ЧЕРНІВЕЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ЮРІЯ ФЕДЬКОВИЧА

ВОРОБЕЦЬ НАТАЛІЯ МИКОЛАІВНА

УДК 577.152.1: 577.152.2:157.175.1: 547.979.8: 546.81:546.23

Ендогенні механізми формування стійкості рослин до дії свинцю за участю
аскорбат-глутатіонової системи

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Чернівці – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Львівському національному медичному університеті

імені Данила Галицького та Львівському
національному

університеті імені Івана Франка

Науковий консультант — академік УААН, доктор біологічних наук, професор
СНІТИНСЬКИЙ Володимир Васильович, Львівський державний аграрний
університет, завідувач кафедри біології та агроекології, ректор

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Мещишен Іван Федорович,

Буковинська державна медична
академія,

завідувач кафедри медичної хімії

член-кор. НАН України, доктор
біологічних наук, професор

Блюм Ярослав Борисович,

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії,

завідувач відділом клітинної біології та біотехнології,

заступник директора з наукової роботи

доктор біологічних наук, професор

Вінниченко Олександр Миколайович,

Дніпропетровський національний
університет,

завідувач кафедри фізіології рослин
і екології,

директор НДІ біології

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса
Шевченка, кафедра біохімії, м. Київ

Захист відбудеться 17 березня 2004 р. о 12.00 годині на засіданні
спеціалізованої ради Д 76.051.05 при Чернівецькому національному
університеті імені Юрія Федьковича за адресою: вул. Лесі Українки (ІІІ
корпус університету, аудиторія

№ 81), м. Чернівці, 58012, Україна

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Чернівецького
національного університету імені Юрія Федьковича за адресою: вул. Лесі
Українки, 23, Чернівці, 58012, Україна

Автореферат розісланий 16 лютого 2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Г.П. Копильчук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Свинець належить до елементів, потреба яких для
живих організмів, зокрема для рослин, не доведена, однак він
зустрічається у складі всіх рослин. У ряді регіонів України
забрудненість ґрунтів свинцем, в т.ч. рухомими формами, перевищує
допустимі рівні в 1,5 – 14 разів (Костишин та інш., 1995; Мусієнко та
інш., 2002; Руденко та інш., 1997; Тютюнник, Горлицкий, 1998). Найбільшу
небезпеку для біоти становлять розчинні та рухомі форми свинцю, частка
яких від 25 до 76 % від загальної кількості. Потрапляючи в організм
рослини, свинець по ланцюгах живлення надходить до організмів тварин і
людини, викликаючи значні порушення їх метаболізму. У наш час існує не
лише необхідність вивчення екологічної ситуації, а й уміння протидіяти
розвиткові забруднення природного оточуючого середовища сполуками важких
металів. Погіршення екологічної ситуації істотно загострює проблему
доконечного вивчення механізмів, за участю яких рослини можуть
запобігати проникненню свинцю або уникати його шкідливої дії. Для
нормального протікання біохімічних процесів у рослинному організмі є
діапазон концентрації іонів свинцю, перевищення яких модулює низку
негативних для метаболізму реакцій. Свинець належить до екологічних
чинників, дія яких викликає в рослин стрес (Morange, 1997). Однією з
реакцій на стрес є продукція активних форм кисню (АФК) (Inze, Van
Montagu, 1995; Davies, 1998; Jamieson, 1998; Hancock, Neill, 1999;
Барабой, Сутковой, 1997; Меньщикова, Зенков, 1993; Willekens et
al.,1997; Rucinska et al., 1998), які здатні ініціювати пероксидне
окиснення ліпідів та білків, започатковувати нові ланцюги
вільнорадикальних процесів. Захист від АФК здійснюється на різних рівнях
і приводить до нейтралізації АФК та/або відновлення продуктів окисного
пошкодження ДНК, білків, ліпідів (Барабой, Сутковой, 1997;
Modaras-Ferreira et al., 1996).

Зміна активності ферментів є первинним проявом стресу від надлишку іонів
важких металів, що зумовлює каскад інших, вторинних, ефектів:
гормональний дисбаланс, дефіцит необхідних елементів, інгібування
фотосинтезу та азотного обміну, зміну водного режиму тощо, які в свою
чергу збільшують гальмування росту рослин (Блюм, 2002, 2003; Костишин та
інш., 1997; Мусієнко, Таран, 1997; Smirnoff, 1998; Klobus et al., 2002).
Здатність ферментних систем знешкоджувати наслідки впливу іонів
важких металів або пристосуватись шляхом зміни конформації молекули
забезпечує підтримання гомеостазу рослинного організму. Знання
біохімічних механізмів, які лежать в основі реакції рослин на дію іонів
свинцю, та забезпечення їх стійкості мають суттєве значення для
розуміння фундаментальних основ адаптації, розробки підходів для
одержання стійких сортів і форм рослин, використання стійких видів з
метою фіторемедіації.

Усе викладене стало підставою для дослідження механізмів стійкості
рослин до дії іонів свинцю та способів впливу на них з метою корекції.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є
частиною наукових тематик: Бс 322Б „Світло-лазерна фотоактивація росту
рослин”, № 0197U018119 держреєстрації; Бр 462Б “Відбір
фізіолого-біохімічних маркерів стресу в рослин до дії промислових
ксенобіотиків”, № 0193U041333 держреєстрації; “Регуляторна роль іонів
кальцію у функціонуванні глутатіонової антиоксидантної системи клітин”,
№ IH.07.00.0001.04 держреєстрації та Українсько-угорського проекту
„Вивчення мобілізації, акумуляції, поширення і біоремедіації важких
металів у забруднених екосистемах верхнього басейну ріки Тиса”, №
М/490-2003 держреєстрації.

Мета і задачі дослідження. З’ясувати особливості функціонування
антиоксидантної системи проростків квасолі та соняшника за умов дії
іонів свинцю, як складової частини ендогенних механізмів формування
стійкості рослин, а також можливості екзогенної регуляції процесу іонами
селену та абсцизовою кислотою (АБК).

Для досягнення поставленої мети було необхідно:

— дати оцінку змін інтенсивності пероксидного окиснення ліпідів,
концентрації пероксиду водню в сім’ядолях і зародкових частинах насіння,
а також коренях і пагонах рослин, вирощених за наявності іонів свинцю в
поживному розчині й сумісної їх дії з селенітом, та в комбінації з
абсцизовою кислотою;

— з’ясувати рівні накопичення іонів свинцю в сім’ядолях і зародкових
частинах насіння, а також коренях і пагонах рослин, вирощених за
наявності іонів свинцю в поживному розчині та їх сумісної дії з
селенітом;

— установити водний статус рослин унаслідок дії іонів свинцю і їх
сумісної дії з селенітом, та абсцизовою кислотою;

— установити рівень азотного обміну в рослинах під дією іонів свинцю та
селеніту;

— вивчити зміни фотосинтетичних процесів унаслідок дії іонів свинцю та
селеніту за змінами концентрації фотосинтетичних пігментів і компонентів
віолаксантинового циклу;

— визначити концентрацію глутатіону, аскорбінової кислоти та її
метаболітів у рослинах, вирощених за наявності іонів свинцю в поживному
розчині та за сумісної дії іонів свинцю й селеніту;

— дослідити активність каталази, пероксидази, глутатіонпероксидази,
глутатіонредуктази, глутатіон-S-трансферази, аскорбатпероксидази,
монодегідроаскорбатредуктази, дегідроаскорбатредуктази, аскорбатоксидази
за дії іонів свинцю та їх сумісної дії з селенітом;

— дослідити ефективність екзогенного впливу селеніту та абсцизової
кислоти на біохімічні та фізіологічні процеси в рослин за умов дії на
них іонів свинцю.

Об’єкт дослідження – механізм дії іонів свинцю на рослини соняшника та
квасолі.

Предмет дослідження – показники пероксидного окиснення ліпідів, азотного
обміну та фотосинтезу, активність віолаксантинового циклу, водний
статус, активність ферментів антиоксидантної аскорбат-глутатіонової
системи рослин під дією на них іонів свинцю, а також за умов сумісної
дії з іонами селеніту й абсцизовою кислотою.

Методи дослідження – біохімічні, фізіологічні, фізико-хімічні,
статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне
дослідження та дано оцінку активності антиоксидантного захисту рослин
унаслідок дії іонів свинцю.

Установлено, що внаслідок дії на рослини іонів свинцю в них змінюється
активність ферментів азотного обміну, концентрація фотосинтетичних
пігментів, зокрема компонентів віолаксантинового циклу.

Показано, що водний статус рослин залежить від впливу на них іонів
свинцю.

Виявлено активацію антиоксидантної аскорбат-глутатіонової системи в
результаті дії низьких концентрацій іонів свинцю і пригнічення її
високими протягом періоду проростання та початкового росту рослин.

Вперше встановлено, що іони селеніту в низьких концентраціях позитивно
впливають на ріст та розвиток рослин, активуючи процеси азотного
метаболізму та фотосинтезу.

Доведено, що за умов дії на рослини іонів свинцю антиоксидантний захист
активується екзогенною дією селеніту та абсцизової кислоти. На поживних
середовищах з ацетатом свинцю абсцизова кислота через активацію
ферментів асиміляції аміаку та відновлення водного статусу стимулює
ростову активність коренів і пагонів рослин.

Вперше виявлено, що інтенсивність проростання насіння рослин за умов
наявності іонів свинцю залежить від рівня вимушеного спокою насіння та
наявності початкового рівня аскорбінової кислоти.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати
поглиблюють уявлення про механізми розвитку стресу в рослин унаслідок
дії іонів свинцю, що відкриває можливість пошуку диференційованого
підходу до подальшого вивчення адаптаційних можливостей рослин.

У результаті проведених досліджень виявлено нові властивості
аскорбат-глутатіонової системи для забезпечення стійкості рослин в
умовах свинцевого навантаження.

Експериментально доведено, що низькі концентрації селеніту натрію
сприяють адаптації рослин до дії іонів свинцю на перших етапах їх росту.

Встановлено, що абсцизова кислота не перешкоджає проникненню іонів
свинцю в органи рослин, однак сприяє адаптації до його дії.

Отримані результати дають змогу добирати види рослин, які, очевидно,
будуть стійкими на ґрунтах з підвищеними концентраціями іонів свинцю з
метою їх застосування для фіторемедіації забруднених ґрунтів.

Матеріали дисертації можуть бути використані в курсах лекцій для
студентів з біохімії та фізіології рослин, екології, фармакогнозії. Вони
стали основою для виконання низки дипломних і курсових робіт студентами
біологічного факультету Львівського національного університету імені
Івана Франка, а також дисертаційної роботи на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук під керівництвом здобувача.

Особистий внесок здобувача полягає в безпосередньому обґрунтуванні
концепції роботи. Автор самостійно розробив дослідницьку програму,
налагодив методики та схеми проведених досліджень і виконав більшість
біохімічних, цитохімічних і фізико-хімічних досліджень (за винятком
визначення мітотичного індекса).

Розроблено та обґрунтовано методичні підходи для вивчення біохімічних
механізмів активності антиоксидантного захисту рослин унаслідок дії
іонів свинцю. Опрацьовано дані літератури, узагальнено одержані
результати, сформульовано висновки та практичні рекомендації.

