 <10 <10 <1 <1 <1 <1 <1 <1 10 5 2 2 <2 <2 2 5 <2 <2 2 <2 Примітка: Km -канаміцин, Gm-гентаміцин, Tm-тобраміцин, Sn-сизоміцин, Nm-неоміцин, Ap-апраміцин, Sm-стрептоміцин, Pm-паромоміцин. Спроби трансформувати протопласти штаму S. kanamyceticus 1 та його мутантів за допомогою ДНК плазмід pIJ702, pWHM4, pTO1 та pSET152 виявилися невдалими. Тому ми розробили систему пренесення ДНК реплікативних (pSOK101, pSOK201 та pCHZ101) та інтегративних (pSET152 та pVWB) плазмід у S. kanamyceticus за допомогою кон’югаційних схрещувань з E. coli ET12567(pUB037). Частота появи транскон’югантів, що містили перелічені вище плазміди становила від 2,2*10-5 до 2,5*10-4. Інтегративні плазміди pSET152 (з геном інтегрази та attP-сайтом фага ?С31) та pVWB (з геном інтегрази та attP-сайтом фага VWB) успадковувались у неселективних умовах з ефективністю 100%. За таких умов менше 20% клонів успадковували реплікативні плазміди. Спостерігається пригнічення синтезу канаміцину у pSET152+- транскон’югантів. Якщо ж використовувати вектор pVWB з відмінною системою інтеграції у хромосому, то синтез антибіотика в екскон’югантів є на рівні вихідного штаму. Досліди з гібридизації фрагментів сумарної ДНК pSET152+-екскон’югантів з міченим PstI-фрагментом pSET152 (800 п.н.) показали, що в хромосомі S. kanamyceticus є два сайти інтеграції цієї плазміди (attB1 та attB2). Клоновано та секвеновано ділянки хромосоми S. kanamyceticus, що прилягають до цих сайтів. У них виявлено 4 ORF, з яких одна – ORF1, ймовірним продуктом якої є білок, що бере участь у конденсації хромосоми штаму, зруйнована інтеграцією pSET152. Розроблена система перенесення реплікативних та інтегративних векторів у S. kanamyceticus та дані про сайти інтеграції pSET152 у хромосому дозволяють застосовувати методи генної інженерії для вивчення та конструювання S. kanamyceticus. Виконаний комплекс досліджень S. kanamyceticus - одного з найважливіших промислових стрептоміцетів, дозволяє застосувати до нього сучасні генетичні та генно-інженерні підходи і розробити на цій основі раціональні підходи до його конструювання й селекції, а також використовувати його як модель для вивчення інших актиноміцетів, що утворюють 2-дезоксистрептамінові аміноглікозидні антибіотики. ВИСНОВКИ У результаті виконаної роботи встановлено закономірності генетичного контролю стійкості актиноміцетів до антибіотиків та вивчено вплив генетичних детермінантів антибіотикорезистентності на біосинтез полікетидних антибіотиків еритроміцину в Sacch. erythraea, спіраміцину в S. ambofaciens, даунорубіцину та доксорубіцину в S. peucetius subsp.caesius, а також аміноглікозидного антибіотика канаміцину в S. kanamyceticus. Обґрунтовано перспективність використання мутацій, що змінюють стійкість актиноміцетів до антибіотиків у селекції штамів з підвищеним синтезом антибіотиків. Показано, що ознаки природної стійкості до антибіотиків можуть розглядатися як модельні для вивчення генетичної нестабільності актиноміцетів а їх виявлення та аналіз є необхідною складовою частиною конструювання та селекції цих бактерій. На основі отриманих результатів опрацьовано підходи до селекції високоактивних продуцентів антибіотиків та створено Колекцію культур мікроорганізмів – продуцентів антибіотиків ЛНУ ім.І.