.

Функціонально-фенотипічна модифікація фібробластів хронічних венозних виразок із використанням методів клітинного культивування (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
146 3448
Скачать документ

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

ДОНЕЦЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ

УНІВЕРСИТЕТ ім. М. ГОРЬКОГО

НАУКОВО-ДОСЛІДНИЙ ІНСТИТУТ ТРАВМАТОЛОГІЇ ТА ОРТОПЕДІЇ

КОРЧАК ОКСАНА МИХАЙЛІВНА

УДК 616.14-002.44-036.12-097

Функціонально-фенотипічна модифікація фібробластів хронічних венозних
виразок із використанням методів клітинного культивування

14.03.08 – імунологія та алергологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Донецьк – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті невідкладної і відновної хірургії ім. В.К.
Гусака АМН України.

Науковий керівник – доктор медичних наук, старший науковий

співробітник Трунова
Ольга Арнольдівна,

Донецький державний
медичний університет

ім. М. Горького,
професор кафедри мікробіології,

вірусології та
епідеміології.

Офіційни опоненти – доктор медичних наук Білозоров Олексій
Павлович,

Інститут дерматології
та венерології АМН України,

завідувач лабораторією
патофізіології, імунології та

патоморфології,

доктор медичних наук,
старший науковий співробітник

Нікольський Ігор
Сергійович,

Інститут експериментальної радіології Наукового

центру
радіаційної медицини АМН України,

завідувач лабораторією
імуногенетики.

Провідна установа – Інститут геронтології АМН України, м.
Київ.

Захист відбудеться „_18_”___травня__ 2007 р. о ___11____ годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 11.600.04 у науково-дослідному
Інституті травматології та ортопедії Донецького державного медичного
університету ім. М. Горького (83048, м. Донецьк, вул. Артема, 106).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Донецького державного
медичного університету ім. М. Горького (83003, м. Донецьк, пр. Ілліча,
16).

Автореферат розісланий „__11__” _____квітня____2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат медичних наук, доцент
Колесніков А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Основне місце в загальній структурі виразок нижніх
кінцівок різного генезу (більше 70%) займають трофічні виразки, які
виникають внаслідок хронічного порушення венозного відтоку. Таке
ускладнення зустрічається приблизно в 2% дорослого населення
індустріально розвинених країн, а в людей похилого віку ця цифра
досягає 4-5 %. Слід зазначити, що в 40% пацієнтів перша виразка виникає
в працездатному віці і ці стани супроводжуються стійкою та тривалою
інвалідизацією (Савельев В.С. и соавт., 2001).

Трофічні порушення при хронічній венозній недостатності провокує
флебогіпертензія, що призводить до каскаду різноманітних патологічних
реакцій на молекулярному, клітинному і тканинному рівнях
(Бок И. Ли и соавт., 2003,

В.С. Савельев и соавт., 2001).

За останні роки велику кількість робіт присвячено вивченню популяції
фібробластів виразкового дефекту – одного з основних клітинних типів,
що відіграють критичну роль у процесах репарації ран (Stanley A.C. et
al.,1997, Hasan A. et al., 1997, Agren M. S. et al., 1999, Norgauer J.
et al., 2002). В експериментах доведено, що в умовах хронічного
запалення проліферативний потенціал цих клітин зазнає різкого зниження
(Stanley A. et.al., 2001), порушується відповідь на дію регуляторних
сигналів, змінюється біохімічна та секреторна активність фібробластів,
помітно знижується ступінь проліферативної відповіді на дію мітогенних
факторів, зокрема, факторів росту й інтерлейкінів (Agren M.S. et al.,
1999, Loots et al., 2002, Byung-Chul Kim et al., 2003). Крім того,
доведено, що у виразковому дефекті відзначаються зміни з боку тканинного
мікрооточення, зокрема, на рівні кількісного вмісту факторів росту та
дисбалансу між протеазами і їхніми інгібіторами, які можуть викликати
зміни складу й структури міжклітинного матриксу, порушення процесу
міграції та проліферації клітин (Trengove N.J. et al., 1999, Parks W.C.,
1999).