При сумісному виконанні дослідів із співробітниками Київського
національного університету імені Тараса Шевченка, Інституту фізіології
рослин і генетики НАН України та Львівського національного університету
імені Івана Франка, вони є співавторами відповідних публікацій.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що включені до
дисертації, були представлені на наукових конференціях Львівського
національного університету імені Івана Франка 1997-2002 р., 2nd
Conference on Progress in Plant Breeding to growth Regulation
(Mosonmagyarovar-Hungary, 1998); Міжнародній конференції „Онтогенез
рослин в природному та трансформованому середовищі” (Львів, 1998); The
11th Congress of the Federation of European Societies of Plant
Physiology (Varna, Bulgaria, 1998); (( International Symposium on Plant
Biotechnology (Kyiv, 1998); I Всеукраїнській науковій конференції
„Екологічний стрес і адаптація в біологічних системах” (Тернопіль,
1998); IV з’їзді товариства фізіологів рослин Росії (Москва, 1999);
Міжнародній конференції „Проблеми сучасної екології” (Запоріжжя, 2000);
((( Congress of the FESPS (Budapest, Hungary, 2000), VII Молодіжній
конференції ботаніків у Санкт-Петербурзі (Санкт-Петербург, 2000);
International scientific conference “Growth, Development and
Productivity of Plants, Theoretical and Practical Problems” (Babtai,
Lituania, 2000); 53-ій науково-технічній конференції студентів та
аспірантів УкрДЛТУ (Львів, 2001); Шостій міжнародній конференції
„Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях” (Москва, 2001);
XI з’їзді Українського ботанічного товариства (Харків, 2001); 17th
International Conference on Plant Growth Substances (Brno, Czech
Republic, 2001); International Symposium “Intracellular Signaling in
Plant and Animal Systems (ISPAS)” (Kyiv, 2001); Міжнародної наукової
конференції „Онтогенез рослин, біологічна фіксація молекулярного азоту
та азотний метаболізм рослин (Тернопіль, 2001); Міжнародній
науково-практичній школі для молодих вчених і спеціалістів „Природні
екосистеми Карпат в умовах посиленого антропогенного впливу” (Ужгород,
2001); Fifth conference on Oxygen, free radicals and oxidative stress in
plants (Nice, France, 2001); VІІІ Українському біохімічному з’їзді
(Чернівці, 2002); III з’їзді Українського біофізичного товариства
(Львів, 2002); 4th Parnas Conference “Molecular Mechanisms of Cell
Activation : Biological Signals and Their Target Enzymes” (Wroc?aw,
Poland, 2002); IV Міжнародній науковій конференції „Промислова ботаніка:
стан та перспективи розвитку” (Донецьк, 2003).

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи висвітлені в 46
публікаціях, у тому числі 26 статтях (з них — 11 одноосібних), які
опубліковані в наукових фахових виданнях, та у 21 тезах доповідей.

Структура і обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду
літератури, опису об’єкта та методів досліджень, опису отриманих
результатів, аналізу й узагальнення результатів дослідження, висновків,
списку використаних джерел (705 назв). Робота викладена на 324
сторінках, містить 60 таблиць, 35 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обгрунтовано актуальність теми, сформульовано мету, завдання
та методи досліджень, розкрито наукову новизну і практичне значення
роботи, зазначено особистий внесок здобувача і апробацію результатів
дисертації.

У першому розділі систематизовано й узагальнено літературні результати
щодо сучасної теорії стресу, проаналізовано експериментальні дані
стосовно механізмів стійкості рослин до дії стресових факторів. Крім
того, проаналізовано дані про вплив іонів свинцю на фізіолого-біохімічні
параметри різних видів рослин, розглянуто участь низькомолекулярних
антиоксидантів і ферментів їх утворення та метаболізму в захисті від
АФК.

Другий розділ присвячений матеріалам і методам дослідження: тут описано
об’єкти дослідження, наведено методи та матеріал дослідження, що
використані в роботі.

Досліди виконані на соняшнику (Helianthus annus L., сорту Світоч та
гібриду Погляд) та квасолі (Phaseolus vulgaris L., сортів Лисецька,
Сперанца, Первомайська, Ювілейна), насіння яких надане Інститутом
рослинництва імені Юр’єва (м. Харків).

Дослідження проводили за двома схемами. За першою схемою насіння
відмивали водою, замочували і пророщували протягом трьох діб у темному
термостаті при +23(С ( 1(С на поживних розчинах різних варіантів. Через
три доби проростки пересаджували у водні культури і продовжували
вирощувати в тих самих поживних розчинах до використання. За другою
схемою насіння відмивали водою, замочували і пророщували протягом трьох
діб у темному термостаті при + 23( ( 1( С на бідистильованій воді.
Через 3 доби проростки пересаджували на поживні суміші різних варіантів.
Пророщували насіння в чашках Петрі або в емальованих кюветах. В обох
схемах дослідів використовували такі варіанти поживних сумішей: водні
розчини ацетату свинцю в концентрації 10-8 М, 10-5 М, 10-3 М; водні
розчини ацетату свинцю у концентрації 10-8 М, 10-5 М, 10-3 М разом з
10-8 М та 10-9 М селенітом натрію; водні розчини ацетату свинцю в
концентрації 10-8 М, 10-5 М, 10-3 М разом з 10-10 М абсцизовою
кислотою. Як контрольні варіанти використовували бідистильовану воду,
розчин Кнопа, а також розчин 10-8 М або 10-9 М селеніту натрію та 10-10
М абсцизової кислоти.

Вивчали енергію проростання, схожість насіння та ріст проростків (у
соняшника через 3 доби — енергію проростання, через 7 діб – схожість; у
квасолі через 4 доби — енергію проростання, схожість – через 8 діб
(Тютюрев, 1949). Приріст маси проростків обчислювали за (Гродзинский,
Гродзинский, 1964), індекс толерантності рослин — за (Wilkins 1978).
Вміст свинцю визначали атомно-адсорбційним методом на спектрофотометрі
С-115 М1 в пропан-бутановому полум’ї з використанням електротермічного
атомізатора “Графіт-2”, а також на атомно-адсорбційному спектрофотометрі
Perkin Elmer model 33000 (Самохвалов и др., 1989). Вміст хлорофілів а та
b і каротиноїдів встановлювали у вихідній витяжці пігментів ацетоном без
попереднього їх розділення (Васильєва, 1978). Визначення вмісту
пероксиду водню проводили колориметрично (Jana, Choudhuri, 1981). Вміст
малонового діальдегіду виявляли за накопиченням у тканинах одного з
кінцевих продуктів – малонового діальдегіду (МДА) у кольоровій реакції з
тіобарбітуровою кислотою (ТБК) (Health, Packer, 1968). Вимірювали вміст
відновленого глутатіону (Lay, Casida 1976). Концентрацію білка визначали
за методом Лоурі (Lowry, 1951) або за методом Бредфорда (Bradford,
1976). Розподіл іонів свинцю вираховували гістохімічно (Серегин, Иванов,
1997). Лігнін визначали за методом Барської (Барская, 1967). Для
з’ясування водного статусу рослин використовували такі показники, як
водний потенціал, який визначали рефрактометричним методом (Григорюк и
др., 1999), та відносний вміст води (Lazcano-Ferrat, Lovatt 1999). Для
обчислення вмісту аскорбінової, дегідроаскорбінової та дикетогулонової
кислот використовували методи (Соколовский и др., 1974) у модифікації
(Окунцев, Аксенов, 1981). Активність пероксидази (гваяколпероксидази)
(КФ 1.11.1.7) визначали за окисненням гваяколу до тетрагваяколу при 420
нм за наявності Н2О2 (Bisbis et al., 1998). Активність
аспартатамінотрансферази (КФ 2.6.1.1) та аланінамінотрансферази (КФ
2.6.1.2) — за допомогою 2,4-динітрофенілгідразину (Тищенко, 1978).
Концентрацію аміаку вимірювали мікродифузним методом (Любимов, 1968).
Активність НАДН-глутаматдегідрогенази (КФ 1.4.1.2.) визначали за
швидкістю окиснення НАДН (Joy, 1969). Активність глутамінсинтетази (КФ
6.3.1.2) – гідроксаматним методом (Евстигнеева и др., 1980). Активність
каталази (КФ 1.11.1.6) визначали спектрофотометрично при 240 нм (Bisbis
et al., 1998). Активність глутатіонпероксидази (КФ 1.11.1.9) — за
модифікованою методикою Моіна (Моин 1986). Активність
аскорбатпероксидази (КФ 1.11.1.11) визначали спектрофотометрично за
зменшенням екстинкції при 290 нм при окисненні аскорбату (Shigeoka et
al., 1980; Nakano, Asada, 1981). Активність монодегідроаскорбатредуктази
(КФ 1.6.5.4) — спектрофотометрично за зміною екстинкції при 360 нм
(Miyake, Asada, 1992). Активність аскорбатоксидази (КФ 1.10.3.3)
обчислювали за зміною поглинання при 265 нм внаслідок окиснення
аскорбінової кислоти (Conklin et al., 1997). Активність
глутатіонредуктази (КФ 1.6.4.2) визначали спектрофотометрично (Foyer,
Halliwell, 1976) у модифікації (Vanaker et al., 1998) за зміною
поглинання при 340 нм. Активність дегідроаскорбатредуктази (КФ 1.8.5.1)
визначали спектрофотометрично за зміною поглинання при 265 нм і
утворенням аскорбінової кислоти (Foyer et al., 1989; Miyake, Asada
1992).

Результати вимірів опрацьовували статистично, визначаючи середнє
арифметичне значення (М) та похибку середнього (m). Вірогідність різниці
середніх значень встановлювали за критерієм t Ст’юдента (Плохинский,
1970). Дисперсійний та кореляційний аналіз отриманих результатів
здійснювали з використанням пакета комп’ютерних програм “Microsoft
Office XP”.

У третьому розділі роботи, який складається з семи частин, викладено
результати дослідження та їх обговорення.

Утворення активних форм кисню в рослинах соняшника та квасолі за дії
свинцю, а також при сумісній дії з низькими концентраціями селеніту та
АБК.