Франка, що включена до Державного реєстру об’єктів, що становлять національне надбання. Головні наукові та практичні результати викладені у таких висновках: 1. Дослідженим штамам актиноміцетів - продуцентам полікетидних антибіотиків та канаміцину властива природна стійкість як до власного, так і інших антибіотиків. Для кожного виду актиноміцетів характерний відмінний спектр множинної антибіотикорезистентності. У різних похідних одного виду, що отримані у результаті селекції на підвищену продукцію антибіотиків, або ж мутантів, що їх не синтезують, а також у морфологічних варіантів одного виду спостерігаються відміни у вияві ознак стійкості як до власного, так і до інших антибіотиків. 2. Охарактеризовано спонтанні та індуковані мутагенами множинні зміни ознак резистентності досліджених штамів актиноміцетів до антибіотиків. У геномі нестабільних мутантів S. coelicolor A3(2) та S. ambofaciens виявлено й охарактеризовано послідовності ДНК, здатні до ампліфікації. 3. Отримано та вивчено колекції мутантів продуцента еритроміцину Sacch. erythraea, стійких до рифампіцину, хлорамфеніколу, тіострептону та стрептоміцину, мутантів продуцента даунорубіцину та доксорубіцину S. peucetius subsp.сaesius, стійких до власних антибіотиків, а також мутантів S. kanamyceticus, стійких до аміноглікозидних антибіотиків. Кожна з груп мутантів є гетерогенною за рівнем стійкості до вказаних антибіотиків, а у значної їх частини змінені інші ознаки, зокрема, синтез антибіотиків. 4. Створено бібліотеку генома продуцента ландоміцину Е S. globisporus 1912, клоновано та частково секвеновано кластер генів біосинтезу ландоміцину Е. У кластері виявлено 30 генів та визначено ймовірні функції 28 з них. Гени lndE, lndF, lndA, lndB, lndC, lndD, lndL, lndM, lndN, lndO, lndP, lndV, lndZ4, lndZ6, lndZ5 контролюють синтез полікетидної частини ландоміцину Е, lndG, lndH, lndQ, lndR, lndS, lndT, lndZ1, lndZ3 – синтез дезоксицукрів, lndGT2, lndGT1, lndGT4 – їхнє приєднання до аглікону, ген lndJ є імовірним детермінантом стійкості до ландоміцину Е, а lndI – регулятором структурних lnd-генів. 5. Отримано і досліджено колекцію мутантів S. kanamyceticus, в яких порушені різні етапи біосинтезу канаміцину та ідентифіковано п’ять класів мутацій генів, що контролюють утворення канаміцину (kanA, kanB, kanC, kanD та kanG). Вперше продемонстровано генетичну рекомбінацію після злиття протопластів S. kanamyceticus. Показано зчепленість мутацій kanB та kanD з мутаціями стійкості до еритроміцину, гентаміцину та рифампіцину. 6. Із штаму S. kanamyceticus 1 та його мутанта genR10 клоновано та секвеновано ген kmrB, що кодує ймовірну метилазу 16S рРНК та зумовлює стійкість до канаміцину, гентаміцину, сизоміцину та тобраміцину. Ділянки ДНК, що оточують ген kmrB, виявляють високий рівень гомології з фрагментами сумарної ДНК продуцента неоміцину S. fradiae та продуцента сизоміцину M. zionensis. 7. За допомогою аналізу макрофрагментів із використанням пульс-електрофорезу визначено розміри хромосомної ДНК п’яти штамів S. kanamyceticus - 7715-8217 т.п.н. Перебудови нуклеотидних послідовностей, а також ампліфікації гена kmrB виявлено у геномах нестабільного Kan- - мутанта kan12 та мутантів genR8 та genR10, стійких до гентаміцину. 8. Створено систему клонування генів у штамах S. kanamyceticus та S. globisporus за допомогою кон’югаційного перенесення плазмід з E. coli. Показано ефективність розробленої системи для спрямованої інактивації lnd-генів S. globisporus. 9. Доведено, що отримання RifR-, CmlR-, TsrR- та StrR-мутантів Sacch. erythraea, CmlR-мутантів S. ambofaciens, DnrR та DxrR –мутантів S. peucetius subsp.caesius, GenR-мутантів S. kanamyceticus може бути одним з етапів селекції відповідних штамів. Злиття протопластів та відбір рекомбінантів, що поєднують rif-, str- та tsr-мутації є ефективним методом селекції штамів Sacch. erythraea. 