ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. В.Н. КАРАЗІНА

ТИМОФЄЄВА ОЛЕНА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 577.043

Фізична модель ендоцитозу

03.00.02 — біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Харків – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН
України.

Науковий керівник

доктор біологічних наук, професор Гордієнко Євген Олександрович,
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач
відділу низькотемпературного консервування (м. Харків)

Офіційні опоненти:

доктор фізико-математичних наук, доцент Прилуцький Юрій Іванович,
Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор
кафедри біофізики (м. Київ);

доктор фізико-математичних наук, професор Мартиненко Олександр
Віталійович, Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна,
завідувач кафедри комп’ютерних технологій і математичного моделювання в
медицині (м. Харків).

Провідна установа

Інститут теоретичної фізики ім. М.М. Боголюбова НАН України, м. Київ

Захист відбудеться “__7__” __жовтня__2005 р. о __1500__годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському
національному університеті імені В.Н. Каразіна за адресою: 61077,
м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. 7-4.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці
Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна за адресою:
61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий “_2_”___вересня___2005 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Ендоцитоз і споріднені йому явища лежать в основі
багатьох життєво важливих механізмів трансмембранного переносу речовин
на клітинному рівні. Вони мають місце, наприклад, при заплідненні
яйцеклітин, при синаптичній передачі сигналів від однієї нервової
клітини до іншої, при перетравлюванні й утилізації речовин. Ендоцитоз
блокується інгібіторами метаболізму і потребує витрати метаболічної
енергії, тобто є своєрідним різновидом активного транспорту. Наразі
спостерігається світова тенденція до поглиблення експериментального
вивчення цього явища, у той час як теоретичний аналіз ендоцитозу
практично відсутній. Хоч і розроблено кілька біофізичних моделей окремих
етапів ендоцитозу (Сериков В.Б. із співавт., 1987, 1990, Будкер В.Г. із
співавт., 1987), проте, ці моделі є надмірно спрощеними. В них, зокрема,
не приймається до уваги те, що клітинна мембрана є замкнутою поверхнею,
й ігнорується здатність мембранних компонентів до латерального
перерозподілу. Більш того, сформульовані дотепер фізичні моделі
ендоцитозу не враховують той факт, що цей транспортний процес є
активним. Тому зазначені моделі не можуть бути підставою для з’ясування
причини, механізму і закономірностей ендоцитозу. Накопичена зараз велика
кількість експериментальних даних щодо ендоцитозу потребує
систематизації й аналізу на основі сучасних теоретичних уявлень про
функціонування біологічних об’єктів.

З теоретичної точки зору побудова моделі ендоцитозу є надзвичайно
складною задачею. Однак, приймаючи до уваги останні досягнення біофізики
в царині термодинаміки і механіки біомембран, а також в області
моделювання процесу злиття мембран і інших споріднених ендоцитозу явищ,
рішення цієї задачі стало цілком реальним.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
у відділі низькотемпературного консервування Інституту проблем
кріобіології і кріомедицини НАН України в рамках відомчої НДР
«Експериментальне вивчення і кількісне моделювання процесів, що
відбуваються в мембранах клітин при кріоконсервуванні біологічних
об’єктів» (№ державної реєстрації 0101U003479).

Мета та задачі дослідження. Метою роботи було створення базової
теоретичної моделі ендоцитозу, яка описує фізичний механізм та загальні
закономірності цього явища на підставі сучасних уявлень щодо фізичних
принципів життєдіяльності клітин.

Для досягнення мети було вирішено наступні задачі:

1.Методами теорії пружності, статистичної фізики і диференціальної
геометрії поверхонь визначити вирази для вільної енергії
багатокомпонентної бішарової мембрани при довільній деформації і
неоднорідному розподілі мембранних компонентів уздовж її моношарів.

2. Методами варіаційного числення і термодинаміки довести принципову
можливість утворення в клітинній мембрані білкового домену при
обводненні клітини і знайти умови, необхідні для його утворення.

3. Довести, що за певних умов зневоднення клітини, в мембрані якої
утворився білковий домен, приводить до появи замкнутої інвагінації
мембрани, що містить позаклітинні речовини.

4. Сформулювати базову фізичну модель ендоцитозу й умови, необхідні для
здійснення цього явища.

5. На підставі сформульованої моделі ендоцитозу пояснити і передбачити
кілька закономірностей цього явища.

6. Визначити модуль ізотропного розтягу мембран гепатоцитів щурів.

Об’єкт дослідження — ендоцитоз.

Предмет дослідження — латеральний перерозподіл мембранних компонентів
при деформації клітинних мембран і механізм ендоцитозу.