Ми виявили, що малоновий діальдегід утворюється в коренях та пагонах
тридобових рослин соняшника на всіх поживних розчинах (табл. 1).
Особливо високий його рівень у коренях рослин, вирощених на обох
концентраціях іонів свинцю та разом із селенітом натрію: 209,4 –225,4
нмоль ( г-1 маси сирої речовини, тоді як у контролі вміст МДА був у 5
разів меншим і становив 42,5 нмоль ( г-1 маси сирої речовини (Р<0,05). У рослин, які росли на розчині селеніту натрію, вміст малонового діальдегіду становив 60,5 нмоль ( г-1 маси сирої речовини. У пагонах спостерігали подібні закономірності, однак рівень МДА був у кілька разів нижчим. Вивчення вмісту МДА у частинах проростаючого насіння квасолі показало, що під дією іонів свинцю він підвищується. Найбільша концентрація МДА спостерігалась у коренях і пагонах тридобових рослин, які росли на поживних розчинах 10-3 М ацетату свинцю та 10-3 М ацетату свинцю разом з 10-8М селенітом натрію. При цьому в коренях концентрація МДА в 1,5-2 рази вища, ніж у пагонах. Найвищий рівень пероксиду водню в коренях і пагонах рослин, які вирощені на найвищій концентрації іонів свинцю та разом з іонами селену. В усіх варіантах дослідів уміст пероксиду водню вищий у коренях, ніж у пагонах. Таблиця 1 Концентрація малонового діальдегіду в органах квасолі під дією свинцю та селеніту натрію, нмоль? г-1 маси сирої речовини (M±m, n=6) Варіанти 3-добові рослини 8-добові рослини корені пагони корені пагони Н2О 30 ( 3,2 28 ( 2,7 37 ( 3,2 20 ( 3,0 Розчин Кнопа 20 ( 0,9 * 20 ( 1,5 * 29 ( 4,8 27 ( 3,6 10-8М Pb2+ 68 ( 5,9 * 74 ( 6,5 * 100 ( 14,8 * 81 ( 13,0 * 10-3М Pb2+ 120 ( 13,4 * 96 ( 4,9 * 403 ( 34,8 * 396 ( 28,8 * 10-8М SeO32- 65 ( 5,8 * 68 ( 5,6 * 134 ( 23,8 * 58 ( 13,5 * 10-8М Pb2+ +10-8М SeO32- 88 ( 6,9 * 78 ( 8,9 * 66 ( 7,8 * 55 ( 9,5 * 10-3М Pb2+ +10-8М SeO32- 201 ( 17,8 * 137 ( 14,2 * 507 ( 45,3 * 488 ( 52,1 * * різниця з контролем (Н2О) вірогідна, Р < 0,05 Особливо високим був уміст Н2О2 у коренях рослин варіантів з 10-3 М ацетатом свинцю. Наявність іонів селеніту разом з високою концентрацією іонів свинцю не запобігала утворенню підвищеної кількості Н2О2. Щоб виявити, чи проникають іони свинцю в частини насінини під час проростання її на розчинах зі свинцем, використовували гістохімічні методи. Для вивчення проникнення та розподілу іонів свинцю ми також використовували обидва варіанти досліду. Гістохімічні дослідження рослин першого варіанта досліду показали, що поодинокі ґранули дитізонатів спостерігаються в коренях контрольних рослин квасолі: на ранніх етапах розвитку лише у протодермі та зовнішніх шарах периблеми, а у 12-добових рослин – у пасках Каспарі ендодерми. Форма та розміри клітин кореня при вирощуванні рослин на 10-8 М ацетаті свинцю протягом усього експерименту такі ж, як у контрольних. У 5-добових рослин, вирощених на розчині ацетату свинцю 10-8 М, дитізонати концентрувались у клітинах зовнішніх шарів кореня біля клітинних стінок. У паренхімних клітинах усіх зон кореня також спостерігали відклади дитізонатів, але переважно в середині клітин. У зоні кореневих волосків та проведення дитізонати були зосереджені біля клітинних стінок ендодерми. У камбіальних клітинах і перициклі відкладів дитізонатів не було. У варіанті з сумісним застосуванням 10-8 М ацетату свинцю з 10-8 М селенітом натрію розподіл дитізонатів по тканинах не змінювався, але візуально їх було менше. Аналіз 8- та 12-добових рослин показав, що перерозподілу дитізонатів не відбувалося, хоча інтенсивність забарвлення збільшилась у всіх варіантах досліду.За наявності 10-3 М ацетату свинцю в його комбінації з селенітом натрію відклади дитізонатів спостерігали практично в усіх зонах кореня та в усіх тканинах і квасолі і соняшника. Винятком були клітини камбію, у яких на варіанті з 10-3 М ацетату свинцю у його комбінації з селенітом натрію дитізонатів не було. Одержані результати свідчать, що клітинна стінка є місцем акумуляції свинцю і можливим бар’єром для його пересування. При вивченні ходу лігніфікації в шестидобових рослин соняшника контрольного варіанта виявлено, що кутикула добре виражена, ендодерма товстостінна коленхіматозного типу. Цей факт ми відзначаємо вперше, оскільки в паренхімних клітин зірчасто потовщені кути. Кільце провідних пучків майже зімкнуте. Протоксилемні елементи звичайні – 3-5 судин у первинних пучках. Широка зона камбію формує групу досить значних за діаметром вторинних флоемних елементів. Реакція на лігнін є лише у первинних ксилемних елементах кореня та гіпокотиля. Ксилема добре виражена. На зрізах коренів рослин варіанта 10-8 М Pb(CH3COO)2 кутикула добре сформована. Чітко видно покривну тканину та коленхіму. Паренхіма кори з типовим потовщенням оболонок. Судинні пучки сформовані, протоксилемних елементів з відкладами лігніну 5-6. Добре розвинена вторинна флоема – до 10 ситоподібних трубок. На зрізах гіпокотилів видно зачатки луб’яних волокон. У кільчастих потовщеннях оболонок протоксилемних елементів гіпокотилю є лігнін. У коренях рослин варіанта 10-3 М Pb(CH3COO)2 на зрізах проявляються ознаки деструкції внутрішньої частини осьового циліндра – клітини лізовані, залишились лише ксилемні групи. Паренхіма кори без особливостей, ендодерма без змін. У гіпокотилях слабо виражена ксилемна зона – групи з 3-5 ксилемних елементів. Паренхіма кори нагадує коленхіматозну тканину – видно потовщення оболонок, оболонки своєрідно набрякають і мають зірчасту внутрішню структуру. При вирощуванні рослин на 10-8 М Pb(CH3COO)2 приріст коренів та гіпокотилів дво- та тридобових рослин був меншим від контролю, у шестидобових рослин достовірно не відрізнявся від контролю. Це свідчить, що шестидобові рослини вже адаптувались до цієї концентрації свинцю. Приріст коренів та гіпокотилів дво- , три- та шестидобових рослин, які росли на 10-3 М Pb(CH3COO)2, був нижчим від контролю. Як показали наші попередні дослідження 10-3 М Pb(CH3COO)2 є летальною концентрацією для соняшника. За наявності в поживному розчині 10-8 М іонів свинцю разом з селенітом натрію в однодобових рослин лігніфіковані лише окремі клітини покривів, паренхіми та ендодерми. На третю добу лігнін фіксується частково в метаксилемі, перициклі, а на дев’яту - в ендодермі, ризодермі провідної зони, частково екзодермі. Дослідження лігніфікації в рослин, які пророщувались за наявності в поживному розчині 10-3 М іонів свинцю разом з селенітом натрію показало, що однодобові рослини найсильніше лігніфіковані в ендодермі, лігніфіковані також деякі клітини паренхіми та метаксилеми. Клітини покривів, ендодерми та метаксилеми кореня і пагона тридобових рослин сильно лігніфіковані. На дев’яту добу всі зазначені клітини містили лігнін. При наявності в поживному розчині 10-8 М іонів свинцю разом з селенітом натрію в однодобових рослин лігніфіковані лише окремі клітини покривів, паренхіми та ендодерми. На третю добу лігнін фіксується частково в метаксилемі, перициклі, а на дев’яту - в ендодермі, ризодермі провідної зони, частково екзодермі. Отримані результати свідчать про те, що лігніфікація клітин ендодерми може обмежувати пересування іонів свинцю симпластом. Процес лігніфікації клітинних стінок, принаймні частково, є пероксидаза/Н2О2 – залежним процесом (Ros Barcelo, 1999), а механізми захисту включають активацію антиоксидантної системи за участю пероксидаз (Reddy, Prasad, 1992; Meksongsee, Wongkaew, 1991; Shaw, 1995). Хоча є роботи, які заперечують це твердження (Lagrimini et al., 1997). Вплив різних концентрацій ацетату свинцю, а також його сумісної дії з низькими концентраціями іонів селеніту та абсцизовою кислотою на ростові процеси в рослин Залежно від концентрації іонів свинець впливає на схожість соняшника, а селеніт у застосованій концентрації сприяє цьому процесу. Відзначено позитивний вплив селеніту на енергію проростання насіння. При сумісній дії іонів свинцю та селеніту на рослини спостерігався достовірний позитивний вплив останнього на процеси проростання. Особливо це помітно при дії високих концентрацій іонів свинцю. У рослин соняшника, пересаджених на розчини ацетату свинцю після 3-добової експозиції на воді (II варіант досліду), їх вплив на ростові процеси залежав від концентрації солей та тривалості їх дії. Вже в п(яти добових проростків достовірно проявляється інгібуюча дія високих концентрацій свинцю на ріст коренів і пагонів. Цей вплив посилюється з часом. Довжина кореня рослин на найнижчій із застосованих нами концентрацій свинцю мало відрізнялась від того, що у вирощених на розчині Кнопа. Однак маса коренів була вищою в контрольних рослин. Селеніт, який ми використовували, у моносольовому розчині позитивно впливав на ріст коренів, однак сумісно з іонами свинцю достовірно позитивного впливу ми не виявили. Маса та довжина пагона на концентрації 10-3 M Pb(CH3COO)2 разом з 10-8 M Na2SeO3 була нижчою, ніж при вирощуванні на інших варіантах поживного розчину. Найбільшою довжина та маса пагонів рослин була при вирощуванні їх на розчині Кнопа. Така ж закономірність у цілому збереглась до 7-ої доби вирощування. Однак у 7-добових рослин 10-8М ацетат свинцю проявляє стимулюючу дію на ріст коренів та приріст їх біомаси. Найменшими всі показники (довжина та маса коренів і пагонів) у 5-, 7- і 12-добових рослин були при вирощуванні їх на поживному середовищі з 10-3 М ацетаті свинцю. Те, що селеніт у моносольовому розчині та разом з іонами свинцю достовірно сприяють росту рослин, підтверджується тим, що приріст біомаси 16 добових рослин соняшника був найвищим у тих з них, які вирощувались на 10-8М ацетаті свинцю або разом з 10-8 М селенітом. Індекс толерантності рослин виявляв подібну закономірність. За наявності іонів селеніту в розчині зі свинцем індекс толерантності на відповідних розчинах підвищувався. Отже, нами встановлено, що при застосуванні моносольового розчину ацетату свинцю спостерігається інгібуюча дія високих його концентрацій на ріст коренів, меншою мірою - пагонів. Цей вплив посилюється з часом. У варіантах із застосуванням селеніту відзначено його деякий стимулюючий вплив на ріст соняшника. Збільшення кількості бічних коренів у рослин, які, крім іонів свинцю в поживному розчині, містили іони селену, може свідчити про позитивну дію останніх на ростові процеси та проліферацію вторинної меристеми коренів. Збільшення кількості бічних корінців повинно поліпшити водний статус рослин. Застосування абсцизової кислоти не лише привело до 3-4-кратного збільшення кількості бічних корінців, але й до появи додаткових у нижній частині гіпокотиля. Одночасно, при високих концентраціях іонів свинцю у розчині, відбувається їх накопичення і в зародкових осях, і в сім’ядолях порівняно з контролем (табл. 2). Таблиця 2 Вміст іонів свинцю в зародкових осях та сім’ядолях тридобових рослин квасолі, мкг·г-1 маси сухої речовини Варіант досліду Н2О розчин Кнопа 10-8 М Pb2+ 10-3 М Pb2+ 10-8 М Pb2+ + 10-10 М АБК 10-3 М Pb2+ + 10-10 М АБК 10-10 М АБК розчин Кнопа + 10-10 М АБК зародкова вісь ( 5 ( 5 ( 5 79,0 ( 1,56 ( 5 122,0 ± 1,0 ( 5 ( 5 сім’ядолі ( 0,5 ( 0,5 ( 0,5 53,0 ( 2,10 ( 0,5 12,0 ± 0,20 ( 0,5 ( 0,5 Додавання до поживного розчину АБК сприяє накопиченню свинцю в зародкових осях та зменшує його накопичення в сім’ядолях. Наведені результати свідчать, що іони свинцю проникають до зародкової осі квасолі і впливають на ріст зародкових корінців, хоча інгібування процесу проростання, яке ми спостерігали в насіння соняшника (Воробець, Микієвич, 2000), не відбувається. Накопичення АБК і зниження вмісту цитокінінів можуть доповнювати одне одного в інгібуванні росту пагонів і, крім того, введення в рослину одного гормона викликає зміни концентрації інших, тобто може діяти не прямо, а опосередковано, змінюючи концентрацію іншого гормона, а накопичення АБК може бути не лише індикатором, але й активатором процесів, спрямованих на зниження концентрації цитокінінів у рослинах при стресі (Кудоярова и др., 1999). Одержані дані частково підтверджують це припущення. Проте, зміни під впливом низької концентрації АБК, які ми виявили, ймовірно викликані її участю як компонента сигнальної трансдукції. Нещодавно показано, що активні види кисню можуть діяти як вторинний месенджер в АБК сигналізації (Pei et al., 2000; Schroeder et al., 2001; Guan et al., 2000). Оскільки відома продукція активних видів кисню під дією важких металів, у випадку дії іонів свинцю також не виключена їх роль як “розподілювача” шляхів стресової сигналізації. Азотний обмін рослин унаслідок дії іонів свинцю різних концентрацій та при сумісній дії з іонами селеніту й абсцизовою кислотою У пагонах п,ятидобових проростків рослин квасолі контрольного варіанта, а також варіанта 10-8 М ацетату свинцю був високий вміст аміаку - в середньому 2,5 мкмоль · г-1 сирої речовини. У рослин, вирощених на 10-3 М Pb2+, вміст аміаку був 1 мкмоль · г-1 сирої речовини. При вирощуванні квасолі на розчині Кнопа, замість Н2О, вміст аміаку в пагонах становив 0,2±0,02, 0,5±0,04 і 1,2±0,1 мкмоль · г-1 маси сирої речовини відповідно в 5-, 7- і 16-добових рослин. У коренях за цих же умов він становив 2,3±0,2, 0,6±0,04 і 1,4±0,1 мкмоль · г-1 сирої речовини відповідно в 5-, 7- і 16-добових рослин. Накопичення NH4+ під дією іонів свинцю в органах рослин може бути пов’язане з недостатньою активністю ферментів у його перетворенні – глутамінсинтетази (ГС) та глутаматдегідрогенази (ГДГ) або зміною його поглинання з поживного розчину. Глутамінсинтетаза є одним з ключових ферментів, завдяки якому неорганічний азот в амонійній формі вводиться у склад амінокислот. Активність ГС у зародкових частинах досліджуваних тридобових контрольних рослин квасолі становила 0,44 ± 0,02 мкмоль ?