10. Показано, що у селекції S. kanamyceticus та S. peucetius subsp.caesius можуть використовуватися мутанти з порушеною глюкозною репресією. 11. Клонування генів dnrI та cpx у S. peucetius subsp.caesius дозволяє виділити штами з підвищеною здатністю до перетворення даунорубіцину в доксорубіцин. 12. Спрямована інактивація гена lndGT4 продуцента ландоміцину Е S. globisporus 1912 зумовлює продукцію нових ландоміцинів F та H, а комплементація генетичних порушень у ньому – синтез ландоміцину G. Нові ландоміцини мають змінені антибактерійні та протипухлинні властивості. СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Федоренко В.А., Стародубцева Л.И., Заворотная С.А., Ломовская Н.В., Даниленко В.Н. Характеристика множественного изменения признаков устойчивости к антибиотикам у Streptomyces coelicolor A3(2) // Генетика.–1989.–Т.25. №4.–С.626-634. Настасяк И.Н., Федоренко В.А., Кириченко Н.В., Даниленко В.Н. Получение и характеристика рифампицин-устойчивых мутантов у Streptomyces erythraeus // Антибиот. и химиотер. – 1990. – Т.35,№12.-С.11-13. Заворотная С.А., Федоренко В.А., Даниленко В.Н. Генетическая нестабильность признака стрептомицин-устойчивости у Streptomyces erythraeus // Антибиот. и химиотер. – 1990. – Т.35,№12.-С.18-21. Заворотная С.А., Федоренко В.А.,Стародубцева Л.И., Даниленко В.Н. Амплифицирующаеся последовательности в геноме Streptomyces coelicolor A3(2) // Антибиот. и химиотер. – 1990. – Т.35,№12.-С.21-23. Настасяк И.Н., Заворотная С.А., Кириченко Н.В., Федоренко В.А., Даниленко В.Н. Получение и изучение свойств мутантов Streptomyces erythraeus с измененнной устойчивостью к антибиотикам // Труды ВНИИА.-1992.-Вып.21.-С.39-45. Кириченко Н.В., Настасяк И.Н., Басилия Л.И., Федоренко В.А., Даниленко В.Н. Получение и характеристика генетических рекомбинантов при слиянии протопластов Saccharopolyspora erythraea // Антибиот. и химиотер. – 1993. – Т.38,№1.-С.24-28. Кириченко Н.В., Настасяк И.Н., Басилия Л.И., Захарова Г.М., Федоренко В.А., Даниленко В.Н. Использование слияния протопластов в селекции продуцента эритромицина Saccharopolyspora erythraea // Антибиот. и химиотер. – 1993. – Т.38,№6.-С.3-8. Голец Л.М., Басилия Л.И., Мазепа А.И., Федоренко В.А. Получение и изучение свойств мутантов Streptomyces kanamyceticus с нарушениями биосинтеза канамицина // Антибиот. и химиотер. – 1995. – Т.40,№1.-С.3-7. Голец Л.М., Демидчук Ю.А., Федоренко В.А. Биосинтез канамицина и резистентность к аминогликозидам у мутантов Streptomyces kanamyceticus, устойчивых к 2-дезоксиглюкозе // Антибиот. и химиотер. – 1996. – Т.41,№6.-С.10-14. Демидчук Ю.А., Голец Л.М., Федоренко В.А. Характеристика мутантов Streptomyces kanamyceticus, устойчивых к аминогликозидным антибиотикам // Антибиот. и химиотер. – 1996. – Т.41,№6.-С.15-20. Голец Л.М., Есипов С.Е., Федоренко В.А. Метаболиты, образуемые мутантами Streptomyces kanamyceticus с нарушенным биосинтезом канамицина // Антибиот. и химиотер. – 1997. – Т.42,№4.-С.8-12. Настасяк И.Н., Федоренко В.А., Даниленко В.Н. Получение и характеристика мутантов штамма Saccharopolyspora erythraea, устойчивых к тиострептону // Антибиот. и химиотер. – 1997. – Т.42,№1.-С.7-11. Настасяк И.Н., Федоренко В.А., Даниленко В.Н. Локализация детерминантов устойчивости к рифампицину на генетической карте Saccharopolyspora erythraea // Антибиот. и химиотер. – 1997. – Т.42,№8.