.

Генетичні маркери крові у хворих на хронічний гепатит С (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 2984
Скачать документ

АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕПІДЕМІОЛОГІЇ ТА ІНФЕКЦІЙНИХ ХВОРОБ

ІМ. Л.В. ГРОМАШЕВСЬКОГО

ПОПОВИЧ ОЛЕКСАНДРА ОЛЕКСАНДРІВНА

УДК 616 – 0.97.616.15.576.858

Генетичні маркери крові у хворих на хронічний гепатит с

14.01.13 – інфекційні хвороби

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Вінницькому національному медичному університеті ім.
М.І. Пирогова МОЗ України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, Мороз Лариса
Василівна, Вінницький національний медичний університет ім. М.І.
Пирогова МОЗ України, завідувач кафедри інфекційних хвороб з курсом
епідеміології.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Дубинська Галина Михайлівна, Українська
стоматологічна медична академія МОЗ України, завідувач кафедри
інфекційних хвороб і епідеміології;

кандидат медичних наук, доцент Печінка Анатолій Михайлович, Національний
медичний університет ім. О.О. Богомольця МОЗ України, завідувач кафедри
інфекційних хвороб.

Провідна установа: Одеський державний медичний університет МОЗ України,
м. Одеса.

Захист відбудеться 31 травня 2007 р. о 11 годині на засіданні
спеціалізованої Вченої Ради Д 26.614.01 при ДУ Інституті епідеміології
та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України (01015, м.
Київ, вул. Січневого Повстання, 23).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДУ Інституту епідеміології
та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України (03038, м.
Київ, вул. М.Амосова, 5).

Автореферат розісланий “_27___” __квтіня__ 2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат медичних наук О.Л.Панасюк

ВСТУП

Актуальність теми. Гепатит С являє собою глобальну проблему сучасної
медицини, яка визначається значними несприятливими наслідками і
прогресу-ючими темпами поширеності (Майер К., 1999; Игнатова Т.М. та
співавт., 2001; Дзюблік І.В., 2005). Згідно з літературними даними
75-80% випадків гострого гепатиту С має субклінічний перебіг. Хронізація
процесу, незалежно від важкості клінічних проявів, спостерігається у
60-80% (Соринсон С.Н. та співавт., 1997; Игнатова Т.М. 2000). Питома
частка гепатиту С, як причини виникнення циротичного переродження
печінки, серед всіх цирозів – 40%, гепатоцелюлярних карцином – 60%
(Малый В.П., 2005; Simmonds P., 2001; Everson G.T., 2005;).

За даними ВООЗ у світі нараховується більше 200 млн. HCV – “носіїв”,
число яких зростає з кожним роком (Блюм Х.Е., 2005; Deuffic-Burban S. et
al., 2004). Відповідно до існуючих критеріїв Україна належить до
регіонів з високим рівнем інфікованості (поширеність HCV – інфекції в
Україні складає приблизно 3%) (Дьяченко П.А. та співавт., 2005; Дзюблик
І.В., 2005).

Сьогодні активно вивчаються розповсюдженість HCV-інфекції (Бара-

нов А.А., та співавт., 2002; Шахгильдян И.В. та співавт., 2003),
етіопатогенетичні чинники (Sprinzl M.F. et al., 2005; Kountours J. et
al., 2003), сформульовані діагностичні критерії хронічного гепатиту С
(Маянский А.Н. та співавт., 2003; Strader D.B. et al., 2004; Ryger S.D.
et al., 2004), розроблені сучасні схеми комбінованої противірусної
терапії (Буеверов А.О. та співавт., 2006; Shirator J. et al., 2005;
Grace J.M., Bordeus R.W., 2005).