-глутамілгідроксамату · (хв · г сирої маси)-1. Активність НАДН-ГДГ в контрольних рослин становила 0,016 ± 0,001 нмоль окисненого НАДН · (хв · г сирої маси)-1. Низькі концентрації іонів свинцю (10-8 М) та АБК (10-10 М) активують НАДН-ГДГ. При цьому активність ГС залишається високою. Високий вміст іонів свинцю у поживному розчині (10-3 М) інгібує активність ГДГ, але водночас підвищується активність ГС порівняно з контролем. Дія абсцизової кислоти, яка викликає зміну активності ГС та ГДГ, за наявності іонів свинцю в поживному розчині може бути непрямою. Відомо, що в рослинах під час стресу, особливо водному дефіциті, накопичується пролін (Lazcano-Ferrat, Lovatt, 1999), попередником якого є глутамінова кислота, біосинтез якої лімітується активністю ГДГ та ГС. Оскільки абсцизова кислота контролює водний статус рослин (Ludewig et al., 1988), є медіатором програм розвитку та інтегратором внутрішньоклітинних сигналів для оптимізації росту рослин та їх виконання (Grill, Himmerbach, 1998), проявляється її позитивний вплив на активність ГДГ та ГС у зародкових частинах рослин квасолі внаслідок дії на них іонів свинцю. Проведені дослідження показали, що в сухих зародкових осях квасолі наявна активність ГС і ГДГ. Вже через 6 год від початку набрякання активність ГС збільшується в 4 рази, потім знижується, а на 18 год знову зростає і стає більшою за контрольну в 2 рази. Активність ГДГ збільшується в процесі набрякання насіння впродовж 18 год практично лінійно. Із часом активність ГС змінюється. Виявлено, що вже в п’ятидобових рослин помітна різниця в активності ГС залежно від варіанта досліду (рис. 1). Найвища активність відзначена в пагонах і коренях рослин, які росли на розчині Кнопа та 10-8 М ацетаті свинцю. У рослин, які росли на воді та розчинах ацетату свинцю 10-5М і 10-3М, активність ГС нижча більше як удвічі. Крім того, відзначено, що активність фермента в пагонах значно вища, ніж у коренях. Рис. 1. Активність глутамінсинтетази в органах квасолі, мкмоль (-ГГК ( (хв ( мг маси сирої речовини)-1. З ростом рослин загальні тенденції у відмінностях активності ГС між варіантами зберігаються. В цілому активність ГС у пагонах вища, ніж у коренях на всіх варіантах досліду. Однак на 10-5М та 10-3М ацетаті свинцю активність значно нижча, ніж в обох контролів. Тобто високі концентрації ацетату свинцю інгібують активність ГС у пагонах і коренях квасолі. Раніше подібні закономірності показані при дії іонів свинцю на рослини пшениці, кукурудзи та соняшника (Vorobets et al., 1998). У наших дослідах активність ГДГ в коренях контрольних рослин та на 10-8М ацетаті свинцю найвища до переходу їх на автотрофне живлення. У 16-добових рослин зростає активність фермента в пагонах і зменшується в коренях. На 10-3М ацетаті свинцю активність ГДГ в коренях 16-добових рослин нижча на 2 порядки порівняно з 5-ти та 7-ми добовими, а в пагонах вона низька протягом усього досліджуваного періоду, крім пагонів варіанта 10-8 М ацетату свинцю. ГС і ГДГ – це ферменти, через які проходять два шляхи асиміляції амонію, життєво важливі для рослини. Один шлях – глутамілсинтетазний – необхідний для реасиміляції амонію, утвореного в процесі дезамінування амінокислот, другий – глутаматдегідрогеназний – забезпечує асиміляцію аміаку в мітохондріях, де він може концентруватися, не завдаючи шкоди рослині. Показано, що через 6 год від початку набрякання насіння квасолі збільшуються активності АлаАТ і АспАТ, відповідно в 7,0 і 1,5 раза, потім їх активності зменшуються. Звертає на себе увагу паралельне збільшення вмісту аланіну та аспарагіну впродовж 6 год та зменшення вмісту цих амінокислот в наступні 6 год. При рості рослин на моносольових розчинах ацетату свинцю та селеніту натрію в концентрації 10-8 М активність АспАТ висока і в коренях, і в пагонах, але нижча, ніж у контролі 1 (у коренях) та в контролі 2 (у пагонах). Моносольовий розчин ацетату свинцю у високій концентрації (10-3 М) активує АспАТ в пагонах, а в комбінації з селенітом натрію – у коренях. Однак при подальшому рості на високій концентрації свинцю різко проявляється його гальмівний вплив на активність АспАТ коренів, дещо меншою мірою - на АспАТ пагонів. Селеніт натрію не знімає цієї дії, не зважаючи на те, що загальний уміст білків дещо зростає. Вплив іонів свинцю на процеси фотосинтезу в рослин Порівняння вмісту ?-каротину в сім’ядолях насінин, які пророщували за наявності різних концентрацій іонів свинцю в поживному розчині, показало їх прямо пропорційну залежність - за дії 10-8 М Pb2+ вміст ?-каротину найнижчий, на концентрації 10-3 М Pb2+ - найвищий (рис.2). За наявності іонів свинцю в поживному розчині відбулось деяке зниження вмісту ?-каротину в сім’ядольних листках семи- та дванадцятидобових рослин. Найменша концентрація пігменту спостерігається в сім’ядольних листках, якщо в поживному розчині найвищий уміст свинцю. Знижується вміст ?-каротину і в сім’ядольних листках. Отже, (-каротин як антиоксидант особливо важливу роль відіграє при проростанні, коли ще недостатня кількість інших антиоксидантів, а іони селену сприяють підвищенню його вмісту. Рис. 2. Уміст ?-каротину в сім’ядолях та сім’ядольних листках соняшника, вирощених на поживних середовищах з різною концентрацією свинцю У сім’ядольних листках активно відбувається синтез хлорофілів а і b за наявності іонів свинцю. Одночасно в сім’ядольних листках варіанта 10-3 М ацетату свинцю спостерігали невеликі некротизовані ділянки. До низької концентрації іонів свинцю - 10-8 М рослини адаптуються, їх фотосинтетичний апарат продовжує виконувати свої функції, так само як і на воді та розчині Кнопа. Посилення вільнорадикальних процесів та зсув рівноваги в бік активації ПОЛ є однією з перших неспецифічних ланок у загальній стрес-реакції організму, яка може ініціювати включення інших механізмів захисту. Цей захист можуть здійснювати пігменти віолаксантинового циклу (ВЦ), пул яких у рослинах збільшується (Курганова и др., 1997; Маслова и др., 1996; Таран, 1999; Navari-Izzo et al., 1990; Sharma, Hall, 1992; Stuhlfauth et al., 1990). Сумарна концентрація пігментів ВЦ значно менша в сім’ядольних листках тих рослин, які вирощені на поживних сумішах з ацетатом свинцю порівняно з обома контролями. Співвідношення між зеаксантином, антераксантином та віолаксантином у сім’ядольних листках відрізняються за варіантами (рис. 3). На 10-8 М Pb2+ найбільша доля віолаксантину порівняно з іншими варіантами, а на 10-3 М Pb2+ - зеаксантина. Очевидно, це відображає реакцію організму на дію стресора – іонів свинцю і тісно пов’язана з доступністю й величиною пулу аскорбінової кислоти (Muller-Moule et al., 2002) . За наявності в поживному розчині іонів свинцю та селеніту вміст пігментів вищий за контролі (табл. 3). Щодо варіантів з моносольовим розчином ацетату свинцю, то за одночасної наявності іонів свинцю та селеніту вміст пігментів ВЦ на 4-18% більший. Величина віолаксантинового пула в сім’ядольних листках зростає з віком рослин. Проведені експерименти свідчать, що іони свинцю неоднаково діють на різні групи пігментів. Рис. 3. Співвідношення пігментів віолаксантинового циклу в сім’ядольних листках 12-добового соняшника. Варіанти досліду: 1- Н2О; 2 - Розчин Кнопа; 3 - 10-8 М Pb(CH3COO)2; 4 - 10-5 М Pb(CH3COO)2; 5 - 10-3 М Pb(CH3COO)2. Пристосування до високої концентрації полютанта повною мірою не відбувається – протягом 10-16 днів росту на 10-3 М ацетаті свинцю рослини гинуть, на 10-5 М ацетаті свинцю термін загибелі дещо пролонгується і лише на 10-8 М ацетаті свинцю вони живуть і розвиваються. Таблиця 3 Концентрація віолаксантинового пула (віолаксантин+ антераксантин + зеаксантин) у сім’ядольних листках соняшника, вирощеного на поживних середовищах з різною концентрацією свинцю та селеніту, мкг ( г-1 маси сирої речовини (M±m, n=6) Варіант досліду 5 діб 7 діб 12 діб Н2О 0,9 ( 0,30 1,2 ( 0,43 1,8 ( 0,66 Розчин Кнопа 1,0 ( 0,36 1,0 ( 0,41 1,8 ( 0,76 10-8 М Pb2+ + 10-9 М SeO32- 1,5 ( 0,46 1,7 ( 0,66 1,9 ( 0,64 10-5 М Pb2+ + 10-9 М SeO32- 1,2 ( 0,50 * 1,5 ( 0,53 1,6 ( 0,62 10-3 М Pb2+ + 10-9 М SeO32- 1,1 ( 0,44 2,7 ( 0,47 * 1,4 ( 0,51 10-9 М SeO32- 0,9 ( 0,33 1,3 ( 0,48 1,9 ( 0,69 * різниця з контролем (Н2О) вірогідна, Р < 0,05 Наочним симптомом негативного впливу іонів свинцю на рослини є інгібування ростової активності. Це може бути зумовлене як прямою дією іонів свинцю, так і вторинними процесами, які пов’язані з роботою електронтранспортної системи або порушеннями, спричиненими змінами водного балансу (Barcelo, Poschenrieder 1990; Van Assche, Clijsters 1985; Kachabova, Natr 1986). Водний статус рослин унаслідок дії іонів свинцю та модифікація селеном і абсцизовою кислотою цієї дії. Щоб виявити дію металу на водний статус рослин вивчали відносний в міст води (ВВВ) та водний потенціал (ВП) органів рослин унаслідок дії іонів свинцю. Виявлено, що за наявності в поживному розчині іонів свинцю ВВВ проростаючої насінини соняшника більший, ніж за проростання її на дистильованій воді. Однак в цьому випадку встановлено, що одночасна наявність іонів свинцю та селеніту призводить до деякого зниження ВВВ. Серед частин насінини найвищий ВВВ в коренях проростків, які проростали на 10-8 М Pb(CH3COO)2 , а в сім’ядолях - на найнижчій із застосованих концентрацій свинцю. У порівнянні з контролем це становить понад 30 та 18 %, відповідно (Р<0,05). На думку більшості дослідників, у рослин з рівнем транспірації нормальних умов ВВВ листків повинен бути в межах від 85% до 95%. Якщо ВВВ нижче критичного значення, тканини починають відмирати, хоча потрібно зазначити, що критичне значення різне для різних видів тканин і рослин. Ми виявили, що на 10-3 М Pb(CH3COO)2 у тридобової квасолі ВВВ на рівні 71-74% і знижується до 33,3% у 12 добових рослин, а також спостерігали некроз кінчика кореня при цьому (Воробец, Мыкиевич, 1999), справжні листки не розвивались у 12-добових рослин узагалі. Отже, дія іонів свинцю супроводжується водним стресом. Водний потенціал тканин кореня, гіпокотиля та сім’ядолей проростаючого соняшника становить – 0,75 … -1,24 МПа і перебуває в тих межах, які не перешкоджають насінині проростати. Додавання до розчинів з високим умістом іонів свинцю абсцизової кислоти підвищувало ВВВ та ВП органів квасолі, однак не до рівня контрольних рослин. У контрольних рослин та тих, які вирощені на 10-8 М Pb2+, високий водний потенціал в усіх органів, який підвищувався екзогенно доданою абсцизовою кислотою. 6 ` d d d B D I r 6 d d 7uuuuuuuouooouuuueoTHTHUII d d d d d d 7?9e9<[email protected]>DtE
F?H2I|JL–L(NpOoQnS~UAVOWOeXjZ?]ue_ooooooooooooooooooooooooooo

