НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ і ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

МАКСИМЕНОК ОЛЕНА ВАЛЕНТИНІВНА

УДК616-097.579+578.828:616-037

Феномен антигенної мімікрії пептидів віл-1 та бактерій і маркери
прогнозування перебігу віл-інфекції

03.00.06 — вірусологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ-2006

Дисертацією є рукопис

Дисертаційна робота виконана в Інституті епідеміології та інфекційних
хвороб

ім. Л.В. Громашевського АМН України

Науковий керівник: доктор медичних наук

Рибалко Світлана Леонтіївна

Інститут епідеміології та інфекційних хвороб

ім. Л.В. Громашевського АМН України, завідувач

лабораторії контролю якості імунобіологічних препаратів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Руденко Адель Вікторівна

Інститут урології АМН України,

завідувач лабораторії мікробіології, вірусології та мікології

доктор біологічних наук

Швед Анатолій Давидович

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України,

завідувач лабораторії молекулярної вірусології

Провідна установа: Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця
МОЗ України, кафедра мікробіології, вірусології та імунології, м. Київ

Захист відбудеться «18» жовтня 2006 р. о 1200 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських
дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К.
Заболотного НАН України за адресою: Україна, Д 03680, Київ ДСП, вул.
Заболотного 154.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Україна, Д
03680, Київ ДСП, вул. Заболотного 154.

Автореферат дисертації розіслано «_15__» вересня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На сьогодні ВІЛ-інфекція/СНІД належить до найбільш
важливих та актуальних медико-соціальних проблем України. За наявними
оцінками, рівень інфікування вірусом імунодефіциту людини (ВІЛ) серед
громадян нашої країни віком 15-49 років складає майже 1,4 %, а темпи
поширення хвороби найвищі серед країн Європи та СНД (Вовк та ін., 2002;
Гураль та ін., 2005).

Вивчення структури й функції білків ВІЛ-1 та збудників супутніх
інфекційних хвороб сприяли виявленню деталей проникнення їх у клітини та
реплікації генетичного матеріалу; однак досі лишається багато
нез’ясованих питань, на вирішення яких спрямовано увагу науковців.
Останнім часом розпочато дослідження щодо ролі феномену антигенної
мімікрії в патогенезі вірусних хвороб. На думку ряду дослідників,
антигенна мімікрія становить одну з причин розвитку імунних порушень (
найважливішого чинника імунопатогенезу ВІЛ-інфекції (Жилинская, 2002;
Alcami, 2003; Bisset, 1994; Tortorella et al., 2000).

Розуміння механізмів репродукції ВІЛ-1 та його взаємодії з клітинами
допомогло розробити лікувальні препарати, які гальмують активність
зворотної транскриптази, транскрипцію РНК з провірусної ДНК та синтез
білків ВІЛ; однак викорінення вірусу в інфікованих осіб, як і раніше,
залишається недосяжним. Найперспективнішими вважаються підходи до
створення дієздатних вакцинних та лікувальних препаратів з урахуванням
антигенної мімікрії поміж пептидами ВІЛ-1 та рецепторами чутливих до
збудника клітин (Панин и др., 1999; Панин, Костина, 2003). Отже, нові
дані про роль феномену антигенної мімікрії у патогенезі ВІЛ-інфекції
допоможуть розкрити основи вірулентності вірусу та розробити підходи до
створення ефективних лікувальних і профілактичних засобів, удосконалити
комплексну терапію хвороби.

Розвиток СНІДу відбувається на тлі супутніх опортуністичних інфекцій,
які обумовлюють тривалість та форми його клінічного перебігу. Незважаючи
на великий практичний інтерес до цієї проблеми, її вивчено недостатньо.
В зв’язку з цим актуальними є дослідження, спрямовані на вивчення
особливостей репродукції ВІЛ-1 за умов асоційованих інфекцій з найбільш
розповсюдженими вірусами.

В останні роки в науковій літературі накопичується все більше відомостей
щодо побічних маркерів прогресування ВІЛ-інфекції, на підставі яких
можна прогнозувати можливий варіант перебігу хвороби вже на ранній її
стадії, виходячи з оцінки імунних особливостей інфікованої особи
(Ольховский, 2002). Тому безумовно актуальними залишаються пошуки нових
лабораторних маркерів прогнозування перебігу ВІЛ-інфекції; таку мету ми
ставили перед собою в даній роботі.

Зв‘язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано
у відповідності з напрямом наукових досліджень Інституту епідеміології
та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України, лабораторії
контролю якості імунобіологічних препаратів і лабораторії вірусних
гепатитів та ВІЛ-інфекції: «Створення панелей типоспецифічних сироваток
А, В, С-ВІЛ на основі розробки тест-системи для серотипування ВІЛ»
(номер держреєстрації 0197V000775″; «Епідеміологічні особливості
розповсюдження ВІЛ-інфекції в Україні та наукове обґрунтування стратегії
її лабораторної діагностики» (номер держреєстрації 0101V002327);
«Молекулярно-біологічні особливості збудників опортуністичних інфекцій
бактеріальної природи, стійких до антибіотиків, у хворих на СНІД»
(0102V000571); «Створення ефективних композицій препаратів проти ВІЛ та
опортуністичних інфекцій при СНІДі з урахуванням їх механізмів дії»
(номер держреєстрації 0197V000541); «Наукове обґрунтування
інформаційного забезпечення епідеміологічного нагляду за ВІЛ-інфекцією
в Україні» (номер держреєстрації 0104U000213); «Вивчення антивірусної
дії новостворених препаратів для лікування СНІДу та опортуністичних
інфекцій (герпес, гепатит С) з урахуванням нових механізмів їх дії»
(номер держреєстрації 0105U000017).

Мета й завдання досліджень. Метою даної роботи було визначення ролі
антигенної мімікрії пептидів ВІЛ-1 і вуглеводовмісних біополімерів (ВБ)
мікроорганізмів у взаємодії ВІЛ-1 з клітинами та вивчення можливості
застосування деяких лабораторних показників як побічних маркерів
прогнозування перебігу хвороби.

Для здійснення вказаної мети було поставлено такі основні завдання:

1. Вивчити біохімічний склад та деякі біологічні властивості ВБ,
виділених з Staphylococcus аureus, Vibrio сholerae, Neisseria
meningitidіs та споротворних бактерій виду Bacillus subtilis, які
входять до складу субаліну.

2. Дослідити особливості репродукції ВІЛ-1 під впливом вірусів грипу,
герпесу 1 типу (ВПГ-1) та Епштейна-Барр (ВЕБ), деяких антивірусних
препаратів та наркотичних речовин.

3. Визначити можливість застосування комбінації антитіл до окремих
антигенів ВІЛ-1 як побічного маркера прогресування ВІЛ-інфекції та
продукції деяких цитокінів як показників активації імунної системи у
ВІЛ-інфікованих осіб.

Об‘єкти дослідження: вуглеводовмісні біополімери мікроорганізмів,
пептиди вірусів, антивірусні препарати, антитіла до збудників
інфекційних хвороб, інтерферон ( (ІФН-(), хемокіни RANTES та MIP-1(.

Предмет дослідження: антигенна спорідненість вуглеводовмісніх
біополімерів мікроорганізмів і пептидів вірусів, репродукція ВІЛ-1,
моделювання змішаних інфекцій, побічні маркери прогресування
ВІЛ-інфекції, показники активації імунної системи.