Різноманітність темпів прогресування хронічного гепатиту С пов’язана з
наявністю великої кількості факторів, що здатні впливати на вірогідність
виникнення і особливості перебігу захворювання. Серед них розглядають
якісно-кількісні характеристики зовнішнього середовища, вірусу та
макроорганізму. Вже доведений вплив таких факторів, як зловживання
алкоголем, вік на момент інфікування, наявність HBV/HCV та HIV/HCV
ко-інфекцій. Значення інших чинників епідеміологічного процесу
знаходиться на стадії інтенсивного наукового пошуку (Steffen T., 2001;
Ohata K., 2003). Однак майже відсутні роботи, котрі спрямовані на
визначення ролі індивідуальних факторів, що можуть обумовлювати
схильність до захворювання і особливості перебігу хронічного гепатиту С.

Дослідження проблеми впливу якісного характеру антигенної організації
людини на стан її здоров’я і визначення біологічної доцільності систем
еритроцитарних антигенів крові в зв’язку з інфекційними хворобами
почалось ще в 20-і роки ХХ століття, але більшість спостережень, що були
проведені, мали ряд методичних похибок ( низьку чисельність
експериментальних груп, відсутність контролю і статистичної обробки
матеріалу), які не дозволяли отримати фундаментальні висновки про
існування конкретних закономірностей розподілу певних антигенів серед
обстежуваного контингенту (Сохин А.А., 1975). Високий поліморфізм
антигенної структури крові людини, чисельні її
функціонально-фізіологічні відмінності значно розширюють уявлення про
еволюцію людини і дозволяють прослідкувати на якому екологічному тлі
реалізується захворювання, які інфекційні процеси провокують його
початок, що розкриває нові горизонти пізнання інтимних механізмів
функціонування організму (Земсков Л.М. та співавт., 2000).

Більшість наукових праць присвячена вивченню особливостей імунних
реакцій у хворих на хронічний гепатит С в залежності від поліморфізму
системи HLA (Zavaglia J. et al., 1998; Asti М. et al., 1999), тому з
огляду на знання про спорідненість багатьох антигенів даної системи з
еритроцитарними (Дранник Г.Н., Дизик Г.М., 1990), для розширення
уявлень про роль факторів хазяїна продовженням теми може бути вивчення
інших антигенів крові у HCV-інфікованих.

За даними літератури зустрічаються поодинокі відомості щодо розподілу
антигенів крові системи АВО і фенотипів гаптоглобіну серед хворих на
гепатит, але в більшості випадків без уточнення етіології і гостроти
патологічного процесу (Суворов А.В. та співавт., 2004).

На сьогодні в наукових повідомленнях відсутні матеріали щодо вивчення
розподілу окремих антигенів крові систем АВО, Rh, P, MN і фенотипів
гаптоглобіну у хворих на хронічний гепатит С. У зв’язку з цим доцільним
було проведення наукового дослідження щодо визначення ролі
індивідуальних факторів у виникненні хронічного гепатиту С і різних
варіантах його перебігу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана в рамках наукового дослідження Вінницького національного
медичного університету ім. М.І. Пирогова за темою “Вивчення
взаємозв’язку вірусних, метаболічних та генетичних факторів з
особливостями перебігу хронічних вірусних гепатитів В та С” (№
держреєстраії 0104V003552). Автор був відповідальним виконавцем цієї
теми.

Мета дослідження: на основі оцінки особливостей розподілу еритроцитарних
маркерів і фенотипів гаптоглобіну крові у хворих на хронічний гепатит С
поглибити уявлення про існування індивідуальної схильності до виникнення
захворювання.

Задачі дослідження:

Визначити антигени крові, які частіше асоціюються із захворюванням на
ХГС.

Оцінити зв’язок генотипу вірусу гепатиту С та величини вірусного
навантаження з певними антигенами крові.

Визначити ступінь активності запального процесу та фіброзу печінки при
ХГС у хворих з різними генетичними маркерами крові.

Визначити частоту гаплотипів крові при ХГС та їх зв’язок з важкістю
перебігу захворювання.

Оцінити ризик формування ХГС і різних варіантів його перебігу в
залежності від маркерів антигенних систем крові.

Об’єкт дослідження: хронічний гепатит С

Предмет дослідження: особливості перебігу хронічного гепатиту С з
урахуванням генетичних маркерів крові, генотип вірусу, вірусне
навантаження, морфофункціональний стан печінки.

