НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. АКАД. О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

УШКО Яна Анатоліївна

УДК 612. 11: 577. 112

Функціональні реакції системи неспецифічного захисту та імунної системи
при стресі за умов блокади опіатних рецепторів

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Луганському національному педагогічному університеті

імені Тараса Шевченка

Науковий керівник: доктор медичних наук,

професор Луганського національного

педагогічного університету

імені Тараса Шевченка

ЛУНІНА Неллі Василівна

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

професор національного

університету імені Тараса

Шевченка КОСЕНКО Анатолій

Федорович

доктор біологічних наук,

провідний науковий співробітник

інституту ендокринології і обміну

речовин імені Василя Павловича

Комісаренка ОЛІЙНИК Борис

Власович

Провідна установа: інститут геронтології АМН України

Захист дисертації відбудеться „.16..”…травня…………… 2006 року
о ..14…….годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.
26.198.01 при Інституті фізіології ім. акад. О.О.Богомольця НАН України
(01024, Київ, вул. акад. Богомольця, 4)

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім.
акад. О.О.Богомольця НАН України (01024, Київ, вул. акад. Богомольця, 4)

Автореферат розісланий „.07…” …..квітня……….. 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних
наук…………………………………………….
З.О.Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Концепцію стресу запропонував і обґрунтував Г. Сельє
(Сельє Г., 1982). Під стресом він розумів неспецифічний комплекс
реакцій, що забезпечує живій системі перехід на новий рівень існування.
Цей комплекс був сформований у процесі еволюції шляхом відбору.

Життя сучасної людини перенасичене різноманітними по модальності, силі
та тривалості стресовими впливами, що дозволяє стверджувати існування
комплексу неспецифічних змін, успішність адаптації до якого визначається
чутливістю, надійністю, економічністю, резервною потужністю адаптивних
механізмів. З одного боку, стрес обумовлює розвиток адаптації, з другого
– може бути причиною виникнення серцево-судинних, нервових, психічних та
ендокринних захворювань (Меерсон Ф.З., 1984; Хайдарлиу С.Х., 1984;
Фурдуй Ф.И., 1986; Олійник С.П., 1998).

Адаптаційні перебудови в організмі відбуваються шляхом мобілізації
нейрогенної та гормонально-гуморальної ланок регуляції. У відповідь на
стимул змінюється активність центральної нервової системи, одночасно
відбувається активація гіпоталамо-гіпофізарно-адренокортикальної
системи. Всі ці зміни спрямовані на відновлення та підтримку гомеостазу
(Меерсон Ф.З., 1983, 1986; Гольдберг Е.Д., 1990; Чехов А.А., 1993).

У підтримці гомеостазу при стресі важливу роль відіграє імунна система
організму. При формуванні адаптаційного синдрому відбуваються зміни
продукції, диференціації, міграції та функціонального стану
імунокомпетентних клітин (Титова Н.Г., 1996; Хаитов Р.М., 2000;
Кетлинский С.А., 2002). Паралельно змінюється кількість деяких
біологічно активних речовин, які мають імунотропну активність.

Найбільш чисельними та поліфункціональними біологічно активними
речовинами, які впливають на життєдіяльність організму, є ендогенні
опіоїдні пептиди. Роль ендогенних опіоїдних пептидів підтверджується
тим, що стресорні дії призводять до підвищення рівня ендогенних
опіоїдних пептидів за рахунок їх синтезу. Дані про вплив опіоїдів на
імунологічну активність суперечливі, але, незважаючи на це, ендогенні
опіоїдні пептиди визнаються фізіологічними регуляторами імунної
відповіді (Зозуля А.А., 1982, 1986, 1987; Насонов Е.Л., 1987; Утешев
Б.С., 1990; Ляшев Ю.Д., 2002).

Порушення імунореактивності, які безпосередньо пов’язані з дією
стресорів, потребують вивчення механізмів змін в імунній системі при
розвитку стрес-реакції. Розуміння механізмів регуляції імунної системи
опіоїдними пептидами, ефекти яких спрямовані на розвиток імунної
відповіді є актуальним. На сучасному етапі мало вивченими є питання
опосередкованого впливу ендогенних опіоїдних пептидів на імунну систему
організму. Зокрема, не з’ясованим залишається питання про вплив
опіоїдних пептидів на стан лізосомального апарату нейтрофілів та
залежність від нього імунної системи при стресі. Таким чином,
дослідження у цьому напрямку можуть бути основою розробки нових шляхів
корекції імунного статусу організму.

Дослідами лабораторії ЛНПУ імені Тараса Шевченка під керівництвом
професора Луніної Н.В. вперше показано, що будь-які стресорні впливи на
організм викликають відповідну реакцію також з боку лізосомального
апарату нейтрофілів. При цьому, в циркулюючих нейтрофілах шляхом
екзоцитозу відбувається зменшення кількості азурофільних гранул
(лізосом). У результаті до кровотоку надходять лізосомальні ферменти
нейтрофілів, де вони і виявляють свію регуляторну дію (у тому числі і на
імунну систему), та забезпечують підтримку гомеостазу при стресі (Луніна
Н.В., 1982, 1983, 1984, 1990, 1994, 1998; Коваль С.Б., 1983, 1984, 1998;
Скрипка Е. В., 1983, 1986, 1990; Добровольская В. Е., 1994; Шейко В.І.,
1996).

Таким чином, у вивченні проблем адаптації заслуговує уваги визначення
участі ендогенних опіоїдних пептидів у регуляції імунної системи
організму при розвитку стрес-синдрому, та виявлення зв’язку системи
опіоїдних пептидів з функціональним станом системи неспецифічного
захисту.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Робота виконана згідно плану наукових досліджень Луганського
національного педагогічного університету імені Тараса Шевченка у рамках
теми “Роль лізосомальних ферментів нейтрофільних лейкоцитів у формуванні
стрес-синдрому” р/№ 0198 U 002641 з січня 1998р. по грудень 2000р.; р/№
0103 U 003605 з січня 2003р. по грудень 2005р.

