СЕВАСТОПОЛЬСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ ТЕХНІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

РОГОВА Ольга Валентинівна

УДК 577.113:541.49

Фізичні механізми комплексоутворення біологічно активних ароматичних
речовин із фрагментами днк різної структурної організації

03.00.02 – біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Севастополь – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Севастопольському національному технічному
університеті Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник доктор фізико-математичних наук,

професор Веселков Олексій Никонович,

Севастопольський національний технічний університет, завідувуч кафедри
фізики.

Офіційні опоненти:

доктор фізико-математичних наук, професор Семенов Михайло Олексійович,
Інститут радіофізики та електроники НАН України, провідний науковий
співробітник (м. Харьків);

— кандидат фізико-математичних наук Осетров Сергій Григорович,
Військово-морський інститут ім.П.С.Нахімова, доцент кафедри фізики
(м.Севастополь).

Провідна установа

Інститут фізики НАН України, відділ фізики біологічних систем, м. Київ.

Захист відбудеться “_25_”_лютого_____ 2005 р. о 15.00 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради К 50.052.05 у Севастопольському
національному технічному університеті, за адресою: 99053 м. Севастополь,
Студмістечко.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Севастопольського
національного технічного університету за адресою:

99053, м. Севастополь, Студмістечко.

Автореферат розісланий “_22_” _січня____ 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Євстигнєєв М.П.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Однією з важливих проблем у сучасній молекулярній
біофізиці є з’ясування фізичних механізмів взаємодії нуклеінових кислот
з ароматичними біологічно активними сполуками (БАС). Велика кількість
біологічно активних ароматичних сполук з різними медико-біологічними
властивостями, виконують свою дію, зв’язуючись з ядерною ДНК шляхом
інтеркаляції. Молекула дезоксирибонуклеінової кислоти (ДНК)
характеризується in vivo різноманітністю форм структурної організації.
Крім класичної подвійної спіралі нуклеінові кислоти можуть знаходитися в
одноланцюгових структурах, які були виявлені в деяких бактеріофагах і є
обов’язковою проміжною формою (матрицею) при синтезі як ДНК, так і РНК,
або формувати шпилькові структури, спостерігаємі у частково
самокомплементарних паліндромних послідовностях, та ін. Взаємодія БАС з
різними формами ДНК впливає на структуру їхньої просторової організації
і, відповідно, на біологічні функції.

Відомо, що характерною рисою БАС, інтеркалюючих у ДНК, є наявність
плоских гетероциклічних хромофорів. Ароматичні БАС володіють
антипухлинними, мутагенними, канцерогенними та іншими
медико-біологічними властивостями. Так, наприклад, розглянутий у роботі
антрацикліновий антибіотик дауноміцин (DAU) є противопухлинним
препаратом, фенантридиновий барвник бромистий етидій (ЕВ) має мутагенні
і трипанацидні властивості, синтетичні похідні феноксазонового
антипухлинного антибіотика актиноміцину D (AMD) мають яскраво виражену
залежність цитотоксичної активності від довжини бічних аміноалкильних
ланцюгів. Зокрема, феноксазонове з’єднання
актиноцил-біс-(2-диметиламіноетил) амід (ActII), з бічними
аміноалкильними ланцюгами, що містять дві СН2 групи, виявляє максимальну
цитотоксичну активність у порівнянні з іншими дослідженими похідними AMD
при концентрації СActII ? 1 ?М. Важливо відзначити, що розробка
антрациклінової групи антипухлинних лікарських засобів з аміноалкильними
бічними ланцюгами призвела до створення нового синтетичного антибіотика,
мітоксантрона, якій має покращені медико-біологічні властивості
(зокрема, більш низьку кардиотоксичність) у порівнянні з природними
антрацикліновими антипухлинними антибіотиками, такими, як доксорубіцин.

Для з’ясування молекулярного механізму взаємодії БАС з нуклеіновими
кислотами різної структурної організації використовують різні
експериментальні і теоретичні підходи, але одержати максимально повну
інформацію про структуру і термодинаміку молекулярних комплексів у
розчині дозволяє метод ЯМР спектроскопії. Разом з тим, універсальних
підходів для визначення структурних параметрів комплексів БАС з
неканонічними структурами ДНК у даний час не існує.

Відомо, що специфіка зв’язування лигандів із ДНК виявляється вже на
коротких дезоксиолігонуклеотидах, отже, основні особливості взаємодії
БАС із ДНК можна визначити на коротких фрагментах ДНК, синтезованих із
заданим нуклеотидним складом і послідовністю основ у ланцюзі.

Зв’язок дисертації з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалася в рамках держбюджетної наукової тематики “Ліганд-2”
Міністерства освіти і науки України (№ держ.реєстр. 0101U001816):
“Молекулярний механізм регуляції медико-біологічної активності при
комбінованому використанні ароматичних сполук і роль гетероасоціації і
конкурентного зв’язування ароматичних лігандів з нуклеіновими
кислотами”, 2001-2003; наукової тематики “Нуклеотид” Міністерства освіти
і науки України (№ держ.реєстр. 0104U000568), 2004-2006; договорів про
науково-технічне співробітництво на 1998-2003 і 2003-2008 р.р. між
Беркбек коледжем Лондонського університету (Великобританія) і СевНТУ,
договору про науково-технічне співробітництво на 1999-2004 р. між
Гумбольдським університетом (Німеччина) і СевНТУ, а також частково в
рамках Міжнародного проекту INTAS (грант INTAS-97 31753): “Design,
synthesis and testing of novel biologically-active molecules as
potential drugs with sequence-specific binding to nucleic acids”,
1999-2003.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було установлення фізичних
механізмів комплексоутворення ароматичних біологічно активних сполук,
які відрізняються структурою хромофорів і бічних ланцюгів, із
фрагментами ДНК різної структурної організації (самокомплементарні,
шпилькові та одноланцюгові послідовності).

Для досягнення поставленої мети вирішувалися задачі:

Розшифровка і віднесення сигналів протонів у спектрах ЯМР водних
розчинів досліджуваних ароматичних молекул і фрагментів ДНК.

Вивчення закономірностей і особливостей процесів самоасоціації
олігомерів ДНК різної довжини, складу і послідовності основ у ланцюзі.

Розробка методик визначення структурних і термодинамічних параметрів
комплексоутворення ароматичних лігандів з олігомерами ДНК різної
структурної організації.

