.

Ферментативна активність і морфокінетичні властивості сперміїв людини до і після низькотемпературного консервування (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 2487
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Родіонова Валерія Львівна

УДК 615.361.013.11.014.413

Ферментативна активність і морфокінетичні властивості сперміїв людини
до і після низькотемпературного консервування

14.01.35 – кріомедицина

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Харків – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН
України

Науковий керівник: академік НАН України, доктор медичних наук,
професор, лауреат Державних премій СРСР та України

Грищенко Валентин Іванович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини
НАН України, директор ІПКіК НАН України, м. Харків

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук Компанієць Антоніна Михайлівна, Інститут проблем
кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу
кріопротекторів, м. Харків

доктор біологічних наук, професор Гладкова Алла Іванівна, Інститут
проблем ендокринної патології АМН України, завідувач лабораторією
репродуктивної ендокринології, м. Харків

Провідна установа

Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, кафедра
педіатрії, акушерства та гінекології факультету фундаментальної
медицини, Міністерство освіти і науки України

Захист відбудеться “__24__”_____січня____2006 року о__13.30_ годині на
засіданні спеціалізованої Вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем
кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м. Харків,
вул. Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІПКіК НАН України за
адресою: 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23.

Автореферат розіслано “__23_”____грудня____ 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої Вченої ради,

член-кореспондент НАН України
Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Чоловіче і жіноче безпліддя – це не тільки
надзвичайно важлива медична, але й соціальна
проблема. У багатьох країнах світу, у
тому числі в Україні, відзначається різке зниження народжуваності
[Стешенко В.С., 2003]. Рішення проблеми безплідного
шлюбу є важливою складовою національної
програми щодо поліпшення демографічної і
соціальної ситуації в Україні.

Відомо, що за останні 15-20 років чоловічий фактор в етіології безпліддя
підвищився з 17 до 55 % [Joffe V., 1994, Сердюк А.М., 1997].

Для лікування безпліддя розроблені і більш широко застосовуються
методи допоміжних репродуктивних технологій
(ДРТ), зокрема метод штучної
інсемінації спермою чоловіка або донора. Використання у багатьох
країнах світу різних технологічних режимів
заморожування – відігріву сперміїв, ооцитів і ембріонів розширює
можливості ДРТ. Для реалізації раніш розробленого в ІПКіК НАН України
методу надшвидкого заморожування сперми людини [Грищенко В.И., Калугин
Ю.В., Лучко Н.А., 1998] виготовляються спеціальні алюмінієві контейнери
і застосовується складна апаратура, яка забезпечує необхідний режим
заморожування. Інші розроблені методи кріоконсервування сперми також
реалізуються за допомогою коштовної і складної апаратури. Розробка
спрощеної, але не менш ефективної технології кріоконсервування чоловічих
гамет, яка не передбачає застосування спеціального устаткування буде
сприяти більш широкому використанню методів інсемінації спермою чоловіка
або донора в центрах по лікуванню безпліддя.

У вивченні сперми людини досягнуто значних результатів, зокрема у
дослідженні гамет та механізмів їхнього ушкодження на різних етапах
низькотемпературного консервування (НТК). Однак пошук нових кріозахисних
середовищ залишається актуальною проблемою. Зміни значень рН і коливання
осмотичного тиску позаклітинних кріозахисних розчинів можуть бути
причинами ушкодження клітин на всіх етапах низькотемпературного
консервування [Белоус А.М., 1982]. Адекватні кріозахисні середовища і
режими заморожування біооб’єктів слід підбирати разом з оптимізацією
умов розморожування, необхідних для ефективної репарації нелетальних
ушкоджень і капацитації сперміїв, що досягається підбором спеціальних
середовищ і умов інкубації у них клітин після відтавання.

Чоловічі статеві клітини – складноорганізована метаболічна “машина”,
де ферментативні реакції відіграють
важливу роль у реалізації процесу
запліднення. За даними літератури, активність акрозину і гіалуронідази в
сперміях людини корелює з їх
фертильністю [Смаглий Н.Ю., 1988]. Тому

оцінка цих ферментів після
низькотемпературного консервування є одним з
найбільш достовірних прогностичних тестів на функціональну повноцінність
деконсервованих сперміїв. Іншим можливим
механізмом низькотемпературного ушкодження гамет може
бути необоротна денатурація ферментів, які беруть участь
у процесі гліколізу та окислювально-відновних реакціях –
сукцинатдегідрогенази (СДГ) і
глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г6ФДГ). Існує небагато робіт, де
показники активності зазначених ферментів встановлені після
заморожування з високими і низькими швидкостями [Goodpasture J.C. et
al., 1981, Смаглий Н.Ю., 1988, Дунаєвська А.В, 2001].

