.

Фізико-хімічні механізми біомолекулярного впізнавання: Автореф. дис… д-ра біол. наук / Д.М. Говорун, НАН України. Ін-т молекуляр. біології і генетик

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 5205
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
Інститут молекулярної біології і генетики

Говорун Дмитро Миколайович

УДК 577.323
577.324

ФІЗИКО-ХІМІЧНІ МЕХАНІЗМИ
БІОМОЛЕКУЛЯРНОГО ВПІЗНАВАННЯ

03.00.03 – молекулярна біологія

Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
доктора біологічних наук

Київ – 1999
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано у відділі молекулярної біофізики Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ.

Науковий консультант: доктор біологічних наук, професор, академік НАН України Мацука Геннадій Харлампійович, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ, директор, завідувач відділу структури і функцій нуклеїнових кислот.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, академік НАН України Єльська Ганна Валентинівна, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ, завідувачка відділу механізмів трансляції генетичної інформації,
доктор біологічних наук, професор Зима Валентин Леонідович, Київський університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри біофізики біологічного факультету,
доктор фізико-математичних наук, професор Харкянен Валерій Миколайович, Інститут фізики НАН України, м. Київ, завідувач відділу фізики біологічних систем.
Провідна установа: Інститут біоорганічної хімії і нафтохімії НАН України, м. Київ.
Захист дисертації відбудеться 23 листопада 1999 року о 10 годині
на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01
в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України
за адресою: 252143, м. Київ-143, вул. Академіка Заболотного, 150.
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (252143, м. Київ-143, вул. Академіка Заболотного, 150).
Автореферат розіслано 21 жовтня 1999 року.

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук,
ст. науковий співробітник Лукаш Л.Л.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Біомолекулярне впізнавання є одним із найхарактерніших атрибутів живого – воно опосередковує переважну більшість біологічно важливих процесів на молекулярному рівні (Енгельгардт, 1976). Тому пошук найбільш загальних, в ідеалі – універсальних, фізико-хімічних закономірностей, котрі лежать в його основі, є одним із фундаментальних напрямків молекулярної і структурної біології. Актуальність цього дуже непростого і вельми розлогого завдання визначається також перспективами цілеспрямованого впливу на перебіг як пара-, так і метаболічних процесів у клітинах організму шляхом синтезу сполук, вибірковість зв’язування яких близька до селективності природних молекул, та створення на їхній основі різноманітних лікарських і діагностичних молекулярних систем. Окрім того, формалізована інформація щодо природи механізмів біомолекулярного впізнавання вкрай необхідна для створення методами супрамолекулярної фізико-хімії новітніх технологій, зокрема біомолекулярної електроніки (Lehn, 1995).
Нині в царині проблеми біомолекулярного впізнавання продовжується інтенсивне накопичення експериментальних даних (в основному рентгеноструктурних і ЯМР) високої роздільної здатності та їхня систематизація. Проте цілісна картина фізико-хімічної природи специфічності до цього часу так і не викристалізувалася. Встановлено лише, що критичними параметрами останньої є площа поверхні обопільного контакту молекул-партнерів та їхня афінність. Якщо перший із них визначається, в основному, силами Ван-дер-Ваальса, то відповідальними за другий є водневі зв’язки (Н-зв’язки), так звані точкові контакти. Вважається, що внесок точкових контактів у специфічність білково-нуклеїнового впізнавання зменшується в ряду нуклеотидна основа – цукровий залишок – фосфатна група. Доведено, що білок розпізнає не середні, а локальні варіації структури ДНК. Визначальну роль у перебігу процесів білково-нуклеїнового впізнавання відіграє великоамплітудна, нелінійна динаміка молекул-партнерів, в першу чергу ДНК. Відома лише одна загальнобіологічна модель, яка концентрує в собі перелічені закономірності, – феноменологічна модель структурно-динамічної відповідності місць впізнавання (Koshland, 1958-1971). Проте внутрішня “молекулярна логіка” процесів впізнавання біополімерами один одного, як доцільно влаштованих систем, продовжує залишатися “поза кадром”.
Аналіз літератури засвідчує, що одним із “вузьких місць” проблеми білково-нуклеїнового впізнавання є обмеженість знань про ті структурно-динамічні особливості ДНК, які відповідають за її специфічну взаємодію з білком. Ось їх далеко не повний перелік: низькочастотна нелінійно-динамічна поведінка, пов’язана з передплавленням та, так званими напіврозкритими станами; здатність лінійної ДНК до низькоенергетичних локальних і інтегральних вигинів, величина яких істотньо залежить від послідовності основ; далекодія в ДНК; варіації конформації цукрово-фосфатного кістяка та відстані між сусідніми комплементарними парами основ ДНК в залежності від послідовності тощо. Так, парадоксальний з точки зору усталених поглядів на структурно-динамічну організацію ДНК висновок, зроблений на основі серії експериментів (Diekmann et al., 1986-1992), про те, що викривленість лінійної ДНК пов’язана із стекінгом, наштовхує на думку, що сучасні уявлення про його природу потребують якщо не перегляду, то принаймні якісного вдосконалення. Те ж саме стосується структурно-динамічних властивостей компонентів НК – основ, нуклеозидів, їхніх Уотсон-Криківських пар тощо. Як випливає з аналізу літератури, вже накопичилося чимало аргументів на підтвердження такої точки зору.