Методи дослідження: в роботі використані імунно-генетичні дослідження з
визначенням еритроцитарних антигенів крові систем АВО, Rh, P, MN і
фенотипів гаптоглобіну, клінічні, біохімічні, молекулярно-біологічні,
морфологічні, інструментальні методи обстеження. Статистична обробка
результатів досліджень виконувалась за модулями GENMOD і LOGISTIC у
рамках статистичної програми SAS 9.13, базисні статистичні розрахунки з
визначенням суттєвості різниці між окремими показниками вибіркового
дослідження визначались за коефіцієнтом вірогідності (критерій
Ст’юдента), для оцінки вірогідності більшої від двох кількості
показників клініко-статистичних груп використовували критерій
відповідності Пірсона (?2).

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проведено комплексне
визначення еритроцитарних антигенів крові системи АВО, Rh, P, MN та
фенотипів гаптоглобіну у хворих на хронічний гепатит С.

Вперше у хворих на хронічний гепатит С досліджений розподіл генетичних
маркерів крові, що асоціюються з певним генотипом вірусу та вірусним
навантаженням.

Вперше при хронічному гепатиті С визначено особливості розподілу
генетичних маркерів крові в групах пацієнтів з різною біохімічною,
морфологічною активністю гепатиту та досліджений розподіл антигенів
крові у хворих з різним за METAVIR ступенем фіброзу.

Вперше проведено інтегральну оцінку достовірності модифікації ризику
виникнення хронічного гепатиту С усіма досліджуваними факторами, надана
оцінка значимості окремих фенотипів антигенних систем крові та
унікальності їх впливу на ступінь активності гепатиту.

Додатково досліджено і поглиблено уявлення про взаємозв’язок тривалості
захворювання з активністю гепатиту та фібротичними змінами тканини
печінки.

Практичне значення отриманих результатів. Практичне значення роботи
полягає у розробці прогностичних критеріїв формування контингенту,
схильного до виникнення та певного перебігу хронічного гепатиту С,
визначенні рекомендацій, спрямованих на покращення
профілактично-лікувальної роботи.

До груп ризику формування хронічного гепатиту С слід включати здорових
осіб в яких обтяжений епідеміологічний анамнез поєднується з наявністю
еритроцитарного антигену P(+) та гаплотипами: О(І)Р(+), В(ІІІ)(Р+),
АВ(ІV)(Р+), Rh(+)Р(+), Rh(-)Р(+), Р(+)МN, Р(+)Нр2-1, Р(+)Нр2-2,
О(І)Rh(-)Р(+), О(І)MP(+), O(I)P(+)Hp2-2, B(III)MNP(+), B(III)P(+)Hp2-1,
AB(IV)Rh(+)P(+), AB(IV)Rh(-)P(+), AB(IV)MP(+), P(+)Rh(+)M, P(+)Rh(+)MN,
P(+)Rh(-)MN, Hp2-1Rh(-)P(+), Hp2-2Rh(-)P(+).

Впровадження результатів дослідження в практику. Результати дослідження
впроваджені у практику Вінницького міського гепатологічного центру МКЛ
№1, роботу гастроентерологічного відділення обласної лікарні ім. М.І.
Пирогова та інфекційного відділення Вінницької центральної районної
клінічної лікарні, обласної інфекційної лікарні м. Хмельницький.

Наукові розробки за матеріалами дисертації використовуються в
навчальному процесі кафедр інфекційних хвороб та дитячих інфекційних
хвороб Вінницького національного медичного університету ім. М.І.
Пирогова.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана на кафедрі
інфекційних хвороб з епідеміологією Вінницького національного медичного
університету ім. М.І. Пирогова і є завершеним науковим дослідженням. В
процесі роботи автором самостійно проведений патентно-інформаційний
пошук та аналіз літературних джерел, розроблено реєстраційну карту
хворих Вінницького гепатологічного центру МКЛ №1, проведено клінічне
обстеження хворих на хронічний гепатит С. Автором засвоєно методики
визначення еритроцитарних антигенів та фенотипів гаптоглобіну крові, які
виконувались у ВНДЦ ВНМУ ім. М.І. Пирогова (директор науково-дослідного
центру професор І.В. Гунас). На базі Інституту хірургії та
трансплантології АМНУ