Мета і задачі дослідження. Метою дослідження стало визначити
функціональний стан системи неспецифічного захисту та імунної системи
при стресі за умов блокади опіатних рецепторів.

Досягнення поставленої мети базувалося на вирішенні таких задач(

Визначити динаміку показників, які характеризують зміни функціональних
реакцій системи неспецифічного захисту при стресі: кінетику нейтрофілів
та гранулоцитопоезу, показники функціонального стану лізосомального
апарату нейтрофілів, показники фагоцитозу нейтрофілів та гемолітичну
активність комплементу.

Визначити динаміку показників, які характеризують зміни функціональних
реакцій імунної системи організму при стресі: кінетику лімфоцитів, вміст
циркулюючих імунних комплексів, рівень сироваткових імуноглобулінів.

Дослідити вплив опіоїдних пептидів на функціональнї реакції системи
неспецифічного захисту та імунної системи при стресі, та порівняти
одержані показники з таковими за умов блокади опіатних рецепторів.

Зробити аналіз залежності показників імунореактивності організму від
активності лізосомального апарату нейтрофілів при стресі.

Об’єкт дослідження – система неспецифічного захисту та імунна система
організму кролів при стресі.

Предмет дослідження – взаємозв’язок опіатергічної системи з
функціональним станом системи неспецифічного захисту та імунної системи
організму при розвитку стрес-синдрому.

Методи дослідження — основним методом дослідження є експеримент, із
моделюванням блокади опіатних рецепторів при розвитку експериментального
стрес-синдрому та наступного порівняльного статистичного аналізу даних.
Для оцінки функціонального стану нейтрофілів та імунного статусу
організму використовували кількісний аналіз та гістохімічні методи
дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів. В роботі розкриваються нові
аспекти регуляції імунологічних процесів при експериментальному стресі.

Встановлені особливості функціонального стану системи неспецифічного
захисту та імунної системи при стресі за умов блокади опіатних
рецепторів. Представлені нові відомості про взаємодію імунної та
опіатергічної систем при формуванні стрес-синдрому. Відображена
залежність імунної системи від системи опіоїдних пептидів при формуванні
імунної відповіді.

У результаті досліджень були встановлені нові факти опосередкованого
впливу опіоїдних пептидів на імунореактивність організму при стресі за
рахунок впливу на стан системи нейтрофільних гранулоцитів та її функції.

Показано, що блокада опіатних рецепторів призводить до розвитку
рівномірно супресивного типу імунного статусу, що характеризується
розвитком нетривалої лімфопенії, яка обумовлена зниженням кількості Т-
та В-лімфоциті, зниженням кількості загального рівня ЦІК, та
пригніченням фагоцитарної активності нейтрофілів.

Зроблені припущення щодо отриманих змін функціонального стану системи
неспецефічного захисту та імунної системи після стресу за умов блокади
опіатних рецепторів. Отримані теоритичні відомості можуть слугувати для
подальших досліджень у цьому напрямку.

Практичне значення одержаних результатів. У роботі обґрунтований
взаємозв’язок системи неспецифічного захисту, імунної системи та системи
опіоїдних пептидів при стресі

Отримані результати можуть бути використані для пояснення механізмів
виникнення захисних реакцій при стресі. Встановлена участь опіоїдних
пептидів у безпосередній та опосередкованій регуляції імунітету. Це дає
можливість спрямовано впливати на імунну систему за допомогою речовин,
які наділені опіатною активністю, або регулювати їх вплив за допомогою
антагоністів опіатних рецепторів.

Отримані факти вказують на імуномоделюючий характер опіоїдних пептидів.
Ці відомості можуть бути використані у практичній медицині для лікування
імунодефіцитних станів. Тому проведене дослідження може стати основою
розробки ефективних імуномодулюючих ліків.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведений збір, науковий
аналіз літературних джерел за предметом дисертаційної роботи та його
узагальнення. Досліджено функціональний стан імунної системи та
нейтрофілів периферичної крові у кролів за умов іммобілізаційного
стресу. Проведено статистичну обробку та аналіз одержаних результатів,
інтерпретацію наукових положень та висновків.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи доповідалися на
конференції у Луганському національному аграрному університеті (2001
рік); на щорічних наукових конференціях Луганського національного
педагогічного університету імені Тараса Шевченка (2002 – 2004 роки); на
III Міжнародній медичній конференції студентів та молодих учених (м.
Дніпропетровськ, 26-28 вересня 2002 рік); на Міжнародній конференції
студентів та молодих учених (м. Львів, 11-13 квітня 2003); на I
Міжрегіональній конференції молодих вчених: студентів, магістрантів,
аспірантів, докторантів (м. Луганськ, 20-21 травня 2003 рік).

Публікації. За результатами досліджень опубліковано 13 наукових робіт,
серед яких 6 статей у журналах та збірниках наукових праць, і 7
робіт тезового характеру.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 150 сторінках і
містить список скорочень. Складається зі вступу, огляду літератури,
розділу описання матеріалів і методів дослідження, двох розділів
результатів власних досліджень, розділу аналізу і узагальнення
результатів дослідження, висновків, списку використаних джерел (302
найменування). Робота ілюстрована 33 рисунками та містить 6 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень

Дослідження проведені на на безпородних кролях, обох статей 5 – 7-и
місячного віку, вагою 3-4 кг.

Тварини були розподілені на дві групи: перша – контрольна – кролі
підлягали тільки дії стресора; друга – дослідна – дія стресора
відтворювалась на фоні блокади опіатних рецепторів.