З іншого боку, із принципових причин проблему біомолекулярного впізнавання не можна вирішити, залишаючись в її рамках. Необхідно проаналізувати її з більш загальних позицій, а саме – як влаштовані біополімери, чим вони відрізняються від органічних полімерів-представників неживого світу і в чому полягають глибинні фізико-хімічні засади (“молекулярна логіка”) їхнього функціонування. Іншими словами, проблема біомолекулярного впізнавання не може бути подолана раніше, аніж буде створена чи, принаймні, окреслена цілісна фізико-хімічна концепція функціонування біополімерів. На превеликий жаль, здобутки у цьому напрямку більш, ніж скромні: маємо, по суті, лише одну феноменологічну модель “білок-машина” (Чернавский, 1987 -1999) і феноменологічний принцип молекулярної регуляції (Monod et al., 1963).
Отже, проблема біомолекулярного впізнавання залишається вкрай актуальною як з огляду на її непересічну теоретичну і практичну значущість, так і з урахуванням стану її недостатньої вивченості. Для свого вирішення вона потребує якісно нових підходів, які виходять за усталені рамки, що склалися в цій галузі знань.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота цілковито відповідає основному планові фундаментальних досліджень відділу молекулярної біофізики Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (завідувач відділу до 1995 року – кандидат біологічних наук, ст. науковий співробітник, доцент Желтовський М.В.). Її виконано в рамках бюджетних тем “Вивчення специфічності білково-нуклеїнових взаємодій в модельних системах різного рівня складності” (№ держ. реєстрації 01.91.0002584, 1991-1995 р.р.) і “Вивчення фізико-хімічної природи перебігу елементарних процесів білково-нуклеїнового впізнавання в модельних системах типу “мономер-мономер” та “мономер-полімер” (№ держ. реєстрації 0198U005247, 1996-2000 р.р.).
Частково робота виконувалася в рамках отриманих на конкурсних засадах вітчизняних та міжнародних проектів “Вплив метилювання нуклеотидних основ на їх впізнавання амінокислотними радикалами, що містять карбоксильну групу” (програма “Фонд фундаментальних досліджень” ДКНТ України, шифр 5/410, 1992-1993 р.р.), “Розробити методи одержання нових антиретровірусних препаратів в ряду заміщених по цукру синтетичних нуклеозидів і їх аналогів” (програма “Біотехнологія” ДКНТ України, шифр 01.11.01/027-92, № держ. реєстрації 0195U019371, 1992-1995 р.р.), “Вплив протонування та депротонування нуклеотидних основ та амінокислот на процеси точкового білково-нуклеїнового впізнавання” (програма “Фонд фундаментальних досліджень” ДКНТ України, шифр 5.2/97, 1993-1994 р.р.), “Пошук речовин з імуномодулюючими та протипухлинними властивостями серед нуклеозидів азапіримідинового ряду” (програма “Захист генофонду населення України” ДКНТ України, шифр 1.01.01/064-92, № держ. реєстрації 0195U011006, 1994 р.), “Вивчення структурно-динамічних особливостей компонентів біополімерів та їх впливу на специфічність точкових білково-нуклеїнових та нуклеїново-нуклеїнових контактів” (програма “Фонд фундаментальних досліджень” ДКНТ України, шифр 5.3/184, 1994-1997 р.р.), “Вивчення структури та фізико-хімічних властивостей низькомолекулярних водневозв’язаних комплексів, що моделюють специфічні білково-нуклеїнові контакти” (грант міжнародного наукового фонду “Україна”, шифр K1F100, 1994-1995 р.р.), “Вплив протонування та депротонування нуклеотидних основ та амінокислот на процеси точкового білково-нуклеїнового впізнавання, визначального для регулятивних механізмів клітини” (програма “Фонд фундаментальних досліджень” ДКНТ України, шифр 5.2/97, 1995 р.), “Прототропна таутомерія нуклеотидних основ: нові підходи до старої проблеми” (програма “Фонд фундаментальних досліджень” ДКНТ України, шифр 5.4/77, 1996 – т.час ) та деяких інших.