-С.14-20. Федоренко В.А., Голец Л.М., Демидчук Ю.А., Крюгель Г. Анализ перестроек генома у мутантов Streptomyces kanamyceticus // Антибиот. и химиотер. – 1998. – Т.43,№4.-С.14-19. Demydchuk J., Oliynyk Z., Fedorenko V. Analysis of a kanamycin resistance gene (kmr) from Streptomyces kanamyceticus and a mutants with increased aminoglycoside resistance // J.Basic Microbiol. – 1998. – Vol.38, N4.- P.231-239. Настасяк И.Н., Заворотная С.А., Федоренко В.А., Даниленко В.Н. Получение и характеристика мутантов Saccharopolyspora erythraea, устойчивых в хлорамфениколу // Антибиот. и химиотер. – 1999. – Т.44,№3.-С.5-10. Федоренко В.О. Конструювання штамів-продуцентів антибіотика канаміцину Streptomyces kanamyceticus за допомогою методів клітинної та генної інженерії // Биол. вестник – 1999.–Т.3.№1-2.–С.111-117. Дубицька Л., Заворотна С., Осташ Б., Громико О., Басілія Л., Федоренко В. Характеристика ознак стійкості до антибіотиків у продуцентів протипухлинних антибіотиків Streptomyces globisporus 1912, Streptomyces peucetius ATCC29050 та Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCC27952 // Вісн. Львів.ун-ту.Сер.біол.-2000.-Вип.25.-С.49-60. Федоренко В.О. Генетична нестабільність стійкості Streptomyces ambofaciens до хлорамфеніколу // Вісн. Львів.ун-ту.Сер.біол.-2000.-Вип.25.-С.67-73. Громико О., Басілія Л., Кириченко Н., Федоренко В. Отримання і характеристика стрептоміцин-резистентних мутантів продуцента протипухлинного антибіотика ландоміцину Е Streptomyces globisporus // Вісн. Львів.ун-ту.Сер.біол.-2000.-Вип.26.-С.46-53. Мар’їна О., Заворотна С., Федоренко В. Вплив кофеїну на вияв генетичної нестабільності у Streptomyces coelicolor A3(2) // Вісн. Львів.ун-ту.Сер.біол.-2000.-Вип.26.-С.63-67. Федоренко В.О., Басілія Л.І., Панькевич К.О., Дубицька Л.П., Осташ Б.О., Лужецький А.М., Громико О.М., Крюгель Г. Генетичний контроль біосинтезу актиноміцетами протиракових антибіотиків-полікетидів // Бюл. ін-ту сільськогосп. мікробіол.-2000.-№8.-С.27-31. Лужецкий А.Н., Осташ Б.Е., Федоренко В.А. Межродовая конъюгация Escherichia coli – Streptomyces globisporus 1912 c использованием интегративной плазмиды pSET152 // Генетика.-2001.-Т.37,№10.-С.1340-1347. Ostash B., Basiliya L., Gromyko O., Rebets Yu., Fedorenko V. Streptomyces globisporus 1912 mutants with altered landomycin biosynthesis // Вісн. Львів. ун-ту. Сер.біол.-2001.-Вип.27.-C.106-112. Pankevych K., Kruegel H., Fedorenko V. Cloning and sequencing of a putative positive transcription regulator gene of landomycin biosynthetic cluster of Streptomyces globisporus 1912 // Вісн. Львів. ун-ту. Сер.біол.-2001.- Вип.27.-С.97-105. Ostash B., Luzhetskyy A., Gromyko O., Fedorenko V. Transfer of plasmid from Escherichia coli to mutant strain Streptomyces globisporus LND900 with altered biosynthesis of antitumor antibiotic landomycin E // Наук. вісн. Ужгород. ун-ту. Сер.біол.–2001.-№10.-С.147-149. Дубицька Л.П., Федоренко В.О. Характеристика мутантів Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCC27952, cтійких до антрациклінових антибіотиків // Мікробіол.журн.- 2001.-Т.63,№4.-С.53-61. Федоренко В.О., Басілія Л.І., Заворотна С.А., Голець Л.М., Кириченко Н.В., Настасяк І.М., Демидчук Ю.О., Дубицька Л.П., Мазепа А.Й., Мар’їна О.В., Панькевич К.О., Осташ Б.О., Лужецький А.М., Громико О.М., Самбір М.В. Генетичний контроль біосинтезу антибіотиків та стійкості до антибіотиків у актиноміцетів // Генетика і селекція в Україні на межі тисячоліть. У 4 т. / Редкол.: В.