d

YI§¬?I©°®c±T?iiaaUUOUUCCUUCC3/4???

d

d

`„Ae

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

[email protected]/4¶CcEYQQEEEE

d

d

d

d

d

d

^„Ae

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

3/4

A

?

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

d

6teridge 1989; Storz et al., 1987; Wolff et al., 1986). В результаті
зростання рівня АФК виникає оксидативний стрес. Тому постійне утворення
АФК в живих організмах урівноважується наявним захистом і їх
дезактивацією антиоксидантами, що дозволяє утримувати АФК на певному
базальному рівні й усувати пошкодження клітин. Для підтримання
гомеостазу потрібна неперервна регенерація антиоксидативної здатності.
Виживання і ріст рослин в умовах свинцевого навантаження може бути
результатом роботи ферментів, які перетворюють пероксид водню, пероксиди
жирних кислот та фосфоліпідів, що при цьому утворюються, до нетоксичних
сполук та наявності низькомолекулярних антиоксидантів. Те, що в органах
тридобових рослин великих кількостей Н2О2 не накопичується, може бути
результатом роботи ферментів їх усунення. Ми показали, що активність
пероксидази в зародкових осях у 4-5 разів вища, ніж у сім’ядолях (рис.
4). Найнижча вона і в зародкових осях, і в сім’ядолях при проростанні
насіння на воді. На інших варіантах досліду активність пероксидази в
сім’ядолях в 4-5 разів вища, ніж на воді, але за значеннями
відрізняється мало. Активність пероксидази в зародкових осях варіанта
10-8 М Pb2+ найнижча, а додавання в розчин 10-9 М SeO32- підвищує
активність на 53%. Селеніт підвищує активність пероксидази на розчині
10-8 М Pb2+ на 28% (Р<0,05). Рис. 4. Активність пероксидази в зародкових осях та сім’ядолях квасолі при проростанні за дії різних концентрацій ацетату свинцю та селеніту натрію. Варіанти досліду: 1 – Н2О; 2 – розчин Кнопа; 3 – 10-8 М ацетат свинцю; 4 – 10-3 М ацетат свинцю; 5 – 10-9 М селеніт натрію; 6 - 10-8 М ацетат свинцю + 10-9 М селеніт натрію; 7 - 10-3 М ацетат свинцю+ 10-9 М селеніт натрію. Відомо, що рівень пероксиду водню може бути сигналом, який індукує антиоксидантні ферменти, зокрема каталазу, що захищає рослину від надлишку продукованого пероксиду при стресі (Prasad et al., 1994). Активність каталази виявляється і в зародкових осях, і в сім’ядолях тридобової квасолі при вирощуванні на шести із семи поживних розчинах, які ми застосовували (рис. 5). При вирощуванні на поживному розчині з 10-3 М ацетат свинцю активність каталази в зародкових осях більш як удвічі менша, ніж у сім’ядолях. Ми виявили високу активність каталази в зародкових осях, пророщуючи насіння на 10-8 М ацетаті свинцю та на 10-9 М селеніті натрію, та ще утричі вища на розчинах цих двох солей одночасно. На 10-3 М ацетаті свинцю активність каталази в зародкових осях була значно меншою, а в сім’ядолях – більшою порівняно щодо з обома контролями. Рис. 5. Активність каталази в зародкових осях та сім’ядолях квасолі при проростанні за дії різних концентрацій ацетату свинцю та селеніту натрію. Варіанти досліду: 1 – Н2О; 2 – розчин Кнопа; 3 – 10-8 М ацетат свинцю; 4 – 10-3 М ацетат свинцю; 5 – 10-9 М селеніт натрію; 6 - 10-8 М ацетат свинцю + 10-9 М селеніт натрію; 7 - 10-3 М ацетат свинцю + 10-9 М селеніт натрію. За даної концентрації іонів свинцю застосування іонів селену привело до повного інгібування активності - при вирощуванні квасолі на розчині 10-3 М ацетат свинцю + 10-9 М селеніт натрію активності каталази ні в зародкових осях, ні в сім’ядолях ми не виявили. Очевидно, за дії іонів свинцю утворюється значна кількість АФК і каталаза бере участь у їх перетворенні. Селеніт активує каталазу за невеликої концентрації іонів свинцю, велика концентрація іонів свинцю інгібує активність каталази. Прямої залежності між активністю пероксидази та концентрацією пероксиду водню в коренях соняшника не спостерігалось. За наявності в розчині одночасно з 10-3М Pb(CH3COO)2 іонів селеніту активність пероксидази у тридобових рослин зростала, однак була значно нижчою, ніж у восьмидобових рослин. Процес лігніфікації клітинних стінок, принаймні частково, є пероксидаза/Н2О2 – залежним процесом (RosBarcelo, 1999) , а механізми захисту включають активацію антиоксидантної системи за участю пероксидази (Meksongsee, Wongkaew, 1991; Reddy, Prasad, 1992). Внесок іонозв’язаної з клітинною стінкою пероксидази в загальну її активність подано в табл. 4. Високу активність спостерігали під час проростання рослин на моносольовому розчині селеніту натрію та 10-8М Pb(CH3COO)2 +Na2SeO3 – на порядок вищу, ніж у рослин контролю. При подальшому їх рості активність ферменту в усіх варіантах досліду підвищувалась і найвищих значень досягала у варіанта 10-8М Pb(CH3COO)2, у 1,7 раз менша у варіантів з іонами свинцю та іонами свинцю разом з іонами селену. Найменша активність була у восьмидобових рослин, вирощених на моносольовому розчині селеніту натрію, хоча значних відмінностей в активності ферменту між варіантами в рослин цього віку не спостерігали. Таблиця 4 Активність пероксидази іонозв’язаної з клітинними стінками в коренях соняшника за дії іонів свинцю та впливу селеніту натрію, нмоль · (хв · г сирої маси)-1 (M±m, n=6) Варіант досліду 3 добові 8 добові Н2О 153 ± 9,1 794 ± 41,2 Розчин Кнопа 20 ± 1,8 * 929 ± 19,8 * 10-8М Pb2+ 54 ± 3,7 * 1281 ± 24,5 * 10-3М Pb2+ 199 ± 6,9 * 749 ± 47,2 10-8М SeO32- 1688 ± 51,2 * 659 ± 48,0 * 10-8М Pb2+ + SeO32- 939 ± 28,7 * 541 ± 44,6 * 10-3М Pb2+ + SeO32- 54 ± 2,7 * 884 ± 35,7 * * різниця з контролем (Н2О) вірогідна, Р < 0,05 Вміст відновленого глутатіону та активність ферментів його метаболізму у квасолі та соняшника за дії іонів свинцю. Ми показали, що концентрація відновленого глутатіону в зародкових осях та в сім’ядолях тридобової квасолі суттєво відрізняється залежно від варіанта досліду (табл. 5). Вищу концентрацію відновленого глутатіону ми спостерігали в сім’ядолях порівняно із зародковими осями в усіх варіантах досліду. При проростанні на воді вміст відновленого глутатіону в зародкових осях вдвічі менший, ніж у сім’ядолях, на розчині Кнопа він дещо вищий, хоча співвідношення між зародковими осями та сім’ядолями таке ж саме. На розчинах зі свинцем високої концентрації (10-3 М) вміст глутатіону подібний до того, що на розчині Кнопа, співвідношення між зародковою віссю та сім’ядолями також. На низькій концентрації свинцю (10-8 М) вміст глутатіону в зародкових осях втричі, а в сім’ядолях удвічі менший, ніж на розчині Кнопа. Найменший вміст глутатіону в зародкових осях насіння, яке пророщували на 10-9 М селеніті, – у 7 разів порівняно з тим, що на розчині Кнопа, хоча в сім’ядолях менший лише в 1,3 раза (Р<0,05). Відмінності вмісту відновленого глутатіону в частинах насінини при проростанні на різних поживних розчинах можуть бути пов’язані з різною інтенсивністю використання, а також зі змінами активності ферментів його синтезу. Зростання активності ГП в зародкових осях квасолі під дією 10-9 М селеніту натрію супроводжується вичерпуванням пулу відновленого глутатіону. При сумісному впливі на проростаюче насіння іонів свинцю та селену активність глутатіонпероксидази вища від контролів та варіантів з моносольовими розчинами ацетату свинцю в зародкових осях, але нижча у сім’ядолях. Одночасно пул відновленого глутатіону у зародкових осях та сім’ядолях залишається високим. Таблиця 5 Концентрація відновленого глутатіону в зародкових осях та сім’ядолях тридобової квасолі, мкг · г-1 маси сухої речовини (M±m, n=6) Варіант досліду Н2О Розчин Кнопа 10-8 М Pb2+ 10-3 М Pb2+ 10-9 М SeO32- 10-8 М Pb2+ + 10-9 М SeO32- 10-3 М Pb2+ + 10-9 М SeO32- Зародкова вісь 52 ( 1,0 72 ( 2,0 * 24 ( 1,0 * 78 ( 2,0 * 10 ( 1,0 * 64 ( 3,0 * 72 ( 3,0 * Сім’ядолі 106 ( 8,0 138 ( 7,0 * 67 ( 5,0 * 110 ( 7,0 100 ( 7,0 186 ( 9,0 * 96 ( 1,0 * різниця з контролем (Н2О) вірогідна, Р < 0,05 Результати вивчення активності ГП у 5-16-добових проростків квасолі показали, що вона зростає в рослин контрольних і дослідних варіантів з ростом рослин. Найвища активність фермента в органах тих рослин, які росли на 10-8 М ацетаті свинцю. Активність зростає на порядок від п’ятої до восьмої доби росту. Активність ГП в органах рослин, які росли на високій концентрації іонів свинцю, найнижча. Дані за результатами впливу різних концентрацій ацетату свинцю на активність глутатіонпероксидази 5-, 8- і 12-добових проростків соняшника свідчать, що в період від п’ятої до восьмої доби росту рослин у коренях активність ферменту зростала вдвічі (рис. 6). Подібна закономірність зберігалась і в пагонах, де активність ферменту зростала в 3 рази. У коренях і в пагонах восьмидобових рослин активність ГП мала найвище значення. При вирощуванні рослин на всіх застосованих концентраціях ацетату свинцю активність ГП в коренях 5-ти та 8-ми добових рослин була у 2-3 рази вищою від контролю, однак у 12-ти добових рослин активність ферменту знижувалась до мінімальних значень. Отже, найбільшу активність фермент має в період проростання та початкового росту рослин за свинцевого стресу. Наведені дані узгоджуються з одержаними нами для квасолі. Глутатіон бере участь у регенерації відновленої аскорбінової кислоти, яке каталізується дегідроаскорбатредуктазою (ДГАР). Якщо аскорбат окиснюється до дегідроаскорбінової кислоти (ДГАК), можна було б очікувати вичерпування пулу глутатіону та підвищення активності глутатіонредуктази (ГР). У квасолі та соняшника досліджуваних варіантів виявлено високу активність ГР в органах контрольних рослин. Рис. 6. Глутатіонпероксидазна активність у коренях соняшника під дією ацетату свинцю Найвища активність ферменту в коренях і пагонах тих рослин, яких вирощували на 10-8 М ацетаті свинцю (рис. 7). На високій концентрації ацетату свинцю в поживному розчині активність ферменту визначалась у зазначений період досліджень, однак була значно нижчою, ніж у рослин в інших варіантів. Рис. 7. Глутатіонредуктазна активність у коренях і пагонах соняшника, вирощеного на різних концентраціях свинцю. Варіанти досліду: 1 –Н2О; 2 - розчин Кнопа; 3 – 10-8 М Pb2+; 4 – 10-3 М Pb2+ Це свідчить, що низькі концентрації іонів свинцю в поживному розчині, які, як ми показали, проникають у рослини, спричиняють пошкодження самого ферменту. Загалом у соняшника і квасолі спостерігали подібні закономірності змін активності ГР, хоча в соняшника активність була нижчою. У 16-добових рослин соняшника активності ГР не виявленао. Щоб з’ясувати рівень використання відновленого глутатіону іншим шляхом, ми вивчили активність глутатіон-S-трансферази (ГТ) в зародкових осях та сім’ядолях тридобової квасолі, вирощуючи її на розчинах зі свинцем. Виявлено, що зародкові осі та сім’ядолі контрольних варіантів мали найнижчу активність ГТ, варіантів зі свинцем обох застосованих концентрацій – удвічі вищу (рис. 8). Найвищу активність ГТ спостерігали в зародкових осях варіанта, де насіння пророщували на 10-8 М Pb2+ + 10-9 М SeO32-. Підвищення рівня активності ферменту на поживному розчині з високою концентрацією іонів свинцю разом із селенітом було незначним. Наявність у поживному розчині АБК разом з іонами свинцю також підвищувало активність ГТ. У цьому випадку активність була значно вищою за наявності високого вмісту