Об’єкт дослідження – дезоксиолігонуклеотиди: дезокситетрануклеотиди
5?-d(TpGpCpА) і 5?-d(GpApApG), дезоксигексануклеотиди 5?-d(GpCpApTpGpС)
і 5?-d(CpGpTpApCpG), дезоксигептануклеотид 5?-d(GpCpGpApApGpC);
ароматичні біологічно активні сполуки: синтетичне феноксазонове
з’єднання, аналог антипухлинного антибіотика актиноміцину D, –
актиноцил-біс-(2-диметиламіноетил) амід (ActII), фенантридиновий барвник
бромистий етидій (ЕВ) і антрацикліновий антипухлинний антибіотик
дауноміцин (DAU).

Предмет дослідження – молекулярні механізми самоасоціації ароматичних
біологічно активних молекул і олігомерів ДНК, комплексоутворення БАС із
фрагментами ДНК різної вторинної структури у водно-сольовому розчині.

Методи дослідження – одномірна і двомірна (2М-TOCSY/2M-COSY,
2М-NOESY/2М-ROESY) гомоядерна 1H і гетероядерна 1H-31P (НМВС) ЯМР
спектроскопія (500 МГц) – для одержання структурних і термодинамічних
параметрів комплексоутворення молекул, побудови структур комплексів
молекул, аналізу динамічної рівноваги молекулярних асоціатів і
зв’язування ароматичних БАС із фрагментами ДНК у розчині;
спектрофотометрія – для визначення концентрації молекулярних компонентів
у водному розчині.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше досліджена специфіка
комплексоутворення синтетичного феноксазонового з’єднання
актиноцил-біс-(2-диметиламіноетил) аміду (ActII) з
дезокситетрануклеотидом 5’-d(TрGрCрА) у водно-сольовому розчині.
Побудовані найбільш імовірні структури комплексів ActII з дуплексом
тетрануклеотид на основі даних двомірної (2M NOESY) ЯМР спектроскопії.
Методом 1Н ЯМР спектроскопії досліджена самоасоціація гексамера
d(GCATGC) у водно-сольовому розчині. Виявлена компактна складчата (типу
шпильки) структура одноланцюгової послідовності самокомплементарного
олігонуклеотиду d(GCATGC) у водному розчині. Зроблено висновок, що
наявність термінальних d(GC)-сайтів у сполученні з центральними
d(AT)-сайтами в самокомплементарних дезоксиолігонуклеотидних
послідовностях створює умови для формування неканонічних компактних
структур (подібних до шпильки) навіть у досить коротких одноланцюгових
фрагментах ДНК. Вперше досліджено комплексоутворення антрациклінового
антипухлинного антибіотика дауноміцину з дезоксигексануклеотидом
d(GCATGC). На основі даних одномірної і двомірної ЯМР спектроскопії
визначені структурні і термодинамічні параметри різних типів комплексів,
побудована найбільш імовірна структура комплексу DAU з дуплексом
гексамеру ДНК. Показано, що хромофор дауноміцину вбудовується з боку
малої борозенки в термінальний сайт d(GрС) гексамера, і триплетні
ділянки переважного зв’язування ліганду можна розташувати в наступному
порядку: 5?-d(GCA)>5?-d(CGT)>5?-d(CGC)>5?-d(TAC). Показано, що положення
резонансів протонів в олігомері ДНК дозволяє зробити цілком визначені
висновки про особливості конформаціїних станів молекул ДНК, виявити
структури, маючі відхилення від стандартної геометрії подвійної спіралі.
Вперше показано, що одноланцюгові несамокомплементарні олігонуклеотиди
одинакового нуклеотидного складу з петлею шпильки, можуть бути
використані як модельні системи для дослідження комплексоутворення
ароматичних лігандів зі шпильковими структурами у водному розчині.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані в роботі
експериментальні і теоретичні результати поглиблюють існуючі уявлення
про взаємодію біологічно активних низькомолекулярних речовин із
фрагментами молекул нуклеінових кислот різної просторової організації.
Запропоновані в дисертаційній роботі методи дозволяють визначити типи та
особливості вторинної структури олігонуклеотидів за положеннями
резонансів протонів, а також проводити аналіз структур комплексів БАС з
різними олігонуклеотидними послідовностями на основі даних одномірної і
двомірної 1Н-ЯМР спектроскопії.

Отримані дані про специфіку комплексоутворення антипухлинних
антибіотиків із фрагментами ДНК різної структурної організації можуть
бути використані при синтезі нових біологічно активних речовин і
лікарських препаратів із заданими медико-біологічними властивостями.

Особистий внесок здобувача: у наукових працях, опублікованих зі
співавторами, особистий внесок здобувача полягає в наступному: у роботах
[2,3,5,6,8,10-13,16,17] – участь у розробці моделей самоасоціації
олігонуклеотидів і їх комплексоутворення з ароматичними біологічно
активними сполуками, проведення розрахунків по запропонованим моделям,
визначення структурних і термодинамічних параметрів комплексоутворення
молекул; у роботах [1,3-7,9,10,11,13,15,17] – участь у розшифровці і
віднесенні сигналів необмінюючихся протонів у двомірних спектрах
2M-NOESY/2M-ROESY і 2M-TOCSY/2M-COSY розчинів молекул, визначення
найбільш імовірних структур комплексів по знайденим міжмолекулярним
контактам; у роботах [2,5,6,7,9,11,14,15] – аналіз літературних даних,
проведення розрахунків, аналіз і обговорення отриманих результатів,
написання наукових статей.

Апробація отриманих результатів. Основні результати досліджень, що
ввійшли в дисертацію, були представлені та обговорені на: III-му з’їзді
Українського біофізичного товариства, Львів, Україна, 2002; 16-й
Міжнародній школі-семінарі “Спектроскопія молекул і кристалів”,
Севастополь, Україна, 2003; 3-й і 4-й міжнародних конференціях молодих
учених “Проблеми практичної фізики”, Київ, Україна, 2003 і 2004 р.,
відповідно; Міжнародних наукових конференціях студентів, аспірантів і
молодих учених “Ломоносов-2003” і “Ломоносов-2004”, Чорноморська філія
МДУ, Севастополь, Україна, 2003 і 2004 р. відповідно; 16ій Міжнародній
конференції по ЯМР спектроскопії, Кембридж, Великобританія, 2003; I
українській науковій конференції “Проблеми біологічної і медичної
фізики”, Харків, Україна, 2004р., об’єднаній 17-ійа Європейській
конференціі по експериментальній ЯМР-спектроскопії (EENC) та 32-ій
Амперівській конференції (AMPERE), Лілль, Франція, 2004 р. Тези
перерахованих доповідей опубліковані.

Публікації. За результатами досліджень, що ввійшли в дисертацію,
опубліковано 17 наукових праць, у тому числі 7 статей у наукових
журналах і 10 тез доповідей на міжнародних та національних наукових
конференціях.