Стресову ситуацію моделювали за допомогою іммобілізації кролів у
положенні на спині впродовж дванадцяти годин (Ведяев Ф.П.
Воробьева Т.М., 1983; Хайдарлиу С.Х., 1984).

Термін експерименту склав 14 діб. Спочатку визначали необхідні
показники, потім вводили налоксон, а через 15 хвилин кролі підлягали
іммобілізації. Подальше дослідження показників проводили на 1, 2, 3, 4,
6, 8, 10, 12, 14 добу експерименту.

Кінетику нейтрофілів визначали за допомогою підрахунку абсолютної їх
кількості у крові та показників, які характеризують гранулоцитопоез
(Кост Е.А. 1968; Меньшов В.В., 1987).

Функціональний стан лізосомального апарату нейтрофілів оцінювали за
кількістю лізосом (Пигаревский В.Е., 1978) та катіонних білків
(Славинский А.А. Никитина Г.В., 1999), з наступним розрахунком
абсолютної кількості дегранульованих клітин, ступеня дегрануляції та
декатіонізації, індексу дегрануляції. Інтенсивність вивільнення
лізосомальних ферментів нейтрофілів у кров’яне русло оцінювали за
активністю в сироватці крові їх маркера – кислої фосфатази (визначали за
допомогою “набору для визначення кислої фосфатази” (Науково-виробнича
фірма “SIMKO Ltd.” 290000, Львів, а/с 335)). Визначали гемолітичну
активність комплементу (Пастер Е.У., Овод В.В., 1989; Чеботкевич В.Н.,
Лютинский С.И., 1998); показники фагоцитозу нейтрофілів; показники
НСТ-тесту нейтрофілів (Чеботкевич В.Н., Лютинский С.И., 1998; Шишкина
Л.Н., 1998).

Функціональний стан імунної системи визначали за такими показниками:
абсолютна кількість лімфоцитів (Меньшов В.В., 1987); абсолютна кількість
Т- та В-лімфоцитів, абсолютна кількість Т-хелперів та Т-супресорів
(Пинчук В.Г., Глузман Д.Ф., 1990); рівень сироваткових імуноглобулінів
(IgG, IgA, IgM), рівень циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) (Пастер
Е.У., Овод В.В., 1989; Чеботкевич В.Н., Лютинский С.И., 1998)

Вивчення впливу ендогенних опіоїдних пептидів здійснювали шляхом блокади
рецепторів опіоїдних пептидів синтетичним антагоністом – налоксоном у
дозі 0,4 мг/кг (виробництво Харківське державне фамацевтичне
підприємство “Здоров’я народу”, Р. 01.99/00143. Налоксон-М 0,04% розчин
по1мл. у ампулах). Препарат вводили внутрішньом’язово у стегно за 15
хвилин до іммобілізації та кожні 6 годин протягом всього експерименту.

Статистичне підрахування результатів проводилось за загальноприйнятою
методикою (Монцевичюте – Эрингене Е.В., 1964; Ефимова М.Р., 1999; Лапач
С.Н., 2000)

Результати досліджень та їх обговорення

Динаміка показників, які характеризують функціональний стан системи
неспецифічного захисту за умов наявності опіоїдних пептидів та блокади
опіатних рецепторів при стресі. У результаті досліджень встановлено, що
у контрольній групі тварин дванадцятигодинна іммобілізація викликала
розвиток закономірного комплексу неспецифічних змін, які виникають в
організмі при дії будь- яких надзвичайних подразників. Обов’язковим
компонентом цього комплексу є зміни з боку системи крові (Горизонтов
П.Д., 1983).

Так, у периферичній крові в контрольній групі тварин спостерігався
розвиток нейтрофільного лейкоцитозу. Максимальних значень абсолютна
кількість нейтрофілів у периферичній крові набувала на 4-у добу
дослідження, та відновлювалася до кінця експерименту (Рис.1).

За даними літератури, підвищення кількості циркулюючих нейтрофілів у
перші чотири доби було обумовлено мобілізацією кістковомозкового резерву
гранулоцитів та виходом нейтрофілів з маргінального пулу в кровоток
(Горизонтов П.Д., 1983; Панин Л.Е., 1987; Дыгай А.М., 1989; Гольдберг
Е.Д., 1991). Про це свідчить зменшення кількості клітин гранулоцитарного
ряду в кістковому мозку на початку експерименту (Рис.2). У подальші
строки експерименту нейтрофільний лейкоцитоз був обумовлений процесами
проліферації та дозрівання мієлоїдних клітин.