(м. Київ) в 2003 році пройшла тематичні курси по циклу “Пункційна
біопсія печінки під контролем УЗД” і самостійно виконувала ПБП.
Біохімічні обстеження проводились на кафедрі інфекційних хвороб ВНМУ ім.
М.І. Пи-рогова (зав. кафедри професор Л.В. Мороз), серологічні і
молекулярно-біологічні дослідження виконувались в Українському
лікувально-діагностич-ному центрі (м. Київ), морфологічне дослідження
біоптатів печінки – на кафедрі патологічної анатомії, судової медицини з
основами права ВНМУ ім. М.І. Пирогова (зав. кафедри професор В.В.
Біктіміров). Автором здійснено обробку результатів дослідження та їх
логічний і базовий статистичний аналіз, написані всі розділи дисертації,
сформульовані та обґрунтовані висновки і практичні рекомендації.
Статистична обробка результатів досліджень прово-дилась дисертантом на
кафедрі соціальної медицини та організації охорони здоров’я ВНМУ ім.
М.І. Пирогова під керівництвом проф. О.М. Очередько (завідувач кафедри
професор О.Г. Процек).

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи
висвітлені на: ІХ науково-практичній конференції Вінницького державного
медичного університету ім. М.І. Пирогова та лікарів ТМО МКЛ №1
„Актуальні проблеми терапії” (Вінниця, 2002), міжрегіональній
науково-практичній конференції “Актуальні питання сімейної медицини”
(Житомир, 2003), 59 міжнародній медичній конференції студентів та
молодих вчених “Актуальні проблеми сучасної медицини” (Київ, 2005),
конференції товариства інфекціоністів Вінницької області “Сучасні
проблеми інфекційних захворювань у дітей та дорослих” (м. Вінниця, 2005
року), науково-практичній конференції і Пленумі Асоціації інфекціоністів
України ”Хіміотерапія та імунокорекція інфекційних хвороб” (Тернопіль,
2005), конференції товариства інфекціоністів Вінницької області
“Актуальні проблеми інфекційної патології” (Вінниця, 2005), VІІ з’їзді
інфекціоністів України “Інфекційні хвороби – загально медична проблема”
(Миргород, 2006).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 10 робіт, з них 6 статей у
фахових виданнях, що рекомендовані ВАК України.

Обсяг і структура дисертації. Роботу виконано за загальноприйнятою
формою на 148 сторінках машинописного тексту. Вона складається зі
вступу, огляду літератури, розділу “Матеріали та методи”, 4 розділів
власних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків,
практичних рекомендацій та списку використаних джерел, з них кирилицею –
119, латиницею – 136. Список використаних джерел викладено на 24
сторінках. Робота ілюстрована 32 таблицями та 24 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Було обстежено 358 хворих на ХГС, з них
232 чоловіка і 126 жінок, які знаходяться на диспансерному обліку у
Вінницькому міському гепатологічному центрі. Матеріалом для дослідження
в залежності від виду надання медичної допомоги (амбулаторна,
стаціонарна) слугували амбулаторні карти та історії хвороб. Всі пацієнти
– особи української національності у третьому поколінні, корінні жителі
Вінницької області.

Контрольну групу склали 358 практично здорових людей мешканців
Подільського регіону України, цілеспрямований відбір яких проводився на
базі науково-дослідного центру Вінницького національного медичного
університету ім. М.І. Пирогова спільно зі співробітниками кафедри
інфекційних хвороб.

Клінічна частина роботи включала вивчення епідеміологічного анамнезу,
фізикального обстеження хворих, комплексу загальноклінічних,
біохімічних, імунологічних, молекулярно-біологічних, інструментальних та
морфологічних методів досліджень.

Проводилась оцінка основних біохімічних синдромів: цитолізу, холестазу,
печінково-клітинної недостатності.