Методи дослідження включають теоретичний аналіз фізичних процесів, що
відбуваються протягом ендоцитозу, здійснений методами теорії пружності,
рівноважної і нерівноважної термодинаміки, статистичної фізики,
диференціальної геометрії поверхонь, варіаційного числення та чисельного
моделювання. Особливості гіпотонічного лізису гепатоцитів щурів вивчено
методом світлової мікроскопії і фізико-математичного аналізу цього
процесу.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі на основі
фундаментальних фізичних принципів сформульована оригінальна базова
модель ендоцитозу, що пояснює механізм цього явища і, на відміну від
невеликого числа існуючих моделей, безпосередньо враховує метаболічну
залежність дослідженого процесу та частково пояснює його механізм.

Теоретично обґрунтовано можливість існування нового механізму спряження
між скалярними біохімічними реакціями, що протікають у цитоплазмі клітин
у режимі автоколивань релаксаційного типу, і векторним процесом переносу
позаклітинних речовин усередину клітин.

Уперше доведена принципова можливість утворення в клітинних мембранах
білкових доменів при ізотропному розтягу клітинних мембран, що виникає у
процесі обводнення клітин. Виходячи з побудованої моделі ендоцитозу,
пояснені і передбачені деякі закономірності цього явища. Теоретично
обґрунтовано і практично реалізовано новий спосіб кількісної оцінки
значення модулю ізотропного розтягу мембран гепатоцитів щура.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані в роботі результати
можуть бути використані для оптимального планування, аналізу,
трактування і систематизації експериментальних даних про захоплення
клітинами позаклітинних речовин за допомогою ендоцитозу. Розроблена в
дисертації модель ендоцитозу у перспективі може бути використана для
підвищення ефективності впливу різних лікарських речовин на організм
людини. Надалі отримані в роботі результати можуть знайти застосування в
різних областях біології для корекції патологій різного генезу і
керування життєво важливими процесами шляхом фізико-хімічних впливів на
біологічні об’єкти.

Особистий внесок здобувача. В опублікованих спільно зі співавторами
наукових працях особистий внесок здобувача полягає: у роботах [1,4] у
самостійному отриманні рівнянь, що описують змінення форми клітин в
процесі ендоцитозу; у роботах [2,7] у самостійній розробці
фізико-математичної моделі неспецифічного ендоцитозу, виконанні
представлених в статті розрахунків та формулюванні висновків; у роботі
[6] у самостійній розробці теоретичного обґрунтування способу оцінки
модулю ізотропного розтягу клітинної мембрани гепатоцитів щура; у
роботах [9,10] у проведенні фізико-математичного аналізу явищ
латерального перерозподілу мембранних компонент на етапах обводнення та
зневоднення клітин.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи
представлені й обговорені на ІІІ-му з’їзді Українського біофізичного
товариства (Львів, 2002), ), щорічних конференціях молодих учених ІПКіК
НАН України „Холод в біології та медицині” (Харків, 2003, 2004),
установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів,
2004), міжнародній науковій конференції “Каразінські природознавчі
студії” (Харків, 2004), І Українській науковій конференції “Проблеми
біологічної і медичної фізики” (Харків, 2004).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 10 наукових праць,
у тому числі 6 статей у фахових наукових журналах і 4 тез доповідей на
міжнародних і національних наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, 6
розділів, висновків і списку використаних джерел. Повний обсяг
дисертації складає 134 сторінки, містить 23 рисунки. Список використаних
джерел, 232 найменування, займає 21 сторінку.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність обраної теми, сформульовано мету та
задачі дослідження та наведена загальна характеристика дисертації.

В розділі 1 представлено аналітичний огляд даних літератури щодо
сучасних уявлень про ендоцитоз і споріднені йому явища, ролі
внутрішньоклітинних автоколивальних процесів у життєдіяльності клітин і
проаналізовано сучасний стан проблеми фізико-математичного моделювання
процесу ендоцитозу.

В розділі 2 подана загальна характеристика методів, які
використовувались для створення фізико-математичної моделі ендоцитозу.
Обчислення вільної енергії деформованої мембрани здійснювалося методами
теорії пружних кінцевих деформацій тонких багатошарових оболонок,
термодинаміки багатокомпонентних розчинів і диференціальної геометрії
поверхонь. Для аналізу умов виникнення білкового домену в ізотропно
розтягнутій мембрані і визначення форми контуру деформованої шляхом
вигину клітини використовувався апарат рівноважної термодинаміки і
варіаційного числення. При формулюванні теоретичної моделі ендоцитозу,
крім перерахованих вище методів, використані деякі положення і принципи
нерівноважної термодинаміки і синергетики. При чисельному моделюванні
процесу ендоцитозу і для рішення системи диференціальних рівнянь, що
описують форму контуру вигнутої мембрани, застосовувався стандартний
метод Рунге-Кутта четвертого порядку. Вивчення особливостей
гіпотонічного лізису гепатоцитів щурів виконано с застосуванням
світлової мікроскопії и фізико-математичного аналізу цього процесу.