Структура дисертації. Робота складається із вступу, шести розділів,
висновків і додатка. Повний обсяг дисертації складає 188 стор., з них
додаток займає 18 стор., список використаних джерел – 208 найменувань –
19 стор. Дисертація містить 49 рис. і 20 табл., у тому числі на 15
окремих сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтована актуальність теми, визначена мета і задачі
дослідження, показані новизна, а також наукова і практична значимість
отриманих результатів.

У першому розділі проведено аналіз літературних даних за темою
дисертації. Обґрунтовано важливість дослідження комплексоутворення
ароматичних біологічно активних речовин із фрагментами ДНК різної
структурної організації. Проведено огляд основних параметрів вторинної
структури ДНК із використанням прийнятої зараз номенклатури. Розглянуто
неканонічні форми вторинної структури ДНК і особливості їхньої взаємодії
з ароматичними речовинами, включаючи фенантридиновий барвник бромистий
етидій, феноксазоновий антибіотик актиноміцин D і його похідні,
антрацикліновий антибіотик дауноміцин. Ці біологічно активні речовини
зв’язуються в ДНК шляхом інтеркаляції.

Зроблено висновок, що структури комплексів ароматичних лігандів із
фрагментами ДНК і термодинамічні параметри комплексоутворення молекул
істотно залежать від вторинної структури дезоксиолігонуклеотидної
послідовності (одноланцюгова, двоспіральна чи шпилькова структура), а
також від структури хромофорів і бічних ланцюгів досліджуваних БАС.

У другому розділі розглянуто фізичні основи одномірної і двомірної
ЯМР-спектроскопії. Коротко описано основні експериментальні параметри
ЯМР-експерименту. Розглянуто методики двомірної гомоядерної
спектроскопії, які виявляють взаємодії між ядрами через хімічні зв’язки
(2М-COSY/2М-TOCSY) і через простір (2М-NOESY/2М-ROESY). Описано засоби
готування розчинів експериментальних зразків і умови проведення
експериментів.

Зразки спокул розчиняли в D2O з ізотопною чистотою 99.95% і
ліофілізували. Розчини готували шляхом додавання зваженої кількості
ліганду в дейтерированій 0.1 M фосфатний буфер (pD 7.1). Концентрацію
молекул DAU, ЕВ і похідних AMD визначали спектрофотометрично за відомими
молярними коефіцієнтами екстинкції ? для дауноміцину ?=11500 М-1?см-1
(?=477 нм), для Act II-Act IV ?=36700 М-1?см-1 (?=450 нм) і ?=5860
М-1?см-1 (?=480 нм) для бромистого етидію. Концентрації, визначені
спектрофотометрично, знаходилися у відповідності з концентраціями,
знайденими за масовим розведенням. Зразки дезоксинуклеозидфосфатів
(5′?d(TGCA), 5’-d(CGTACG), 5’-d(GCATGC), 5’-d(GCGAAGC), 5’-d(GAAG))
синтезовані компанією “Oswel DNA Service” (Великобританія). Їх також
ліофілізовули з D2O і розчиняли у дейтерированому 0.1 M фосфатному
буфері.

Одномірні і двомірні 1H ЯМР спектри вимірювали на спектрометрах з
резонансною частотою 500 МГц (“JEOL GSX 500” , “Bruker DRX 500”), і 600
МГц (“Bruker AMX 600”). Температурні залежності хімічних зсувів протонів
визначалися при постійному складі розчину. Концентраційні виміри
протонних хімічних зсувів проводили при двох температурах при фіксованій
концентрації однієї з сполук. У процесі вимірів температура зразка
стабілізувалася з похибкою ?1 К за допомогою терморегулятора BVT-3000
чи “JEOL NM ? GVT 3”. Протонні хімічні зсуви вимірялися відносно
внутрішнього стандарту – ТМА (бромід тетраметиламонію), тому що його
сигнал практично не залежить від рН і температури у водних розчинах
нуклеотидів, а потім перераховувалися відносно DSS.

У третьому розділі при ототожненні сигналів протонів досліджених
дезоксиолігонуклеотидів проведений порівняльний аналіз положення
резонансів ?е(Нi) протонів різних триплетних послідовностей у залежності
від їхнього розташування в олігонуклеотидному ланцюзі. Отримані
результати свідчать про те, що належність триплету до тієї чи іншої
досліджуваної дезоксиолігонуклеотидної послідовності, його місце
розташування в ланцюзі, а також довжина дезоксиолігонуклеотиду суттєво
впливають на значення протонних хімічних зсувів. На основі подібних
досліджень можна зробити цілком однозначні висновки про особливості
конформаційних станів молекул ДНК, виявити структури, які мають
відхилення від стандартної геометрії подвійної спіралі (зокрема, це
стосується одноланцюгових і шпилькових структур ДНК), а також провести
аналіз впливу плавлення кінцевих нуклеотидних пар в коротких фрагментах
ДНК на геометрію подвійної спіралі.

Розділ 4 присвячений дослідженню специфіки комплексоутворення
синтетичного феноксазонового антибіотика ActII
(актиноцил-біс-(2-диметиламиноэтил) аміду) із самокомплементарним
дезокситетрануклеотидом 5’-d (TpGpCpА) у водному розчині. Для цього, у
відповідність із загальною схемою досліджень, спочатку були визначені
параметри самоасоціації даного феноксазонового антибіотика на основі
концентраційних і температурних залежностей хімічних зсувів протонів
ActII з використанням нескінченомірної некооперативної моделі
самоасоціації молекул. Для того, щоб визначити імовірність утворення
агрегатів антибіотика більш високого порядку, ніж димери,
експериментальні результати були проаналізовані за допомогою
нескінченомірної кооперативної моделі самоасоціації. Отримано наступні
значення термодинамічних параметрів самоасоціації ActII у
водно-сольовому розчині: K = (2.8?1.1)?103 л/моль, ? = 1.25?0.01, ?G0 =
-(19.7?1.0) кДж/моль, ?H0 = -(29.7?3.6) кДж/моль, ?S0 = -(32.4?9.5)
Дж/(моль?К).

Віднесення сигналів необмінюючихся протонів дезокситетрануклеотиду
5’-d(TpGpCpA) у водно-сольовому розчині (0.1M NaCl) проводилося на
основі даних 2М-TOCSY і 2М-NOESY спектроскопії. Для даної молекулярної
системи сигнали NOE між сахарними протонами Н1’ і Н2’’ дезоксирибози
виявилися більш інтенсивними в порівнянні з крос-піками Н1’-Н2’, що
свідчить про переважну S-конформацію (C2’-ендо) дезоксирибозних залишків
у ланцюзі дезокситетрануклеотиду, а, отже, дуплекс тетрамера знаходиться
в конформації, близької до В-форми.