Методи дослідження. Для виконання поставлених завдань у роботі
використано комплекс вірусологічних, біохімічних, серологічних та
статистичних методів дослідження.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше доведено, що досліджені
мікроорганізми продукують вуглеводовмісні речовини ( «мімікрини», які
мають антигенну спорідненість з пептидом р17 ВІЛ-1. Встановлено, що
мімікрини пригнічують репродукцію ВІЛ-1 за умов гострої та хронічної
моноінфекції в культурі клітин. На моделі змішаних інфекцій в культурі
клітин вперше показано, що спостерігається зменшення репродукції ВІЛ-1
або її посилення в залежності від ступеня антигенної спорідненості між
пептидами вірусів-асоціантів. Одночасно встановлено, що при сумісному
інфікуванні культури клітин ВІЛ-1 та ВПГ-1, антивірусні препарати
«Комбівір» та «Унітіол» не пригнічують розмноження ВІЛ-1. Доведено, що
на підставі визначення комбінації антитіл до ВІЛ-1 можливо прогнозувати
перебіг ВІЛ-інфекції. Вперше показано, що у ВІЛ-інфікованих осіб
циркулюють антитіла до мімікрину S. aureus, які перехресно взаємодіють з
р17 ВІЛ-1, що може бути причиною хибно-позитивних результатів при
дослідженні методом імунного блоту (ІБ). За спроможністю мононуклеарів
периферійної крові продукувати цитокіни Rantes і ІФН-( у відповідь на
стимуляцію антигенами ВІЛ-1 можна оцінити функціональний стан клітин
CD4+ у ВІЛ-інфікованих осіб.

Практична значимість отриманих результатів. Отримані дані щодо
спорідненості мімікринів з білком р17 ВІЛ-1 можуть стати підґрунтям для
розробки нових підходів до конструювання антивірусних препаратів.
Запропоновані моделі змішаних інфекцій ВІЛ-1 з вірусами грипу, ВПГ-1 і
ВЕБ у культурах клітин дають змогу вивчати специфічну анти-ВІЛ
активність лікувальних препаратів різного механізму дії в умовах, більше
наближених до макроорганізму. Отримані дані знайшли відображення у
Патенті на винахід «Інгібітор вірусів герпесу та імунодефіциту людини –
1,2-дитіол-3-пропілсульфонат натрію» [Рибалко та ін., 2004]. Визначено
можливість застосування нових побічних маркерів прогнозування перебігу
ВІЛ-інфекції: доведено прогностичну роль виявлення комбінацій антитіл
проти різних білків ВІЛ та значення рівнів деяких цитокінів при оцінці
стану імунної системи у ВІЛ-інфікованих осіб.

Особистий внесок автора. Основна частина експериментального матеріалу,
викладеного в дисертації, отримана автором самостійно. Це стосується
даних щодо антигенної подібності мімікринів поміж собою та з пептидами
деяких вірусів; впливу мімікринів на інфекційну активність ВІЛ-1;
вивчення особливостей репродукції ВІЛ-1 та активності антивірусних
препаратів на моделі змішаних інфекцій з вірусами грипу, ВПГ-1 та ВЕБ;
дослідження індукції ІФН під впливом опіатних наркотиків; визначення
ролі комбінації антитіл та рівня деяких цитокінів у прогнозуванні
перебігу ВІЛ-інфекції.

Дослідження біохімічного складу біополімерів здійснено в Інституті
мікробіології та вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України за
консультативної допомоги д.м.н., проф. Варбанець Л.Д., яка є співавтором
публікацій дисертанта.

Дисертантом особисто розроблені методичні підходи щодо виконання
поставленої мети, експериментального її обґрунтування, критичного
аналізу літературних даних, узагальнення одержаних результатів.
Інтерпретацію та формулювання основних положень і висновків, підготовку
публікацій за результатами досліджень та представлення їх на наукових
конференціях здійснено спільно з науковим керівником д.м.н. С.Л.Рибалко.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної
роботи було висвітлено на 4-й та 7-й Міжнародних конференціях «СПИД, рак
и родственные проблемы» (Санкт-Петербург, 1996; 1999), 12-й Всесвітній
конференції зі СНІДу (Женева, 1998), Науково-практичній конференції і
пленумі Асоціації інфекціоністів України «Вірусні гепатити. СНІД»
(Тернопіль, 1999), Нараді-семінарі спеціалістів з клінічної лабораторної
діагностики (Київ, 1999), Науково-практичній конференції «Сучасні
можливості лікування ВІЛ-інфекції, СНІДу та опортуністичних інфекцій»
(Київ, 2001), Міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій
пам‘яті Л.В.Громашевського «Проблеми епідеміології, діагностики,
клініки, лікування та профілактики інфекційних хвороб» (Київ, 2002),
Міжнародному форумі «Основи молекулярно-генетичного оздоровлення людини
і довкілля» (Київ, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 наукових праць, з
них 5 ( у наукових фахових виданнях, 1 патент на винахід та 1 практичний
посібник.

Структура і обсяг роботи. Дисертаційна робота складається зі вступу, 3
розділів огляду літератури, 4 розділів власних досліджень, узагальнення
отриманих результатів, висновків та списку використаних джерел;
дисертацію викладено на 140 сторінках, ілюстровано 36 рисунками та 14
таблицями. Список використаної літератури включає 230 джерел (44
вітчизняних та країн СНД та 186 зарубіжних).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури

В огляді літератури, який складається з 3 розділів, наведено доступні
літературні дані щодо феномену антигенної мімікрії пептидів вірусів і
бактерій; розглянуто етіологію та патогенез ВІЛ-інфекції; визначено
чинники, що сприяють швидкому або повільному прогресуванню хвороби;
узагальнено відомості щодо сучасних лікувальних анти-ВІЛ препаратів та
лабораторних показників прогресування ВІЛ-інфекції.

Матеріали та методи досліджень

У роботі використано культури мікроорганізмів S. aureus, V. cholerae, N.
meningitidis та B. subtilis, культивованих за стандартними методиками
(Лабинская, 1978). Джерелом ВІЛ-1 було культуральне середовище клітин
МТ4/ВІІІ ЛБК, інфікованість яких складала практично 100 %; тотожність
вірусу підтверджено в реакції нейтралізації. Інфекційний титр ВІЛ-1 у
продуктивній культурі складав 8,0 lg ІД50. Для моделювання змішаної
інфекції ВІЛ-1 з іншими вірусами використовували вірус грипу
А/Гонконг/1/68/H3N2/ ( еталонний штам з гемаглютинаційним титром
1:256-1:1024, інфекційним ( 6,5-9,5 lg ІД50; вірус герпесу простого
антигенного типу 1, штам VC, з інфекційним титром у культурі клітин
Vero 5,0-5,5 lg ТЦПД50. Вірус Епштейна-Барр отримували в результаті
його 10-добового вирощування у клітинах В95-8. При вивченні динаміки
індукції інтерферону використовували вірус везикулярного стоматиту
(ВВС), штам Індіана, з інфекційним титром в 4,0-5,0 lg ТЦПД50.

Було використано такі культури клітин: МDСК ( перещеплювані клітини
нирки собаки; МТ-4 ( суспензійна культура Т-лімфоцитів людини; МТ4/ВІІІ
ЛБК ( суспензійна культура Т-лімфоцитів людини, яка хронічно інфікована
та продукує ВІЛ-1; В95-8 ( лейкоцити мавп мармазеток, які трансформовані
ВЕБ та продукують його; VERO ( перещеплювана культура клітин нирок
мавпи; COS ( перещеплювана культура нирки мавпи. Усі віруси та лінії
клітин одержано в Інституті вірусології ім. Д.І.Івановського РАМН (РФ).

Антигенну спорідненість між ВБ та пептидами вірусів вивчали за допомогою
гіперімунних та моноклональних сироваток до гемаглютинінів (ГА) вірусу
грипу, моноклональних сироваток до пептидів р17 та р24 ВІЛ-1, EBSK2
клону Mo AbSK1 ВЕБ, gр-антигенів ВПГ 1 типу та клону 6 до стандартного
препарату HBsAg вірусу гепатиту В, антивидових антитіл проти
імуноглобулінів кроля, мічених пероксидазою хрону (Інститут вірусології
РАМН, РФ).