В дослідній групі, в умовах блокади опіатних рецепторів не
спостерігалося розвитку нейтрофільного лейкоцитозу (Рис.1) та
постіммобілізаційної активації гранулоцитопоезу (Рис.2). Абсолютна
кількість клітин грануцатарного ряду, а також абсолютна кількість
клітин проліферуючого (Р<0,001) та зріючого (Р<0,001) пулів у тварин дослідної групи вірогідно не відрізнялися від вихідних величин на протязі усього експерименту. Рис.1 Абсолютна кількість нейтрофілів ((109/л) у периферичній крові кролів після іммобілізації та блокади опіатних рецепторів Рис. 2. Абсолютна кількість клітин гранулоцитарного ряду ((((((л) після іммобілізації та блокади опіатних рецепторів Отримані результати дозволяють висунути припущення, що налоксон відміняє фізіологічний ефект мет-енкефаліну, оскільки відомо, що в умовах стресу в надниркових залозах разом з глюкокортикоїдами виробляється переважно мет-екефалін, дія якого на кровотворну систему виявляється у розвитку адаптивної кістковомозкової гіперплазії. Він специфічно взаємодіє з (-рецепторами, антагоністом яких у першу чергу є налоксон (Олейник В.А., 1985; Сергеев П.В., 1987; Гольдберг Е.Д., 1989; Захарова О.Ю., 1989). Також можна припустити, що опіоїдні пептиди виконують у кістковому мозку роль місцевих регуляторів клітинної продукції. Тому, можливо, ендогенні опіоїди можуть бути регуляторними пептидами з паракринним типом дії для системи крові. Крім того, ефект опіоїдних пептидів може реалізуватися також безпосередньо через рецептори на клітинних елементах, які утворюють гемопоезіндуковане мікрооточення (Т-лімфацити, макрофаги та ін.) за рахунок зміни секреції короткодистантних гуморальних факторів, що регулюють проліферацію та диференціювання гемопоетичних клітин-попередників. Відсутність нейтрофільного лейкоцитозу у другій групі (виняток склала 4-та доба, коли відзначався незначний нейтрофільоз) (Рис.1) можливо призвела до відсутності активації гранулоцитопоезу в дослідній групі. Досліджувалася також активність кислої фосфатази у сироватці крові тварин тому, що вона вважається маркером лізосомальних ферментів нейтрофілів, і характеризує функціональний стан цих клітин. У результаті спостерігалися зміни кількості кислої фосфатази у сироватці крові в обох групах (Рис.3). Рис. 3. Активність кислої фосфатази у сироватці крові (нмоль/(л*с)) після іммобілізації та блокади опіатних рецепторів Але у дослідних тварин її кількість значно нижча, ніж у контрольних, і мала максимальне значення лише у першу добу експерименту. Тоді, як у контрольній групі відбувалося поступове підвищення кількості кислої фосфатази до 4-ї доби, коли і відзначалося її максимальне значення. Відповідно поставленій меті визначали ступінь дегрануляції нейтрофілів. У результаті з’ясувалося, що в обох групах тварин ступінь дегрануляції був однаковим (Р<0,001). Таким чином, зменшення активності кислої фосфатази у плазмі крові в другій групі тварин, на наш погляд, можна пояснити відсутністю нейтрофільного лейкоцитозу під час стресу. Досліджувалися показники фагоцитарних реакцій організму та гемолітична активність комплементу. Саме цей ланцюг здійснює захист організму протягом перших 96 годин після стресу. Саме в ці строки починається розвиток адаптаційної імунної відповіді. За функціональним станом зазначених вище систем можна прогнозувати інтенсивність специфічних реакцій організму при стресі (Чеботкевич В.Н., Лютинский С.И., 1998). Результати нашого дослідження вказують на те, що у контрольній групі після іммобілізації гемолітична активність комплементу у сироватці крові підвищувалася та досягала максимальних значень на третю добу експерименту (+20,0±0,45; Р<0,001). У дослідних тварин підвищення гемолітичної активності комплементу у сироватці крові було незначним з максимальним значенням показника на шосту добу (+5,8±0,28; Р<0,001). Була також підтверджена залежність між активністю комплементу та рівнем кислої фосфатази у сироватці крові (Добровольская В. Е., 1994). Цю залежність відбиває коефіцієнт кореляції, який склав у контрольній групі r = 0,9, а у дослідній r = 0,82. Дослідження фагоцитозу є корисним інструментом загальноклінічної діагностики. Це в першу чергу належить до нейтрофілів крові: вони сприймають численні сигнали про дестабілізацію внутрішнього середовища, змінюють свій функціональний вигляд, що свідчить про порушення гомеостазу (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989). Наше дослідження дозволяє проаналізувати кисеньзалежний та кисеньнезалежний механізми фагоцитозу. Так, показники фагоцитозу нейтрофілів у контрольних тварин знижувалися у післяіммобілізаційний період. Це відобразилося у порушенні травної здатності нейтрофілів. У контрольних тварин порушення травної здатності нейтрофілів відбувалося з 6-ї по 10-у добу (Р<0,01) після стресу (коефіцієнт завершеності фагоцитозу нейтрофілів (КЗФ) підвищувався). У тварин дослідної групи спостерігалося більш виражене зниження травної здатності нейтрофілів. Величина КЗФ перевищувала вихідні дані на протязі усього експерименту (Р<0,001), і не відновлювалася до кінця експерименту. Але, кисеньзалежні механізми фагоцитозу після стресу активувалися (Рис. 4). Підвищувалася також резервна здатність нейтрофілів до активації процесів окислювально-відновного метаболізму в першій групі. Рис. 4. Спонтанний НСТ – тест (%) після іммобілізації та блокади опіатних рецепторів Утворення активних форм кисню як у контрольній, так і в дослідній групі тварин відбувалося протягом 14-ти діб та не відновлювалося до кінця експерименту. Але максимальних значень „респіраторний вибух” у контрольних тварин набував на третю добу (Р<0,001), тоді як у дослідних – лише на восьму (Р<0,001) і тільки на 3,7 %. Ці зміни знайшли відображення у зниженні резервної здатності нейтрофілів до активації процесів окислювально-відновного метаболізму в другій групі. З даними літератури (Мазинг Ю.