Розділ 3 містить фізико-математичний аналіз процесів деформації і
латерального перерозподілу мембранних компонентів у багатокомпонентній
бішаровій мембрані, що відбувається при обводненні клітини, початкова
форма мембрани якої є сфера. В результаті теоретичного аналізу,
заснованого на фундаментальних положеннях теорії пружності кінцевих
деформацій, статистичної фізики і диференціальної геометрії поверхонь,
отримано шуканий вираз для вільної енергії деформації бішарової
m-компонентної мембрани:

, (1)

де

,

,

,

— площа поверхні мембрани в деформованому і недеформованому станах,

— локальна середня кривизна мембрани в деформованому і недеформованому
станах,

2h — товщина бішару,

— ефективні модулі ізотермічного розтягу зовнішнього і внутрішнього
моношарів бішарової мембрани,

— локальні молекулярні концентрації молекул j-го сорту в зовнішньому і
внутрішньому моношарах бішарової мембрани,

— площа, що припадає в середньому на одну молекулу i-го сорту в
зовнішньому і внутрішньому моношарах бішарової мембрани у відсутності її
деформації,

— модуль ізотермічного розтягу мембранної молекули j-го сорту,

— власна спонтанна кривизна молекули j-го сорту.

У загальному випадку вільна енергія деформації бішару складається з двох
частин. Перша з них, що відповідає першому доданку в (1), пов’язана з
ізотропним розтягом серединної поверхні бішару, а друга частина, що
відповідає другому доданку в наведеному вище виразі для вільної енергії
деформації, — зі згинанням бішару, при якому площа серединної поверхні
бішару не змінюється, а змінюється тільки локальна середня кривизна
мембрани. Другий доданок у виразі для вільної енергії деформації
мембрани (1) пропорційний малому параметру h2. Тому при ізотропному
розтягу мембрани, що неминуче виникає при достатньо значному обводненні
клітини, яка має сферичну форму, можна знехтувати другим доданком у
порівнянні з першим. У цьому випадку ефектами, пов’язаними з кривизною
мембрани, можна знехтувати у порівнянні з ефектом, викликаним
збільшенням площі поверхні мембрани. З іншого боку, при зневоднюванні
клітини в силу принципу мінімуму вільної енергії вирішальний внесок у
вільну енергію деформації вносять ефекти, пов’язані з кривизною
мембрани, а ізотропний розтяг мембрани відсутній. Цей висновок є
надзвичайно важливим для сформульованої нами моделі ендоцитозу. В
розділі 3 також доведена принципова можливість виникнення білкового
домену в мембрані при обводненні клітини, що виникає в результаті її
контакту з гіпотонічним середовищем. У цьому випадку, як зазначено
раніше, вільна енергія деформації визначається тільки першим доданком в
отриманому виразі для вільної енергії (1). Повна вільна енергія
деформації двокомпонентної мембрани обводненої клітини, в якій
утворюється домен, що містить тільки молекули другого сорту, крім
вільної енергії ізотропного розтягу містить ще внесок, зв’язаний зі
зменшенням ентропії мембрани, що завжди виникає при відхиленні розподілу
мембранних компонентів у мембрані від однорідного:

, (2)

— кількість молекул у домені, що складається тільки з молекул другого
сорту,

N1 і N2 — повна кількість молекул першого і другого сорту, що містяться
в мембрані,

— концентрація насиченого розчину другого мембранного компоненту в
першому.

. Як видно, вільна енергія ізотропно розтягнутої мембрани з доменом, що
утворився в ній, перевищує вільну енергію

(1 — 0,08223; 2 — 0,08226; 3 — 0,08228).

, змішати з

, що припадає на одну молекулу в недеформованому двокомпонентному
мембранному моношарі, від молярної концентрації n одної з мембранних
компонент.

була увігнутою вниз. Ця умова є необхідною для утворення домену в
ізотропно розтягнутій мембрані. Відповідно до універсального
термодинамічного принципу мінімуму вільної енергії будь-яка
термодинамічна система при термодинамічній рівновазі приймає мінімально
можливе при заданих зовнішніх умовах значення. Одним з різновидів цього
принципу є відомий у термодинаміці принцип Ле Шательє, що говорить: якщо
будь-яка термодинамічна система виводиться зі стану рівноваги в
результаті якого-небудь зовнішнього впливу, то в ній стимулюються
процеси, спрямовані на послаблення результату цього зовнішнього впливу.
У розглянутому нами випадку ізотропного розтягу мембрани таким процесом
є латеральний розподіл мембранних компонентів і утворення в мембрані
білкового домену.

В розділі 4 проведено фізико-математичний аналіз стадії зневоднювання
клітини, в мембрані якої за рахунок попереднього обводнення утворився
домен, що складається тільки з молекул одного сорту. Вільна енергія
деформації в цьому випадку в силу зазначених вище фізичних міркувань
визначається виразом

, (3)

де Н — середня кривизна мембрани в деформованому стані, що залежить від
положення точки, яка розглядається, на мембрані,

— середня кривизна недеформованої мембрани, що також залежить від
положення точки на мембрані,

h2 — модуль вигину клітинної мембрани, що має розмірність енергії.