Вивчали антивірусну активність препаратів “Комбівір” (GlaxoWellcom,
Великобританія), “Ацикловір” (Krka, Словенія), авторського препарату
“Унітіол” (Інститут фармакології та токсикології АМН України);
інтерфероніндуктивну активність наркотичних препаратів «Морфіну
гідрохлорид», «Промедолу», кустарної наркотичної речовини “ширки”.

Визначення комбінацій антитіл до окремих антигенів ВІЛ-1 здійснювали
шляхом аналізу результатів 536 досліджень методом імунного блоту (ІБ)
зразків сироваток крові 37 пацієнтів з «повільним» та «швидким»
перебігом ВІЛ-інфекції в динаміці нагляду.

Здатність мононуклеарів периферійної крові (МПР) відповідати продукцією
цитокінів на стимуляцію антигенами ВІЛ-1 вивчали за допомогою
рекомбінантних білків ENV1 з молекулярною масою 65 кДа та GAG1 з
молекулярною масою 70 кДа, синтезованих в клітинах Esherichia coli
штамів ITG-71 та ITG-36. Мононуклеари отримали від 16 ВІЛ-інфікованих
осіб (8 чоловіків та 8 жінок) з відомим рівнем вірусного навантаження та
імунним статусом.

ВБ виділяли за оригінальною методикою (Рыбалко, 1991) з подальшим
очищенням отриманих сполук методом гель-фільтрації на сефадексі G-200 та
сефарозі 4В; розділення отриманих сполук ( методом аніонообмінної
високоефективної хроматографії на системі HPLC Gold System (Beckman,
США). Визначення амінокислотного та гекзозамінного складу виділених
сполук проводили на автоматичному аналізаторі амінокислот KLA-5
(Hitachi, Японія), нейтральних моноцукрів ( методом газорідинної
хроматографії у вигляді ацетатів поліолів на автоматичному приладі
«Chrom-5» (Чехія).

Дослідження антигенної спорідненості ВБ між собою та з пептидами вірусів
проводили методом непрямого твердофазного імуноферментного аналізу (ІФА)
(Voller et al., 1976) та ІБ (Sykes et al., 1970). Порівняння
амінокислотного складу гемаглютиніну (ГА) вірусу грипу та р17 ВІЛ-1
здійснювали за допомогою комп‘ютерної бази даних «Epilign» (National
Laboratory Los Alamos, США).

Цитотоксичну дію ВБ досліджували шляхом підрахунку життєздатних клітин;
мінімальну ефективну дозу ( при вивченні впливу біополімерів на
репродукцію ВІЛ-1 в культурі клітин МТ-4. Активність ІФН-( вивчали за
загальноприйнятою методикою (Ho&Enders, 1959).

Рівень антигену (АГ) р24 ВІЛ-1, маркери опортуністичних інфекцій у
ВІЛ-інфікованих осіб та кількість хемокінів виявляли методом ІФА з
застосуванням комерційних наборів; спектр антитіл до діагностичних
білків ВІЛ-1 в зразках сироваток крові ВІЛ-інфікованих осіб визначали
методом ІБ.

Статистичну обробку отриманих даних здійснювали з використанням методів
варіаційної статистики за допомогою комп’ютерної програми Microsoft
Excel-2000.

Вивчення біохімічного складу та деяких біологічних властивостей
вуглеводовмісних біополімерів бактерій

З мікроорганізмів S. aureus, V. cholerae, N. meningitidis та B. subtilis
виділено ВБ, які, за їхньою основною біологічною властивістю, назвали
«мімікринами». Встановлено, що виділені біополімери містили основний та
хроматографічно гомогенний компонент з високим негативним зарядом та не
більш як 5-10 % домішок, що доводило високу ефективність попередньої
стадії очистки. Досліджені сполуки являли собою білково-вуглеводні
комплекси: співвідношення білкової частки до вуглеводної становило у ВБ
S. aureus ( 1:10; ВБ V. cholerae ( 1:5; ВБ N. meningitidis ( 1:7; ВБ B.
subtilis ( 1:1,5, відповідно.

Порівняльний аналіз амінокислотного складу мімікрину стафілокока дав
змогу виявити в його складі майже повний набір амінокислот, за винятком
аргініну та цистеїну; амінокислотний склад інших біополімерів
представлено 3-4 амінокислотами. У складі біополімерів ідентифіковано
два гексозаміни: у ВБ S. aureus галактозамін та глюкозамін виявлено у
співвідношенні 0,5:3,5; у ВБ V. cholerae ( 1:1,5; у ВБ B. subtilis (
3:1; у ВБ B. subtilis-rec (штаму B. subtilis, який містить рекомбінантну
плазміду з геном ІФН-( людини та входить до складу субаліну) ( 5:1. За
вмістом вуглеводного компоненту біополімери можна розділити на 2 групи (
манозозбагачені (мімікрини S. aureus та N. meningitidis) та
галактозозбагачені (мімікрин V. cholerae).

Виходячи з антигенної подібності мімікрину S. aureus до ГА вірусу грипу
(Рыбалко, 1991), ми припустили, що й інші виділені нами біополімери
можуть бути антигенно споріднені як поміж собою, так і з пептидами
деяких вірусів. Методом ІФА вивчали взаємодію ВБ, отриманих із S.
aureus, V. cholerae, N. meningitidis та B. subtilis, з гіперімунними
сироватками до зазначених збудників. Аналізували титри імунних
сироваток; при цьому антигенно спорідненими вважали ВБ, які перехресно
взаємодіяли між собою до повного або 1/4 гомологічного титру (Поляков и
др., 1980). На рис. 1 представлено взаємодію мімікринів S. aureus, V.
cholerae, N. meningitidis, B. subtilis та B. subtilis-rec з сироваткою
до ВБ S. aureus. Подібні результати отримали й при вивченні антигенної
спорідненості інших виділених сполук.

Рис. 1. Взаємодія ВБ S. aureus, V. cholerae, N. meningitidis, B.
subtilis та B. subtilis-rec з сироваткою до ВБ S. aureus

Мімікрини S. аureus, V. cholerae, N. meningitidis та B. subtilis-rec
взаємодіють з сироваткою до S. аureus до гомологічних титрів 1:640, ВБ
B. subtilis ( до титрів 1:300. Подібна картина спостерігається між ВБ та
сироваткою до V. сholerae ( біополімери S. аureus, V. cholerae, N.
meningitidis та B. subtilis також взаємодіють з сироваткою до титрів
1:640, а ВБ B. subtilis-rec ( до титру 1:300, що не перевищує 1/4
кінцевого титру. Встановлено, що з сироваткою до N. meningitidis у
титрах 1:640 взаємодіють ВБ S. аureus, N. meningitidis, V. cholerae, B.
subtilis. ВБ B. subtilis-rec зв‘язуються з сироваткою до N.
meningitidis лише до титрів 1:100, що може свідчити про менший ступінь
антигенної спорідненості. Таким чином, проведені дослідження показали,
що всі виділені сполуки демонструють виражену антигенну спорідненість
між собою, оскільки спостерігається кореляційна залежність між оптичною
густиною та розведеннями сироваток. Найбільш виражену подібність
виявлено при взаємодії ВБ S. aureus, V. cholerae та N. meningitidis з
сироватками до S. aureus та V. cholerae.

Наявність антигенної спорідненості між ВБ підтверджено методом
імунофлуоресценції ( при взаємодії препаратів спинномозкової рідини та
харкотиння хворих, що містили N. meningitidis та S. pneumoniae, з
сироваткою до мімікрину S. aureus було виявлено характерне свічення;
воно свідчить, що бактеріальні клітини продукують сполуки, антигенно
споріднені між собою.