Мета і завдання дослідження. Мета роботи – встановити найбільш загальні фізико-хімічні закономір¬ності нуклеїново-нуклеїнового і білково-нуклеїнового впізнавання на мікро¬структур-ному рівні, спрямувавши основні зусилля на виявлення нових, функціонально важливих структурно-динамічних властивостей компонентів НК і модельних комплексів типу “мономер-мономер”, з’ясування їхньої квантовохімічної природи і створення на цій основі макромолекулярних моделей впізнавання.
Для досягнення цієї мети були поставлені такі комплексні завдання:
1. Вивчити основні фізико-хімічні форми структурної мінливості нуклеотидних основ: в першу чергу – стереохімічну нежорсткість, структурну ізомерію та прототропну таутомерію, а також нові аспекти спонтанного дезамінування та пошкодження кисневими радикалами і дати їм належну квантовохімічну інтерпретацію.
2. Дослідити протонодонорні, включаючи СН-кислотність, та протоноакцепторні властивості азотистих основ, що визначають їхню комплексотвірну здатність. Встановити, як змінюється структурна нежорсткість основ при їхньому протонуванні і депротонуванні та при втягуванні у міжмолекулярні Н-зв’язки.
3. Дослідити конформаційну гнучкість Уотсон-Криківських пар основ ДНК, встановити основні стереоелектронні чинники, що лежать в її основі, та проаналізувати її можливу біологічну значущість у царині біомолекулярного впізнавання.
4. Вивчити вплив стереохімічної нежорсткості основ ДНК на оптико-фізичні властивості їхніх кристалів і розвинути на цій основі нові уявлення про стекінг нуклеотидних основ та їхніх Уотсон-Криківських пар.
5. Визначити енергетику і кооперативні властивості міжмолекулярних Н-зв’язків у модельних системах нуклеїново-нуклеїнового впізнавання – кристалах і співкристалізатах основ ДНК – та її внесок у стабілізацію останніх.
6. Створити експериментальну установку для прецизійної реєстрації Раманівських спектрів біополі¬мерів та їхніх складових частин. Отримати низькочастотні ( Cyt > Ade, причому для Gua він близький до kT при фізіологічній температурі. Згодом цей висновок було підтверджено квантовохімічними розрахунками високого рівня складності (Leszczyński, Šponer et al., 1996). Вперше шляхом зіставлення величини бар’єру площинної інверсії з експериментальною частотою віялового (інверсного) коливання амінного фрагмента зафіксовано надбар’єрний характер площинної інверсії в Ade, Cyt і Gua у вигляді суттєво ангармонійного коливання великої амплітуди, котра сягає десятків градусів. Вперше зроблено принципово важливий висновок про квантову геометрію цих біологічно важливих молекул. Це означає, що врахування нульової коливальної енергії суттєво змінює геометрію молекули, яка відповідає глобальному мінімуму. Навіть при Т > 0 К Ade, Cyt і Gua є ефективно планарними молекулами (ефективна симетрія СS), при цьому величину відхилення від площинності амінного фрагмента у глобальному мінімумі ГППЕ можна розглядати як оцінку знизу амплітуди його віялового коливання. Таким чином, вдалося подолати існуючу дилему “планарність-непланарність” щодо будови нуклеотидних основ з аміногрупою. Нині експериментальні дані щодо структурної нежорсткості азотистих основ з аміногрупою відсутні, проте, на наш погляд, найкращим її доказом є непридатність гармонійного наближення для інтерпретації частот деформаційних коливань амінного фрагмента.
Зроблено узагальнення щодо анізотропії повертання аміногрупи – найбільша її величина спостерігається у тих випадках, коли аміногрупа оточена з одного боку ендоциклічним атомом азоту, а з іншого – екзоциклічним зв’язком NH чи CH, як це має місце в Cyt (5 ккал/моль) і Gua (4,4 ккал/моль за даними АМ1). За цих умов аміногрупі значно вигідніше повертатися амінопротонами у бік сусіднього подвійного зв’язку C=N, бо перехідний стан повертання у цьому випадку стабілізується кулонівською взаємодією амінних атомів водню з ендоциклічним атомом азоту і ВЕП амінного атома азоту з атомом водню сусідньої групи NH чи CH. Цю взаємодію можна розглядати як внутрішньомолекулярні Н-зв’язки, що взаємопосилюються. Повертання аміногрупи у зворотній бік значно ускладнене дестабілізацією перехідного стану кулонівським відштовхуванням ВЕП амінного і сусіднього ендоциклічного атома азоту, а також амінних і атома водню групи NH чи CH. Таким чином, вперше встановлено, що аміногрупа в канонічних нуклеотидних основах не обертається ізотропно на 360° без деформацій, як це традиційно вважалося раніше, а переважно повертається в обмеженому секторі (180°) двогранних кутів, істотньо при цьому деформуючись. Зроблено висновок, що основними стереохімічними чинниками структурної нежорсткості азотистих основ з аміногрупою є р?-спряження ВЕП амінного атома азоту з ?-електронною системою кільця, Фермі- відштовхування між амінним зв’язком NН і сусіднім зв’язком NН чи CН, кулонівська взаємодія ВЕП амінного атома азоту як з ВЕП сусідніх атомів, так і з атомом водню сусіднього зв’язку NН чи CН. Вперше встановлено взаємозалежність структурної нежорсткості азотистих основ з аміногрупою від таутомерії і геометричної ізомерії.