Таким чином, активність ферментів у сполученні з морфологічними
характеристиками клітин може бути критерієм оцінки
морфофункціонального стану статевих клітин
до кріоконсервування та ефективності методів
низькотемпературного консервування і, зокрема, кріозахисних середовищ,
які використовуються при заморожуванні сперми людини.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана відповідно до плану НДР ІПКіК НАН України в рамках теми
№2.2.6.96 „Вивчення особливостей дії низьких температур і гіпотермії на
гамети, ембріони, ембріональні клітини в залежності від етапу гамето- і
ембріогенезу, розробка середовищ збереження, кріоконсервування та
репарації нелетальних кріопошкоджень цих біооб’єктів”, № держреєстрації
0100U003480.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи – оцінити ступень збереження
ферментативної активності та морфокінетичних показників сперми донорів,
кріоконсервованої нескладним і ефективним методом, який не потребує
спеціального обладнання.

Відповідно до поставленої мети передбачалося:

1.Провести порівняльний аналіз впливу різних кріозахисних середовищ на
кінетичні параметри, морфологічні характеристики, а також на збереження
мембран і конденсацію хроматину в сперміях людини.

2.Визначити вплив складу, рН і осмолярності кріозахисних середовищ на
рухливість сперміїв людини.

3.Зробити вимір діелектричної проникності сперми при нормо- та
олігозооспермії і еквілібрації з кріозахисним середовищем
гліцерин-лактоза-жовток.

4.Розробити доступний, ефективний метод кріоконсервування сперми
людини, який не потребує спеціального обладнання.

5.Дослідити морфофункціональні показники сперміїв людини і
ферментативну активність в них акрозину, гіалуронідази,
сукцинатдегідрогенази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази до і після
заморожування.

6.Дослідити вплив різних середовищ інкубації сперміїв після
розморожування на рухливість чоловічих гамет.

Об’єкт дослідження. Вплив факторів низькотемпературного
консервування на морфокінетичні властивості та
активність ферментів сперміїв
людини.

Предмет дослідження. Спермії і еякулят людини.

Методи дослідження: морфологічні, біохімічні (спектрофотометрія,
фотоелектрокалориметрія), біофізичні (рН-метрія, осмометрія,
КВЧ-діелектрометрія).

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше встановлена активність
основних ферментів сперми людини після низькотемпературного
консервування під захистом середовища гліцерин-лактоза-жовток з
використанням розробленого режиму заморожування. Проведено теоретичне
обгрунтування оптимальної швидкості охолодження сперміїв людини на всіх
етапах кріоконсервування, яке підтверджено результатами
експериментальної роботи. Уперше для підвищення рухливості сперміїв
встановлена доцільність додавання адреналіну в середовище їх інкубації
до і після розморожування. Уперше визначена діелектрична проникність
сперми людини в нормі та при патології сперматогенезу, а також після
експозиції з середовищем гліцерин-лактоза-жовток.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено доступний та
ефективний метод низькотемпературного консервування сперми людини, який
не потребує застосування спеціального обладнання. Створено банк
кріоконсервованих доз донорської сперми людини. Деконсервована сперма
успішно використується для лікування чоловічого безпліддя на базі деяких
клінік ДРТ України.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем самостійно отримано
експериментальні дані, підготовлено аналітичний огляд літератури за
тематикою дисертації. Разом з науковим керівником дисертантом було
здійснене обговорення і узагальнення результатів дослідження та
сформульовані остаточні висновки. В опублікованих спільно зі
співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:

– у роботах [1,5] у визначенні активності основних ферментів у
кріоконсервованих по розробленому методу сперміях людини;

– у роботах [2,7] у вивченні змін концентрації, рухливості,
життєздатності, морфологічної цілісності сперміїв людини після
заморожування по розробленому методу;

– у роботі [3] у вивченні впливу шкідливих факторів зовнішнього
середовища на морфофункціональні властивості
сперміїв людини, зокрема у визначенні їх фізико-хімічних властивостей та
стану хроматину;

– у роботі [4] у вимірі діелектричної проникності сперміїв людини при
патології сперматогенезу та додаванні кріопротектора;

– у роботі [7] в участі у теоретичній та практичній розробці методу
кріоконсервування сперми донорів.