В досліджених у даній роботі 2М-NОЕSY спектрах змішаних розчинів,
отриманих при різних концентраціях ліганду (1ммоль/л і 2ммоль/л) і
тетрамеру (2ммоль/л) у розчині, спостерігається досить велика кількість
міжмолекулярних крос-піків (табл. 1), що має місце при різних
співвідношеннях концентрацій взаємодіючих молекул і часу змішування в
2М-NОЕ-експерименті.

Аналіз крос-піків NOE дозволяє зробити висновок, що феноксазоновий
антибіотик ActII переважно взаємодіє з термінальним d(TG)-сайтом
дуплексу дезокситетрануклеотиду. З урахуванням експериментальних
міжмолекулярних NOE-контактів були побудовані просторові структури
комплексів d(TGCA) – ActII (рис.1), де представлені дві можливі,
взаємо-протилежні орієнтації хромофора антибіотика (а) і (б).

Таблиця 1.

NOE-контакти між необмінюючимися протонами дезокситетрануклеотиду

5?- d(TpGpCpА) і актиноцил-біс-(2-диметиламіноетил)аміду (ActII)

N контакт Інтен-

сив-

ність Орієнтація хромофора (рис.1.) N Контакт Інтен-

сив-ність Орієнтація хромофора

(рис.1.)

1 H7(L)?H8(A) W (б) 17 6CH3(L)?H1?(T) M (a)

2 H7(L)?H8(G) W (a) 18 CH2??(L)?H4?(C) M (б)

3 H7(L)?H5(C) W (б) 19 CH2??(L)?H4?(T) M (a)

4 H7(L)?H1?(A) M (б) 20 (CH3)2 (L)?H4?(G) W (б)

5 H7(L)?H2?(G) M (a) 21 (CH3)2(L)?H4?(A) W (a)

6 H7(L)?H1?(T) M (a) 22 (CH3)2(L)?H4?(C) W (a)

7 H7(L)?H6(T) M (a) 23 (CH3)2(L)?H4?(T) W (б)

8 H8(L)?H8(A) W (б) 24 (CH3)2(L)?H2?(T) W (б)

9 H8(L)?H8(G) M (a) 25 (CH3)2(L)?H1?(A) W (a)

10 H8(L)?H1?(A) M (б) 26 (CH3)2(L)?H1?(G) W (б)

11 H8(L)?H2?(A) M (б) 27 (CH3)2(L)?H6(T) W (б)

12 H8(L)?H2?(G) W (a) 28 (CH3)2(L)?H2(A) W (a)

13 H8(L)?H1?(G) M (a) 29 (CH3)2(L) ?5CH3 W (б)

14 4CH3(L)?H2(A) W (a) 30 (CH3)2?(L)?H2?(C) W (б)

15 6CH3(L)?H2(A) W (б) 31 (CH3)2?(L)?H6(C) W (б)

16 6CH3(L)?H8(A) W (б) 32 (CH3)2?(L)?H8(G) W (a)

Примітка. Використовані наступні скорочення:

М, W – крос-піки середньої і слабкої інтенсивності, відповідно;

L – ліганд.

Рис.1. Розраховані методом молекулярної механіки просторові структури
інтеркальованих комплексів феноксазонового антибіотику ActII з
дезокситетрануклеотидом 5?-d(TpGpCpА): (а) бензольне кільце хромофора
ActII орієнтоване до 3?-кінця сахарофосфатного ланцюга; (б) бензольне
кільце хромофора ActII орієнтоване до 5?-кінця сахарофосфатного ланцюга.

У розділі 5 наведені результати дослідження самоасоціації
самокомплементарного дезоксигексануклеотиду 5’-d(GpCpApTpGpС) і його
комплексоутворення з антрацикліновим антипухлинним антибіотиком
дауноміцином. Процедура ототожнення сигналів протонів олігонуклеотиду за
даними двомірних кореляційних спектрів 2М-TOCSY і 2М-NOESY відповідала
відомій методиці.

На рис. 2а наведені концентраційні залежності хімічних зсувів деяких
необмінюючихся протонів (СН3(Т4) і Н6(С2)) дезоксигексануклеотиду
d(G1C2A3T4G5C6), отримані при температурах 298 К та 308 К. Там же для
порівняння наведені криві титрування для аналогічних протонів основ в
ізомернім дезоксигексануклеотиді d(C1G2T3A4C5G6) при температурах 303 і
313 K. Звертає на себе увагу дуже незначні зміни хімічних зсувів
протонів d(GCATGC) у дослідженому діапазоні концентрацій (0,02 — 3,1
ммоль/л) у порівнянні з кривими титрування для гексамеру d(CGTACG) в
аналогічних умовах розчинника. При цьому спостерігається якісно різний
хід кривіх титрування ізомерних послідовностей в межах малих
концентрацій при зміні температури: зокрема, при підвищенні температури
розчину для протонів CH3(T4) гексамеру d(GCATGC) має місце більш
виражена залежність хімічного зсуву від концентрації ?(N0), а для
аналогічних протонів CH3(T3) ізомерного дезоксигексануклеотиду d(CGTACG)
спостерігається зворотня картина — цей ефект виявляється при зниженні
температури (рис. 2а). Аналогічна картина має місце і для інших
необмінюючихся протонів ізомерних дезоксигексануклеотидів. У той же час
температурні залежності протонних хімічних зсувів дезоксигексануклеотиду
d(GCATGC), як видно з рис. 2б, мають виражену S-образну форму,
характерну для плавлення дуплекса, і добре корелюють з аналогічними
залежностями хімічних зсувів протонів гексамера d(CGTACG). Можна
припустити, що причиною розходження в ході концентраційних залежностей
гексамерів при низьких температурах є формування одноланцюговим
дезоксигексануклеотидом d(GCATGC) у розчині компактної складчатої
структури (шпилькоподібної), магнітне екранування протонів у якій
близько до магнітного екранування в дуплексі гексамеру. Таке припущення
можна вважати виправданим у зв’язку з підвищеною конформаційною
гнучкістю гексамера на ділянці d(ApТ).

Для визначення рівноважної константи і термодинамічних параметрів
реакції утворення дуплекса гексамеру d(GCATGC) використані температурні
залежності протонних хімічних зcувів, отримані при максимальній у даних
дослідженнях концентрації (рис. 2б). При цьому для опису
експериментальних кривих була використана модель двох станів, у
припущенні, що внесок компактної структури мономера
дезоксигексануклеотиду відіграє суттєву роль лише в області малих
концентрацій і при порівняно низьких температурах. Відповідно до такої
моделі результуючий хімічний зсув i-го протона гексамеру при температурі
T може бути представлений у виді:

, (1)

де ?mi(T), ?di і fm(T), fd(T) — протонні хімічні зсуви і рівноважні
мольні частки гексамеру при температурі T у мономерній і
дуплексній формах відповідно.

»

$

* l ? V

X

Z

?