Оскільки досліджені нами ВБ виявилися антигенно подібними, а дослідження
(Рыбалко, 1991) довели спорідненість мімікрину S. aureus та ГА вірусу
грипу, виникло питання, чи існує взаємозв‘язок поміж мімікринами та
пептидами деяких інших вірусів, насамперед ВІЛ-1, ВПГ-1, ВЕБ та гепатиту
В (рис. 2). На підставі проведених досліджень методом ТІФА встановлено
виражену антигенну спорідненість мімікрину S. aureus з р17 ВІЛ-1 (
взаємодія спостерігається до кінцевого розведення 1:640. Необхідно
зазначити, що білок р17 відіграє ключову роль у морфогенезі ВІЛ-1,
оскільки сприяє закріпленню трансмембранного поверхневого білку на
поверхні вірусу, допомагає проникненню вірусу до клітини тощо (Cannon,
1997).

З моноклональною сироваткою до HBsAg вірусу гепатиту В мімікрин
взаємодіє до розведення 1:240. В той же час, між ВЕБ та ВБ S. aureus
антигенна спорідненість виражена слабше (специфічна взаємодія
спостерігається до розведення сироватки 1:40); її майже немає з
пептидами ВПГ-1 (при розведенні сироватки 1:30 вже зареєстровано
величину оптичного сигналу на рівні граничного значення). Антигенної
спорідненості між мімікрином стафілокока та р24 ВІЛ-1 виявити не
вдалося.

Прямий доказ антигенної спорідненості поміж ВБ S. aureus та р17 ВІЛ-1
отримали за допомогою ІБ. Встановлено, що забарвлена лінія, яка свідчить
про специфічну взаємодію мімікрину з моноклональною сироваткою до р17,
лежить на рівні, що відповідає анти-р17 контрольного зразка.

Щоб визначити ділянку пептиду мімікрину S. aureus, відповідальну за
антигенну спорідненість, проаналізовано амінокислотні послідовності ГА
вірусу грипу та р17 ВІЛ-1, кожен з яких антигенно подібний до зазначеної
сполуки. Методом комп‘ютерного порівняння за допомогою бази даних
«Epilign» виявлено практично тотожну для обох пептидів послідовність з
10 амінокислот, яка може являти собою консенсус, відповідальний за
загальну для цих білків функцію.

Виходячи з антигенної подібності між мімікрином S. aureus та р17 ВІЛ-1,
дослідили можливий вплив ВБ на взаємодію цього вірусу з лімфоїдними
клітинами. Як джерело ВІЛ-1 використовували культуральну рідину
продуктивної культури МТ-4/ВІІІ; автентичність вірусу підтверджували в
реакції нейтралізації (відсоток нейтралізації > 97,5).

Рис. 2. Вивчення антигенної спорідненості між ВБ S. aureus та пептидами
вірусів герпесу, Епштейна-Барр, гепатиту В і ВІЛ-1

Досліджували можливу цитотоксичну дію мімікринів на клітини та визначали
мінімальну ефективну дозу препаратів для подальших експериментів.
Встановлено, що мімікрини у концентраціях 1000, 500 та 100 мкг/мл
практично не впливали на життєздатність клітин МТ-4. Мінімальна
ефективна доза для всіх досліджених мімікринів ( 10 мкг/мл; у цій
концентрації ВБ S. aureus пригнічував репродукцію ВІЛ-1 на 3,0; ВБ N.
meningitidis ( на 2,5; ВБ V. cholerae ( на 3,0; ВБ біоспорину та
субаліну ( на 2,1 та 2,0 lg ІД50, що дало змогу перейти до вивчення
впливу ВБ на експресію та репродукцію ВІЛ-1 за умов гострої та хронічної
інфекції, які моделювали на культурах клітин МТ-4 та МТ-4/ВІІІ.

Показано, що рівень накопичення АГ р24 ВІЛ-1 в культурі інфікованих
клітин МТ-4 був знижений практично вдвічі при обробці їх ВБ у дозі 10
мкг/мл. За умов продуктивної культури МТ-4/ВІІІ також виявлено деяке
зниження рівня накопичення зазначеного АГ, однак ВБ S. aureus та N.
meningitidis не впливали на експресію р24 ВІЛ-1. У той же час
встановлено, що мімікрини в мінімальній ефективній дозі здатні
пригнічувати репродукцію вірусу в культурі клітин на 2,0-3,0 lg ІД50 за
умов гострої та на 5,0 lg ІД50 ( за умов персистентної інфекції (рис.
3). На нашу думку, здатність ВБ уповільнювати репродукцію ВІЛ-1
пов‘язана з антигенною спорідненістю між мімікринами та р17 ВІЛ-1.

Рис. 3. Вплив вуглеводовмісних біополімерів на репродукцію ВІЛ-1 за умов
гострої та хронічної інфекції в культурі клітин

Отримані дані дали змогу припустити, що ВБ впливають на розмноження
вірусу шляхом конкурентної взаємодії з рецепторами ВІЛ-1 і, в такий
спосіб, блокують проникнення вірусу в клітини-мішені. Ця думка
підтверджується антигенною подібністю поміж мімікрином S. aureus та ГА
вірусу грипу (Рыбалко, 1991), який, у свою чергу, проявляє біологічну
активність як фактор злиття з мембранами клітин. Подальші дослідження
антивірусної активності мімікринів можуть стати підґрунтям для розробки
нових противірусних препаратів.

У наших дослідженнях не встановлено кореляційної залежності поміж рівнем
експресії АГ р24 та інфекційним титром ВІЛ-1 під впливом мімікринів:
експресія АГ р24 у контролі ВІЛ-1 та під впливом біополімерів із
стафілокока та менінгокока майже не відрізнялася, в той же час при
вивченні репродукції вірусу зафіксовано значну гальмівну дію цих сполук.
Таким чином, реєстрація самого лише рівня експресії АГ р24 не дає змоги
дослідити дію різноманітних чинників на репродукцію ВІЛ-1. Єдиний
об‘єктивний показник такого впливу – це визначення інфекційного титру
вірусу.

Вивчення особливостей репродукції ВІЛ-1 під впливом деяких вірусів,
антивірусних препаратів та наркотичних речовин

Проблема вірусних асоційованих інфекцій надзвичайно важлива, оскільки
взаємодія поміж різними вірусами може розвиватися за типом
інтерференції, взаємного посилення репродукції або ж незалежного
розмноження обох вірусів; відтак це може впливати й на результат дії
антивірусних препаратів. Ця проблема набуває особливого значення у
випадку ВІЛ-інфекції, значний внесок у розвиток симптомокомплексу якої
припадає на долю опортуністичних інфекцій.

4 ` – Ae

AE

,

AE

6 ` ? o R

A

Ae

AE

i

B

V

7 ВІЛ-1. У той же час, між р17 ВІЛ-1 та пептидами ВЕБ така подібність
виражена слабше та її майже немає з gр-антигеном ВПГ-1. Ми дослідили
можливість впливу антигенної мімікрії на репродукцію вірусів за умов
змішаної інфекції ВІЛ-1 з вірусами грипу, ВПГ-1 та ВЕБ.

Розроблено моделі змішаної інфекції ВІЛ-1+ВПГ-1 та ВІЛ-1+вірус грипу
А/H1N1/77: суспензійну культуру МТ4 заражали ВІЛ-1; після 24 год.
культивування, в культуру вносили ВПГ-1 або А/H1N1/77. За контроль
правили моноінфекції ВІЛ-1, ВПГ-1 та А/H1N1/77. Встановлено, що при
змішаній інфекції ВІЛ-1+ВПГ-1 відбувалося посилення репродукції ВІЛ-1 на
2,0 lg IД50; присутність вірусу грипу в інфікованій культурі клітин
призводила до пригнічення репродукції ВІЛ-1 на 2,0 lg IД50 (рис. 4).