Апробація результатів дисертації. Результати проведених досліджень
доповідалися на щорічній конференції молодих вчених
“Холод в біології і медицині ” ІПКіК НАН
України разом з міжнародною кафедрою кріобіології
під егідою ЮНЕСКО (Харків, 2002 – 2004); на щорічній
конференції “Збереження генетичних
ресурсів” (Пущіно, 2002); на конференції
“Фундаментальні питання експериментальної та клінічної
ендокринології” (Харків, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертаційного дослідження опубліковано 6
наукових праць, у тому числі 4 статті у спеціалізованих фахових виданнях
та 1 патент на винахід.

Структура дисертації. Дисертацію викладено на 129 сторінках друкованого
тексту, з яких 111 сторінок основного змісту. Дисертація складається зі
вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень,
результатів власних досліджень та їх обговорення, заключення, висновків,
списку використаної літератури (в кількості 189 джерел на 18 сторінках).
Робота ілюстрована 19 рисунками та 7 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень

Для виконання роботи було використано 273 зразків еякулятів і
спермоплазми 187 чоловіків-донорів і претендентів у донори віком від 20
до 40 років після 3-4 днів статевої абстиненції. Кріоконсервування
зразків сперми проводили під захистом середовища гліцерин-лактоза-жовток
(ГЛЖ) у полімерних трубочках довжиною 70–80 мм, з зовнішнім діаметром
3,8 мм та товщиною стінок 120 мкм [Осташко Ф.И., 1990], які поміщали в
ультратермостат, що потім переносили в холодильник, і на першому етапі
охолоджували зі швидкістю1-2°С/мин до температури 8±2°С. Далі зразки
переносили до металевого контейнера, який встановлювали на поверхні
рідкого азоту і охолоджували зі швидкістю 80°С/мин до температури
–70-75°С на протязі 1 хвилини, після чого трубочки занурювали у рідкий
азот. Також кріоконсервування проводили з використанням програмного
заморожувача УОП2 СКТБ ІПКіК НАНУ за аналогічною програмою.

Кріоконсервовані зразки сперми відігрівали на водяній бані при
температурі 37°С протягом 10 секунд.

Дослідження еякулятів проводили відповідно до рекомендацій ВООЗ (2001)
за загальноприйнятою методикою. Концентрацію і рухливість сперміїв
визначали за допомогою лічильної
камери Makler (Ізраїль) і методом комп’ютерного аналізу (CASA).
Життєздатність сперміїв визначали за методом суправітального фарбування
еозин-нігрозином. Функціональну цілісність цитоплазматичної мембрани
визначали за тестом гіпоосмотичного набрякання (HOS-тест), що дозволяє
визначити толерантність мембран спермїів до гіпоосмотичного стресу
(Jeyendran, 1984). Для морфологічного дослідження сперміїв
використовували модифіковану нами методику фарбування мазків, при якій
не виникає стиснення клітин [Рубенков А.А., 1959]. Середню кількість
дефектів на один спермій з морфологічними порушеннями визначали за
допомогою індексу тератозооспермії, що дорівнює відношенню суми
кількості всіх дефектів, визначених у 200 сперміях, до відсотка
атипічних форм. Стан хроматину сперміїв оцінювали за методом Tejada
(1984), тобто коли використовуються метахроматичні властивості акридину
оранжевого.

Активність акрозину досліджували за методикою, що грунтується на
визначенні кількості казеїна, який нерозщеплений ферментом. Визначення
активності гіалуронідази зумовлено здатністю ферменту каталізувати
процес гідролітичного розщеплення субстрату до утворення гіалуронової
кислоти (ГК). Сукцинатдегідрогеназну активність у сперміях людини
досліджували за модифікованою нами методикою, яка базується на вимірі
падіння оптичної щільності 2,6–діхлорфеноліндофенола, що відновлюється
при окислюванні сукцинату. Визначення глюкозо-6-фосфатдегідрогеназної
активності проводили за методом [Baquer N.Z., 1967], тобто на реакції
відновлення никотинамідаденіндинуклеотидфосфату (НАДФ) у присутності
глюкозо-6-фосфата.