Синдром цитолізу оцінювали шляхом визначення активності АлАт (КФ
2.6.1.2) та АсАт (КФ 2.6.1.1) уніфікованими методами Райтмана-Френкеля
(Меншиков В.В., 1987), синдром холестазу оцінювали визначенням
активності ГГТ (КФ 2.3.2.2) за швидкістю вивільнення 4-нiтроанiлiну з
(-глутамiлнiтроанiлiду, та вмістом білірубіну, який визначали
уніфікованим методом Єндрасика-Грофа (Меншиков В.В., 1987), синдром
печінковоклітинної недостатності оцінювали уніфікованими методами за
вмістом загального білку (мікробіуретовий метод), білкових фракцій
(електрофорез на папері) та величини протромбінового індексу (Меншиков
В.В., 1987).

Ступінь біохімічної активності патологічного процесу згідно з
міжнародною класифікацією захворювань печінки (Лос – Анджелес, 1994)
встановлювали за рівнем підвищення активності АлАт.

У всіх хворих на ХГС діагноз був підтверджений виявленням антитіл до
HCV, у 269 пацієнтів – виявленням HCVRNA, у 198 – верифікацією генотипу
вірусу, у 97 – встановленням рівню вірусного навантаження. В сироватці
165 хворих також визначали вміст антинуклеарних антитіл.

Дослідження здійснювались в Українському лікувально-діагностичному
центрі (м. Київ). Визначення HCVRNA в ПЛР, генотипування та вірусне
навантаження проводилось на тест системах фірми АмплиСенс (Росія),
антитіл до HCV – на імуноферментних тест – системах “ІФА – АНТИ – НСV”
(Росія), антитіл до cor- NS3-, NS4-, NS5-HCV – на тест системах фірми
Ордженікс (Ізраіль), ANA – на тест системах Трініті Біотех (США).

Визначення еритроцитарних антигенів крові систем АВО, Rh, MN, Р
проводилось за реакцією гемаглютинації типоспецифічними сироватками із
застосуванням групоспецифічних сироваток виробництва Вінницької ОСПК,
стандартних тест-еритроцитів, моноклональних антитіл асоціації “Ридан”
(м. Київ), реакції аглютинації з моноклональними антитілами фірми (Тест(
(Харків). Якісне визначення типів гаптоглобінів здійснювали методом
електрофорезу в агарово-крохмальному гелі з використанням лужної
боратної системи (Давиденкова Е.Ф., Бутомо И.В., 1978; Матвейков Г.П.,
1993).

Проводилось УЗ-обстеження печінки і селезінки відносно еталонного
середовища. Ехографічні дослідження виконувались на УЗ сканері “Toshiba
SSA-220A”, (Японія) конвексним датчиком 3,75 МГц.

З метою оцінки морфологічної активності ХГС, проводилась черезшкірна
пункційна біопсія печінки голками “UNICUT G16” фірми “Bard” (Німеччина)
та “Tru-Cut G14” фірми “Allegiance” (США). Отриманий матеріал фіксували
у 10% буферному розчині формаліну. Використовували загальногістологічні
методики фарбування: гематоксилін-еозином, пікрофуксином по ван Гізон.
Морфологічні зміни структури печінки оцінювались за шкалою METAVIR (Bats
K.P., Lud-

vig J., 1995).

Статистична обробка результатів типування генетично детермінованих
антигенів виконувалась на персональному комп’ютері Pentium (r) II
Processor Intel MMX ™ в рамках статистичного пакету програми
“Statistica 5,0”, “Microsoft Excell” та Paradox for Windows 5.0”,
парціальні ефекти вираховувались модулями GENMOD і LOGISTIC статистичної
системи SAS 9.13 за ітеративною процедурою. Оформлення та друк роботи
виконувались в текстовому редакторі Word (Вороненко Ю.В., Москаленко
В.Ф., 2000).

Результати досліджень та їх обговорення. Аналіз розподілу хворих на ХГС
за групами крові систем ABO, Rh, MN, P та фенотипів гаптоглобіну
показав, що у популяції Вінницької області серед хворих на ХГС
достовірно частіше діагностуються еритроцитарні антигени АВ(ІV)
(13,97%), MN (49,60%), Р(+) (84,92%).