іонів свинцю. На розчинах з АБК також спостерігали підвищення активності ГТ, особливо в сім’ядолях. Вивчення активності ГТ в частинах проростаючого насіння соняшника показало, що в сім’ядолях контрольних варіантів вона найвища і такого самого рівня в зародкових осях при проростанні на 10-3 М Pb2+. У 8- та 16-добових проростках ГТ найбільш активна в пагонах усіх варіантів досліду. Рис. 8. Глутатіон-S-трансферазна активність зародкових осей та сім’ядолей тридобової квасолі та вплив АБК. Варіанти досліду: 1- H2O; 2 – розчин Кнопа; 3 – 10-8 M Pb2+; 4 - 10-3 M Pb2+; 5 - 10-9 M SeO32-; 6 - 10-8 M Pb2+ +10-9 M SeO32-; 7 - 10-3 M Pb2+ +10-9 M SeO32-; 8 - 10-8 M Pb2+ + 10-10 M AБК; 9 - 10-3 M Pb2+ + 10-10 M AБК; 10 - 10-10 M AБК. Вміст аскорбінової кислоти та продуктів її метаболізму в рослинах за дії іонів свинцю. Активність ферментів аскорбатного циклу. Результати проведених досліджень з визначення вмісту аскорбату в сухому насінні квасолі та соняшника показали, що в сухому насінні соняшника аскорбат був відсутнім, проте він виявився в зародкових осях та сім’ядолях квасолі. І в сухому насінні соняшника, і в сухому насінні квасолі наявна дегідроаскорбінова кислота. У проростаючому насінні обох досліджуваних видів доволі високий вміст аскорбату. Очевидно, відсутність аскорбату в сухому насінні соняшника призводить до більш негативної дії високих доз іонів свинцю в поживному розчині на проростання та приріст біомаси порівняно з квасолею, як ми показали. У тридобових рослин квасолі індекс толерантності доволі високий при вирощуванні і на 10-8 М, і на 10-3 М розчині ацетату свинцю (Воробець, Микієвич, 2001). Свіжо зібране насіння квасолі перебуває в неглибокому спокої, з якого виходить у процесі сухого зберігання (Bewley, Black, 1982) , тобто є рекальцитрантним (за термінологією Tommasi, 1999). Здатність насіння квасолі краще проростати порівняно з насінням соняшника за наявності іонів свинцю в поживному розчині, очевидно, пов’язана з належністю квасолі до групи „рекальцитрантів” (Tommasi et al., 1999), насіння яких перебуває в неглибокому спокої (Bewley, Black 1982), а соняшника - до групи „ортодоксальних” рослин, у яких аскорбат у сухому насінні не нагромаджується (Таран 1956). Ми виявили високу активність аскорбатпероксидази у проростаючих та запасаючих частинах насіння квасолі і соняшника. Так, у насіння квасолі, яке проростає на воді та розчині Кнопа, активність АскП в зародкових осях у кілька разів вища, ніж у сім’ядолях, а при проростанні на розчинах зі свинцем активність у кілька разів вища як в зародкових осях, так і в сім’ядолях порівняно з контрольними варіантами. При проростанні на розчинах зі свинцем активність АспП в 2- 2,5 раза вища, ніж у контрольних варіантів. Отже, насіння соняшника та квасолі проростає за наявності в поживному розчині іонів свинцю різної концентрації. Це можливо завдяки достатньо високому пулу відновленого глутатіону та аскорбату, які утворюються внаслідок активності низки ферментів. Однак можливість проростання насіння ще не забезпечує рослині подальший ріст і розвиток, якщо дія токсиканта не припиняється. Проникнення великої кількості іонів свинцю в зародкові осі та сім’ядолі спричиняє незворотні зміни метаболізму. Зародкові осі та сім’ядолі тридобових рослин соняшника містять аскорбат, однак його вміст значно нижчий, ніж у квасолі. Незважаючи на високу активнсть АскП, як в зародкових осях, так і в сім’ядолях соняшника та квасолі з ростом рослин вона знижується на 10-3 М Pb2+, особливо в коренях соняшника, і не забезпечує подальшого виживання рослин. Під дією іонів свинцю в органах рослин змінюється вміст аскорбінової кислоти та співвідношення її до дегідроаскорбінової й дикетогулонової кислот у соняшника та квасолі протягом 7-12 діб росту навіть в тому випадку, коли вони пересаджені на свинецьвмісні розчини у віці трьох діб (II варіант досліду). Найнижчі рівні всіх трьох кислот у коренях і пагонах семидобових рослин контрольних варіантів, а також рослин, які пересаджені на 10-8 М ацетат свинцю. На 10-3 М ацетаті свинцю в коренях і пагонах рослин рівні всіх кислот значно вищі. Важливо, що з підвищенням вмісту АскК зростає вміст ДГАК та ДКГК. У 12-добових рослин найвищий вміст суми досліджуваних кислот також на 10-3 М ацетаті свинцю в коренях і пагонах. Виявлено, що вміст АскК в коренях і пагонах досить високий і приблизно однаковий у 7- та 12-добових рослин. Проте від сьомої до дванадцятої доби вирощування спостерігається високий вміст ДГАК та ДКГК. На середовищі з високою концентрацією іонів свинцю (10-3 М) концентрація АскК була значно вищою, ніж на середовищі з низькою (10-8 М). Відзначене підвищення концентрації АФК в рослинах, які росли на свинецьвмісних субстратах з одночасним підвищенням умісту ДГАК, очевидно, також є відображенням участі аскорбатної системи у протистоянні їх дії. З огляду на це метою наступного дослідження було вивчити, як різна кількість іонів свинцю, який надходять у рослину соняшника з поживного розчину, впливає на активність аскорбатпероксидази (АскП) та монодегідроаскорбатредуктазу (МДГАР) у її органах і чи змінює селеніт їх активність. У рослин, які росли на 10-3 М концентрації ацетату свинцю, де активність АскП менш висока, спостерігається і нижча ростова активність. Висока активність АскП в пагонах рослин дає змогу їм ще деякий час протистояти дії високих концентрацій іонів свинцю. Сумісна дія іонів свинцю 10-8- 10-5 М з іонами селеніту спричинила до підвищення активності АскП і в коренях, і в пагонах, хоча на моносольовому розчині селеніту такого не спостерігалося. Значне зменшення активності ферменту було в коренях рослин, які вирощувались на 10-3 М ацетаті свинцю + 10-8 М селеніті натрію протягом 4 діб – у 1,6 раза, а в пагонах лише в 1,4 раза. У період, протягом якого ми проводили дослідження, значення активності МДГАР в органах рослин, які і в подальшому нормально росли і розвивались, не набагато вищі від тих, що в рослин варіантів, які в подальшому загинули. Щоб виявити, чи відбувається перетворення ДГАК в АскК за участю ДГАР, вивчили активність ферменту (табл. 6). Активність ДГАР в зародкових осях 3-добової квасолі набагато вища, ніж у соняшника. Підвищення активності в 5-6 разів спостерігається при проростанні насіння квасолі на поживних розчинах з іонами свинцю. За подібних умов вирощування соняшника такого значного підвищення активності ДГАК в нього не спостерігалось. Можливо, висока активність ДГАР в перші доби проростання також є особливістю насіння “ортодоксальних” видів. Результати свідчать, що і в період початкового росту активність ДГАР доволі висока. Таблиця 6 Активність дегідроаскорбатредуктази в зародкових осях тридобових рослин, нмоль дегідроаскорбінової кислоти ( (хв ( г маси сирої речовини)-1 (M±m, n=6) Варіант досліду H2O Розчин Кнопа 10-8 M Pb2+ 10-3 M Pb2+ Квасоля 10,6 ( 2,1 15,0 ( 3,5 65,1 ( 9,5 * 51,0 ( 6,6 * Соняшник 2,6 ( 0,6 4,0 ( 0,8 * 5,5 ( 0,6 * 4,8 ( 0,8 * * різниця з контролем (Н2О) вірогідна, Р < 0,05 Виявлена найвища активність АскО в зародкових осях квасолі та соняшника при проростанні їх на воді менша на розчині Кнопа і ще менша на розчині зі свинцем. Низька активність ферменту в зародкових осях квасолі та соняшника спостерігалась при більшому вмісті в них АскО. Подібні закономірності виявили інші автори в зародкових осях гороху (Pallanca, Smirnoff, 2000). Таким чином, ми встановили, що за умов дії на рослини іонів свинцю в них змінюється активність ферментів азотного обміну, концентрація фотосинтетичних пігментів, у тому числі пігментів віолаксантинового циклу. Активність аскорбат-глутатіонової антиоксидантної системи стимулюється низькими концентраціями Pb2+ та інгібується високими, а низькі концентрації селеніту та абсцизової кислоти сприяють антиоксидантному захисту рослин. Висновки: У дисертації подано теоретичне узагальнення й нове розв’язання наукової проблеми, що виявляється в з’ясуванні біохімічних механізмів формування стійкості рослин до дії іонів свинцю за участю аскорбат-глутатіонової системи та пошуку ефективних екзогенних чинників для корекції виявлених порушень. Установлено, що під дією іонів свинцю на рослини в їх органах відбувається порушення фізіологічних і біохімічних процесів, яке проявляється передусім у підвищенні концентрації продуктів ПОЛ та пероксиду водню. Гістохімічне дослідження розподілу дитізонатів у квасолі і соняшника показало, що іони свинцю проникають й починають нагромаджуватись у клітинах соняшника та квасолі від першої доби вирощування. Клітинна стінка клітин протодерми, ендодерми та лігніфікованих клітин є бар’єром для пересування іонів свинцю за наявності його в поживному середовищі в концентрації 10-8 - 10-5 М, клітини камбію та перициклу залишаються вільними. У поживному середовищі з іонами свинцю у концентрації 10-3 М іони проникають у всі зони та тканини кореня. Іони селеніту (10-8 М), за наявності їх у поживному розчині, сприяють зменшенню рівня ПОЛ та пероксиду водню, кількості відкладених дитізонатів. Іони селеніту в моносольовому розчині та разом з іонами свинцю позитивно впливають на проростання й початковий ріст соняшника і квасолі, активуючи ферменти антиоксидантного захисту. Починаючи від першої доби пророщування насіння соняшника на розчинах ацетату свинцю (10-3 М) іони свинцю проникають до зародкової частини, під час росту в коренях проявляються ознаки деструкції внутрішньої частини осьового циліндра – клітини лізовані, проте паренхіма кори та ендодерма без змін. Хід диференціювання клітин та лігніфікації в рослин соняшника, які проростають і ростуть на розчині 10-8 М ацетату свинцю, не порушений. Лігніфікація клітин ендодерми може обмежувати пересування свинцю симпластом. У квасолі на розчині ацетату свинцю (10-8 М) вже через одну добу проростання виявляється лігнін у покривній тканині, окремих клітинах паренхіми та метаксилеми; на розчині ацетату свинцю високої концентрації (10-3 М) лігнін виявлявся у клітинах ендодерми, паренхіми та метаксилеми. Абсцизова кислота в поживному розчині разом з іонами свинцю не перешкоджає його накопиченню органами квасолі, проте сприяє адаптації рослин до дії іонів свинцю. Це проявляється у збільшенні ростової активності коренів і пагонів, підвищенні активності ферментів асиміляції аміаку. Сумарна концентрація пігментів віолаксантинового циклу менша в сім’ядольних листках тих рослин, які вирощуються на поживних розчинах зі свинцем. На 10-8 М концентрації іонів свинцю найбільша частка віолаксантину, а на 10-3 М – зеаксантину. Іони селеніту збільшують величину віолаксантинового пула в рослин, вирощених на 10-3 М ацетаті свинцю. Під дією іонів свинцю (10-3 М) порушується водний статус коренів, гіпокотилів та листків рослин – зменшується відносний вміст води та водний потенціал. Абсцизова кислота, додана до поживного розчину з іонами свинцю, сприяє відновленню водного статусу, однак на 10-3 М ацетаті свинцю він не досягає оптимальних значень для росту та розвитку. При проростанні рослин на поживних розчинах з ацетатом свинцю інтенсивно використовується відновлений глутатіон, вміст якого в зародкових осях насіння, яке проростає на низькій концентрації іонів свинцю (10-8 М) у поживному розчині, у кілька разів нижчий, ніж за проростання на високій його концентрації (10-3 М). Збільшений пул відноаленого глутатіону в сім’ядолях при додаванні до поживного розчину зі свинцем (10-8 М) селеніту (10-9 М) сприяє нормалізації метаболізму в зародковій осі та проходженню рослинами наступних фаз онтогенезу. Висока активність глутатіонпероксидази та глутатіон-S-трансферази в зародкових осях, яка спостерігається під дією іонів свинцю, сприяє проростанню та початковому росту рослин. Селеніт натрію (10-9 М) активує глутіонпероксидазу та глутатіон- S-трансферазу рослин унаслідок дії на них іонів свинцю. Здатність насіння квасолі порівняно з насінням соняшника краще проростати за наявності іонів свинцю пов’язана з належністю квасолі до групи “рекальцитрантів”, насіння яких перебуває в неглибокому спокої і має базовий пул аскорбінової кислоти, а соняшника - до групи рослин з “ортодоксальним” насінням, яке має глибокий спокій і не має базового пулу аскорбату. Виявлено високу активність аскорбатпероксидази та монодегідроаскорбатредуктази в органах квасолі та соняшника за проростання та початкового росту в умовах свинцевого стресу. З ростом рослин на середовищі з великим вмістом іонів свинцю (10-3 М) активність ферментів у коренях знижується настільки, що не забезпечує подальшого використання аскорбінової кислоти та відновлення її достатнього пулу. Список публікацій за темою дисертації Воробець Н.