Сукупність цих змін, можливо, є однією з причин тривалого загоєння
хронічних ран, а також резистентності їх до традиційних методів терапії.
Саме цим і обумовлений пошук нових підходів у терапії трофічних виразок
венозної етіології, які враховували б дані аспекти патогенезу (Falanga
V., 2001). Як відомо, одним із провідних напрямків терапії хронічних
виразок є перемикання запального процесу у фазу проліферації і
репарації, коли основним завданням стає стимуляція росту й дозрівання
сполучної тканини (Васютков В.Я. и соавт., 1999).

Удосконалення технологій одержання рекомбінантних препаратів дозволило
застосувати в якості лікувальних заходів такі методи модифікації
клітинного пулу хронічних виразкових дефектів нижніх кінцівок, як
топічне використання рекомбінантних цитокінів: фактора росту
фібробластів (Richard J. L. et al., 1995,

Robson M.C. et al., 1992,), епідермального фактора росту (Falanga V. et
al., 1992, Schultz G. et al., 1991),
гранулоцитарно-макрофагального колонієстимулюючого

фактора (Da Costa R. M. et al., 1997), трансформуючого
фактора росту-?

(Robson M.C. et al., 1995), інтерлейкіну-1 (Robson M.C. et al., 1994).

Однак дані про ефективність цих підходів неоднозначні, оскільки
немає точних спостережень відносно патологічних змін рецепторного
апарату фібробластів хронічного виразкового дефекту, залишається
невизначеною незворотність цих змін, потребують на уточнення можливості
терапевтичного впливу з урахуванням застосування технологій
клітинно-тканинного культивування.

Одним з найбільш перспективних напрямків створення адекватних
терапевтичних схем є застосування трансплантатів культур клітин і
тканинних еквівалентів при лікуванні даної патології, причому
спостерігається підвищений інтерес до використання фетальних тканинних
препаратів, що ґрунтується на їхній здатності до відновлення процесів
фізіологічної регенерації як за рахунок стовбурових клітин різного
рівня потентності, так і відновлення тканинних дефектів за рахунок
стимуляції проліферації збережених диференційованих клітинних популяцій
(Trent J.F. et al., 1998, Богачев В.Ю. и соавт., 2001, Veves A.

et al., 2001, Harding K.G. et al., 2002).

У цьому напрямку особливого значення набуває вивчення взаємодій між
фетальними клітинами як клітинами – індукторами репаративних процесів і
клітинними популяціями тканини-мішені. На сьогодні визнаним є факт
передачі інформації від клітини до клітини за допомогою рецепторного
апарату, що здатний визначати не тільки тип та стадію диференціювання
клітини, але і її функціональний стан. Тому виявлення антигенів
клітинної поверхні фетальних фібробластів (ФФ) і фібробластів хронічного
виразкового дефекту (ФХВД), взаємодій між цими клітинними популяціями є
одним з важливих завдань у вивченні спрямованості дії ембріональних
препаратів на патологічний процес.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота була
виконана в лабораторії клітинного та тканинного культивування Інституту
невідкладної і відновної хірургії ім. В.К. Гусака АМН у рамках
науково-дослідницької роботи за планом АМН України “Розробити
клітинно-тканинні технології для хірургічної профілактики й лікування
хронічних виразково-раневих дефектів нижніх кінцівок” (№ держреєстрації
0104U006347, термін виконання 2004-2006 р.р.)

Мета дослідження: визначити функціонально-фенотипічні зміни фібробластів
хронічної венозної виразки нижніх кінцівок і можливості їхньої
корекції з використанням методів клітинного культивування.

Завдання дослідження:

Визначити поверхневі рецептори культивованих фетальних фібробластів і
фібробластів здорової шкіри (ФЗШ).

Вивчити особливості рецепторного апарату та проліферативної активності
фібробластів хронічного виразкового дефекту.