У той же час, при дослідженні експресії АГ р24 ВІЛ-1 не виявлено значних
відмінностей у рівнях зазначеного антигену за умов моноінфекції ВІЛ-1 та
змішаної інфекції ВІЛ-1+ВПГ-1; при змішаній інфекції ВІЛ-1+А/H1N1/77
зареєстровано зниження рівня експресії АГ р24 у 1,5 рази.

При вивченні репродукції ВПГ-1 та вірусу грипу А/H1N1/77 за умов
змішаної інфекції ВІЛ-1+ВПГ-1 та ВІЛ-1+А/H1N1/77 на моношарових
перещеплюваних культурах клітин Vero та МDСК встановлено, що інфекційний
титр ВПГ-1 в умовах змішаної інфекції збільшувався на 1,5 lg IД50; у
той же час цей показник для вірусу грипу зменшувався на 1,0 lg IД50.

За умов змішаної інфекції ВІЛ-1+ВЕБ на клітинах МТ4 інфекційний титр
ВІЛ-1 зменшувався на 2,0 lg ІД50 порівняно з моноінфекцією ВІЛ-1. Під
впливом ВБ B. subtilis розмноження ВІЛ-1 було пригнічене на 2,5 lg ІД50,
а застосування інших мімікринів (ВБ S. aureus, ВБ B. subtilis-rec та N.
meningitidis) призводило до падіння інфекційної активності ВІЛ-1
практично до нуля (рис.5).

Рис. 4. Вивчення репродукції ВІЛ-1 при моно- та змішаних інфекціях
ВІЛ-1+ВПГ-1 і ВІЛ-1+А/H1N1/77 на культурі клітин МТ4

Рис. 5. Вивчення репродукції ВІЛ-1 в умовах змішаної інфекції ВІЛ-1+ВЕБ
під впливом деяких мімікринів

Відомо, що на термінальній стадії ВІЛ-інфекції особливо небезпечною
буває активація герпетичної інфекції, оскільки в багатьох випадках це
фатально погіршує стан хворого. Представляло інтерес дослідити, чи
проявляють специфічну активність на моделі змішаної інфекції ВІЛ-1+ВПГ-І
деякі лікувальні препарати, які активні при моноінфекції ВІЛ-1.
Встановлено, що досліджені препарати «Комбівір» та «Унітіол» за умов
«комбінованого» інфікування культури клітин не пригнічували репродукцію
ВІЛ-1 (табл. 1).

Таблиця 1

Вивчення впливу препаратів на репродукцію ВІЛ при моно-ВІЛ-1

та сумісній ВІЛ-1+ВПГ-1 інфекції

Досліджені Доза препарату Інфекційний титр ВІЛ-1 Зниження
інфекційного титру ВІЛ-1

матеріали (мкг/мл) (lg ІД50) lg ІД50 %

ВІЛ-1+унітіол 50 1,0±0,02 2,0±0,05 66,7±14,9

ВІЛ-1+комбівір 50 0 3,0±0,07 100,0

Контроль ВІЛ-1 ( 3,0±0,07 0 (

ВІЛ+ВПГ+унітіол 50 4,5±0,11 1,0±0,02 18,2±12,2

ВІЛ+ВПГ+комбівір 50 4,0±0,1 1,5±0,04 27,3±14,1

Контроль ВІЛ+ВПГ ( 5,5±0,14 0 (

Отримані результати, на нашу думку, пояснюються тим, що вірус герпесу
здатен посилювати активність зворотної транскриптази або блокувати дію
її інгібіторів (у наших дослідах ( «Комбівіру») й, в такий спосіб,
активізувати репродукцію ВІЛ-1 у чутливих клітинах.

Відомо, що найчастіше на ВІЛ-інфікування наражаються споживачі
ін‘єкційних наркотичних препаратів. Епідемія наркоманії в нашій країні
характеризується широким застосуванням сурогатної речовини ( «ширки»,
яка виготовляється з макової соломки та містить опій. Досліджено дію
морфію, промедолу та «ширки» на експресію й репродукцію ВІЛ-1 у культурі
клітин МТ4. Встановлено, що досліджені наркотичні препарати певним чином
впливають на експресію АГ р24 ВІЛ-1: морфій у дозі 100 мкг/мл та
промедол у дозі 10 мкг/мл підвищували експресію зазначеного АГ в 1,4
рази, а «ширка» в обох дозах ( у 1,6 рази порівняно з контролем; морфій
у дозі 10 мкг/мл та промедол у дозі 100 мкг/мл її знижують у 1,4 рази. В
той же час досліджені наркотичні речовини не пригнічували розмноження
ВІЛ-1 у культурі клітин МТ-4.

Вивчали вплив опіатних наркотиків на здатність викликати синтез
інтерферону лейкоцитами людини, отриманими з донорської крові (рис. 6).
До суспензій лейкоцитів додавали по 100 мкг морфію, промедолу та
«ширки»; як індуктор ІФН-( використовували вірус хвороби Ньюкасла (ВХН).
Показано, що досліджені опіатні наркотичні речовини не індукували
продукцію ІФН-( лейкоцитами людини. За умов попередньої обробки цими
препаратами клітин протягом 60 хв. відбувалося зниження продукції ІФН-(
у 8-16 разів порівняно з контролем.

Рис. 6. Вивчення впливу опіатних наркотиків на рівень
інтерферон-індуктивної активності лейкоцитів людини

Побічні маркери прогресування ВІЛ-інфекції

У ВІЛ-інфікованих осіб реєструють численні відхилення лабораторних
показників; однак лише деякі показники можуть розглядатися як побічні
маркери, що дають змогу судити про перебіг хвороби та стан активації
імунної системи хворого. Щоб визначити, чи можна прогнозувати перебіг
ВІЛ-інфекції шляхом виявлення комбінації антитіл до окремих антигенів
ВІЛ-1, проаналізували результати досліджень методом ІБ зразків сироваток
крові ВІЛ-інфікованих осіб, діагноз яким встановили не пізніше 1995 р.
ВІЛ-інфікованих розподілили на дві групи: 1-а група включала 20
пацієнтів з «повільним» перебігом хвороби, термін спостереження за якими
складав 10 років і більше, а 2-а ( 17 пацієнтів з «швидким» перебігом
ВІЛ-інфекції, які померли за досить короткий проміжок часу від моменту
встановлення діагнозу (від 1 до 4 років). Зразки сироваток крові
отримували раз на півроку під час планових обстежень у клініці Інституту
епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського АМН України
та досліджували на наявність АГ р24, антитіл до р17 ВІЛ-1 та
серологічних маркерів деяких опортуністичних інфекцій.

При проведені досліджень не було виявлено значної різниці в частоті
виявлення зазначених маркерів. Так, у пацієнтів 1-ї групи антитіла до
цитомегаловірусу реєстрували в 1,4 рази, антитіла до ВЕБ ( в 1,3 рази,
антитіла до вірусу гепатиту С ( в 3,4 рази частіше, ніж у пацієнтів 2-ї
групи (р > 0,05). У другій групі обстежених у 1,8 рази частіше виявляли
антитіла до вірусів герпесу, в 1,5 рази ( антитіла до T. gondii, в 1,9
рази ( антитіла до НВс-антигену та в 2,4 рази ( HBsAg вірусу гепатиту В
(p > 0,05). АГ р24 періодично виявляли в сироватках крові п‘яти
пацієнтів 1-ої групи та 8 хворих з 2-ої групи. Таким чином, за нашими
даними, на підставі частоти виявлення досліджених серологічних маркерів
прогнозувати «повільний» або «швидкий» перебіг ВІЛ-інфекції не видається
можливим.

Досліджували динаміку виявлення антитіл до окремих діагностичних білків
ВІЛ-1 у пацієнтів обох груп. Аналізували результати ІБ при первинному
обстеженні, потім ( при регулярних обстеженнях; для пацієнтів 2-ої групи
йдеться про останні прижиттєві результати. Інтенсивність забарвлення
смуг («+», «±», «-«) оцінювали візуально відносно позитивної
контрольної сироватки тест-системи «New Lav Blot I». Можливі комбінації
антитіл до білків комплексів gag (р55, р40, р24/25, р17/18) і pol (р68,
р52, р34) згрупували наступним чином: «gag(+/±)+pol(+/±)» та
«gag(-)+pol(+/±/-)».