М. Активність ферментів азотного обміну в зародковій осі квасолі при набряканні // Укр. ботан. журн. – 1989. – Т.46, №6 – С. 68-70. Воробець Н.М. Активність аспартат- та аланін амінотрансфераз у соняшника за дії різних доз свинцю // Физиол. и биохим. культ. раст. - 2002. – Т.34, № 2. – С. 147-151. Воробець Н.М., Пацула О.І. Функціонування ферментів глутатіонового циклу в насінні квасолі при проростанні за дії іонів свинцю та селену // Физиол. и биохим. культ. раст. - 2002. – Т.34, № 4. – С. 326-332. (Дисертантові належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, участь у виконанні експериментальних робіт, аналіз результатів, формулювання висновків та написання статті). Воробець Н.М. Взаємозв’язок між пероксидом водню та пероксидазною активністю коренів рослин // Вісник проблем біол. та мед. – 2003. - № 6. – С. 8-12. Воробець Н.М., Григорюк І.П. Водний статус насіння соняшника при проростанні за наявності іонів свинцю у поживному розчині // Доповіді НАН України. - 2003 - №8. – С.156-158. (Дисертантові належить виконання експериментальних робіт, участь в аналізі результатів, формулювання висновків та написання статті). Воробець Н.М. Вплив свинцю на активність деяких амінотрансфераз у проростках рослин // Вісник проблем біол. та мед. – 2003. - № 7/8. – С. 50-53. Воробець Н.М., Григорюк І.П. Роль абсцизової кислоти у регуляції водного режиму квасолі за дії іонів свинцю // Доповіді НАН України. – 2004. – № 1. – С. 18-21. (Дисертантові належить виконання експериментальних робіт, участь в аналізі результатів, формулювання висновків та написання статті). Воробець Н.М., Григорюк І.П. Формування і функціонування пігментного апарату проростків квасолі за стресової дії свинцю // Физиол. и биохим. культ. раст. - 2004. – Т.36, № 1. – С. 43-47. (Дисертантові належить виконання експериментальних робіт, участь в аналізі результатів, формулювання висновків та написання статті). Воробець Н.М., Микієвич І.М., Романюк Н.Д., Терек О.І. Нагромадження свинцю рослинами соняшника та квасолі залежно від його вмісту в поживному розчині // Вісник Ужгородського держ. ун-ту. Серія біол. – 2000. - №8. – С. 65-68. (Дисертантові належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, підготовка зразків для аналізу, аналіз результатів, формулювання висновків та написання статті). Воробець Н.М., Микієвич І.М. Сумісна дія свинцю і селену на проростання та ріст соняшника // Вісник Львів. ун-ту. Серія біол. - 2000. - Вип. 26. - С. 159-165. (Дисертантові належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, участь у виконанні експериментальних робіт, аналіз результатів, формулювання висновків та написання статті). Воробець Н.М. Вплив абсцизової кислоти на активність ферментів антиоксидантного захисту у насінні квасолі при проростанні за дії різних концентрацій іонів свинцю // Науковий вісник УжНУ. Серія біол. - 2001. - №9. – С. 316-319. Воробець Н.М., Микієвич І.М. Фізіологічна оцінка стійкості рослин квасолі до дії свинцю // Науковий вісник Львівської держ. академії ветеринарної медицини. – 2001. – Т. 3, №1. – С. 3-6. (Дисертантові належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, виконання експериментальних робіт, аналіз результатів, формулювання висновків та написання статті). Воробець Н.М., Микієвич І.М. Вміст аскорбінової, дегідроаскорбінової, дикетогулонової кислот у проростках соняшника за дії іонів свинцю // Вісник Львів. ун-ту. Серія біол. – 2001. – Вип.27. – С. 244-252. (Дисертантові належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, участь у виконанні експериментальних робіт, аналіз результатів, формулювання висновків та написання статті). Воробець Н.М. Пероксидазна активність коренів соняшника за дії іонів свинцю та селену // Наукові записки Тернопільського педун-ту. Серія біол. – 2002. – № 3 (18). – С. 148-153. Воробець Н.М., Мусієнко М.М. Інтоксикація ґрунтів сполуками свинцю та їх фіторемедіація // Науковий вісник Національного аграрного ун-ту. – 2002. – Т.58. - С. 202-216. (Дисертантові належить опрацювання даних літератури і власних результатів, участь в аналізі і написання статті). Воробець Н.М., Брайон О.В., Мусієнко М.М. Ефекти різних доз свинцю на лігніфікацію клітинних стінок у проростків соняшника // Науковий вісник УжНУ. Серія біол. - 2002. - № 11. – С. 72-74. (Дисертантові належить виконання експериментальних робіт, участь в аналізі результатів, формулюванні висновків та написання статті). Воробець Н.М. Пігментний апарат проростків соняшника за дії різних доз свинцю // Науковий вісник УжНУ. Серія біол. - 2003. - №12. – С. 69-73. Воробець Н.М. Функціонування аскорбатпероксидази та вміст аскорбінової і дегідроаскорбінової кислот у проростаючого насіння соняшника та квасолі за дії різних доз свинцю // Науковий вісник УжНУ. Серія біол. - 2003. - Вип.13. – С. 53-56. Воробець Н.М. Пігменти віолаксантинового циклу проростків соняшника за дії різних доз іонів свинцю та селену // Науковий вісник Київського нац. ун-ту імені Т.Шевченка. - 2003. – Вип. 39. – С.33-35. Воробець Н.М., Микієвич І.М. Функціонування аскорбатпероксидази та монодегідроаскорбатоксидази у проростків соняшника за дії надлишкових кількостей свинцю // Наукові записки. Тернопільський педун-т. Серія біол. – 2003. – № 1 (20) – С.81-86. (Дисертант є автором ідеї, покладеної в основу статті, їй належить аналіз результатів, формулювання висновків та написання статті). Воробець Н.М. Утворення малонового діальдегіду та пероксиду водню при вирощуванні соняшника на поживних середовищах з різною концентрацією іонів свинцю // Науковий вісник Чернівецького нац. ун-ту. - 2004. – Вип. 194. – С. 9-15. Микієвич І.М., Воробець Н.М., Калинович Н.О. Локалізація свинцю у тканинах кореня соняшника і модифікація селеном його токсичної дії // Актуальні проблеми медицини, біології, ветеринарії і сільського господарства. Серія мед. і біол. -2001. – Вип.5. – С. 77-81. (Дисертантові належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, виконання експериментальних робіт, аналіз результатів та написання статті). Vorobets N., Mykiyevich I. Single and combined effects of lead and selenium on sunflower seedlings // Scientific works. Horticulture and vegetable growing. - 2000. - V. 19, N3. – P. 390-395. (Дисертантові належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, участь у виконанні експериментальних робіт, аналіз результатів, формулювання висновків та написання статті). Пацула О.І., Воробець Н.М. Реакція соняшника на дію свинцю за участю глутатіонпероксидази // Наукові основи збереження біотичної різноманітності. - 2001. - Вип.3. – С. 150-155. (Дисертантові належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, участь у виконанні експериментальних робіт, аналіз результатів, формулювання висновків та написання статті). Воробець Н.М. Активність ключових ферментів асиміляції аміаку у рослин квасолі на перших етапах росту за дії свинцю // Онтогенез рослин, біологічна фіксація молекулярного азоту та азотний метаболізм рослин. Матеріали Міжнародної наукової конференції. - Тернопіль, 2001. - С. 150-153. Пацула О.І., Воробець Н.М. Участь каталази у механізмах захисту рослин до дії свинцю // Ведення лісового і садово-паркового господарства та охорона довкілля. Матеріали 53-ої науково-технічної конференції студентів та аспірантів УкрДЛТУ. - Львів, 2001. - С. 81-85. (Дисертантові належить ідея, покладена в основу статті, опрацювання робочої схеми експерименту, участь у виконанні експериментальних робіт, аналіз результатів, формулювання висновків та написання статті). Воробець, Н.М., Шидловська І.Я., Підковко Н.О., Микієвич І.М., Терек О.І. Вплив різних концентрацій ацетату свинцю на вміст білків у різних видів рослин на ранніх етапах онтогенезу // Онтогенез рослин в природному та трансформованому середовищі. Львів: Cполом, 1998. - С. 194-195. Воробець Н.М., Микієвич І.М. Аскорбінова кислота в органах квасолі при дії на рослини свинцю // Матеріали I Всеукраїнської наукової конференції Екологічний стрес і адаптація в біологічних системах. – Тернопіль: Вид-во Терноп. держ. пед. ун-ту, 1998. – С. 43-44. Воробец Н.Н., Мыкиевич И.М. Поступление свинца в растения подсолнечника и фасоли при экспонировании их на растворах ацетата свинца / Международная конференция “Физиология растений – наука 111 тысячелетия” - Москва, 1999. – С.340-341. Пацула О.И., Воробец Н.Н., Мыкиевич И.М. Формирование глутатионпероксидазной системы защиты у фасоли в условиях действия свинца // Тезисы V11 Молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге, 2000. - С.143. Воробець Н.М., Микієвич І.М., Калинович Н.О. Розподіл свинцю у органах рослин соняшника та квасолі при вирощуванні їх на різних концентраціях ацетату свинцю // Тези міжнародної конференції "Проблеми сучасної екології”. –Запоріжжя, 2000. - С.17. Воробец Н.Н. Влияние экзогенной абсцизовой кислоты на устойчивость фасоли к действию ацетата свинца // Шестая международная конференция “Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях”. – М.: Изд-во МСХА, 2001. - С.20. Воробець Н. М. Вплив абсцизової кислоти та іонів селену на активність пероксидних ферментів у рослин квасолі (Phaseolus vulgaris L.) за дії свинцю // Матеріали (I з’їзду Українського ботанічного товариства. – Харків, 2001. - С. 72-73. Микієвич І.М., Воробець Н.М. Співвідношення аскорбінової кислоти та продуктів її окиснення у рослин соняшника (Helianthus annuus L.) за дії іонів свинцю // Матеріали (I з’їзду Українського ботанічного товариства. – Харків, 2001.- С. 242-243. Воробець Н.М. Антиоксидантний захист у рослин соняшника за дії на них іонів свинцю // Укр. біохім. журнал. - 2002. - Т.74, №4б. - С. 120-121. Воробець Н.