Розробити культуральну модель для вивчення процесів спрямованої
модифікації рецепторного апарату фібробластів хронічного виразкового
дефекту іn vіtro.

Визначити резервні можливості відновлення рецепторного апарату
фібробластів хронічного виразкового дефекту з використанням методів
сукупного культивування з фетальними фібробластами.

Оцінити отримані результати для теоретичного обґрунтування можливості
клінічного використання запропонованої методики.

Об’єкт дослідження – комплекс мембранних антигенів культивованих
фетальних фібробластів, фібробластів здорової шкіри та фібробластів
хронічного виразкового дефекту. Мікс-культури фетальних фібробластів та
фібробластів хронічного виразкового дефекту.

Предмет дослідження – функціонально – фенотипічна модифікація
фібробластів хронічного виразкового дефекту у мікс-культурі з фетальними
фібробластами.

Методи дослідження: для одержання культур клітин і створення
мікс-культур використовувався метод культивування.

Для визначення фенотипу клітин застосовувалися методи
імунофлуоресцентного маркування поверхневих клітинних структур з
використанням моноклональних антитіл (МКА), які були рекомендовані для
специфічного маркування поверхневих антигенів на 7-мій Міжнародній
робочій нараді з питань лейкоцитарних антигенів (Harrogate, UK, 2000):
адгезивні молекули міжклітинної взаємодії – CD22, CD44, CD50, CD54,
CD56, CD166, молекули адгезії до ендотеліальних клітин й адгезивні
молекули ендотеліоцитів – CD31, CD106, CD62E, CD62P, CD62L, молекули, що
забезпечують адгезію до міжклітинного матриксу – CD11a, CD11b, CD11c,
CD29, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD41a, CD51, CD104,
молекули, відповідальні за активацію імунокомпетентних клітин – CD1a,
CD2, CD23, CD24, CD36, CD40, CD58, CDw60, CD95, CD141, CD147, CLA,
рецептори факторів росту і інтерлейкінів – CD140?, CD140в, ІL-1б-R,
ІL-1в -R, CD126, CD128, молекули МНС (Major Histocompatibility
Complex) – HLA A,B,C, HLA-DR, CLІР, HLA-DQ.

Для кількісного виміру клітинної проліферації був використаний
МТТ(methylthіazoletetrazolіum) – аналіз.

Для вивчення клітинних елементів мікс-культур був застосований метод
фарбування клітин вітальними РКН-барвниками (запатентовані барвники,
тропні до ліпідних регіонів мембрани клітини – РКН67 та РКН26), а також
одночасне маркування PKH-пофарбованих клітин специфічними МКА.

Наукова новизна роботи. Уперше описані фенотипи ФФ, ФЗШ та ФХВД
відповідно до панелі МКА, що використовувалась. Уперше визначені
функціонально-фенотипічні особливості цих типів клітин. На мембрані
ФХВД, у

порівнянні з ФЗШ, знижений рівень експресії або відсутні молекули
костимуляції та активації міжклітинних взаємодій (CD58, CDw60, CD141),
рецептори адгезії (СD166, CD56, CD54) та б2, б4, б6 ланцюги інтегринів,
які необхідні для формування повноцінних рецепторів до колагену,
ламініну та фібронектину.

Уперше розроблено культуральну модель для вивчення процесів спрямованої
модифікації рецепторного апарату фібробластів іn vіtro.

Уперше доказано можливість модифікації рецепторного апарата ФХВД
(відновлення б2 та б4 ланцюгів інтегринових рецепторів на поверхні) та
стимуляції проліферативної активності у мікс-культурі з ФФ.

Практичне значення отриманих результатів. На підставі отриманих даних
зроблено патогенетичне обґрунтування використання культивованих
фетальних фібробластів для підвищення медичної ефективності лікування
хронічних венозних виразок. Результати проведених досліджень дали змогу
доповнити схему лікування хворих із хронічними виразками нижніх кінцівок
венозної етіології методами трансплантації культивованих фетальних
фібробластів.