Було встановлено, що у пацієнтів з різним ступенем біохімічної
активності, MN фенотип частіше асоціюється з мінімальним підвищенням
АлАт (49,40%), Р(+) група крові превалює у хворих з мінімальною (85,40%)
та помірною (81,25%) біохімічною активністю гепатиту, N антиген рідше
асоціюється з мінімальним підвищенням АлАт (14,00%).

Дослідження взаємозв’язку генетичних маркерів крові з різними генотипами
HCV показало більшу частоту АВ(ІV) (18,32%) і меншу N фенотипу (12,21%)
у хворих з 1-м генотипом вірусу. Серед осіб зі всіма генотипами HCV
переважали носії Р(+) антигену (хворі на ХГС з 1-м генотипом вірусу
(81,86%), з 2-м генотипом (100%), з 3-м генотипом (91,84%) (рис. 1).

Оцінюючи поширення еритроцитарних антигенів та фенотипів гаптоглобіну у
хворих на ХГС в зв’язку з різним вірусним навантаженням було визначено,
що MN група крові частіше зустрічається серед осіб з низьким вірусним
навантаженням (58,18%). Носії Р(+) фенотипу складають більшу питому
частку в групах пацієнтів з високим (88,10%) і низьким (92,73%) вірусним
навантаженнями (табл. 1).

Таблиця 1

Розподіл хворих з різним вірусним навантаженням за групами крові системи
Р

Антигени крові

Здорові люди

Абс.=358 Хворі з високим навантаженням

Абс.=42 Хворі з низьким навантаженням

Абс.=55

Абс. P±m,% Абс. P±m,% Абс. P±m,%

Р(-) 139 38,83±2,58 5 11,90±5,00* 4 7,27±3,50*

Р(+) 219 61,17±2,58 37 88,10±5,00* 51 92,73±3,50*

Примітка. * – різниця статистично достовірна, рRh j ? ? ucccccccccUcccccccccccccc 1/4 3/4 A h j ’ iiiia??Ae??Ae?!!“ & „ dh1$G$^„ dh1$G$^„`„ dh1$G$^„`„ @ dh1$G$^„`„ @ ^„`„A ^„`„Ae `„A `„Aa$ dh1$G$^„`„? ій: A(II)P(+), B(III)P(+), AB(IV)P(+), O(I)Hp2-2, Rh(+)P(+), Rh(+)MN, P(+)MN, P(+)Hp2-1, P(+)Hp2-2, MNHp2-2, менша питома частка двокомпонентних асоціацій представлена фенотипами: AB(IV)P(-), O(I)P(-), A(II)P(-), B(III)P(-), B(III)M, O(I)N, O(I)Hp2-1, O(I)Hp1-1, Rh(+)P(-), Rh(-)P(-), Rh(+)N, P(-)M, P(-)N, P(-)Hp2-1, P(-)Hp2-2, NHp2-1. При помірному ступені активності захворювання частіше зустрічаються гаплотипи: O(I)P(+), P(+)MN, P(+)Hp2-2, Rh(+)P(+), Rh(-)P(+), рідше: O(I)P(-), B(III)Rh(+), B(III)Hp1-1, Rh(+)P(-), P(-)M, P(-)N, P(-)Hp2-1, P(-)Hp2-2, NHp2-1. У хворих з вираженою активністю гепатиту частіше ніж у здорових людей трапляються двокомпонентні комбінації: AB(IV)Rh(+), AB(IV)P(+), AB(IV)M, AB(IV)N, AB(IV)MN, AB(IV)Hp2-1, P(+)Hp2-1, рідше асоціації антигенів: O(I)P(-), O(I)N, A(II)P(-), A(II)Rh(+), A(II)M, A(II)MN, A(II)Hp2-1, A(II)Hp2-2, Rh(+)P(-), P(-)MN, P(-)Hp1-1, P(-)Hp2-1. Аналіз достовірності модифікації ризику формування ХГС усіма генетичними маркерами разом показав, що комплекс включених антигенів суттєво (p

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020