Встановлено, що комбінація антитіл у сироватках крові ВІЛ-інфікованих
осіб з 1-ї (термін спостереження ( ( 10 років) та 2-ї групи (термін
спостереження 1-4 роки) значно відрізняється. У зразках сироваток крові
пацієнтів 1-ї групи з «повільним» перебігом хвороби на початку
спостереження у 18 осіб (90±6,7 %) зустрічалася комбінація антитіл
«gag(+/±)+pol(+/±)», через 10 років вона визначалася тільки у 7
(35,0±10,6 %) пацієнтів (р(0,05). Разом з тим, при першому дослідженні
поєднання антитіл «gag(-)+pol(+/±/-)» визначили у 2-х осіб (10±6,7 %), а
зараз його спостерігають у 13 (65,0±10,6 %) хворих (р(0,05).

У сироватках крові пацієнтів 2-ої групи при першому обстеженні
комбінацію антитіл «gag(+/±)+pol(+/±)» виявлено у 10 осіб (58,8±11,9 %),
при останньому прижиттєвому обстеженні її реєстрували лише у 2 (11,7±7,8
%) хворих (р(0,05). У той же час поєднання антитіл «gag(-)+pol(+/±/-)»
на початку дослідження спостерігали в зразках сироваток крові 7
(41,2±11,9 %) осіб, а при останньому дослідженні ( у 15 (88,2±7,8 %)
(р(0,05). Зникнення комбінації антитіл «gag(+/±)+pol(+/±)» та виявлення
«gag(-)+pol(+/±/-)» у зразках сироваток крові слід вважати несприятливою
прогностичною ознакою, яка свідчить про погіршення стану хворого.

Використання комбінації антитіл як побічного маркера прогресування
ВІЛ-інфекції видається доцільнішим, ніж визначення антитіл до окремих
антигенів збудника. Так, не було зареєстровано достовірної різниці у
частоті виявлення антитіл до р17 у зразках сироваток осіб з обох груп,
хоча, за даними літератури (Новохатский, Хлябич, 1992; Chargelegue et
al., 1995), зниження рівня цих антитіл вважається досить інформативним
прогностичним показником перебігу ВІЛ-інфекції. Ми припустили, що
отримані розбіжності можна пояснити, виходячи з антигенної подібності
мімікрину S. aureus до р17 ВІЛ-1 (рис. 6).