В.Моргун (головн. ред.) та ін.–К.:Логос,2001.–Т.1.-С.469-476. Федоренко В.О., Заворотна С.А., Голець Л.М., Настасяк І.М., Мар’їна О.В., Басілія Л.І., Кириченко Н.В., Демидчук Ю.О. Механізми генетичної нестабільності ознак актиноміцетів // Генетика і селекція в Україні на межі тисячоліть. У 4 т. / Редкол.: В.В.Моргун (головн. ред.) та ін.– К.:Логос, 2001.–Т.1.-С.462-468. Дубицька Л.П., Федоренко В.О. Характеристика мутантів Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCC27952-2, cтійких до хлорамфеніколу // Вісн. Львів.ун-ту.Сер.біол.-2002.-Вип.28.-С.105-113. Дубицька Л.П., Федоренко В.О. Конструювання штамів Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCC27952-2 з підвищеною здатністю перетворювати даунорубіцин в доксорубіцин // Біополімери і клітина-2002.-Т.18,№2.-С.91-95. Luzhetskyy A., Fedoryshyn M., Hoffmeister D., Bechthold A., Fedorenko V. Gene cloning system for Streptomyces cyanogenus S136 // Вісн. Львів.ун-ту.Сер.біол.-2002.-Вип.29.-С.62-68. Дубицкая Л.П., Федоренко В.А. Влияние глюкозы на антиботическую активность и резистентность к антибиотикам у Streptomyces peucetius subsp. caesius ATCC 27952-2 и его мутантов // Антибиот. и химиотер. – 2002. – Т.47,№6.-С.7-11. Cидоров Ю.І., Федоренко В.О., Громико О.М., Новіков В.П., Влязло Р.Й., Верес.Р.М. Розрахункова модель виробництва протипухлинного антибіотика “Ландоміцин Е” // Вісн. Націонал. ун-ту “Львівська політехніка”. Хімія, технологія речовин та їх застосування. – 2002.-№461.-С.204-208. Rebets Y., Ostash B., Luzhetskyy A., Hoffmeister D., Brana A., Salas J.A., Bechtold A., V.Fedorenko. Production of landomycins in Streptomyces globisporus 1912 and S. cyanogenus S136 is regulated by genes encoding putative transcriptional activators // FEMS Microbiol. Let.-2003.-Vol. 222, Is.1. –P.149 – 153. Ostash B., Rebets Y., Yuskevich V., Luzhetskyy A., Tkachenko V., V.Fedorenko. Targeted disruption of Streptomyces globisporus lndF and lndL cyclase genes involved in landomycin E biosynthesis // Folia Microbiol.-2003.-Vol.48.-P.484-488. Ostash B., Rebets Yu., Samborskyy M., Salas J.A., Fedorenko V. Sequencing and analysis of putative 3D-4H ring cyclase gene lndF of Streptomyces globisporus 1912 landomycin E biosynthetic gene cluster // Вісн. Львів. ун-ту. Сер.біол.-2003.-Вип.32.-C.84-91. Rebets Yu., Ostash B., Gromyko O., Mik U., Basiliya L., Fedorenko V. Resistance of recombinant Streptomyces albus CEST 114 and Streptomyces globisporus strains to landomycin E // Вісн. Львів. ун-ту. Сер.біол.-2003.-Вип.33.-C.47-54. Громико О.,Басілія Л.,Федоренко В. Вплив мутагенів на антибіотичну активність Streptomyces globisporus 1912 - продуцента протипухлинного антибіотика ландоміцину Е // Наук.вісн. Львів. держ. акад. вет. мед.-2003.- Т.5, (№2).-Ч.3. – С.45-52. Ostash B., Rix U., Remsing Rix L.L., Tao Liu, Lombo F., Luzhetskyy A., Gromyko O., Wang C., Brana A.F., Mendez C., Salas J.A., Fedorenko V., Rohr J. Generation of novel landomycins by combinatorial biosynthetic manipulation of the lndGT4 gene of the landopmycin E cluster in S.globisporus // Chemistry and Biology-2004.-Vol.11.-N.4.-P.547-555. Gromyko O., Rebets Y., Ostash B., Luzhetskyy A., Fukuchara M., Bechthold A., Nakamura T., Fedorenko V. Generation of Streptomyces globisporus SMY622 strain with increased landomycin E production and it’s initial characterization // J.Antibiot.-2004.-Vol.57.