М. Утворення активних видів кисню у проростків соняшника за експозиції їх на середовищах з іонами свинцю // Тези доповідей III з’їзду Українського біофізичного товариства. – Львів, 2002. – С. 122. Воробець Н.М., Чонка І.І., Бойко Н.В., Ніколайчук В.І. Активність глутатіон- S-трансферази та вміст важких металів у рослинах квасолі, вирощеної на ґрунтах прируслових ділянок ріки Тиса Виноградівського району Закарпатської області // Матеріали IV Міжнар. наук. конф. „Промислова ботаніка: стан та перспективи розвитку” – Донецьк: ТОВ „Лебідь”, 2003. – С.98-99. Vorobets N. Lead accumulation in different organs of beans and sunflower in response to lead stress / (( International Symposium on Plant Biotechnology. – Kyiv, 1998. - P.145. Vorobets N., Kravchischin V., Terek O. Responses of higher plants GDH and GS activities to lead // 2nd Conference on progress in plant sciences. – Mosonmagyarovar, Hungary, 1998 – P. 37. Kravchischin V., Terek O., Vorobets N. Effect of lead on transaminases activities of higher plants with different types of metabolism // 2nd Conference on progress in plant sciences. – Mosonmagyarovar, Hungary, 1998 – P. 48. Vorobets N., Terek O., Kravchichin V. Responses of higher plants nitrogen metabolism enzymes to lead // Bulgarian J. Plant Physiology. The 11th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology. – Varna, Bulgaria, 1998. - P. 271. Vorobets N. Glutathione peroxidase and catalase activity responses to lead in bean and sunflower seedlings // Plant Physiology and biochemistry. 12th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology. – Budapest, 2000. - V.38. - P.181. Mykiyevich I.M, Vorobets N. The effect of lead on early stages of bean growth // Plant Physiology and biochemistry. 12th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology. – Budapest, 2000. - V.38. - P. 181. Vorobets N.M. ABA as adaptive responses mediator to lead stress during seed germination / International Symposium Intracellular Signalling in Plant and Animal Systems. Programme and Abstracts. – Kyiv, 2001. - P. 110. Vorobets N. Medium applied ABA regulation lead resistance and antioxidant enzymes activity in Phaseolus vulgaris L. seedlings // 17th International Conference on Plant Growth Substances. – Brno, Czech Republic, 2001. - P. 135. Vorobets N.M. Involvement of ABA in antioxidant defense of bean under lead influence // Fifth conference on Oxygen, free radicals and oxidative stress in plants. – Nice, France, 2001. - P. 70. Vorobets N. M. Abscisic acid increases lead tolerance in bean seedlings // 4th Parnas Conference Molecular Mechanisms of Cell Activation: Biological Signals and Their Target Enzymes. – Wroc?aw, 2002. - P. 126. АНОТАЦІЇ Воробець Н.М. Ендогенні механізми формування стійкості рослин до дії свинцю за участю аскорбат-глутатіонової системи. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича, Чернівці, 2004. Дисертація присвячена вивченню особливостей функціонування антиоксидантної системи проростків квасолі та соняшника як складової ендогенних механізмів формування стійкості рослин до дії іонів свинцю, а також можливостям екзогенної регуляції цього процесу іонами селеніту та абсцизовою кислотою. Установлено, що за умов дії на рослини іонів свинцю в них відбувається накопичення свинцю, порушення метаболічних процесів, що супроводжується збільшенням концентрації малонового діальдегіду та пероксиду водню. При цьому змінюється активність ферментів азотного обміну (глутамінсинтетази, глутаматдегідрогенази, аспартатамінотрансферази та аланінамінотрансферази), концентрація фотосинтетичних пігментів, у тому числі пігментів віолаксантинового циклу. Іони селеніту (10-9 - 10-8 М) та абсцизова кислота (10-10 М) позитивно впливають на ріст та розвиток рослин, знижують рівень пероксидного окиснення ліпідів та пероксиду водню. Абсцизова кислота не перешкоджає проникненню іонів свинцю в рослини, однак сприяє пристосуванню до їх дії. Показано, що водний статус рослин залежить від впливу на них іонів свинцю – на високих концентраціях свинцю відносний вміст води та водний потенціал в період проростання насіння перебувають у межах, які не перешкоджають проростанню, однак у подальшому знижується до рівня, недостатнього для нормального перебігу реакцій. У період проростання та початкового росту рослин низькі концентрації свинцю (10-8 М) активують антиоксидантну аскорбат-глутатіонову систему, а високі (10-3 М) – пригнічують її. При проростанні насіння на поживних розчинах зі свинцем активно використовується відновлений глутатіон, змінюється співвідношення аскорбінової, дегідроаскорбінової і дикетогулонової кислот. Імовірність проростання насіння рослин за наявності в середовищі іонів свинцю залежить і від рівня їх вимушеного спокою та наявності пулу аскорбінової кислоти. Ключові слова: свинець, антиоксидантна система, водний статус, соняшник, квасоля, віолаксантиновий цикл, адаптація, селеніт, абсцизова кислота. Воробец Н.Н. Эндогенные механизмы формирования устойчивости растений к действию свинца при участии аскорбат-глутатионовой системы. – Рукопись. Диссертация на соискание научной степени доктора биологических наук по специальности 03.00.04 – биохимия. – Черновицкий национальный университет имени Юрия Федьковича, Черновцы, 2004. Диссертация посвящена изучению функционирования антиоксидантной системы проростков фасоли и подсолнечника, как составляющих эндогенных механизмов формирования устойчивости растений к действию ионов свинца, а также возможностям эндогенного регулирования этого процесса ионами селенита и абсцизовой кислотой. Установлено, что при действии ионов свинца на растения в их органах нарушаются физиологические процессы, что проявляется прежде всего в повышении концентрации продуктов пероксидации липидов и пероксида водорода. Показано, что начиная от первых суток выращивания подсолнечника на растворах ацетата свинца (10-3 М) ионы металла проникают в зародышевую часть, по мере роста в корнях проявляются признаки деструкции внутренней части осевого цилиндра – клетки лизированы, хотя паренхима коры и эндодерма без изменений. При прорастании на растворе низкой концентрации ацетата свинца (10-8 М) дифференцировка клеток и процессы лигнификации не изменяются. По-видимому лигнификация может ограничивать передвижение свинца симпластом. У фасоли при прорастании на растворе свинца (10-8 М) уже через одни сутки выявляется лигнин в покрывной ткани, отдельных клетках паренхимы и метаксилемы, на более высокой концентрации ацетата свинца (10-3 М) лигнин выявляется в клетках эндодермы, паренхимы и метаксилемы. При прорастании и начальном росте на растворах ацетата свинца (10-8 М-10-3 М) в органах растений подсолнечника и фасоли накапливается свинец. Добавление к растворам ацетата свинца абсцизовой кислоты (10-10 М) не препятствует накоплению растениями фасоли данного металла, однако способствует адаптации к действию ионов свинца. Показано, что при действии на растение ионов свинца изменяется активность ферментов азотного обмена (глутаминсинтетазы, глутаматдегидрогеназы, аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы), концентрация фотосинтетических пигментов, в частности участников виолаксантинового цикла. Ионы селенита при одновременном действии на растения с ионами свинца (10-3 М) повышают уровень виолаксантинового пула. ?-каротин выполняет функции антиоксиданта при прорастании семян в условиях свинцового стресса. Показано, что водный статус растений зависит от влияния на них ионов свинца – на высоких концентрациях относительное содержание воды и водный потенциал в период прорастания семян изменяются в пределах не препятствующих прорастанию, в последующий период роста снижается до уровня, не достаточного для нормального протекания реакций. Абсцизовая кислота, добавленная в питательные растворы со свинцом, способствует возобновлению водного статуса, однак на високой концентрации свинца (10-3 М) водный статус снижается до значений при которых нормальная жизнедеятельность растений невозможна. В период прорастания и начального роста семян низкие концентрации свинца (10-8 М) активируют антиоксидантную аскорбат-глутатионовую систему, а высокие (10-3 М) – угнетают ее. При прорастании семян на питательных растворах со свинцом активно используется восстановленный глутатион. Высокая активность глутатионпероксидазы, глутатион-S-трансферазы, аскорбатпероксидазы, монодегидроаскорбатредуктазы в органах растений способствуют их прорастанию и начальному росту на питательных растворах со свинцом. Вероятность прорастания семян растений зависит и от уровня их вынужденного покоя и базового пула аскорбиновой кислоты. Ключевые слова: свинец, антиоксидантная система, водный статус, подсолнечник, фасоль, виолаксантиновый цикл, адаптация, селенит, абсцизовая кислота. Vorobets N. Endogenous mechanisms in plant to lead detoxification by the ascorbate-glutathione system participation. – Manuscript. Thesis for a scientific degree of the Doctor of Biological Sciences by speciality 03.00.04 – biochemistry. – Yuriy Fedkovych Chernivtsi National University, Chernivtsi, 2004. The dissertation is devoted to a problem of plant tolerance to lead and possibility of selenite and abscisic acid to regulate this process. It is shown, that the presence of lead ions in concentration 10-3- 10-8 M in medium conduct to changes in metabolic process, increases of malondialdehyde and hydrogen peroxide content. It is established the inhibitory effect of high dose of lead (10-3 M) on glutamate dehydrogenase, glutamine synthetase, aspartate amino transferase and alanine amino transferase. Pool and correlation between violaxanthin cycle pigments change in exceed lead ions level. Perhaps this cycle is implicated in protection against damage by lead. The decrease in water status of the plant takes place in high dose lead medium supplied condition (10-3 M). A high ascorbic acid content during the first stages of germination and growth is a strategy developed in seed of plants to cope with an increased level of reactive oxygen species induced by lead ions. Analysis of enzymes activity proved that the ascorbic acid-glutathione cycle (especially ascorbate peroxidase activity) is stimulated to counteract the injurious effects of lead in sunflower and bean under germination and early growth period. Dehydroascorbate reductase and glutathione reductase contribute to maintaining a high level of ascorbic acid and to avoiding the accumulation of dehydroascorbic acid. Lead (10-3 M) in medium resulted in significant increment of dehydroascorbic and diketogulonic acids concentration in roots. The increase of antioxidant stress enzyme activities in response to lead exposure may be taken evidence for an enhanced detoxification capacity of P. vulgaris and H. annuus plants toward reactive oxygen species (and derivates) that might be generated in the stress plants. Medium-applied abscisic acid doesn’t reduce lead uptake and accumulation by plants but provide for their adaptation to it. Key words: lead, antioxidative system, water status, sunflower, bean, violaxanthin cycle, adaptation, selenite, abscisic acid.

Похожие записи