На підтвердження цієї думки проведено дослідження, спрямоване на
визначення титру антитіл до мімікрину S. aureus у сироватках крові 148
ВІЛ-інфікованих осіб. Встановлено, що в зразках сироваток крові хворих
на ВІЛ-інфекцію в 73,2±3,6 % випадків визначається високий рівень
антитіл до мімікрину в титрах від 1.000 до 10.000; у той же час у
зразках сироваток осіб контрольної групи (72 донори крові) таких антитіл
взагалі не виявили у 37,2±5,7 % випадків, у невисоких титрах (від 10 до
100) виявили у 49,5±5,9 % обстежених, а у титрах 160-640 ( у 12,3±3,9 %
випадків (р < 0,05). Рис. 6. Виявлення антитіл до мімікрину S. aureus у зразках сироваток крові донорів та ВІЛ-інфікованих осіб Таким чином, доведено, що у ВІЛ-інфікованих осіб циркулюють антитіла до мімікрину, подібні до анти-р17 ВІЛ-1, що може бути причиною "природних" хибно-позитивних результатів, спричинених взаємодією антитіл з антигенно подібними до них структурами. При визначенні антитіл до окремих білків ВІЛ-1 необхідно враховувати можливість отримання неспецифічних результатів, пов‘язаних з феноменом антигенної мімікрії. Досліджено можливість використання рівня хемокінів RANTES, MIP-1-( та ІФН-( як показників активації імунної системи у ВІЛ-інфікованих. Обстежували 2 групи пацієнтів ( 1-а ( 6 осіб без ознак імунодефіциту (кількість CD4+ > 0,5 клітин х 109/л), 2-а ( 10 осіб зі зниженою
кількістю CD4+ (0,35-0,5 клітин х 109/л та < 0,35 клітин х 109/л). Встановлено, що в пацієнтів 1-ї групи середні значення кількості хемокіну RANTES, який продукують інтактні мононуклеари та ці ж клітини при стимуляції антигенами ENV майже однакові; при стимуляції антигеном GAG перевищують показник для інтактних клітин у 1,5 рази. У пацієнтів 2-ї групи кількість RANTES, який синтезують МПР при стимуляції антигенами GAG та ENV знижується в 1,4 рази порівняно з інтактними клітинами. В той же час, кількість хемокінів MIP-1-( у пацієнтів 1-ї та 2-ї груп при стимуляції антигенами достовірно не відрізнялася. При порівнянні активності ІФН-(, який синтезують інтактні МПР, встановлено, що у пацієнтів другої групи вона у вісім разів вища, ніж аналогічний показник у пацієнтів першої. Клітини пацієнтів першої групи активніше відповідали на стимуляцію GAG (у 8,9 рази). У пацієнтів другої групи вихідний рівень ІФН-( був у 2,4 рази вищий, ніж при стимуляції GAG та в 2,9 рази вищий, ніж при стимуляції ENV. Таким чином, встановлено, що в осіб без ознак імунодефіциту (кількість клітин CD4+ ( 0,5х109/л) імунокомпетентні клітини здатні продукувати хемокіни RANTES та ІФН-( у відповідь на стимуляцію антигеном GAG ВІЛ-1. У той же час у осіб зі зниженою кількістю клітин CD4+ така стимуляція призводить до пригнічення продукції зазначених цитокінів, що можна використовувати як додатковий критерій при оцінці стану імунної системи у ВІЛ-інфікованих. ВИСНОВКИ 1. Отримано нові дані щодо ролі антигенної мімікрії у взаємодії ВІЛ-1 з лімфоїдними клітинами. Вперше доведено, що мікроорганізми Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Neisseria meningitidis та Bacillus subtilis продукують вуглеводовмісні біополімери ( мімікрини, антигенно подібні до пептиду р17 ВІЛ-1. 2. Встановлено, що мімікрини являють собою білково-вуглеводні комплекси: білкова частина мімікрину S. aureus містить 17 амінокислот, інших біополімерів ( 3-4 амінокислоти. За вмістом вуглеводного компоненту біополімери поділяються на 2 групи ( манозозбагачені (мімікрини S. aureus і N. meningitidis) та галактозозбагачені (мімікрин V. cholerae). 3. Встановлено, що мімікрини S. aureus, V. cholerae, N. meningitidis та B. subtilis пригнічують репродукцію ВІЛ-1 у культурі клітин МТ-4/ВІІІ та МТ-4 ( зареєстровано зменшення інфекційного титру вірусу на 5,0 lg ІД50 за умов хронічної (культура клітин МТ-4/ВІІІ) та на 2,0-3,0 lg ІД50 ( за умов гострої інфекції (культура клітин МТ-4). 4. Запропоновано моделі змішаних інфекцій ВІЛ-1 з вірусами грипу, герпесу типу 1 та Епштейна-Барр у культурі клітин МТ-4: ( в умовах змішаної інфекції ВІЛ-1+вірус грипу спостерігається пригнічення репродукції ВІЛ-1 на 2,0 lg ІД50; ( при змішаній інфекції ВІЛ-1+ВПГ-1 відбувається активація репродукції ВІЛ-1 на 2,0 lg ІД50. Антивірусні препарати "Комбівір" і "Унітіол" за цих умов не пригнічували розмноження ВІЛ-1 у культурі клітин; ( в умовах змішаної інфекції ВІЛ-1+ВЕБ інфекційний титр ВІЛ-1 зменшується на 2,0 lg ІД50 порівняно з моноінфекцією ВІЛ-1. 5. Досліджені наркотичні речовини (морфій, промедол та "ширка") не впливали на розмноження ВІЛ-1 у культурі клітин МТ-4, однак пригнічували ІФН-продуктивну активність лейкоцитів людини. 6. Доведено, що у ВІЛ-інфікованих осіб циркулюють антитіла до мімікрину S. aureus, що перехресно реагують з р17 ВІЛ-1. Це може бути причиною хибно-позитивних результатів при виявленні антитіл до р17 ВІЛ-1 ( прогностичного серологічного показника перебігу ВІЛ-інфекції. 7. Визначено можливість застосування нових побічних маркерів, що дозволяють прогнозувати перебіг ВІЛ-інфекції: ( виявлення комбінації антитіл "gag(+/±)+pol(+/±)" у зразках сироваток крові інфікованих осіб є сприятливою прогностичною ознакою повільного перебігу ВІЛ-інфекції; ( виявлення комбінації антитіл "gag(-)+pol(+/±/-)" при першому обстеженні є несприятливою прогностичною ознакою швидкого перебігу ВІЛ-інфекції; ( заміна комбінації антитіл "gag(+/±)+pol(+/±)" на "gag(-)+pol(+/±/-)" корелює з погіршенням клінічного стану хворих; ( здатність мононуклеарів периферійної крові продукувати хемокін RANTES та ІФН-( у відповідь на стимуляцію рекомбінантним антигеном GAG ВІЛ-1 становить додатковий критерій оцінки стану імунної системи у ВІЛ-інфікованих: у осіб без проявів імунодефіциту (кількість клітин CD4+ ( 0,5х109/л) мононуклеари продукують хемокін RANTES та ІФН-( у відповідь на стимуляцію; в осіб зі зниженою кількістю клітин CD4+ така стимуляція призводить до пригнічення продукції цих цитокінів. СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Дяченко Н.С., Рибалко С.Л., Грицак Т.Ф., Максименок О.В., Дядюн С.Т., Повниця О.Ю., Нестерова Н.В., Береговенко В.М., Пацьковський Ю.В. Вивчення особливостей змішаного інфікування лімфоцитів вірусом імунодефіциту людини та деякими ДНК-геномними лімфотропними вірусами, що можуть бути асоційовані зі СНІДом // Біополімери і клітина. – 1997. – Т. 13, N 6. – С. 503-508. (Дисертанткою проведено визначення рівня експресії антигену р24 ВІЛ-1 та інфекційності вірусу в умовах змішаного інфікування лімфотропними вірусами). Рибалко С.Л., Максименок О.В., Христова М.Л., Шапіро А.В., Варбанець Л.Д., Іванська Н.В., Пацьковський Ю.В., Грицак Т.Ф., Сорокулова І.Б. Углеводсодержащие биополимеры бактерий – "мимикрины" пептидов вирусов гриппа и иммунодефицита человека // Лабораторная диагностика. – 2005. – N 2. – С. 26-30. (Мета роботи авторами сформульована спільно, здобувачем проведено дослідження антигенної спорідненості біополімерів між собою та з пептидами вірусів, вивчено вплив біополімерів на репродукцію ВІЛ-1, підготовка роботи до друку). Максименок О.В., Рибалко С.Л., Дядюн С.Т., Щербінська А.М., Антоненко С.В., Антоняк С.М., Кравченко О.М., Сельнікова О.П., Раєвська Г.Є. Про можливість використання деяких цитокінів як показників активації імунної системи у ВІЛ-інфікованих // Лабораторна діагностика. – 2005. – N 4. – С. 64-68. (Особистий внесок – сформульовано завдання роботи та висновки, проведено визначення рівня цитокінів, робота підготовлена до друку). Максименок Е.В. Значение косвенных лабораторных маркеров в прогнозировании течения ВИЧ-инфекции // Лабораторная диагностика. – 2003. – N 1. – С. 15-21. Кислих О.М., Максименок О.В., Ватаманюк М.Ю., Лузан Д.П. Застосування імуноферментних тест-систем для виявлення маркерів опортуністичних інфекцій та імунного статусу у ВІЛ-інфікованих // Лабораторна діагностика ( 1999. ( N 3. ( С. 33-35. (Здобувачем проведено дослідження щодо оцінки імунного статусу у ВІЛ-інфікованих осіб). Патент на винахід UA N 63020 "Інгібітор вірусів герпесу та імунодефіциту людини - 1,2-дитіол-3-пропілсульфонат натрію" / Рибалко С.Л., Максименок О.В., Дядюн В.Т., Даниленко В.П., Даниленко Г.І., Овруцький В.М., Григорьєва Т.І., Лозицький В.П., Федчук А.С., Нестерова Н.В., Колядич О.П., 2004, 2 стор. (Дисертантка особисто провела дослідження анти-ВІЛ активності препарату). Рибалко С.Л., Максименок О.В., Дядюн С.Т., Фурзікова Т.М., Дяченко Н.С. Вивчення антивірусної активності анти-ВІЛ препаратів в умовах змішаної інфекції // Зб. "Проблеми епідеміології, діагностики, клініки, лікування та профілактики інфекційних хвороб", Київ, 2002. – С. 286-290. (Здобувачем проведено експериментальні дослідження анти-ВІЛ активності препаратів на моделі змішаної інфекції, підготовка роботи до друку). Рибалко С.Л., Максименок О.В., Христова М.Л., Шапіро А.В., Варбанець Л.Д., Іванська Н.В., Пацьковський Ю.В., Грицак Т.Ф., Сорокулова І.