Якщо процес зневоднювання відбувається досить швидко, то форма клітини
змінюється так, щоб була мінімізована вільна енергія вигину при заданому
розподілі мембранних компонентів уздовж поверхні мембрани.

, де ? — кут між дотичною до контуру осесиметричної клітини і віссю
симетрії у точці мембрани, що розглядається, s — відстань від полюса
контуру клітини до тієї ж точки уздовж контуру мембрани, ? — відстань
від осі симетрії до точки мембрани, що розглядається. Середня кривизна
поверхні мембрани дорівнює напівсумі середніх кривизн меридіана і
паралелі. Тому в довільній точці мембрани

. (4)

, де V — об’єм зневодненої клітини, знаходимо, що в стані
термодинамічної рівноваги мінімально можливе при заданому об’ємі клітини
значення повинен приймати функціонал

,

де ? і ? — невизначені множники Лагранжа.

Форму контуру мембрани зневодненої клітини знаходимо з необхідних умов
мінімуму цього функціонала, тобто рівності нулю його першої варіації.
Таким чином, одержуємо необхідні умови екстремуму функціонала у вигляді
системи диференційних рівнянь:

,

.

, знаходимо

.

Переходячи до невимірних змінних

, одержуємо наступну систему рівнянь у невимірних змінних, що описують
форму осесиметричного контуру клітини в процесі її зневоднювання

;

;

;

;

.

На рис. 3 показана розрахована за рівняннями (5) зміна форми контуру
бішарової мембрани, в якій за рахунок попереднього обводнення утворився
домен, що складається тільки з молекул другого сорту, а саме з
інтегральних білків, які за розташуванням у мембрані мають негативну
спонтанну кривизну, у залежності від ступеня зневоднювання клітини.

Рис. 3. Зміна форми контуру мембрани клітини в процесі зневоднювання
після попереднього обводнення.

Як видно, у цьому випадку зневоднювання клітини, в якій за рахунок
попереднього обводнення утворився білковий домен, приводить до утворення
замкнутої інвагінації, з’єднаної з іншою частиною мембрани вузьким
циліндричним перешийком. Як відомо з добре розробленої теорії злиття
біомембран, цей перешийок легко розривається за рахунок теплових
флуктуацій і дуже швидко (за час порядку декількох секунд) мембранний
пухирець відокремлюється від іншої частини мембрани. Таким чином,
утворюється внутрішньоклітинна ендосома, в якій знаходяться речовини,
раніше адсорбовані на зовнішній поверхні клітинної мембрани.

Необхідною умовою для утворення ендосоми є наявність великої власної
негативної кривизни інтегральних білків, якими збагачений домен, що
виник у результаті попереднього обводнення клітини.

? ? &

V

4

a

@

??I?U?ae?o?th???!¬!tcvc6§??aeoiOµµµµµ™™yyy™™y

I

?

Oe

O

U

Ue

2я у вигляді декількох стійких граничних циклів, що описуються
замкнутими траєкторіями на фазовій площині (х, у).

На рис. 4 приведений фазовий портрет біохімічної реакції, що має три
стійких граничних цикли 1,2,3. Граничному циклу еліптичної форми 1
відповідають майже синусоїдальні коливання концентрацій з часом. При
збільшенні (або зменшенні) значення керуючого параметру така

Рис. 4. Фазовий портрет нелінійної системи диференційних рівнянь, які
припускають можливість стійких автоколивальних рішень.

біохімічна система може перейти на граничний цикл із більш високим
числом. При цьому амплітуда коливань концентрацій субстратів і продуктів
реакцій збільшується, і форма фазової траєкторії змінюється від
еліптичної (1) до майже трикутної (3), що відповідає релаксаційному
режиму (рис.5). Якщо біохімічна реакція є реакцією типу розпад-з’єднання
чи супроводжується зміною конформації речовин, що беруть участь у
реакції, і, отже, ступеня їхньої гідратації і сольватації, осмотичний
тиск внутрішньоклітинного розчину періодично то збільшується, то
зменшується. Оскільки при цьому склад позаклітинного середовища не
міняється, це приводить

Рис. 5. Автоколивання концентрації внутрішньоклітинних речовин
релаксаційного типу.

до пульсацій об’єму клітини з часом під дією перепаду осмотичного тиску,
що періодично змінюється, на мембрані. При автоколиваннях релаксаційного
типу фаза обводнення клітини в метаболічно активованому стані може бути
значно більш тривалою за фазу зневоднювання, як показано на рис.6.
Вихідним припущенням розробленої нами моделі ендоцитозу є припущення про
те, що в активованому стані об’єм спеціалізованих клітин, здійснює
релаксаційні коливання під дією описаного вище біохімічного
автоколивального процесу. Це узгоджується з неодноразово висловленим у
літературі припущенням про можливість регуляції клітинного об’єму
специфічним внутрішньоклітинним водієм ритму. Таким чином, сформульована
нами модель ендоцитозу спирається на уявлення про те, що в основі
функціонування здатних до ендоцитозу клітин лежить

Рис.6. Періодичні коливання об’єму V спеціалізованої клітини, що
виникають у результаті нелінійного автохвильового біохімічного процесу
усередині клітини за рахунок хімічних процесів з’єднання і розпаду (S0 –
площа поверхні клітинної мембрани в недеформованому стані).