Впровадження результатів дослідження в практику. Матеріали дисертаційної
роботи включені до програми навчання на кафедрі комбустіології,
пластичної хірургії та урології Донецького державного медичного
університету ім. М. Горького (акт впровадження від 28.08.2006 р.),
матеріали Деклараційного патенту на винахід № 68580 А (51) UA, МПК
А61К38/39 „Спосіб стимуляції проліферативних процесів у рані шляхом
внесення до неї колагенового гелю з культивованими фібробластами”
впроваджені в лікувальний процес у відділенні загальної хірургії,
опіковому відділенні та у відділенні судинної хірургії ІНВХ ім. В.К.
Гусака АМН (акт впровадження від 02.02.2006 р.), матеріали дисертаційної
роботи і Деклараційного патенту на корисну модель № 8551 UA, МПК
А61В5/00 „Спосіб імунофлуоресцентного маркування поверхневих антигенів
зафіксованих на скельцях адгерентних клітин у культурі з використанням
моноклональних антитіл для флуоресцентної мікроскопії” включені в
програму навчання на кафедрі мікробіології, вірусології та епідеміології
Донецького державного медичного університету (акт впровадження від
23.08.2006 р.), а також прийняті до практичного використання в
лабораторії фундаментальних досліджень відділу експериментальної
хірургії ІНВХ ім. В.К. Гусака АМН України (акт впровадження від
14.02.2006 р.).

Особистий внесок здобувача. Разом з науковим керівником
професором

О.А. Труновой розроблена концепція роботи, сформульовані мета та

завдання роботи. Дисертанткою особисто створено методичну
основу роботи,

адекватну меті та завданням дослідження. Власне здобувачкою проведено
удосконалення методу маркування структур клітинної поверхні в культурі
адгерентних клітин, а також всі дослідження з фенотипування
культивованих

клітин, МТТ-аналіз, розробка експериментальної культуральної моделі
(мікс-культури) та маркування поверхневих антигенів РКН-розділених
культур, математична та статистична обробка матеріалу, його аналіз і
узагальнення, підготовка та впровадження методичних документів.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи було
представлено та обговорено на конференціях: Міжнародній
науково-практичній конференції, присвяченій 45-річчю Донецького
опікового центру “Сучасні питання лікування термічних уражень і їх
наслідків” (Донецьк, 2005), науково-практичній конференції з міжнародною
участю “Рани м’яких тканин та ранова інфекція” (Київ, 2005),
Всеукраїнській хірургічній науково-практичній конференції “ІІ
Скліфосовські читання” (Полтава, 2006), VІІІ науково-практичній
конференції з актуальних питань клінічної і лабораторної імунології,
алергології та імунореабілітації (Київ, 2006).

Публікації. Матеріали дисертації знайшли відображення в 17 роботах:
опубліковано 5 статей у виданнях, занесених до переліку ВАК України, у
тому числі самостійно – 1 стаття, 9 тез, отримано 2 Деклараційних
патенти України на винахід і 1 Деклараційний патент України на корисну
модель.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 143 сторінках
машинописного тексту й складається зі вступу, огляду літератури, опису
матеріалів і методів дослідження, 3 розділів власних спостережень,
обговорення, висновків, списку використаних джерел. Дисертація
ілюстрована 25 таблицями та 68 малюнками. У бібліографічному покажчику
на 18 сторінках міститься 187 джерел (з них 74 вітчизняних і
російськомовних та 113 зарубіжних).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали й методи дослідження. Фібробласти трофічних виразок було
отримано від 20-ти пацієнтів із хронічними венозними виразками нижніх
кінцівок. Біопсійний матеріал забирали під час висічення виразкових
дефектів із крайових неепітелізованих частин виразок.

Біоптати для одержання культури ФЗШ відбиралися під час планових
операцій грижосічення з приводу вентральних гриж у 10 пацієнтів віком
від 45 до 56 років.