Наявність низьких ( 200 см-1) частот в коливальних спектрах азотистих основ, що відповідають непланарним деформаціям кільця, вказує на його квазіжорсткість: розрахунок за формулою гармонійного осцилятора з використанням літературних даних для силових постійних непланарних коливань кільця (10 – 20 ккал/моль) дає для нульової амплітуди величину, що перевищує 10°. Ця елементарна оцінка цілковито узгоджується з дослідженнями конформаційної гнучкості гетероциклів нуклеотидних основ квантовохімічними методами високого рівня складності (Шишкін, 1999).
Вперше показано, що при переході від основи до нуклеозиду спостерігається слабка тенденція до підвищення бар’єру площинної інверсії амінного фрагмента і відповідно зниження бар’єрів поворотної рухомості аміногрупи. На відміну від основ та їхніх метильованих по глікозидному азоту аналогів, де площинна інверсія амінного фрагмента відбувається у дзеркально-симетричному адіабатичному потенціалі, в нуклеозиді цей потенціал стає асиметричним, причому величина асиметрії помітно менша за бар’єр інверсії. Це означає, що для нуклеотидних основ з аміногрупою у складі нуклеозидів появляється, нехай і у динамічному сенсі, виділений напрямок “верх-низ”.
Використовуючи метод MNDO/Н, вперше вдалося показати, що канонічні нуклеотидні основи охоплені просторовою сіткою взаємозалежних внутрішньомолекулярних Н-зв’язків типу NН…О і NН…N з енергією 0,7-3 ккал/моль (яку треба розглядати як оцінку зверху). Такі уявлення підкріплюються експериментальними даними: так, зокрема, найслабший (0,7 ккал/моль) внутрішньомолекулярний Н-зв’язок N6Н’’…N7 в Ade зафіксовано рентгено¬структурними методом у кристалічному стані (Jeffrey, Saenger, 1994), а найсильніший (3 ккал/моль) N4Н’…N3 в Cyt зареєстровано нами методом ЯМР-спектроскопії у безводному диметилсульфоксиді. Для внутрішньомолекулярних Н-зв’язкві за участю аміногрупи характерно те, що при її анізотропному повертанні вони істотньо змінюють не лише свою енергетику, перемикаючись з одних атомних груп на інші, а й кількість: їхня енергія, кооперативні властивості, тип і навіть кількість не є стаціонарними характеристиками.
Прототропна таутомерія. Вперше в практиці квантовохімічного дослідження явища прототропної таутомерії азотистих основ “з прицілом” на її біологічну значимість ця задача розв’язана у максимально можливому форматі, обмеженому лише уявленнями про природу хімічного зв’язку, для досить великої кількості молекул, що послідовно ускладнюються: канонічних основ ДНК, їхніх дезамінованих аналогів та складових частин – пурину, піримідину і імідазолу (Im). Такий підхід, дозволив зафіксувати низку нових фізико-хімчних закономірностей прототропної таутомерії азотистих основ.
Так, вперше встановлено, що це явище має молекулярно-цвітеріонний характер – в ньому беруть участь усі без винятку протони, включаючи карбопротони. Показано, що пуринові основи та Im мають значно більшу схильність до цвітеріонної таутомерії, аніж піримідинові. Виявлено спільну структурну рису молекулярно-цвітеріонних таутомерів основ, що мають у своєму складі атоми кисню, – переважну цис-орієнтацію гідроксильних груп відносно сусіднього ендоциклічного атома азоту. Доведено, що планарна будова основного таутомера не є наскрізною властивістю всієї множини таутомерів.