А., 1988; Морозов В.И., 1991) погоджується той факт, що зниження фагоцитарної активності нейтрофілів корелює із підвищенням концентрації катіонних білків та кислої фосфатази у сироватці крові. Тому головною причиною пригнічення кисеньнезалежної бактерицидності в обох групах тварин є зменшення вмісту катіонних білків та кислої фосфатази в нейтрофілах. \ | . Z \ o d f ? L I & З пригніченням кисеньзалежних механізмів фагоцитозу в другій групі тварин може бути пов’язана відсутність нейтрофільного лейкоцитозу (Рис. 1) за рахунок підвищення строку життя нейтрофілів. Цей факт пояснює також відсутність процесів відновлення у кістковому мозку (Рис. 2). Зміни показників клітинного імунітету за умов наявності опіоїдних пептидів та блокади опіатних рецепторів при стресі. У периферичній крові в обох групах тварин відбувається розвиток лімфопенії. Але, в другій групі мінімальна кількість лімфоцитів реєструвалася у першу добу експерименту (-1,4±0,17; Р<0,001), а у контрольній – на третю (-1,9±0,09; Р<0,001). Обидва показника відновлювалися до кінця експерименту. Відомо, що розвиток лімфопенії пов’язаний з міграцією лімфоідних клітин з периферичної крові у кістковий мозок, лімфатичні вузли і тканини (Горизонтов П.Д., 1983; Гольдберг Е.Д., 1991). Вважається, що підвищення міграції лімфоцитів у кістковий мозок на початку стрес-реакції реалізується при участі ?-адренорецепторів та глюкокортикоїдів (ГоризонтовО.И., Хаитов Р.М., 1980; Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., 2000). Закономірним наслідком цього є розвиток “лімфоідного піка” у кістковому мозку, що супроводжується підвищенням його імунологічної компетенції та активацією гранулоцитопоезу (Гольдберг Е.Д., 1990). Звертає на себе увагу той факт, що як в першій, так і в другій групі тварин, розвиток лімфопенії у периферичній крові відбувається переважно за рахунок Т-лімфоцитів (Рис. 5). Рис. 5. Абсолютна кількість Т-лімфоцитів ((((((л) у периферичній крові після іммобілізації та блокади опіатних рецепторів На регуляторний вплив Т-лімфоцитів у процеси кровотворення вказували також інші автори (Гольдберг Е.Д., 1991), які встановили, що Т-клітини реалізують свій вплив на рівні не тільки комітированих клітин-попередників еритро- та гранулоцитопоезу, а і більш диференційованих їх нащадків. Наявність Т-лімфоцитів у кістковому мозку необхідна також для нормального перебігу гранулоцитопоезу. Але встановленим вважається і той факт, що міграція Т-лімфоцитів у кістковий мозок залежить від рівня гормонів кори надниркових залоз (Захарова О.Ю., 1989; Гольдберг Е.Д., 1989, 1990). Гольдберг Є.Д. та співав. доказали, що глюкокортикоїди здійснюють свій регуляторний вплив на процеси проліферації та диференціювання клітин-попередників гранулоцитопоезу при стресі опосередковано, через систему Т-лімфоцитів. Зокрема, завдяки глюкокортикоїдам відбувається хомінг у кістковий мозок Т-клітин-регуляторів. Результати нашого дослідження вказують на те, що в обох групах стрес призводить до зниження кількості клітин всіх субпопуляцій Т-лімфоцитів (Т-хелперів та Т-супресорів). Але у контрольних тварин зниження було найбільш виражене на 3-ю добу, а у дослідних – мінімальні значення реєструвалися на першу добу експерименту. Нетривалу лімфопенію в умовах блокади опіатних рецепторів можна пояснити тим, що ендогенні опіоїдні пептиди стимулюють хемотаксис мононуклеарів (Зозуля А.А., 1986; Утешев Б.С., 1990). Тому, зв’язування опіатних рецепторів на мембрані лімфоцитів з налоксоном призводить до порушення даного ефекту. Також глюкокортикоїди впливають на хомінг Т-лімфоцитів у кістковий мозок. А так, як глюкокортикоїди виробляються разом з опіоїдними пептидами у надниркових залозах, і їх дії сполучені, можливо блокада опіатних рецепторів відобразилася і на синтезі глюкокортикоїдів, що і стало наслідком нетривалої лімфопенії. Однією з причин нетривалої лімфопенії може бути також відсутність нейтрофільного лейкоцитозу. Можливо з нетривалою лімфопенією пов’язана також відсутність активації гранулоцитопоезу, оскільки вважається, що опіоїдні пептиди, які синтезуються лімфоцитами можуть виконувати у кістковому мозку роль місцевих регуляторів клітинної продукції (Гольдберг Е.Д., 1990). Зміни показників гуморального імунітету за умов наявності опіоїдних пептидів та блокади опіатних рецепторів при стресі. У контрольних тварин кількість В-лімфоцитів збільшувалася в перші 4-и доби (Р<0,001), а тільки потім відбувалося їх різке зниження (Рис. 6). Збільшення кількості В-лімфоцитів на ранніх стадіях формування імунної відповіді в умовах стресу також було описано рядом авторів (Левандо В.А., 1990; Реджебова О.К., 1992). Вони висловили думку, що даний ефект може бути пов’язаний з протеолітичними ферментами нейтрофільних лейкоцитів. Подальше зменшення їх кількості (6-а – 10-а доба) можна пояснити декількома причинами. По-перше – міграцією В-лімфоцитів у периферичні лімфоїдні органи для перетворення в антитілоутворюючи клітини (Вершигора А.Е., 1990). По-друге – згідно з даними Кульберга А.Я (1985), при перетворенні В-лімфоцитів у плазматичні клітини вони втрачають таку функцію, як рецепція антигенів, але набувають здатність до продукції антитіл, а тому і не ідентифікуються. Рис. 6. Абсолютна кількість В-лімфоцитів ((((((л) у периферичній крові після іммобілізації та блокади опіатних рецепторів У дослідній групі, навпаки, спостерігалося зниження абсолютної кількості В-лімфоцитів протягом усього експерименту, з мінімальним значенням показника на першу добу (Р<0,001). Дослідження гуморальної ланки імунітету також показали, що у периферичній крові спостерігалися зміни загальної кількості циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) та рівня сироваткових імуноглобулінів (Ig) основних класів. Визначення вмісту ЦІК при стресі вважається необхідним тому, що ЦІК виступають у якості агентів, які приймають участь у регуляції імунної відповіді та підтримки зв’язку між імунною системою і іншими регуляторними системами організму, які спрямовані на його захист. А коли порушується цей зв’язок, імунні комплекси (ІК) починають виявляти патогенні властивості (Константинова Н.