-N.6-P.383-389. Cпосіб отримання штамів Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCC27952-2 з підвищеним біосинтезом доксорубіцину та здатністю до перетворення даунорубіцину в доксорубіцин. Патент UA50047A, МПК7C12N13/03 / Федоренко В.О., Дубицька Л.П. - Заявл.16.03.200; Опубл.15.10.2002.-Бюл.№10. - 10 с. Спосіб отримання штамів Streptomyces globisporus з підвищеним рівнем біосинтезу ландоміцинів. Патент UA62200A, МПК7C12N15/00 / Федоренко В.О., Ребець Ю.В., Осташ Б.О., Лужецький А.М. – Заявл. 24.01.2003; Опубл.15.12.2003.- Бюл.№12. - 10 с. Штам актиноміцетів Streptomyces globisporus Smy622 – продуцент протипухлинного антибіотика ландоміцину Е. Патент UA62200A, МПК7C12N15/00 / Громико О.М., Федоренко В.О., Басілія Л.І. - Заявл. 3.06. 2003; Опубл. 15.04.2004.-Бюл.№4.-4 с. Zavorotna S., Fedorenko V. The pSE201 plasmid of Saccharopolyspora erythraea. // Abstr. 7th Int. Symp. Genet. Ind. Microorg., Montreal, June 26-July 1, 1994 – P.252. Golec L., Basiliya L., Mazepa A., Kirichenko N., Esypov S., Fedorenko V. Identification of genes controlling the kanamycin biosynthesis in Streptomyces kanamyceticus // Abstr. VAAM Workshop “Biologie der Actinomyceten”, Muenster, Sept.24-26, 1995.-P.30. Golec L., Sambir M., Mazepa A., Fedorenko V. Genetic recombination during protoplast fusion Streptomyces kanamyceticus // Abstr. 10th Int. Symp. Biol. Actinom., Bejing, May 27-30, 1997.-10P1. Luzhetskyy A., Fedoryshyn M., Hoffmeister D., Bechtold A., Fedorenko V. Conjugal transfer of plasmid DNA from Esherichia coli to Streptomyces kanamyceticus: effects of chromosomal insertions on kanamycin production // Abstr. VAAM Workshop “Biologie bakterieller Naturstoffproduzenten”, Freiburg, Sept.29-Oct.1, 2003.-V3. Ostash B., Luzhetskyy A.,Yuskevich V., Hrek M., Salas J.A., Bechtold A., Rohr J., Fedorenko V. Generation of novel landomycin through genetic engineering // Abstr. Int. Weigl Conf. “Microorganisms in pathogenesis and their drug resistance”, Lviv, Sept.11-14, 2003.-P.126. АНОТАЦІЇ Федоренко В.О. Генетичний контроль стійкості актиноміцетів до антибіотиків та його роль у біосинтезі антибіотиків. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.15.- генетика. Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2004. У дисертації вивчено закономірності генетичного контролю стійкості актиноміцетів до антибіотиків та вплив генетичних детермінантів антибіотикорезистентності на біосинтез полікетидних антибіотиків еритроміцину в Sacch. erythraea, спіраміцину в S. ambofaciens, даунорубіцину та доксорубіцину в S. peucetius subsp.caesius, а також аміноглікозидного антибіотика канаміцину в S. kanamyceticus. У досліджених штамів відбуваються спонтанні та індуковані мутагенами множинні зміни ознак резистентності до антибіотиків. Показано, що мутанти Sacch. erythraea, стійкі до рифампіцину, хлорамфеніколу, тіострептону та стрептоміцину, мутанти S. peucetius subsp.сaesius, стійкі до даунорубіцину та доксорубіцину, а також мутанти S. kanamyceticus, стійкі до аміноглікозидів, перспективні для селекції штамів з підвищеним синтезом антибіотиків. З бібліотеки генома продуцента ландоміцину Е S. globisporus 1912, клоновано та секвеновано кластер генів біосинтезу цього антибіотика. У ньому виявлено 30 генів та визначено ймовірні функції 28 з них. Ідентифіковано п’ять класів мутацій генів, що контролюють утворення канаміцину в S. kanamyceticus. Клоновано та секвеновано ген kmrB, що кодує метилазу 16S рРНК та зумовлює стійкість S. kanamyceticus до канаміцину, гентаміцину, сизоміцину та