&

O

&

F

O

EH/y

O

???H J -akd

OJPJQJ

???„c†c-akd=

???FFHF-akdF

EHuy

??????.

У виразі (1) враховано, що значення ?mi(T) монотонно змінюється зі
збільшенням температури за рахунок конформаційних перебудов мономера,
обумовлених змінами внутрішньомолекулярного стекингу основ. Розрахунок
термодинамічних параметрів (ентропії і ентальпії) проводився з
використанням співвідношення:

(2)

припускаючи, що величини ?H і ?S практично не залежать від температури в
дослідженому температурному діапазоні.

Для того, щоб узгоджити результати температурних і концентраційних
залежностей протонних хімічних зсувів молекул гексамеру d(GCATGC) (див.
рис. 2а, б) в адитивній моделі (1) для аналізу кривих концентраційного
титрування (рис. 2а) був додатково врахований внесок від компактної
форми мономеру, магнітне екранування протонів у яких може суттєво
відрізнятися від екранування в «розгорнутій» одноланцюговій
послідовності:

(3)

де ?i (N0) і ?сi – результуючий хімічний зсув i-го протона гексамеру і
протонний хімічний зсув в компактної одноланцюговій структурі, fm(N0),
fd(N0) і fc(N0) – рівноважні мольні частки дезоксигексануклеотиду в
мономерній, дуплексній і компактній (шпильковій) формах, відповідно.
Розрахункові значення K, ?H0, ?S0 (при стандартних умовах, T=298 К) і
величина Tm, розраховані по температурним залежностям хімічних зсувів
протонів гексамеру d(GCATGC), представлені в табл. 2.

Таблиця 2.

Рівноважні параметри реакції самоасоціації дезоксигексануклеотиду
5?-d(GpCpApTpGpС) у 0.1 М Na-фосфатному буфері, pD 7.1 при Т=298 К

Kd, 103

л/моль Тm,

K -?H0,

кДж/моль -?S0,

Дж/(моль?К) -?G0,

кДж/моль

126±51 323±2 173±8 486±21 29,1±0,9

У результаті розрахунку за моделею (3) були отримані значення
рівноважної константи утворення компактної структури гексамеру при двох
температурах: Kс(298)?3.0, Kс(308)?0.8, що знаходяться в гарній згоді з
величиною рівноважної константи утворення шпилькової структури
дезоксигептануклеотиду d(GCGAAGC) у водному розчині.

Розрахунок просторової структури компактної (шпилькоподібної) форми
одноланцюгової послідовності гексамеру d(GCATGC) виконаний методами
молекулярної механіки з використанням програми X-PLOR (версія 3.851).
Одна з можливих компактних одноланцюгових структур
дезоксигексануклеотиду d(GpCpApTpGpС) у розчині у вигляді шпильки, що
містить стебло з двох GC пар, наведена на рис. 3.

Дослідження комплексоутворення дезоксигексануклеотиду 5’-d(GpCpApTpGpC)
з дауноміцином проводилося на основі даних одномірних і двомірних
спектрів змішаних розчинів. Аналіз експериментальних даних дозволив
зробити висновок, що DAU переважно інтеркалює у термінальний d(GС)-сайт
гексануклеотидного дуплекса d(GpCpApTpGpС)2.

Для визначення рівноважних констант комплексоутворення DAU з
дезоксигексануклеотидом і граничних значень хімічних зсувів у складі
комплексів антибіотика з одно- і дволанцюговими формами гексамеру були
отримані залежності протонних хімічних зсувів ліганду від концентрації
олігонуклеотиду N0 і температури T змішаного розчину. Розрахунок
параметрів комплексоутворення DAU з дезоксигексануклеотидом проводився з
використанням наступної моделі молекулярної рівноваги в розчині:

(4)

де D і N — мономери DAU і гексамера, KA і KD — рівноважні константи
димеризації антибіотика і гексануклеотиду, K1 ? K4 — рівноважні
константи утворення 1:1 (DN), 1:2 (DN2), 2:1 (D2N) і 2:2 (D2N2)
комплексів, відповідно. За умовами експерименту константи димеризації
DAU прийнято рівними 234 і 153 (л/моль) при 308 K і 318 K, відповідно.
Відповідно до схеми реакцій (4) хімічний зсув спостерігаємих протонів
антибіотика DAU може бути наведений у виглязі:

(?M + 2?AKAD + ?1K1N + ?2K2KDN 2 + 2?3K3K1ND + 2?4K4K2KDN 2D) (5)

де ?M і ?A — протонні хімічні зсуви антибіотика в мономерній і
асоційованій (димерній) формах, ?1 ? ?4 — граничні значення хімічних
зсувів протонів дауноміцину в складі комплексів DN, DN2, D2N і D2N2,
відповідно; D0 — вхідна концентрація ліганду. Результати розрахунку
значень рівноважних констант Ki утворення різних типів комплексів DAU з
гексамером d(GCATGC) і значень ?i (i=1,2,3,4) наведені в табл. 3.

Таблиця 3.

Розрахункові значення параметрів (?i, млн-1 і Ki·103, л/моль)
комплексоутворення дауноміцина з дезоксигексануклеотидом d(GCATGC) у 0,1
М фосфатному буфері, pD 7.1, Т=298 K

Протон ?1 ?2 ?3 ?4 ?M K1 K2 K3 K4

H2 7,82 7,6 7,47 7,28 7,83

H1 7,76 7,48 6,92 6,76 7,78

H3 7,21 7,36 7,15 6,33 7,55 139?30 13000?3000 55?15 16?15

H1’ 4,52 5,47 5,04 5,34 5,52

4OMe 3,97 3,79 3,65 3,86 4,02

Розрахунок просторової структури інтеркальованого 1:2 комплексу
DAU-d(GCATGC)2 виконаний методами молекулярної механіки на основі
повного атомного представлення з використанням програм X-PLOR і силового
поля CHARMM 22. При визначенні структур комплексів DAU+d(GCATGC)2
враховувалися також розрахункові значення граничних хімічних зсувів ?i
протонів антибіотика в складі 1:2 комплексу. Найбільш ймовірна
просторова структура фрагментів 1:2 комплексу DAU з дуплексом
дезоксигексануклеотиду d(GCATGC)2, що відповідає інтеркаляції
антибіотика в d(GpС)-сайт гексамеру, наведена на рис.4. Інтеркальований
комплекс DAU+d(GCATGC)2 характеризується наступними конформаційними
параметрами подвійної спіралі: DZ=0,64 нм, ?=29,5?, ?=-4,5?, DX=-0,18
нм, DY=-0,05 нм, ?=0,6?, ?=-6,0?, ?=7,0?. Розрахунки показали, що
хромофор антибіотика орієнтований під кутом ??120? до подовжньої осі
нижньої пари основ інтеркальованого комплексу в подвійній спіралі
гексамерного дуплекса, що добре узгоджується з даними
рентгеноструктурних досліджень подібних систем.