Вперше з’ясовано, що для кожної азотистої основи пуринового ряду та Im основним таутомером-цвітеріоном з-поміж тих, що формуються шляхом міграції карбопротонів, є ілідна форма, що утворюється в результаті переходу протона при атомі вуглецю С8 (С2 в Im) на сусідній атом азоту (N7 – у пуринах, N2 – в Im). Біологічна значущість її, зокрема, полягає в тому, що вона є перехідним станом реакції Н > T(D) – обміну групи С8Н пуринових основ і групи С2Н Im у воді при сприятливих pH: молекулярно-кінетичний механізм її формування – це естафетне протонування (атома N7 пуринів і атома N3 Im) – депротонування (зв’язку С8Н пуринів і С2Н Im) за участю протонів з водного середовища. Встановлено, що у випадку пуринових основ, які мають у своєму складі аміногрупу, навіть на низькомолекулярному рівні процес обміну є конформаційно-чутливим, оскільки перехід з основної таутомерної форми в ілідну супроводжується істотним збуренням структурно-динамічних властивостей амінного фрагмента. Це означає, що швидкість обміну в групі С8Н Ade і Gua визначається не лише конформацією НК, але й її збуренням при переході в ілідну форму. Зроблено припущення про участь ілідних таутомерів пуринових основ в процесах їхнього пошкодження кисневими радикалами.
Обгрунтовано точку зору про значно більшу біологічну значущість прототропної таутомерії азотистих основ, аніж це прийнято нині. Це стосується, насамперед, високоенергетичних таутомерів, зокрема цвітеріонних, які безпосередньо не фіксуються фізико-хімічними методами, в першу чергу – спектроскопічними, в умовах термодинамічної рівноваги і гомогенності оточення (вакуум, низькотемпературна інертна матриця, розчин тощо), – так званих “прихованих структур”. Стверджується, що в умовах суттєвої гетерогенності локального оточення, як це має місце у високомолекулярних білково-нуклеїнових комплексах, більшість, якщо не всі таутомери тієї чи іншої нуклеотидної основи, можуть бути зафіксовані Н-зв’язками у відповідних місцях впізнавання. Принципових фізико-хімічних перешкод для цього не існує, оскільки характерний для них діапазон енергетичної стабільності ( 30 ккал/моль) з надлишком може бути перекритий втягуванням рідкісних таутомерів у Н-зв’язки із кількома бічними радикалами амінокислот (особливо зарядженими), що утворюють місце впізнавання. Характерним тут є приклад біосинтезу пуринових нуклеотидів – необхідною його передумовою, як відомо, є переведення основи із основної у рідкісну таутомерну форму N7Н з відкритим для приєднання цукрового залишку атомом азоту N9 імідазольного циклу, яке реалізується ферментом. Окрім того, в кристалі isoCyt співіснують дві таутомерні форми – основна, з локалізацією імінопротона при атомі N3, і рідкісна, з локалізацією імінопротона при атомі N1, енергії яких істотньо відрізняються – на 12,2 ккал/моль (за даними АМ1). Це показовий приклад того, як навіть у гомогенних умовах за рахунок залежності комплексотвірної здатності основи від її таутомерного стану міжмолекулярні Н-зв’язки стабілізують рідкісну таутомерну форму з досить високою енергією. Отже, неправомірно ставити у пряму залежність, як це традиційно робиться, біологічну значущість тієї чи іншої таутомерної форми від її енергетичної стабільності.
Вперше постульовано можливість взаємоперетворення деяких таутомерів азотистих основ за рахунок перенесення протону вздовж внутрішньомолекулярного Н-зв’язку. Пізніші розрахунки високого рівня складності координати реакції внутрішньомолекулярного перенесення протону в Gua (від атома N1 на атом кисню), Cyt (з аміногрупи на атом N3) і деяких інших основах ДНК (Leszczynski, Gorb, 1998-1999) повністю це підтвердили. Більше того, ці розрахунки є чи не найкращим додатковим свідченням наявності в нуклеотидних основах внутрішньомолекулярних Н-зв’язків.
Здатність приєднувати або відщеплювати протон. Оригінальність запропонованого підходу для вирішення цієї задачі полягає у використанні широкого (такого ж, як і у випадку вивчення прототропної таутомерії) набору об’єктів дослідження. Це дозволило встановити спільні і відмінні риси як протонодонорних-протоноакцепторних властивостей азотистих основ, так і їхньої здатності деформуватися при зміні зарядового стану, а також прослідкувати, як вони змінюються з ускладненням структури молекули.