тобраміцину. Опрацьовано системи клонування генів у штамах S. kanamyceticus та S. globisporus за допомогою кон’югаційного перенесення плазмід з E. coli та розоблено генетичні та генно-інженерні підходи до створення штамів, які здатні до підвищеного синтезу еритроміцину, ефективної трансформації даунорубіцину в доксорубіцин та продукції нових ландоміцинів H, F та G. Ключові слова: Streptomyces, Saccharopolyspora, антибіотики, еритроміцин, канаміцин, спіраміцин, даунорубіцин, доксорубіцин, ландоміцин, стійкість до антибіотиків. Федоренко В.А. Генетический контроль устойчивсти актиномицетов к антибиотикам и его роль в биосинтезе антибиотиков. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.15.- генетика. Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2004. В диссертации изучены закономерности генетического контроля устойчивости актиномицетов к антибиотикам и влияние генетических детерминантов антибиотикорезистентности на биосинтез поликетидных антибиотиков эритромицина у Sacch. erythraea, спирамицина у S. ambofaciens, даунорубицина и доксорубицина у S. peucetius subsp.caesius, а также аминогликозидного антибиотика канамицина у S. kanamyceticus. У исследованных штаммов происходят спонтанные и индуцированные мутагенами множественные изменения признаков резистентности к антибиотикам. Показано, что мутанты Sacch. erythraea, устойчивые к рифампицину, хлорамфениколу, тиострептону и стрептомицину, мутанты S. peucetius subsp.сaesius, устойчивые к даунорубицину и доксорубицину, а также мутанты S. kanamyceticus, резистентные к аминогликозидам, перспективны для селекции штаммов с повышенным синтезом антибиотиков. Из библиотеки генома продуцента ландомицина Е S. globisporus 1912 клонирован и секвенирован кластер генов биосинтеза этого антибиотика. В нем обнаружены 30 генов и определены вероятные функции 28 из них. Идентифицированы пять классов мутаций генов, контролирующих продукцию канамицина у S. kanamyceticus. Клонирован та секвенирован ген kmrB, кодирующий метилазу 16S рРНК и определяющий устойчивость S. kanamyceticus к канамицину, гентамицину, сизомицину и тобрамицину. Разработаны системы клонирования генов в штаммах S. kanamyceticus и S. globisporus с помощью конъюгационного переноса плазмид из E. coli, а также генетические и генно-инженерные походы к созданию штаммов, способных к повышенному синтезу эритромицина, эффективной трансформации даунорубицина в доксорубицин, а также продукции новых ландомицинов H, F и G. Ключевые слова: Streptomyces, Saccharopolyspora, антибиотики, эритромицин, канамицин, спирамицин, даунорубицин, доксорубицин, ландомицин, устойчивость к антибиотикам. Fedorenko V. O. Genetic control of actinomycete resistance to antibiotics and its role in the biosynthesis of antibiotics. – Manuscript. Thesis for Doctor of Science degree on speciality 03.00.15 – Genetics. – Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2004. The mechanisms underlying the genetic control of actinomycete resistance to antibiotics have been investigated together with the roles of the genetic determinants of antibiotic resistance in the biosynthesis of the polyketide antibiotics erythromycin by Sacch. erythraea, spiramycin by S. ambofaciens, daunorubicin and doxorubicin by S. peucetius subsp. caesius as well as of the aminoglycoside antibiotic kanamycin by S. kanamyceticus. The spontaneous and mutagen-induced multiple changes of the antibiotic resistance traits were shown to occur in the studied strains. The amplification-capable DNA sequences have been found and characterized in the genome of S. coelicolor A3(2) and S. ambofaciens unstable mutants. The genomic library of landomycin E producer S. globisporus 1912 has been constructed and the landomycin E biosynthesis gene cluster has been cloned and sequenced. 