У шостому розділі на основі даних 1Н ЯМР спектроскопії (500/600 МГц)
проведений порівняльний аналіз параметрів взаємодії фенантридинового
барвника бромистого етидія з дезоксигептануклеотидом d(GpCpGpApApGpC),
здатним утворювати в розчині шпилькову структуру, і одноланцюговим
дезокситетрануклеотидом d(GpApApG), що входить як складовий елемент у
структуру гептамера.

Аналіз структур комплексів бромистого етидію з тетрамером d(GAAG)
виконували на підставі розрахованих граничних значень протонних хімічних
зсувів. При побудові структури 1:1 комплексу була запропонована
наступна методика: використовувалися перетворення координат нуклеотидних
пар в подвійній спіралі, для чого в процесі обчислень до одноланцюгового
тетрануклеотиду d(GAAG) добудовували другу нитку дуплекса з
комплементарних основ d(CTTC). Однак при розрахунку екранування
протонів барвника враховували підстави тільки однієї нитки спіралі, а
комплементарні основі другої (добудованої) нитки виключали з розгляду.
Екранування протонів бромистого етидію сусідніми основами в 1:1
комплексах розраховували при варіації конформаційних параметрів
подвійної спіралі. У розрахунках вважали, що GA-сайт є переважним місцем
посадки барвника в 1:1 комплексі. На рис. 5 наведена розрахована
найбільш ймовірна структура комплексу 1:1 бромистого етидію з
некомплементарним тетрануклеотидом 5’-d(GAAG).

Термодинамічні параметри комплексоутворення ЕВ з олігонуклеотидами були
розраховані з використанням експериментальних температурних залежностей
хімічних зсувів протонів і моделі динамічної рівноваги між різними
конформаційними формами олігомерів у розчині. Зокрема, у випадку
гептамера розглядали утворення мономерної, шпилькової і димерної форм у
водному розчині.

Н утворення комплексу барвника з петлею шпильки d(GAAG)
дезоксигептануклеотиду d(GpCpGpApApGpC).

Таблиця 4

Термодинамічні параметри ?G, ?H (кДж/моль) і ?S (Дж/(моль?K))

комплексоутворення бромистого етидію з дезоксигептануклеотидом

5’-d(GpCpGpApApGpС) і дезокситетрануклеотидом 5’-d(GpApApG)

у 0.1 М фосфатному буфері, pD 7.1

Реакції

DN 18.7 ? 0.9 45 ? 9 105 ? 30

Примітка. АL* відповідає петлі шпилькової структури гептамера

Отримані результати дозволяють зробити висновок, що одноланцюгові
несамокомплементарні олігонуклеотиди однакового нуклеотидного складу з
петлею шпильки, можуть бути використані як модельні системи для
дослідження комплексоутворення ароматичних лігандів зі шпильковими
структурами в розчині.

ВИСНОВКИ

Показано, що положення резонансів протонів в олігомері ДНК дає цілком
однозначну інформацію про особливості конформаційних станів молекул
ДНК, дозволяє виявити структури, які мають відхилення від стандартної
геометрії подвійної спіралі (зокрема, це відноситься до одноланцюгових
та шпилькових структур ДНК).

Уперше досліджено комплексоутворення синтетичного феноксазонового
з’єднання актиноцил-біс-(2-диметиламіноетил) аміду (ActII) із
самокомплементарним дезокситетрануклеотидом 5’-d(TрGрCрA) у
водно-сольовому розчині методом двомірної ЯМР спектроскопії. Побудовані
найбільш імовірні структури комплексів ActII з дуплексом тетрануклеотиду
на основі даних 2M NOESY спектрів і визначені фізичні фактори,
відповідальні за специфіку зв’язування антибіотика з ДНК.

Виявлено компактну складчасту (типу шпильки) структуру одноланцюгової
послідовності самокомплементарного олігонуклеотиду d(GCATGC) у водному
розчині при дослідженні самоасоціації гексамера методом 1Н ЯМР
спектроскопії. Показано, що наявність термінальних d(GC)-сайтів у
сполученні з центральними d(AT)-сайтами в самокомплементарних
дезоксиолігонуклеотидах створює умови для формування неканонічних
компактних структур (подібних до шпильки) у досить коротких
одноланцюгових послідовностях ДНК.

Показано, що аналіз даних одномірної ЯМР спектроскопії – концентраційних
і температурних залежностей протонних хімічних зсувів – молекулярних
систем у водно-сольовому розчині за певних умов експерименту (діапазон
концентрацій і температур, типи і послідовність основ в
олігонуклеотидному ланцюзі, вид вторинної структури ДНК і т.п.) може
бути використаний для визначення особливостей просторових структур
олігомерів ДНК (шпилькові структури, одноланцюгові послідовності ДНК).

Вперше досліджено комплексоутворення антрациклінового антипухлинного
антибіотика дауноміцина з дезоксигексануклеотидом d(GCATGC). На основі
даних одномірної і двомірної ЯМР спектроскопії визначені структурні і
термодинамічні параметри різних типів комплексів, побудована найбільш
імовірна структура комплексу DAU з дуплексом гексамера ДНК. Показано, що
триплет d(GCA) є сайтом переважної посадки DAU на олігонуклеотидну
послідовність ДНК.

На основі порівняльного аналізу комплексоутворення фенантридинового
барвника бромистого етидію з одноланцюговою послідовністю d(GpApApG) і
петлею шпилькової структури d(GpCpGpApApGpC) однакового нуклеотидного
складу показано, що одноланцюгові несамокомплементарні олігонуклеотиди
однакового нуклеотидного складу з петлею шпильки можуть бути
використовани як модельні системи для дослідження взаємодії ароматичних
лігандів зі шпильковими структурами у водному розчині.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Веселков А.Н., Итон Р.Дж., Лантушенко А.О., Рогова О.В., Эрнандес
Сантьяго А., Дэвис Д.Б. 2М 1H-ЯМР анализ комплексообразования
феноксазонового антибиотика актиноцил-бис-(2-диметиламиноэтил) амида с
дезокситетрануклеотидом 5?-d(TpGpCpA) в водном растворе // Биополимеры и
клетка. — 2003. – Т.19. — № 5. — С.377-386.

Барановский C.Ф., Рогова О.В., Эрнандес Сантьяго А.А., Завьялова О.С.,
Веселков А.Н. Термодинамика комплексообразования ароматического лиганда
с одноцепочечной последовательностью и петлей шпилечной структуры
одинакового нуклеотидного состава // Биополимеры и клетка. — 2004. –
Т.20. — № 3. — С.215-223.