А., 1996). Також сила імунної відповіді цілком залежить від біофізичних властивостей ІК (склад, розмір, заряд). За розмірами розрізняють високо-, середньо- та низькомолекулярні ІК. Склад і розмір ІК визначається афінітетом антитіла, яке його утворює. Так, високомолекулярні комплекси утворюються при високому афінітеті антитіла до відповідного антигена. Вироблення низькоафінних антитіл та утворення низькомолекулярних комплексів є показником імунної нестачі. На афінність антитіл впливають: оточуюче середовище, порушення функцій макрофагів, Т-хелперів (Константинова Н.А., 1996). Наше дослідження дозволяє розглянути ЦІК за молекулярним складом. Можна відзначити, що у контрольних тварин на початку експерименту, та з 6-ї по 10-у добу у сироватці крові значно більше високомолекулярних імунних комплексів. Наприкінці експерименту підвищувався рівень низькомолекулярних комплексів. Що ж стосується середньомолекулярних комплексів, то їх кількість вірогідно знижувалася у першу добу експерименту, та з 6-ї по 10-у добу їх рівень був нижче вихідних величин. У другій групі тварин кількість високомолекулярних комплексів була нижче вихідного стану у 1-у та 14-у добу експерименту, а низькомолекулярних – на 4-у. Кількість середньомолекулярних комплексів лише у перші дві доби була вище вихідних величин, а на 8-у – вірогідно знижувалася. В інші строки дослідження їх кількість не відрізнялася від вихідних величин. Подібні зміни кількості ІК в другій групі можливо обумовлені тим, що після стресу в умовах блокади опіатних рецепторів не відбувається підвищення кількості В-лімфоцитів, які є основними продуцентами імуноглобулінів, які в свою чергу, необхідні для утворення ІК. Якщо простежити за змінами загальної кількості ЦІК, то слід відзначити, що у контрольних тварин їх кількість поступово знижувалася в перші чотири доби. У дослідних тварин загальна кількість ЦІК знижувалася з 6-ї по 10-у добу експерименту. В інші строки дослідження кількісні зміни рівня ЦІК не набували вірогідних значень (Рис. 7). Зниження загальної кількості ЦІК в обох групах після стресу може бути обумовлено процесом елімінації їх з організму. При формуванні імунних комплексів (ІК) важливим фактором є клас імуноглобуліну, який входить до складу комплексу. Тому, що імуноглобуліни визначають валентність антитіл і цим обумовлюють розмір ІК. Нами були досліджені імуноглобуліни основних класів. Встановлено, що при дії іммобілізаційного стресу у контрольних тварин у першу добу знижувалася кількість IgG, а на десяту добу визначалася максимальна кількість усіх імунноглобулінів основних класів (IgG, IgA, IgM). Рис. 7. Абсолютна кількість загального рівня ЦІК (%) після іммобілізації та блокади опіатних рецепторів У дослідних тварин, на відміну від контрольних, кількість IgG та IgA вірогідно не відрізнялась від вихідних величин на протязі усього експерименту. Кількість IgM підвищувалася з 2-ї по 6-у добу. Таким чином, можна припустити, що, зв’язавшись з опіатними рецепторами на В-лімфоцитах, опіоїдні пептиди вмикають ланку сигналів, які необхідні для нормального розвитку імунної відповіді, а налоксон блокує антитілостимулюючий ефект опіоїдних пептидів. ВИСНОВКИ Проведено експериментальне дослідження по вивченню функціонального стану системи неспецифічного захисту та імунної системи при стресі за умов блокади опіатних рецепторів. Встановлена наявність функціональних змін з боку нейтрофілів та клітинної і гуморальної ланок імунної системи, які розкривають нові аспекти регуляції гомеостазу при експериментальному стресі. Іммобілізація кролів призводить до поступового підвищення кількості нейтрофілів у периферичній крові в перші чотири доби, що обумовлено мобілізацією кістковомозкового резерву гранулоцитів. Розвиток нейтрофільного лейкоцитозу супроводжується активацією гранулоцитопоезу після четвертої доби дослідження. В умовах іммобілізації кролів відбувається активація лізосомального апарату нейтрофілів, що супроводжується збільшенням активності комплементу, пригніченням фагоцитарної активності нейтрофілів, та активацією кисеньзалежних механізмів фагоцитозу. За умов блокади опіатних рецепторів при стресі спостерігається нейтрофільний лейкоцитоз лише на четверту добу дослідження, що супроводжується відсутністю активації гранулоцитопоезу на протязі усього експерименту. Блокада опіатних рецепторів за умов стресу призводить до підвищення активності лізосомального апарату нейтрофілів, що супроводжується більш вираженим порушенням фагоцитарної функції нейтрофілів, та пригніченням кисеньзалежних механізмів фагоцитозу. Цим підтверджена участь опіоїдних пептидів у регуляції фагоцитарної функції нейтрофілів. Іммобілізація кролів призводить до зміни показників клітинної та гуморальної ланок імунітету: спостерігається розвиток лімфопенії, який відбувається за рахунок зниження Т-лімфоцитів. Кількість В-лімфоцитів підвишувалася перші чотири доби, що може бути пов’язане з вивільненням лізосомальних ферментів нейтрофілів. Вміст імуноглобулінів основних класів (IgG, IgA, IgM) підвищується лише на десяту добу дослідження, що супроводжується зменшенням вмісту загальної кількості ЦІК у сироватці крові на початку стрес-реакції. В умовах блокади опіатних рецепторів при стресі розвивається рівномірно супресивний тип імунного статусу, який характеризується зниженням показників клітинної і гуморальної ланок імунітету. Блокада опіатних рецепторів призводить до нетривалої лімфопенії за рахунок зниження як Т-лімфоцитів (у тому числі Т-хелперів і Т-супресорів), так і В-лімфоцитів. Підвищується вміст тільки IgM з другої по шосту добу дослідження, що супроводжується зниженням загальної кількості ЦІК у сироватці крові з шостої по десяту добу експерименту. Результати проведених досліджень свідчать, про участь опіоїдних пептидів в адаптаційних перебудовах в організмі при стресі, а також про опосередкований вплив опіоїдних пептидів на імунний статус організму через зміни функціонального стану системи нейтрофільних гранулоцитів та їх функції. СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Луніна Н.