Статистичну обробку одержаних результатів проводили за методом
Стьюдента-Фішера.

Результати власних досліджень та їх обговорення

Вплив різних факторів зовнішнього середовища на сперматогенез
при підборі донорів сперми.
Відомо, що початковий стан біооб’єкта значно
впливає на результат його кріоконсервування. Різні фізико-хімічні
впливи на організм людини зумовлюють
збільшення патологічних форм сперміїв, які не
елімінуються в процесі сперматогенезу. У зв’язку з цим, було
проведено обстеження чоловіків з метою
підбору донорів сперми для її використання в
репродуктивних технологіях і, зокрема, для кріоконсервування. Були
досліджені еякуляти 90 чоловіків, праця
яких пов’язана зі шкідливими
умовами: 1 – праця зі надвисокочастотним (НВЧ) обладнанням; 2 – робота з
комп’ютером більш 6-7 годин на добу; 3 – хімічне
виробництво; 4 – мали тривале
переохолодження; 5 – зварники; 6 – вантажники; 7 – водії; 8 –
спортсмени-борці; у групу 9 (контроль) входили 94
кандидата у донори і донорів сперми,
праця яких не була безпосередньо пов’язана зі шкідливими
умовами (рис.1). В усіх групах вік чоловіків складав від 20
до 42 років. При оцінці якості еякуляту
ми враховували об’єм еякуляту, а також значення рН, час розрідження,
концентрацію, рухливість, життєздатність, морфологічні характеристики
сперміїв, деконденсацію хроматина в
гаметах.

Рис.1. Вплив шкідливих професійних факторів на концентрацію сперміїв,
кількість лейкоцитів (а), рухливість, морфологічні характеристики,
конденсацію хроматину (б) в сперміях людини.

Встановлено, що рН еякулятів у контролі, а також у групах 2,3,6 7 і 8
коливався лише в невеликих межах і складав 7-7,3.
Зниження рН до кислої сторони (6,8)
відзначали в пацієнтів груп 1,4,5. В’язкість еякулятів і час
їхнього розрідження позитивно корелюють з ростом
кількості лейкоцитів у групах 1,3,4,5,6 (рис.1). Виявлено достовірне
зменшення концентрації сперміїв у всіх досліджуваних групах стосовно
контролю (РПродовження табл. 1 1 2 3 4 4. Glicerol CryoBioSistem 5,8 2567 0,65 5.Medi-cult 6,7 3000 0,8 6.ЕГ;1,2ПД; ДМФА (глюкоза) 5,0 2920 2,2 7.ЕГ;1,2ПД; ДМФА 5,4 3100 2,2 Примітки: КС 1-5 - кінцева концентрація гліцерину; КС 6-7 - кінцева концентрація суміші ЕГ+1,2-ПД+ДМФА.

O

AEuA

A

e

Oe

O

AEA

@

@

?A

A

e

@

$

@

· Y

O

· Y

O

O

@

O

@

· Y

O

@

· Y

O

O

@

O

@

· Y

O

@

· Y

O

досліджуваних КС. Після 30 хвилин еквілібрації
суспензії клітин із КС найбільша
рухливість сперміїв (групи “а”+“в”) спостерігалася в середовищах
Sperm Freeze, ГЛЖ і Medi-cult і не відрізнялася від
контролю. Контакт же сперміїв із КС 1,
4, призводив до достовірного зменшення рухливості
сперміїв у порівнянні з контролем (рис.3).

Рис.3. Вплив КС на рухливість сперміїв людини (n = 42): а –
активнорухливі спермії, в – рухливі спермії (1 – безжовткове середовище,
2 – Sperm Freeze, 3 – ГЛЖ, 4 – Glicerol, 5 – Medi-cult, 6,7 –
багатокомпонентні середовища).

Під захистом багатокомпонентних КС 6 і 7 спостерігалося достовірне
зниження кількості сперміїв групи “а”+“в” (р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020