циклічний біохімічний процес, який протікає в цитоплазмі, у результаті
якого вода, внутрішньоклітинні іони і біомакромолекули періодично
переходять з вільного в зв’язаний стан, наприклад, у результаті процесів
адсорбції-десорбції чи реакцій з’єднання-розпаду. В результаті
зазначених процесів об’єм спеціалізованих клітин, що здійснюють
ендоцитоз, періодично змінюється з часом, то збільшуючись, то
зменшуючись. Внаслідок ізотропного розтягу клітинної мембрани, що
відбувається при обводненні клітини, виникає латеральний перерозподіл
мембранних компонентів, у результаті якого на невеликій ділянці мембрани
накопичуються інтегральні білки з негативною спонтанною кривизною.
Вважається, що вказані білки-рецептори попередньо зв’язують молекули
речовин або частинок, які повинні підвергнутись ендоцитозу, на зовнішній
поверхні мембрани, що саме і приводить до запуску цього процесу. На
стадії наступного зневоднювання клітини, як доведено в попередніх
розділах роботи, вільна енергія деформації клітинної мембрани
визначається переважно її кривизною, оскільки в цьому випадку мембрана
може деформуватися не шляхом ізотропного розтягу, а шляхом згинання
поверхні мембрани. Саме тому на етапі зневоднювання клітини енергетично
вигідною стає така форма клітини, при якій кривизна мембрани в області
білкового домену майже збігається з власною кривизною молекул, що
складають домен. Завдяки цьому в області білкового домену на мембрані
утворюється інвагінація, що з’єднана з мембраною клітини невеличким
перешийком (рис.7 с). Далі внаслідок теплових флуктуацій перешийок, що
утворився таким чином, розривається, і від мембрани в цитоплазму клітини
відокремлюється пухирець, що містить позаклітинні речовини (рис.7 d).

Рис.7. Схематичне зображення утворення білкового домену в ізотропно
розтягнутій мембрані й утворення внутрішньоклітинного мембранного
пухирця при наступному зневоднюванні клітини.

Мембранний пухирець, що відокремився від мембрани містить
зовнішньо-клітинний розчин, осмотичний тиск якого є ізотонічним.
Оскільки осмотичний тиск цитоплазми після відокремлення пухирця від
мембрани збільшується відносно ізотонічного розчину, об’єм мембранного
пухирця, що відокремився від мембрани, зменшується аж до наступної фази
зневоднення. На стадії зневоднення (DA’, D’A’’ на рис. 6), очевидно,
об’єм мембранного пухирця збільшується до значень, при котрих в його
мембрані виникає відповідний ізотропний натяг. Якщо до цього моменту
мембранний пухирець, що утворився, вже знаходиться в контакті з
лізосомою, то ізотропний розтяг мембрани пухирця сприяє його злиттю з
лізосомою, оскільки при такому злитті зменшується їх сумарна вільна
енергія деформації.

Після обробки протеолітичними ферментами речовин, що були захоплені
усередину клітини, мембранний пухирець руйнується і білки-рецептори
потрапляють в цитоплазму. Оскільки їх молекули є амфіфільними,
термодинамічно вигідним є їх довільне вбудовування в клітинну мембрану.
Більш того, термодинамічно вигідним є таке занурення цих білків у бішар
клітинної мембрани, при якому більш велика гідрофільна основа білкової
молекули звернена усередину цитоплазми. В протилежному випадку була б
потрібна витрата більшої енергії на перенос гідрофільної частини
білка-рецептора крізь гідрофобну серцевину бішару. Сформульована нами
теоретична модель ендоцитозу передбачає, що мембрана
внутрішньоклітинного пухирця, який утворюється при ендоцитозі, містить
підвищену концентрацію білків з негативною (за розташуванням в мембрані)
спонтанною кривизною і що осмотичний тиск цитоплазми клітини, що
здійснює ендоцитоз, періодично міняється з часом. Модель передбачає, що
незалежно від розміру часток, які поглинаються шляхом ендоцитозу, радіус
пухирців, які відокремлюються від основної частини клітинної мембрани,
залишається постійним. Частота поглинання позаклітинних речовин однією
клітиною шляхом ендоцитозу є цілком визначеною, що лімітує швидкість
зазначеного процесу при постійній кількості клітин, які здійснюють
ендоцитоз. Тому в екстремальних ситуаціях швидкість поглинання
позаклітинних речовин за допомогою ендоцитозу може бути збільшена тільки
за рахунок росту числа клітин, що здійснюють цей процес, чи за рахунок
більш повільного процесу — синтезу додаткової кількості
білків-рецепторів.