Так, детальний аналіз величини та характеру структурних збурень, що мають місце при протонуванні та депротонуванні основи, засвідчує, що максимальні зміни величини геометричних параметрів (валентних зв’язків, валентних та двогранних кутів) спостерігаються поблизу місць приєднання чи відщеплення протона, зменшуючись на периферії, при цьому збурення геометричних параметрів супроводжується істотним перерозподілом зарядів на атомах. Азотисті основи, які не мають у своєму складі аміногрупи, не змінюють площинного характеру своєї будови при протонуванні чи депротонуванні незалежно від його місця. Вперше встановлено, що азотисті основи з аміногрупою поводять себе інакше: найістотніших збурень, які сягають десятків градусів при зміні їхнього зарядового стану шляхом протонування чи депротонування, зазнають “найм’якші” геометричні параметри – двогранні кути, що характеризують пірамідність амінного фрагмента CNН2. Протонування основ з аміногрупою, незалежно від його місця (виняток складає лише амінний атом азоту), призводить до повного їхнього сплощення – їхня інтерконверсія відбувається лише шляхом анізотропного повертання аміногрупи навколо екзоциклічного зв’язку CN, причому величини бар’єрів повертання зростають у порівнянні з електронейтральною основою. Депротонування основ з аміногрупою навпаки – значно посилює неплощинність їхнього амінного фрагмента і дещо зморщує кільце. При цьому величина ефекту та його характер залежить від місця депротонування основи. Їхня інтерконверсія відбувається, як і у електронейтральних аналогів, трьома топологічно і енергетично нееквівалентними шляхами, але на відміну від останніх, зростає бар’єр площинної інверсії і відповідно зменшуються бар’єри внутрішнього повертання аміногрупи. У аніонів Ade, наприклад, бар’єр площинної інверсії зростає більше, ніж на порядок у порівнянні з електронейтральною основою, і можна впевнено говорити про їхню непланарну конформацію. Останнє стосується всих без винятку аніонів основ з аміногрупою. Характер перебудови ГППЕ нуклеотидних основ з аміногрупою при зміні їхнього зарядового стану переконливо вказує на те, що одним із головних стереоелектронних чинників, що визначають їхню структурну нежорсткість, є р?-спряження ВЕП амінного азоту з ?-електронною системою кільця. Про це також говорить збільшення довжини екзоциклічного зв’язку CN при протонуванні амінного атома азоту (на ~ 0,09 – 0,1 Е за даними АМ1) внаслідок унеможливлення р?-спряження. Вперше зафіксовано важливий з біологічної точки зору ефект – можливість дистанційного управління структурною нежорсткістю основи з аміногрупою через зміну зарядового стану нуклеозиду шляхом депротонування його цукрового залишка по місцях О3’ і О5’.
Вперше побудовано ряди кислотних (включаючи СН-кислотність) і лужних властивостей для всих досліджених молекул. Встановлено, що вони не корелюють з такими електронними характеристиками відповідних атомних груп, як заряди на атомах чи їхні густини. Це пояснюється, зокрема, тим, що ВЕП атома-акцептора протону в цих молекулах принципово не можуть бути ототожнені з однією незв’язуючою молекулярною орбіталлю, строго на ньому локалізованою (Крашенников и др., 1978). Показано, що з-поміж всих досліджених канонічних основ ДНК найоптимальніше співіснування кислотно-лужних властивостей має місце в Gua. На відміну від Gua, Cyt є найпротофільнішою молекулою з найгіршими кислотними властивостями; з іншого боку – молекула Thy є найкислішою основою. Вперше пояснено, що зафіксоване експериментально (Greco et al., 1990) обернення ряду протофільності (Gua>Cyt) цілковито пов’язане з прототропною таутомерією цих основ. Навіть у двічі метильованому гуаніні m21,9Gua його протофільність (228,8 ккал/моль за даними АМ1) помітно менша, ніж протофільність m1Cyt (230,3 ккал / моль).
На прикладі двох енергетично найвигідніших таутомерів N7Н і N9Н Xan і Hyp вперше показано, що кислотно-лужні властивості основ істотньо залежать від їхнього таутомерного стану. На прикладі пурину та його складових частин – піримідину і Im прослідковано, як протонування та депротонування основи впливає на її кислотно-лужні властивості. Встановлено, що в протонованих і депротонованих сполуках пріоритетність місць протонування і депротонування істотньо змінюється у порівнянні з електронейтральними аналогами.
Пильну увагу приділено СН-кислотним властивостям азотистих основ. Це пов’язано з тим, що Н-зв’язки за участю груп СН, як донора протону, попри свою відносну слабкість у порівнянні з класичними Н-зв’язками, відіграють непересічну роль у структурній і молекулярній біології (Zhurkin, 1998). Вперше встановлено, що азотисті основи як СН-кислоти істотньо відрізняються від “нормальних” органічних СН-кислот, протонодонорна здатність котрих визначається величиною заряду на атомі водню групи СН (Погорелый и др., 1984). Не зафіксовано прийнятного для практичного застосування рівня кореляції між енергією депротонування груп СН азотистих основ, з одного боку, і такими параметрами, як заряд на їхньому атомі водню, довжина зв’язку СН і частота його валентного коливання, з іншого.