30 genes have been identified, with the putative functions assigned to 28 of them. The lndE, lndF, lndA, lndB, lndC, lndD, lndL, lndM, lndN, lndO, lndP, lndV, lndZ4, lndZ6, lndZ5 genes govern the biosynthesis of landomycine E polyketide moiety, lndG, lndH, lndQ, lndR, lndS, lndT, lndZ1, lndZ3 are responsible for the deoxysugars syntesis, lndGT2, lndGT1, lndGT4 – for sugar chain attachment to the aglycone structure; the lndJ gene is recognized as landomycin E resistance determinant, and lndI — as regulatory gene for lnd–cluster. The collection of S. kanamyceticus mutant strains with deficiencies for the different kanamycin biosynthesis stages has been created and studied. The five classes of mutations within genes controlling the kanamycin biosynthesis (kanA, kanB, kanC, kanD та kanG) have been identified in these mutants. The genetic recombination events following the S. kanamyceticus protoplasts fusion have been shown. The linkage of the kanB and kanD mutations with the erythromycin, gentamycin and rifampicin resistance mutations has been revealed. The kmrB gene which codes for 16S rRNA methylase and conferrs the kanamycin, gentamycin, sisomycin and tobramycin resistance to S. kanamyceticus, has been cloned and sequenced. By means of the PFGE-analysis of the restriction macrofragments, the chromosome sizes of five S. kanamyceticus strains have been determined and fall in the range of 7715–8217 kb. The nucleotide sequence rearrangements as well as kmrB gene amplifications have been found in the genomes of the unstable Kan––mutant kan12 and gentamycin-resistant mutants genR8 and genR10. The gene cloning system for S. kanamyceticus and S. globisporus strains based on the conjugative plasmid transfer from E. coli has been developed. This system has been shown to work effectively for the targeted lnd-genes disruption in S. globisporus. The rifampicin, chloramphenicol, thiostrepton and streptomycin resistant Sacch. erythraea mutant strains, as well as daunorubicin and doxorubicin resistant S. peucetius subsp. сaesius mutant strains appeared to be promising for the selection of the strains with an elevated antibiotic biosynthesis levels. The protoplast fusion and the selection of the recombinants simultaneously containing rif-, str- and tsr-mutations is an effective technique for Sacch. erythraea strains selection. It has been demonstrated that mutants with impaired glucose repression can be used in the selection of S. kanamyceticus and S. peucetius subsp. caesius. The cloning of dnrI and cpx genes in S. peucetius subsp. caesius makes possible the isolation of the strains owing an increased ability of daunorubicin to doxorubicin transformation. The lndGT4 gene knockout in landomycin E producer S. globisporus 1912 causes the appearance of novel landomycins F and G, and after the complementation of this deficiency — the synthesis of landomycin G. The novel landomycins posess an altered antibacterial and antitumor properties. Keywords: Streptomyces, Saccharopolyspora, antibiotics, erythromycin, kanamycin, spiramycin, daunorubicin, doxorubicin, landomycin, antibiotic resistance. PAGE 31

Похожие записи