Розроблена модель ендоцитозу дозволяє пояснити деякі відомі з
літератури експериментальні дані про це явище. Зміна осмотичного тиску
позаклітинного розчину як убік його зниження, так і підвищення,
пригнічує ендоцитоз, оскільки зникає необхідне для здійснення цього
процесу чергування ізотропного натягу клітинної мембрани з її вигином.
Періодична зміна об’єму вакуолей, що відокремилися від основної частини
мембрани при ендоцитозі, пояснюється періодичною зміною осмотичного
тиску цитоплазми, що лежить в основі нашої моделі.

Згідно з висунутими уявленнями метаболічна енергія при ендоцитозі
витрачається на поперемінне обводнення і зневоднювання клітини,
наприклад, за рахунок зв’язування і переходу у вільний стан частини
внутрішньоклітинних речовин. Площа поверхні мембранного пухирця, що
утворюється при ендоцитозі, приблизно збігається з площею мембранного
домену, збагаченого інтегральними білками з негативною спонтанною
кривизною.

У рамках побудованої моделі ендоцитозу роль спеціалізованих білків, що
беруть участь у впізнанні об’єкта, що захоплюється клітиною, його
фіксації на мембрані й в утворенні сигналу для початку ендоцитозу, у
загальному вигляді описується керуючим параметром ?, зміна якого
переводить функціонування клітини на більш високий метаболічний рівень,
що відповідає переходу на більш віддалений від рівноваги граничний цикл.

В розділі 6 методом світлової мікроскопії досліджені особливості
гіпотонічного лізису гепатоцитів щурів. Встановлено, що в процесі
гіпотонічного лізису цих клітин після розведення клітинної суспензії
дистилірованою водою на поверхні гепатоцитів утворюються пухирці, що
мають форму сферичного сегменту, при цьому площа поверхні клітини на сто
і більше відсотків перевищує її початкове значення. На ґрунті простих
фізичних та геометричних міркувань наведено алгоритм визначення модулю
ізотропного розтягу мембрани гепатоцитів щурів за даними, отриманими
упродовж візуального спостереження за процесом гіпотонічного лізису
вказаних клітин. Одержано кількісну оцінку модуля ізотропного розтягу
мембран гепатоцитів щурів, який становить 0,0079 Н/м, тобто має
аномально низьке значення у порівнянні, наприклад, з еритроцитами
людини. Встановлено, що мембрана гепатоциту щура не втрачає властивості
вибіркової проникності після утворення розриву в ній, викиду частини
внутрішньоклітинного розчину з клітини та довільного заліковування пори.

ВИСНОВКИ

1. Розроблені наразі біофізичні моделі окремих етапів ендоцитозу є
надмірно спрощеними та не враховують зв’язки цього процесу з
метаболічною активністю клітин, що не дозволяє визначити причини,
механізми і закономірності ендоцитозу в межах цих моделей та
використувати їх для аналізу і трактування результатів експериментів.

2. Вперше отримано вираз для вільної енергії деформації
багатокомпонентної бішарової мембрани в загальному випадку довільної
деформації і довільного розподілу мембранних компонент уздовж моношарів.

3. Теоретично і експериментально обгрунтовано новий метод визначення
модулю ізотропного розтягу мембран гепатоцитів щурів.

4. Встановлено, що площа мембран гепатоцитів щурів може збільшуватися на
сто і більш відсотків без порушення їхньої цільності.

5. Сформульована і фізично обґрунтована базова теоретична модель
ендоцитозу і визначені фізичні умови, необхідні для здійснення цього
процесу.

6. Теоретично передбачена можливість існування нового механізму
спряження між скалярними біохімічними реакціями, що протікають у
цитоплазмі клітин у режимі автоколивань релаксаційного типу, і векторним
процесом переносу позаклітинних речовин усередину клітин.

7. Вперше доведена принципова можливість утворення в мембрані домену,
збагаченого одним з мембранним компонентів, у результаті ізотропного
розтягу мембрани при обводненні сферичної клітини.

8. Теоретично пояснений відомий з експериментів ефект інгібування
ендоцитозу при зменшенні осмотичного тиску позаклітинного розчину і
передбачені деякі загальні закономірності цього явища, зокрема, ефект
його інгібування позаклітинним гіпертонічним розчином.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гордиенко Е.А., Тимофеева Е.В. Физико-математическая осесимметричная
модель адсорбционного эндоцитоза. 1. Уравнения, определяющие форму
клетки // Вісник Харківського університету. — Біофізичний Вісник. –
2002. – Вип. 1(10). – С. 58-61.

2. Гордиенко Е.А., Тимофеева Е.В. Физическая модель неспецифического
эндоцитоза // Вісник Харківського університету. — Біофізичний Вісник. –
2003. – Вип. 1(12). – С. 79-85.