Структурна ізомерія. Вперше досліджено структурну ізомерію азотистих основ та її основні фізико-хімічні закономірності. Так, аналіз енергетичних характеристик повного сімейства структурних ізомерів амінопурину, амінооксипурину, амінооксипіримідину та С-метилурацилу дозволив вперше виявити виняткову властивість двох канонічних нуклеотидних основ – Ade і Thy : в своїх сімействах вони є енергетично найвигіднішими структурними ізомерами. На відміну від Ade та комплементарного йому Thy дві інші комплементарні основи ДНК – Gua та Cyt не є енергетично найвигіднішими молекулами в своїх сімействах структурних ізомерів. Серед сімейства структурних ізомерів амінопурину енергетично найвигіднішим є о8Ade – продукт окислення Ade – теплота його утворення на 11,7 ккал/моль нижча, ніж аналогічна величина для Gua; серед повної множини ізомерів амінооксипіримідину енергетично найвигіднішою структурою є 5-aminoо4Pur – він має теплоту утворення на 7,2 ккал/моль нижчу, ніж Cyt. Окрім того, Ade має ще одну виняткову рису: лише для цієї основи енергетична відстань між ним і сусіднім у сімействі структурним ізомером, що має інші кодові властивості, найбільша (5,3 ккал/моль). При цьому 2- aminoPur, який, як відомо (Sowers et al., 1987), є досить сильним мутагеном, в сімействі геометричних ізомерів амінопурину має найвищу енергію – теплота його утворення перевищує аналогічну величину для Ade на 7,8 ккал/моль (за даними АМ1).
Отримані результати дозволяють, на наш погляд, розглядати канонічні основи ДНК в контексті молекулярної еволюції і пов’язати першочерговість утворення Ade – єдиної основи, яка не має у своєму складі кисню, – у абіогенному синтезі з компонентів первинної атмосфери і подальше “виживання” в ній (Павловская, 1973) не лише з найбільшою енергією електронного спряження (Pullman, 1962), а й з найменшою теплотою його утворення у своєму сімействі структурних ізомерів. Про особливе місце Ade серед канонічних нуклеотидних основ свідчать також і найменша його схильність з-поміж основ ДНК до таких генотоксичних структурних перетворень, як прототропна таутомерія піримідинового кільця, спонтанне дезамінування і окислення у воді тощо. Всі ці дані можна розцінювати як аргументи на користь відомої гіпотези (Rich, 1964) щодо того, що на ранніх етапах еволюції структура первинних полінуклеотидів була значно монотоннішою і вони містили лише дві комплементарні основи – Ade і Thy. Окрім того, їх можна розглядати як одне із можливих пояснень, чому Ade має у геномі найвищу кодову цінність (Мазин, 1980), чому саме АТФ використовується у живій природі як універсальна “енергетична валюта” тощо.
Отримані результати щодо структурної ізомерії нуклеотидних основ проливають також світло на те, чому саме збагачені на пари Gua:Cyt ділянки ДНК є потенційним джерелом точкових мутацій (Bernardi, 1995). Цілком ймовірно, що однією з причин цього є деградація Gua і Cyt в низькоенергетичні структурні ізомери, індукована різноманітними фізико-хімічними чинниками екзогенного походження, зокрема УФ-опроміненням.
Спонтанне дезамінування. Враховуючи, що індуковане теплом за наявності води дезамінування основ ДНК відіграє неабияку роль у спонтанному мутагенезі, спричиняючи транзиції (Данилов та ін., 1971), було досліджено енергетичні (ентальпію) та структурні (зміни стереохімічної нежорсткості та таутомерного стану) його особливості для канонічних нуклеотидних основ та низки їхніх аналогів – мінорних основ ДНК, продуктів алкілування та пошкодження кисневими радикалами, структурних ізомерів, молекул, що мають терапевтичне значення, мутагенів, модельних сполук (всього 38 структур), що мають аміногрупу, у вільному стані.
Вперше отримано такі результати.
За схильністю до спонтанного дезамінування канонічні основи ДНК утворюють ряд Gua > Cyt > Ade. Лише для Ade та переважної більшості його похідних цей процес є ендотермічним; для Gua, Cyt та всих без винятку їхніх похідних він має екзотермічний характер. Серед структурних ізомерів амінопурину найменшу схильність до спонтанного дезамінування має лише Ade. Метильовані по глікозидному зв’язку канонічні основи ДНК за своєю здатністю спонтанно дезамінуватися утворюють ряд m1Cyt > Cyt, m9Gua Ade. Нетипова поведінка Gua і m9Gua пояснюється фіксацією метилюванням високоенергетичної таутомерної форми продукту дезамінування останнього в формі m9Xan. Продукти дезамінування всих досліджених сполук, що належать до класу структурно-нежорстких молекул, є планарними квазіжорсткими молекулами. У переважній більшості випадків дезамінування не спричиняє таутомерних переходів.