Pahomov V.I. , Rogova O.V., Volynkin V.S. , Veselkov K.A. , Hernandez
Santiago A.A. , Semanin A.V. , Djimant L.N. , Veselkov A.N.
Distinctive features of complexation of anthracycline antibiotic
daunomycin with deoxyhexanucleotide d(GCATGC) in aqueous solution: 1D-
and 2D-NMR analysis // SPIE Proceedings. – 2004. –V.5507. –P. 333- 341.

Веселков А.Н., Лантушенко А.О., Рогова О.В., Веселков Д.А., Дэвис Д.Б.
Термодинамический анализ самоассоциации антибиотика
актиноцил-бис-(2-диметиламиноэтил) амида в водном растворе методом 1H
ЯМР спектроскопии // Журн.органич.химии. – 2003. – T. 39, вып. 1. – C.
96-100.

Пахомов В.И., Итон Р.Дж., Веселков К.А., Рогова О.В., Дымант Л.Н.
Структурні та термодинамічні параметри комплексів дауноміцина з
дезоксигексануклеотидами за даними ЯМР- спектроскопії // Вестник СевГТУ
(Физика и математика). – 2003. – № 43. – C.29-38.

Рогова О.В., Волынкин В.С., Рыбакова К.А., Пахомов В.И. 1Н-ЯМР анализ
самоассоциации самокомплементарного дезоксигексануклеотида
5?-d(GpCpApTpGpC) в водном растворе // Вестник СевГТУ (Физика и
математика). – 2004. – № 59. – C. 22-30.

Завьялова О.С., Рогова О.В., Печенкина А.И., Барановский С.Ф. Анализ
особенностей вторичной структуры коротких фрагментов ДНК по
экспериментальным значениям протонных химических сдвигов // Вестник
СевГТУ (Физка и математика). – 2004. – № 59. – C. 39-48.

Eaton R.J., Davies D.B., Pahomov V.I., Rogova O.V., Hernandez Santiago
A.A., Veselkov A.N. 1D- and 2D-1H NMR analysis of the distinctive
features of the self-association of the deoxyhexanucleotide,
d(GpCpApTpGpC), and its complexation with daunomycin in aqueous solution
// Proceeding of 16th International meeting on NMR spectroscopy. –
Cambridge. – 2003. –P.156.

Lantushenko A.O., Rogova O.V., Davies D.B., Veselkov A.N. 1H NMR
analysis of self-association of synthetic phenoxazone antibiotics in
aqueous solution // III съезд УБФО. – Львів – 2002. – Р. 42.

Рогова О.В., Волынкин В.С., Веселков К.А., Пахомов В.И. Особенности
процесса самоассоциации дезоксигексануклеотидов в водном растворе: 1H
ЯМР анализ // Международная научная конференция студентов, аспирантов и
молодых ученых “Ломоносов-2003”. – Севастополь, ЧФ МГУ. – 2003. – С.80.

D.B. Davies, L.N. Djimant, O.V. Rogova., D.N. Ermolaev, A.N. Veselkov.
1H NMR analysis and MM calculations of a distinctive single-stranded,
folded structure of the self-complementary deoxyhexanucleotide,
5?-d(GpCpApTpGpC) // 17th EENC/32nd Ampere Conference. – Lille. – 2004.
– ID PO287.

Davies D.B., Eaton R.J., Pahomov V.I., Volynkin V.S., Rogova O.V.,
Veselkov K.A., Hernandez Santiago A.A., Veselkov A.N. 1H NMR analysis of
the stability of self-complementary deoxyhexanucleotides in aqueous
solution // Abstracts of XVI International School-Seminar on
Spectroscopy of Molecules and Crystals. – Sevastopol. – 2003. – P.248.

Pahomov V.I., Rogova O.V., Volynkin V.S., Veselkov K.A., Hernandez
Santiago A.A., Semanin A.V., Djimant L.N., Veselkov A.N. Distinctive
features of complexation of anthracycline antibiotic daunomycin with
deoxyhexanucleotides, d(GCATGC) and d(TACGTA), in aqueous solution: 1D-
and 2D-NMR analysis // Abstracts of XVI International School-Seminar on
Spectroscopy of Molecules and Crystals. – Sevastopol. – 2003. – P.303.

Rogova O.V., Volynkin V. S., Zavyalova O.S., Veselkov A.N. Comparative
analysis of complexation of phenanthridine dye with single-stranded
deoxyoligonucleotide and a hairpin loop of the same nucleotide content
// Proceeding of 4th international young scientists conference on
applied physics. – Kyiv. – 2003. – P.154–155.

Завьялова О.С., Рогова О.В., Печенкина А.И., Барановский С.Ф. Анализ
особенностей вторичной структуры коротких фрагментов ДНК по
экспериментальным значениям протонных химических сдвигов // Доповіді I
Українськой науковой конференції “Проблеми біологічної і медичної
фізики”. – Харьків. – 2004. – C. 55.

Дымант Л.Н., Рогова О.В., Ермолаев Д.Н., Веселков А.Н. Сравнительный
анализ самоассоциации изомерных дезоксигексануклеотидов
5’-d(GpCpApTpGpC) и 5’-d(CpGpTpApCpG) в растворе // Доповіді I
Українськой науковой конференції “Проблеми біологічної і медичної
фізики”. – Харьків. –2004. – C. 56.

Евстигнеев М.П., Рогова О.В., Волынкин В.С., Пахомов В.И., Веселков А.Н.
2М-ЯМР анализ комплексообразования дезокситетрануклеотида d(TрGрCрA) с
синтетическими производными актиномицина D // Доповіді I Українськой
науковой конференції “Проблеми біологічної і медичної фізики”. –
Харьків. – 2004р. – C.57.

АНОТАЦІЯ

Рогова О.В. Фізичні механізми комплексоутворення біологічно активних
ароматичних речовин із фрагментами ДНК різної структурної організації. –
Рукопис.

Дисертація на здобуття ученого ступеня кандидата фізико-математичних
наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Севастопольський
національний технічний університет м. Севастополь, 2005.

Вивчено механізми комплексоутворення біологічно активних ароматичних
речовин з дезоксиолігонуклеотидами різної вторинної структури
(мономерна, дуплексна і шпилькова форми ДНК). Для визначення параметрів
комплексів, використані методи одно- і двомірної спектроскопії ЯМР
(500/600 МГц). Розрахунок просторових структур виконаний методами
молекулярної механіки з використанням програми X-PLOR. Досліджено
комплексоутворення феноксазонового антибіотика ActII з тетрануклеотидом
5’-d(TpGpCpА), антрациклинового антибіотика дауноміцину з
гексануклеотидом 5’-d(GpCpApTpGpС). Проведено порівняльний аналіз
взаємодії бромистого етидія з гептануклеотидом d(GpCpGpApApGpС), що
утворює у розчині стабільну шпилькову структуру, і одноланцюговим
тетрануклеотидом d(GpApApG), що є складовим елементом нуклеотидної
послідовності гептамера. Показано, що одноланцюгові несамокомплементарні
олігонуклеотиди однакового нуклеотидного складу з петлею шпильки, можуть
бути використані як модельні системи для дослідження комплексоутворення
лігандів зі шпильковими структурами у водному розчині.