3. Тимофеева Е.В. Теоретическая модель эндоцитоза // Сучасні аспекти
репродуктології, перенатальної медицини та кріобіології. — 2003. — С.
220-224.

4. Тимофеева Е.В., Гордиенко Е.А. Физико-математическая осесимметричная
модель адсорбционного эндоцитоза. II. Изменение формы клетки на этапе
обезвоживания // Вісник Харківського університету. — Біофізичний Вісник.
– 2003. – Вип.2 (13). – С. 68-71.

5. Тимофеева Е.В. Теоретическая модель эндоцитоза // Биополимеры и
клетка. – 2004. – Т.20, №5. – С. 440-442.

6. Тимофеева Е.В., Кулешова Л.Г. Теоретическое обоснование способа
оценки модуля изотропного растяжения клеточной мембраны гепатоцитов
крысы // Вісник Харківського університету. — Біофізичний Вісник. – 2004.
– № 637. – Вип. 1-2 (14). – С 85-87.

7. Гордієнко Є.О., Тимофєєва О.В. Фізико-математична модель
адсорбційного ендоцитозу // Тези доповідей III з’їзду Українського
біофізичного товариства. –Львів. – 2002. – С. 166.

8. Тимофєєва О.В. Фізична модель ендоцитозу // Установчій з’їзд
Українського товариства клітинної біології. – Львів. – 2004. — С. 324.

9. Тимофєєва О.В., Гордієнко Є.О. Латеральний перерозподіл компонентів у
біомембранах при обводненні і зневодненні клітин // Міжнародна наукова
конференція “Каразінські природознавчі студії”. – Харків. – 2004. — С.
243-244.

10. Тимофєєва О.В., Гордієнко Є.О. Аналіз фізичних процесів, які
виникають у біомембранах при обводненні і зневодненні клітин на підставі
принципу мінімуму вільної енергії // I Українська наукова конференція
“Проблеми біологічної і медичної фізики”. — Харків. – 2004. — С. 103.

АНОТАЦІЯ

Тимофєєва О.В. Фізична модель ендоцитозу. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних
наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. — Харківський національний
університет ім. В.Н. Каразіна, м. Харків, 2005.

В дисертації на підставі фундаментальних фізичних принципів
сформульована фізична модель ендоцитозу. В основі моделі лежить уявлення
про автоколивальний хімічний процес релаксаційного типу. Внаслідок цього
об’єм клітини, яка здійснює ендоцитоз, спочатку повільно зростає, а
потім швидко зменшується. При зростанні об’єму клітини в її
цитоплазматичній мембрані виникає ізотропний натяг, який при
встановлених в роботі умовах приводить до утворення в мембрані білкового
домену. В процесі наступної стадії швидкого зневоднення клітини в
області домену, що утворився на попередній стадії, утворюється
інвагінація, яка відокремлена від основної частини мембрани вузьким
нестабільним щодо теплових флуктуацій перешийком.

В роботі уперше обґрунтована можливість здійснення механізму спряження,
який раніше не розглядався, між скалярними біохімічними реакціями, що
протікають всередині клітини і векторним процесом трансмембранного
переносу речовин із зовні в клітину.

Методом світлової мікроскопії досліджені особливості гіпотонічного
лізису гепатоцитів щурів.

Ключові слова: фізико-математичне моделювання, деформація мембрани,
ендоцитоз, латеральний перерозподіл мембранних компонент.

АННОТАЦИЯ

Тимофеева Е.В. Физическая модель эндоцитоза. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических
наук по специальности 03.00.02 – биофизика. – Харьковский национальный
университет им. В.Н. Каразина, г. Харьков, 2005.

В диссертации на основе фундаментальных физических принципов
сформулирована физическая модель эндоцитоза, в основе которой лежит
представление о протекающем в цитоплазме автоколебательном химическом
процессе релаксационного типа, в результате которого осмотическое
давление внутриклеточного раствора то возрастает, то уменьшается.
Вследствие этого объем совершающей эндоцитоз клетки вначале медленно
увеличивается, а затем быстро уменьшается. При увеличении объема клетки
в ее цитоплазматической мембране возникает изотропное натяжение, которое
при установленных в работе условиях приводит к образованию в мембране
домена, в котором сосредотачиваются преимущественно интегральные белки
определенного типа с отрицательной по расположению в мембране спонтанной
кривизной. В процессе последующей стадии быстрого обезвоживания клетки в
области образовавшегося на предыдущей стадии домена образуется
инвагинация, отделенная от основной части мембраны узким нестабильным по
отношению к тепловым флуктуациям перешейком. Разрыв этого перешейка
приводит к тому, что от мембраны отщепляется замкнутая везикула,
содержащая внутри себя предварительно адсорбированные на внешней
поверхности клеточной мембраны вещества. Теоретический анализ физических
процессов которые происходят в течение эндоцитоза, осуществлен методами
теории упругости, равновесной и неравновесной термодинамики,
статистической физики, дифференциальной геометрии поверхностей,
вариационного исчисления и численного моделирования. В отличие от
имеющихся в настоящее время количественных моделей отдельных стадий
эндоцитоза, разработанная нами модель учитывает то обстоятельство, что
эндоцитоз является активным, метаболически зависимым процессом.