Спонтанне пошкодження кисневими радикалами. Враховуючи біологічну значущість цього процесу було вивчено його енергетичний (ентальпію) та структурний (заміну стереохімічної нежорсткості і таутомерного стану) аспекти. Задача з подібною постановкою (особливо в обчислювально-теоретичній площині) не попадала в поле зору дослідників. Приймаючи до уваги, що найбільшу біологічну значущість мають продукти пошкодження кисневими радикалами саме пуринових основ (Полтев, Брусков и др., 1993), об’єктами дослідження вибрано Ade і Gua, їхні метильовані по дев’ятому положенню аналоги, що є найпростішими моделями нуклеозидів, продукти дезамінування цих сполук, а також деякі “модельні” молекули (Im, Pur, m1Im та m9Pur).
Вперше отримано такі результати. Встановлено, що для всих без винятку досліджених молекул найімовірнішим місцем приєднання кисню в процесі їхнього окислення є атом С8 імідазольного кільця (С2 – у випадку Im і m1Im).
За схильністю до окислення досліджені сполуки утворюють ряди Gua>Ade, m9Gua>m9Ade, причому m9Ade>Ade, m9Gua>Gua. Останні два співвідношення можуть свідчити про те, що при переході від основи до нуклеозиду схильність до ушкоджень кисневими радикалами підвищується. При цьому молекули-продукти дезамінування у порівнянні з вихідними основами з аміногрупою та їхніми метильованими в дев’ятому положенні похідними проявляють меншу здатність до цього процесу. Порівняння відповідних ентальпій для Im (m1Im) та пуринових основ (метильованих в дев’ятому положенні аналогів) вказує на значну їхню залежність від конденсації імідазольного кільця із піримідиновим. У всих випадках, за винятком Xan, ця конденсація призводить до суттєвого зниження ентальпії реакції окислення. Окислення пуринових основ суттєво змінює їхню квазіжорсткість. Це пов’язано з тим, що молекула о2Im у порівнянні з Im є значно м’якшою структурою по відношенню до непланарних деформацій. Змін таутомерного стану при ушкодженні азотистих основ пуринового ряду кисневими радикалами не зафіксовано.
Викладені вище результати дозволяють зробити дуже важливий, на погляд автора, висновок: головна відмінність нуклеотидних основ, а відтак – і НК від органічних полімерів – представників неживої природи криється, очевидно, у тому, що вони поєднують у собі унікально широкий спектр фізико-хімічних форм структурної мінливості, кожна з яких притаманна окремим класам органічних молекул – представників неживого світу. Водночас ця характерна властивість НК таїть у собі, вочевидь, і негативний сенс з точки зору тривалості безперебійного їхнього функціювання. Цілком можливо, що саме вона є джерелом так званих додаткових біохімічних активностей (Bartosz, 1981), які не “вписуються” в класичні схеми метаболізму і спричиняють перебіг параметаболічних процесів, що призводять врешті-решт до старіння (Голубев, 1996). Можна також припустити, що розмаїття фізико-хімічних форм структурної мінливості НК, про які йшлося вище, є конкретним мікроструктурним наповненням їхньої “кінетичної довершеності”, яка розцінюється як засіб і як результат еволюційного процесу (Шноль, 1979).
Спектроскопічне дослідження твердофазних комплексів, що моделюють точкові білково-нуклеїнові і нуклеїново-нуклеїнові контакти
На базі серійного приладу ДФС-24 створено високочутливий лазерний трьохпроменевий Раманівський спектрометр для реєстрації високоякісних спектрів біополімерів і їхніх компонентів у широкому діапазоні частот, що має поліфункціональні можливості, високі метрологічні характеристики і рівень автоматизації. У складі цієї установки використано низку власних розробок, з-поміж них: оригінальні конструкції магнітних дефокусуючих насадок для підвищення порогової чутливості ФЕП; просту цифрову схему усунення впливу нестабільності лазера на якість отримуваних спектрів, а також цифровий пристрій, що дозволяє нормувати фоточутливості основного і опорного каналів спектрометра на оптичний сигнал від коригуючого джерела; високоефективний метод зниження розсіяного монохроматором світла поблизу лінії збудження, що розширює нижню границю спектрального діапазону до 10 см-1 при дослідженнях сильнорозсіюючих зразків. Розроблено також методику збудження Раманівських спектрів компонентів біополімерів та їхніх комплексів в полікристалічному стані. До неї входить підготовка зразків для дослідження та використання оригінальних кювет – це дозволяє суттєво поліпшити співвідношення сигнал/шум на вхідній щілині монохроматора за мінімальної кількості речовини і невеликої потужності лазера.
Експериментально обгрунтовано застосування низькочастотної Раманівської спектроскопії як ефективного методу вивчення структурно-динамічних властивостей твердофазних нуклеїново-нуклеїнових і білково-нуклеїнових комплексів.
Отримано найбільш повні низькочастотні (10 см-1

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020