Б. Вивчення антигенної спорідненості між вуглеводмісткими біополімерами бактерій та пептидами деяких вірусів // Матеріали міжнародного форуму "Основи молекулярно-генетичного оздоровлення людини і довкілля", Київ, 2005. – С. 179-182. (Авторами спільно сформульовано мету, здобувачем досліджено антигенну спорідненість біополімерів між собою та з пептидами вірусів, вивчено вплив біополімерів на репродукцію ВІЛ-1, підготовлено роботу до друку). Максименок О.В. Сучасні підходи до лабораторної діагностики ВІЛ-інфекції // Лабораторна діагностика. – 2003. – N 4. – С. 31-37. Гураль А.Л., Іванська Н.В., Кислих О.М., Максименок О.В. Серологічна діагностика ВІЛ-інфекції. Практичний посібник // Київ. – 2004. – 52 с. (Здобувач узагальнила дані щодо виявлення антитіл до ВІЛ). Кислих О.М., Максименок О.В., Ватаманюк М.Ю., Лузан Д.П. Досвід застосування комерційних наборів для імунного блоту при виявленні анти ВІЛ-1 на стадії сероконверсії // Зб."ВІЛ-інфекція та СНІД в Україні. Аналіз, профілактика, лікування", Київ. – 2001.– С. 176-177. Кислих О.М., Максименок О.В., Ватаманюк М.Ю. Вивчення маркерів вірусних гепатитів, опортуністичних інфекцій та імунного статусу у ВІЛ-інфікованих ін‘єкційних наркоманів // Матеріали науково-практичної конференції і пленуму Асоціації інфекціоністів України "Вірусні гепатити. СНІД" (10-11 листопада 1999 р.). – Тернопіль: Укрмедкнига. – 1999. – С. 47-48. Максименок Е.В., Ченцова Н., Кислых Е., Зеленецкая К., Рощенко Л. Изучение распространенности HCV-инфекции среди ВИЧ-инфицированных граждан Украины // Материалы 4-й международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы", Санкт-Петербург, 1996. – С. 132-133. Машарский А.Э., Набатов А.А., Максименок Е.В., Кислих Е.Н., Ченцова Н.П., Козлов А.П. Генетические субтипы вариантов ВИЧ-1, циркулирующие среди ВИЧ-инфицированых наркоманов на Украине // Русский журнал "ВИЧ, СПИД и родственные проблемы". – 1999. – Т.3. – № 1. – С. 76. Sergeyeva T.A., Maximenok O.V., Kislykh O.M., Gural A.L. Viral hepatitis B and C at HIV-infected in Ukraine: seroprevalence of markers // XIV International AIDS Conference. ( Geneva, July 7-12, 1998. ( Abst. N C10980. АНОТАЦІЯ Максименок О.В. Феномен антигенної мімікрії пептидів ВІЛ-1 та бактерій і маркери прогнозування перебігу ВІЛ-інфекції. ( Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 ( вірусологія. ( Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України, Київ, 2006. Дисертація присвячена визначенню ролі антигенної мімікрії пептидів ВІЛ-1 і вуглеводовмісних біополімерів мікроорганізмів у патогенезі ВІЛ-інфекції та вивченню можливості застосування деяких лабораторних показників як побічних маркерів прогнозування перебігу хвороби. В роботі показано, що мікроорганізми Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Neisseria meningitidis та Bacillus subtilis продукують біополімери ( мімікрини, антигенно споріднені між собою та з пептидом р17 ВІЛ-1. Мімікрини пригнічують репродукцію ВІЛ-1 на 5,0 lg ІД50 за умов хронічної та на 2,0-3,0 lg ІД50 ( за умов гострої інфекції в культурі клітин. Досліджено можливість впливу "антигенної" мімікрії на репродукцію ВІЛ-1 при моделюванні змішаних інфекцій з вірусами грипу, Епштейна-Барр та герпесу 1 типу. Показано, що в залежності від ступеня спорідненості між пептидами вірусів спостерігається пригнічення репродукції ВІЛ-1 (з вірусом грипу та ВЕБ) або її посилення (з ВПГ-1). Виявлення комбінації антитіл "gag(+/±)+pol(+/±)" у сироватці крові хворого є сприятливою прогностичною ознакою повільного перебігу ВІЛ-інфекції, в той час, як комбінація "gag(-)+pol(+/±/-)" свідчить про погіршення клінічного стану. Показано, що у ВІЛ-інфікованих осіб без ознак імунодефіциту імунокомпетентні клітини здатні продукувати Rantes і ІФН-( у відповідь на стимуляцію антигенами ВІЛ-1. Ключові слова: вуглеводовмісні біополімери, антигенна спорідненість, ВІЛ, змішані інфекції, прогностичні маркери. АННОТАЦИЯ Максименок Е.В. Феномен антигенной мимикрии пептидов ВИЧ-1 и бактерий и маркеры прогнозирования течения ВИЧ-инфекции. ( Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 ( вирусология. ( Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного НАН Украины, Киев, 2006. Диссертация посвящена изучению роли антигенной мимикрии пептидов ВИЧ-1 и углеводосодержащих биополимеров микроорганизмов в патогенезе ВИЧ-инфекции и выяснению возможности применения некоторых лабораторных показателей как побочных маркеров прогнозирования течения болезни. В работе показано, что микроорганизмы Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Neisseria meningitidis и Bacillus subtilis продуцируют углеводосодержащие биополимеры ( мимикрины, антигенно подобные между собой и с пептидом р17 ВИЧ-1. Мимикрины представляют собой белково-углеводные комплексы; белковая часть мимикрина S. aureus содержит 17 аминокислот; аминокислотный состав других мимикринов, выращенных на синтетических и безсывороточных средах, ( представлен 3-4 аминокислотами. По содержанию углеводного компонента биополимеры можно разделить на 2 группы ( маннозообогащенные (мимикрины S. aureus и N. meningitidis) и галактозобогащенные (мимикрин V. cholerae). Мимикрины подавляют репродукцию ВИЧ-1 на 5,0 lg ИД50 в условиях хронической и на 2,0-3,0 lg ИД50 ( в условиях острой инфекции в культуре клеток. Исследована возможность влияния "антигенной" мимикрии на репродукцию ВИЧ-1 в условиях смешанных инфекций с вирусами гриппа, ВЭБ и ВПГ-1. Показано, что в зависимости от степени антигенного подобия между пептидами вирусов наблюдается угнетение репродукции ВИЧ-1 на 2,0 lg ИД50 (с вирусом гриппа и ВЕБ) либо ее усиление на 2,0 lg ИД50 (с ВПГ-1). При смешанной инфекции ВИЧ-1+ВПГ-1 специфический анти-ВИЧ препарат "Комбивир" не подавляет репродукцию ВИЧ-1. Выявление комбинации антител "gag(+/±)+pol(+/±)" в сыворотке крови больного является благоприятным прогностическим признаком медленного течения ВИЧ-инфекции. Определение комбинации антител "gag(-)+pol(+/±/-)" при первом обследовании ( неблагоприятный прогностический признак, свидетельствующий о быстром протекании болезни, а замена комбинации антител "gag(+/±)+pol(+/±)" на "gag(-)+pol(+/±/-)" в динамике наблюдения ( об ухудшении клинического состояния больного. Установлено, что у ВИЧ-инфицированных циркулируют антитела к мимикрину, подобные анти-р17 ВИЧ-1, что может быть причиной ложно-положительных результатов при исследовании методом иммунного блота. У ВИЧ-инфицированных пациентов без признаков иммунодефицита (количество клеток CD4+ ( 0,5х109/л) мононуклеары периферической крови продуцируют RANTES и ИФН-( в ответ на стимуляцию антигеном GAG ВИЧ-1. У лиц со сниженным количеством клеток CD4+ такая стимуляция приводит к угнетению продукции указанных цитокинов, что можно использовать как дополнительный параметр при оценке состояния иммунной системы ВИЧ-инфицированных. Ключевые слова: углеводсодержащие биополимеры, антигенное родство, ВИЧ, смешанные инфекции, прогностические маркеры. ANNOTATION Maximenok O.V. Phenomenon of antigenic mimicry of HIV-1 and bacteria and prognostic markers of HIV-infection course. ( Manuscript. The thesis for scientific degree of the Candidate of Biological Sciences in speciality 03.00.06 ( virology. ( Danylo Zabolotny Institute of Microbiology and Virology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2006. The thesis deals with the study of the antigenic mimicry role of HIV-1 peptides and carbohydrate-containing bacterial biopolymers in the HIV-infection pathogenesis; the author has also studied the possibilities to use some laboratory data as surrogate markers of infection course prediction. The author shows that some microorganisms, such as Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Neisseria meningitidis and Bacillus subtilis, produce carbohydrate-containing biopolymers ( mimicrins possessing antigenic similarity between themselves as well as with HIV-1 peptide p17. These compounds inhibit the HIV-1 reproduction by 5.0 lg ID50 in chronically infected cell cultures and by 2.0-3.0 lg ID50 in acutely infected cells. The possibility of antigenic mimicry effect on the HIV-1 reproduction has been investigated using models of mixed HIV-1 infections with influenza, Epstein-Barr, and herpes simplex type 1 viruses. Depending on the degree of antigen similarity, HIV-1 development suppression (with influenza and Epstein-Barr viruses) or HIV-1 reproduction increase (with herpes simplex 1 virus) is observed. The detection of antibody combination "gag(+/±)+pol(+/±)" in patients’ sera is a favorable prognostic factor predicting slow process development, another combination –"gag(-)+pol(+/±/-)" being a marker of increased disease course. In HIV-infected patients without immunodeficiency peripheral blood mononuclear cells produce RANTES and IFN -( following their stimulation by the HIV-1 GAG antigen. Key words: carbohydrate-containing biopolymers, antigenic similarity, HIV, mixed infections, prognostic markers. PAGE 2

Похожие записи