ФФ виділяли з абортивного матеріалу, отриманого в ході планових операцій
з переривання вагітності при строках гестації 6-8 тижнів.

Клітинні культури: культуру ФХВД і культуру ФЗШ одержували методом
експлантатів. Зразки було подрібнено до розмірів приблизно 1 мм2
і вміщено в

культуральні флакони 25 см2 (Сostar, США) у середовище Ігла (Інститут
поліомієлітів і вірусних енцефалітів, Москва) з 10% ембріональною
телячою сироваткою (ЕТС) (Біолот, Росія). Зміну середовища
проводили кожні 3-4 доби

культивування. Після візуальної оцінки можливості перенесення мігруючих
та/або проліферуючих клітин за щільністю клітин навколо експлантата,
фібробласти знімалися з культурального флакона з використанням трипсин
/ ЕДТА – суміші (Sіgma, США) у співвідношенні 0,05 %: 0,02% у ФСБ
(рН=7,4). Культивування проводили з використанням живильного середовища
Ігла з додаванням 10% ЕТС в CO2-інкубаторі при 37ос і 5 % CO2.
Пасируванню піддівали лише культуру ФЗШ, використовуючи трипсин / ЕДТА –
суміш у співвідношенні 0,05% : 0,02% у ФСБ (рН=7,4). Коефіцієнт
пасирування становив 1:2.

Культуру ФФ одержували після виділення фібробластів шляхом східчастої
трипсинізації 0,25% розчином трипсину (Інститут поліомієлітів і вірусних
енцефалітів, Москва) фрагментів шкірно-м’язової тканини ембріону при
температурі 37оС. Інгібування трипсину здійснювали за допомогою
сироватки великої рогатої худоби (Біолот, Росія). Культивування
проводили у живильному середовищі Ігла, додаючи 10% ЕТС, в
CO2-інкубаторі при 37ос і 5 % CO2. Пасирування здійснювали аналогічно
культурі ФЗШ.

Мікроскопічний контроль культивування здіснювався за допомогою
інвертованого мікроскопа LEІCA DM ІL і системи відеодокументації
зображення LEІCA QWіn500 Standart (Germany).

Мікс-культуру ФФ і ФХВД (mіx-культура) для проведення МТТ-аналізу
одержували в такий спосіб: ФФ 5 пасажу змішували з ФХВД у
співвідношенні 1:2. Сукупне культивування проводили на протязі 5 діб з
використанням 5 ліній культур ФХВД та 5 ліній ФФ.

Для фарбування вітальними барвниками та мікроскопії: ФФ 5 пасажу, які
були попередньо пофарбовані барвником РКН67 Green (Sіgma, США),
змішували з попередньо пофарбованими ФХВД барвником РКН26 Red (Sіgma,
США) у співвідношенні 1:2. Фарбування вітальними барвниками
клітинних культур

проводилося відповідно до інструкції фірми-виробника Sіgma-Aldrіch, Іnc.
Далі культивування здійснювали у культуральних флаконах 25 см2 (Сostar,
США) за стандартною методикою, оцінку ступеня проліферації виконували
візуально з використанням флуоресценції на мікроскопах LEІCA DM ІL і
LEІCA DM LS, фотодокументування результатів проводили за допомогою
програми ІM50 і Leіca QWіn Standart.

Для порівняння динаміки росту та проліферації культур клітин ФФ, ФЗШ і
ФХВД був використаний метод кількісного аналізу проліферативної
активності з

використанням диметиліазол-дифенілтетразолію броміду (МТТ-аналіз).
Оптичну густину рідини вимірювали спектрофотометрично, визначаючи
поглинання як функцію від концентрації перетвореного барвника, кількість
якого прямо пропорційно залежить від кількості метаболічно активних
клітин у культурі.