В., Ушко Я.А., Степаненко В.В. Вплив опіоїдних пептидів на функціональний стан лізосомального апарату нейтрофілів при стресі // Збірник наукових праць Луганського національного аграрного університету.– 2002.– № 21 (33).– С. 77-84. Ушко Я.А. Функціональна активність лімфоцитів в умовах дефіциту опіоїдних пептидів при стресі // Вісник Запорізького державного університету.– 2003.– № 1.– С. 197-201. Луніна Н.В., Ушко Я.А., Степаненко В.В. Роль опіоїдних пептидів у реакції кровотворної системи при стресі // Природничий альманах.– 2003.– № 3.– С. 75-79. Ушко Я.А., Луніна Н.В., Степаненко В.В. Вплив опіоїдних пептидів на фагоцитарну активність нейтрофілів при стресі // Вісник Луганського національного педагогічного університету.– 2004.– № 4(72).– С 107-114. Ушко Я.А., Луніна Н.В., Степаненко В.В. Гуморальна ланка імунітету в умовах дефіциту опіоїдних пептидів при стресі // Вісник Луганського національного педагогічного університету.– 2004.– № 6(74).– С. 128-134. Ушко Я.А., Луніна Н.В., Степаненко В.В. Роль опіоїдних пептидів в регуляції лізосомальними ферментами нейтрофілів функціонального стану Т-лімфоцитів при стресі // Экспериментальная и клиническая медицина. – 2004. – № 3. – С. 345-350. Луніна Н.В., Ушко Я.А. Вплив опіоїдних пептидів на гранулоцитопоез при стресі // Тези доп. III Міжнар. медичної конф. студентів та молодих учених „Медицина – здоров’я – XXI сторіччя” (Дніпропетровськ, Україна, 26-28 вересня 2002 р.).– С. 34. Луніна Н.В., Ушко Я.А., Чехова В.Є. Вплив опіоїдних пептидів на антитілоутворення при стресі // Матер. VI Міжнар. науково-практ. конф. „Наука і освіта 2003” (Дніпропетровськ, Україна, 20-24 січня 2003 р.).– Т. 3.– С. 34-35. Луніна Н.В., Ушко Я.А., Степаненко В.В. Гуморальна регуляція утворення ЦІК при формуванні стрес-синдрому // Тези доп. Міжнар. конф. студентів і молодих вчених „Екологічні проблеми міст і промислових зон: шляхи їх вирішення” (Львів, Україна, 11-13 квітня 2003 р.).– СПОЛОМ, 2003.– С. 104-105. Ушко Я.А., Степаненко В.В., Луніна Н.В. Фактори неспецифічної резистентності в умовах нестачі опіоїдних пептидів при формуванні стрес-синдрому // Наукові праці I Міжрегіон. конф. молодих вчених: студентів, магістрантів, аспірантів, докторантів „Актуальні питання біології та медицини” (Луганськ, Україна, 20-21 травня 2003 р.).– АЛЬМА-МАТЕР, 2003.– С. 87-88. Ушко Я.А., Луніна Н.В., Степаненко В.В. Активність комплементу в умовах формування стрес-синдрому // Матер. Міжнар. науково-практ. конф. „Україна наукова 2003” (Дніпропетровськ, Україна, 16-20 червня 2003 р.).– Т. 13.– С. 47-48. Ушко Я.А., Луніна Н.В., Степаненко В.В., Чехова В.Є. Регуляторний вплив опіоїдних пептидів на імунний статус організму при розвитку стрес-синдрому // Матер. II Міжнар. науково-практ. конф. „Динаміка наукових досліджень 2003” (Дніпропетровськ, Україна, 20-27 жовтня 2003 р.).– Т. 5.– С. 69-70. Ушко Я.А., Луніна Н.В., Степаненко В.В. Вплив опіоїдних пептидів на розвиток післяіммобілізаційної лімфопенії // Матер. VII Міжнар. науково-практ. конф. „Наука і освіта 2004” (Дніпропетровськ, Україна, 10-25 лютого 2004 р.).– Т. 54.– С. 61-63. АНОТАЦІЇ Ушко Я.А. Функціональні реакції системи неспецифічного захисту та імунної системи при стресі за умов блокади опіатних рецепторів. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 – фізіологія людини та тварин. – Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, Київ, 2006. Дисертаційна робота присвячена визначенню участі опіоїдних пептидів у безпосередній та опосередкованій регуляції імунної системи організму при розвитку стрес-синдрому. Встановлено, що опосередкований вплив опіоїдних пептидів на стан імунної системи організму при стресі здійснюється шляхом зміни функціонального стану системи нейтрофільних гранулоцитів та їх функцій, що підтверджує наявність функціонального зв’язку між регуляторними системами у процесі гуморальній регуляції функцій організму при стресі. За допомогою блокатора опіатних рецепторів (налоксону) показано, що після іммобілізаційного стресу не відбувається активації гранулоцитопоезу і розвитку нейтрофільного лейкоцитозу. Виявлено зниження активності лізосомального апарату нейтрофілів . Відзначено більш виражене порушення фагоцитарної функції нейтрофілів. Встановлено, що в умовах блокади опіатних рецепторів після стресу розвивається рівномірно супресований тип імунного статусу, який характеризується зниженням абсолютної кількості клітин всіх субпопуляцій Т-лімфоцитів, кількості В-лімфоцитів, загальної кількості ЦІК. У сироватці крові підвищується рівень лише IgM. Отримані дані можуть бути основою розробки нових шляхів корекції імунної відповіді при розвитку стрес-синдрому. Ключові слова: стрес-синдром, опіоїдні пептиди, лізосомальні ферменти нейтрофілів, імунна система, налоксон. Ушко Я.А. Функциональные реакции системы неспецифической защиты и иммунной системы при стрессе в условиях блокады опиатных рецепторов. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 – физиология человека и животных. – Институт физиологии им. А.А.Богомольца НАН Украины, Киев, 2006. Диссертация посвящена определению участия опиоидных пептидов в непосредственной и опосредованной регуляции иммунной системы организма при развитии стресс-синдрома. Установлено, что опосредованное влияние опиоидных пептидов на состояние иммунной системы организма при стрессе осуществляется путём изменения функционального состояния системы нейтрофильных гранулоцитов и их функций, что подтверждает наличие функциональной взаимосвязи между регуляторными системами в процессе гуморальной регуляции функций организма при стрессе. При помощи блокатора опиатных рецепторов (налоксона) установлено, что после иммобилизации не наблюдается развития нейтрофильного лейкоцитоза и, как следствие, не происходит активации гранулоцитопоеза. Данные нашего исследования позволяют предположить, что отсутствие активации гранулоцитопоэза может быть также связано с непродолжительной лимфопенией, которая наблюдалась во второй группе животных после стресса. Данное предположение основано на данных литературы, так как считается, что опиоидные пептиды секретируемые лимфоцитами могут выполнять в костном мозге роль местных регуляторов клеточной продукции. Также впервые было установлено, что после стресса у животных с блокадой опиатных рецепторов изменяется корреляционная связь между уровнем кислой фосфатази и индексом дегрануляции в контрольной (r = 0,69) и подопытной (r = 0,43) группах. Снижение корреляционной связи может свидетельствовать, что часть кислой фосфатазы выходит в плазму крови из других клеток. Данный факт может указывать на повреждение тканей при стрессе, и тем самым подтверждает антистрессорную роль опиоидных пептидов. В работе были расширены представления о функционировании иммунной системы в условиях блокады опиатных рецепторов при стрессе. В результате исследований отмечено развитие равномерно супрессивного типа иммунного статуса. Отмечалось снижение количества как Т-, так и В-лимфоцитов у животных подопытной группы. Однако в этой группе наблюдалась менее продолжительная лимфопения по сравнению с первой группой животных. Данное явление мы объясняем несколькими обстоятельствами: Во-первых: взаимодействие опиатных рецепторов на мембране лимфоцитов с налоксоном может приводить к нарушению хемотаксиса; Во-вторых: так как глюкокортикоиды вырабатываются вместе с опиоидными пептидами в надпочечниках, и их действия сопряжены, то возможно блокада опиатных рецепторов отразилась и на синтезе глюкокортикоидов, что и стало причиной непродолжительной лимфопении; В-третьих: одной из причин непродолжительной лимфопении может быть также отсутствие нейтрофильного лейкоцитоза. Получены новые данные об изменениях количества ЦИК и сывороточных иммуноглобулинов основных классов во второй группе животных после стресса. Основываясь на данных литературы можно предположить, что взаимодействие опиоидных пептидов с рецепторами на на В-лимфоцитах включает цепь сигналов, необходимых для нормального развития иммунного ответа, а введение налоксона приводит к изменению антителостимулирующего эффекта опиоидных пептидов. Впервые было показано, что блокада опиатных рецепторов приводит к угнетению фагоцитарной функции нейтрофилов. Основной причиной наблюдаемых изменений послужило уменьшение содержания кислой фосфатазы и катионных белков в лизосомах нейтрофилов. Принимая во внимание изменения показателей иммунитета у животных второй группы можно сказать, что регуляция иммунной системы зависит от уровня опиоидных пептидов и от функционального состояния нейтрофилов. Полученные результаты могут лечь в основу разработки новых путей коррекции иммунного ответа при развитии стресс-синдрома. Ключевые слова: стресс-синдром, опиоидные пептиды, лизосомальные ферменты нейтрофилов, иммунная система, налоксон. Uchko Y.A. The functional reactions of system of unspecific defense and immune system in state of stress under condition of opiate receptor’s block. – Manuscript. The thesis for a candidate’s degree by speciality 03.00.13 – human and animal physiology. – O.O.Bogomoletz Institute of Physiology of the NAS of Ukraine, Kyiv, 2006. The dissertation is devoted to the role of opioid peptides in direct and indirect regulation of immune system of organism under conditions of development of stress-syndrome. We ascertained that indirect influence of opioid peptides on the state of immune system of organism in state of stress is made through changing the functional state of neutrophile’s system and their functions, which establishes a connection between regulation systems in the process of humoral regulation of functions of organism in stress. With the help of a blockator of opiate receptors (nalaxone) it was shown that after the immobilization stress there was no activation of granulocyte formation and neutrophile leucocytosis. And also the activity of lysosomal apparatus of neutrophiles remains the same. We marked more manifested violation of the phagocytosis function of neutrophiles. We ascertained that under the conditions of deficiency of opioid peptides after stress evenly-suppressive type of immune status was being developed. We observed a decrease of absolute number of cells of all subpopulations of T-lymphocytes, B-lymphocytes and the total number of CIC (circulatory immune complex). The change of the level of serum immunoglobuline M (IgM) take place only. The data received may be used as the basis of elaboration of new ways of correction of immune reaction in stress-syndrome development. Key words: stress-syndrome, opioid peptides, lysosomal ferments of neutrophiles, immune system, nalaxone. PAGE 17

Похожие записи