Зроблено висновки про специфіку взаємодії лігандів із фрагментами ДНК
різної структурної організації, про особливості використання методик ЯМР
для аналізу структур досліджених олігомерів і їхніх комплексів з
біологічно активними речовинами.

Ключові слова: шпилька, дуплекс, одноланцюгова ДНК, ЯМР-спектроскопія,
дезоксиолігонуклеотиди, комплексоутворення, дауноміцин, похідні
актиноміцину D, бромистий етидій.

АННОТАЦИЯ

Рогова О.В. Физические механизмы комплексообразования биологически
активных ароматических веществ с фрагментами ДНК различной структурной
организации. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических
наук по специальности 03.00.02 – биофизика. – Севастопольский
национальный технический университет г. Севастополь, 2005.

Изучены механизмы комплексообразования биологически активных
ароматических веществ с дезоксиолигонуклеотидами различной вторичной
структуры (мономерная, дуплексная и шпилечная формы ДНК). Для
определения параметров комплексов, использованы методы одно- и двумерной
спектроскопии ЯМР (500/600 МГц). Расчет пространственных структур
выполнен методами молекулярной механики с использованием программы
X-PLOR. Исследовано комплексообразование феноксазонового антибиотика
ActII с тетрануклеотидом 5’-d(TpGpCpA), антрациклинового антибиотика
дауномицина с гексануклеотидом 5’-d(GpCpApTpGpC). Проведен сравнительный
анализ взаимодействия бромистого этидия с гептануклеотидом
d(GpCpGpApApGpC), образующим в растворе стабильную шпилечную структуру,
и одноцепочечным тетрануклеотидом d(GpApApG), являющимся составным
элементом нуклеотидной последовательности гептамера. Показано, что
одноцепочечные несамокомплементарные олигонуклеотиды одинакового
нуклеотидного состава с петлей шпильки, могут быть использованы в
качестве модельных систем для исследования комплексообразования лигандов
со шпилечными структурами в водном растворе.

Сделаны выводы о специфике взаимодействия лигандов с фрагментами ДНК
различной структурной организации, об особенностях использования методик
ЯМР для анализа структур исследованных олигомеров и их комплексов с
биологически активными веществами.

Ключевые слова: шпилька, дуплекс, одноцепочечная ДНК, ЯМР-спектроскопия,
дезоксиолигонуклеотиды, комплексообразование, дауномицин, производные
актиномицина D, бромистый этидий.

SUMMARY

Rogova O.V. Physical mechanisms of complexation of biologically active
aromatic compounds with DNA fragments of different secondary structure.
– Manuscript.

Thesis for a Candidate’s degree of Physical and Mathematical Sciences in
Biophysics — Speciality 03.00.02, Sevastopol National Technical
University, Sevastopol, 2005.

Molecular mechanisms of complexation of biologically active aromatic
compounds with DNA fragments of different secondary structures
(single-stranded, duplex and hairpin forms) have been investigated.
Experimental NMR data (1D and 2D-NMR spectroscopy, 500/600 MHz), have
been used for determination of the structural and thermodynamical
parameters of molecular complexes in aqueous solution. The spatial
structures of the molecular complexes have been calculated by molecular
mechanics methods using X-PLOR software.

Complexation of synthetic phenoxazone compound
actinocyl-bis-(2-dimethylaminoethyl) amide (ActII) with
self-complementary deoxytetranucleotide 5?-d(TpGpCpA) in aqueous salt
solution has been studied by 2D-NOESY spectroscopy. Analysis of
intermolecular NOE-contacts enables to conclude that ActII
preferentially intercalates into the terminal d(TG)-site of the
tetranucleotide duplex. The most favourable spatial structures of
intercalated ActII-d(TpGpCpA) complexes have been constructed using
2D-NOESY data.

The self-association of self-complementary deoxyhexanucleotide
5?-d(GpCpApTpGpC) and its complexation with antitumor antibiotic
daunomycin have been investigated in aqueous salt solution (0.1 M
phosphate buffer, pD 7.1). Measurements of the concentration and
temperature dependences of chemical shifts of nonexchangeable protons of
deoxyhexanucleotide and daunomycin have been used to calculate the
equilibrium constants and thermodynamical parameters (?H and ?S) of
d(GCATGC)2 duplex formation and complexation of the hexamer with the
antibiotic. Based on the analysis of the proton chemical shifts of the
hexamer at small concentrations and at relatively low temperatures, it
has been concluded that the hexamer d(GCATGC) forms a compact structure
(similar to a hairpin) in aqueous solution. The spatial structures of
the hairpin and the intercalated complex of daunomycin with the duplex
of the hexamer d(GCATGC)2 have been determined by molecular mechanics
methods using X-PLOR software.

Comparative analysis of the thermodynamical parameters of interaction of
phenanthridine dye, ethidium bromide (EB) with deoxyheptanucleotide
d(GpCpGpApApGpC), capable to form a hairpin structure, and a
single-stranded deoxytetranucleotide d(GpApApG), being a component
element of the heptamer sequence, has been made using 1Н NMR
spectroscopy.

Н value of complex formation between the dye molecule and the hairpin
loop d(GAA). Analysis of the obtained results enables to conclude that
single-stranded non-self-complementery oligonucleotides of the same
nucleotide content as in the hairpin loop may be used as model systems
for investigation of complexation of aromatic ligands with hairpin
structures in solution. Distinctive features of complexation of
biologically active compounds with DNA fragments of different length and
secondary structures have been discussed.

Key words: hairpin, duplex, single-stranded DNA, NMR-spectroscopy,
deoxyoligonucleotides, complexation, daunomycin, derivates of
actinomycin D, ethidium bromide.

Наукове видання

РОГОВА Ольга Валентинівна

“Фізичні механізми комплексоутворення біологічно активних ароматичних
речовин із фрагментами ДНК різної структурної організації”

Підписано до друку 15.01.2005р. Формат 60х90 1/16

Друк офсетний. Умовн.-др.арк. 1.0.

Тираж 100 прим. Зам. №1

Видавництво “СевНТУ”, Севастополь, 53, Стрілецька бухта, Студмістечко,
НМЦ

PAGE \* Arabic 24

(3)

Похожие записи