В експерименті був використаний барвник МТТ (Sіgma, США) та ізопропанол
(Merck, Німеччина). Сукупне культивування ФХВД і ФФ проводилося в
24-ямкових полістиролових планшетах Costar (США) в 5 серіях, оптична
густина отриманого розчину вимірялася з використанням фотометра для
багатофункціонального аналізу Synergy HT Bіo-Tek® Іnstruments (США) за
допомогою програми КС4.

Імунофенотипування клітинних культур виконували за допомогою МКА у
культурі ФФ, ФЗШ і ФХВД з обов’язковим використанням ізотип-контролів. У
роботі були використані МКА та ізотип-контролі виробництва BD
PharMіngen (США).

Для вивчення складу мембранних антигенів, що експресуються на поверхні
фібробластів, було проведено фенотипування 10 ліній ФФ 1-10 пасажів, 10
ліній ФЗШ 1-10 пасажів і 20 культур ФХВД, отриманих після пересівання
первинної культури та культивування до утворення моношару без
пасирувань.

Статистична обробка отриманих результатів проводилась із застосуванням
статистичних пакетів “Stadia 6.0” (Куланчев А.П., 1998, посвідчення
госрегістрації №0115-97.1.0 Rus, ліцензійний №1206), “MedStat” (Лях
Ю.Е. и соавт., 2004, версія 3, серійний №MS000027) з використанням
адекватних методів біостатистики (описової статистики, кореляційного,
регресійного та дисперсійного аналізу). Кількісні характеристики
випадкових величин представлені в матеріалах дисертації переважно у
вигляді середніх значень та помилок середніх значень. Для вибірок з
розподілом, відмінним від нормального (за критерієм ?2)
використовувалися критерії медіанних зрушень. Факторні ефекти
оцінювалися за критеріями Н-статистики непараметричного однофакторного
дисперсійного аналізу Крускала – Уоллиса (Гланц С., 1999).

Для аналізу отриманих даних фенотипування клітинних культур був
використаний підхід перекладу якісних показників у напівкількісні –
бали.

Для порівняння проліферативної активності клітинних ліній
використовувався метод оцінки розходжень параметрів регресій лінійних
моделей з обчисленням t-статистики Ст’юдента (Гланц С., 1999).

Отримані результати і їх обговорення. Аналіз показників часу, коли
можливе пересівання первинної культури ФХВД, показав, що одержання
достатньої

кількості клітин з експлантату ФЗШ можливе на 15,1±0,4 доби, а у випадку
введення біоптату ФХВД у ростовому середовищі достатня кількість
проліферуючих/мігруючих клітин для пересівання й подальшого
культивування досягається лише на 27,5 ±1,1 доби. Таким чином,
проліферація/міграція клітин з

біоптату хронічної венозної виразки відбувається практично в 2 рази
повільніше (рAE® ` ’ ” – ? `„? ? ? ? ? e e  c¤0 i „?th^„?th A yyyyooiiiiiyyyyyiiiiicUU 5o7¶=4BAENGzGoessoOC??????CCY— .zGNHPHRH:IjJOKAEL3/4NeOIP?XbY’[>]@]?_ `oaeae****EE»»»»»±±Y

d

d

d

d

&

d

&

d

d

d

`„Ae

???

??

??

??

??

??

????l????

??

??

??

??

??

??

71 ± 0,121 0,04 ± 0,021***

49c (Integrin б3 / C3 II.1) 2,81 ± 0,131 3,58 ±1,151*

49d (Integrin б4 / 9F10) 4,10 ± 0,072 0,04 ± 0,011***

49e (Integrin б5 / IIA1) 4,81 ± 0,064 2,42 ±0,133***

49f (Integrin б6 / GoH3) 1,73 ± 0,172 0,04 ± 0,024**

141 (Fetomodulin / V1 E013R) 4,12 ± 0,151 2,54 ± 0,171**

95 (Fas, Apo-1 / DX2) 0,87 ± 0,162 0,15 ± 0,071**

(HLA A,B,C / G46-2.6) 0,18 ± 0,053 0*

Примітка: * – р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020