При формулировке модели эндоцитоза получено значение свободной энергии
деформации многокомпонентной бислойной клеточной мембраны, минимизация
которого в предельных случаях, соответствующих оводнению или
обезвоживанию клеток, позволяет определить как условия возникновения
указанного выше белкового домена на мембране при ее изотропном
растяжении, так и форму инвагинации, возникающей при изгибе мембраны на
стадии последующего обезвоживания.

В работе впервые обоснована возможность осуществления не
рассматривавшегося ранее механизма сопряжения между протекающими внутри
клетки скалярными нелинейными биохимическими реакциями и векторным
процессом трансмембранного переноса веществ снаружи внутрь клетки.
Показано, что достаточно большое изотропное растяжение мембраны приводит
к латеральному разделению мембранных компонент, например, к образованию
домена, содержащего только одну из мембранных компонент, и что изгиб
мембраны, как и изотропное растяжение, является физической причиной
сепарации мембранных компонент. Этот вывод согласуется с принципом
Ле-Шателье, который утверждает, что любое внешнее воздействие
стимулирует в термодинамической системе процессы, ослабляющие результат
этого воздействия.

Исходя из необходимых условий минимума свободной энергии, получена
система уравнений, которая описывает форму контура мембраны обезвоженной
клетки, в мембране которой за счет предшествующего оводнения образовался
домен, состоящий только из молекул второго сорта. Как показывают
проведенные нами расчеты, при обезвоживании первоначально сферической
клетки, в мембране которой образовался домен, состоящий из интегральных
белков, которые имеют отрицательную собственную кривизну, на мембране
клеток спонтанно образуется замкнутая мембранная инвагинация,
соединенная с основной частью мембраны узким перешейком, состав которой
определяется составом указанного выше белкового домена.

На основе разработанной модели объяснены и предсказаны некоторые
закономерности эндоцитоза, в частности, явление его ингибирования при
понижении осмотического давления внеклеточной среды.

Конечно, представленная в работе физическая модель эндоцитоза является в
определенном смысле лишь базовой – для каждой разновидности клеток,
которые способны совершать избирательный захват внеклеточных веществ или
частиц, она нуждается в уточнении и конкретизации, то есть является
открытой моделью. Очевидно, развитые в работе представления в дальнейшем
могут быть использованы также при изучении экзоцитоза – процесса, в
некотором смысле, обратного эндоцитозу, а также родственных эндоцитозу
явлений.

Методом световой микроскопии исследованы особенности гипотонического
лизиса гепатоцитов крыс. На основании простых физических и
геометрических соображений построен алгоритм определения модуля
изотропного растяжения мембран гепатоцитов крыс и получена
количественная оценка модуля изотропного растяжения мембран этих клеток.

Ключевые слова: физико-математическое моделирование, деформация
мембраны, эндоцитоз, латеральное перераспределение мембранных компонент.

SUMMARY

Tymofyeyeva O.V. Physical model of endocytosis. — Manuscript.

Thesis for a candidate’s degree by speciality 03.00.02. – Biophysics. –
V.N. Karazin Kharkiv National University, Kharkiv, 2005.

In the thesis the physical model of endocytosis is formulated basing on
fundamental physical principles. The model is based on the conception of
self-oscillating chemical process. As a result of it the volume of cell
being in the process of endocytosis at first slowly increases, and then
rapidly falls. When the cell volume increases the isotropic tension in
the plasma membrane arises and under the conditions established by us in
our work leads to formation of protein membrane domain. During the next
stage of rapid cell dehydration in the area where domain was formed at
the previous stage an invagination, separated from the main part of
membrane by a narrow unstable to thermal fluctuations isthmus is formed.

In this work we have substantiated for the first time the possibility of
the realization of the mechanism of coupling between scalar non-linear
biochemical reactions, occurring inside the cell, as well as the vector
process of transmembrane transition of substances from the outside into
the cell which hasn’t been considered before.

Peculiarities of hypotonic lysis of rat hepathocytes were investigated
using light microscopy method.

Key words: physical and mathematical modeling, membrane deformation,
endocytosis, lateral redistribution of membrane components.

Наукове видання

ТИМОФЄЄВА Олена Володимирівна

ФІЗИЧНА МОДЕЛЬ ЕНДОЦИТОЗУ

Підписано до друку 10.06. 2005р. Формат паперу 60×90 1/16.

Друк офсетний. Умовн. др. арк. 0,9

Наклад 100 прим. Зам. № 161.

ТОВ “Рейтинг”

М.Харків, вул. Сумська, 37.

PAGE \* Arabic 1

PAGE \* Arabic 20

(5)

Похожие записи