НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

ОЛІШЕВСЬКА СНІЖАНА ВІКТОРІВНА

УДК 579.26+582.28+546.3+631.412

Еколого-систематична характеристика та біологічна активність
мікроскопічних грибів, виділених із забруднених важкими металами ґрунтів
України

03.00.07 – мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ — 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К.
Заболотного НАН України та Інституті геохімії навколишнього середовища
НАН і МНС України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Жданова Неллі
Миколаївна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного
НАН України, завідувач відділу фізіології та систематики мікроміцетів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник Козлова Ірина Панасівна, Інститут мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, провідний науковий
співробітник відділу загальної і ґрунтової мікробіології

доктор біологічних наук, професор Бухало Ася Сергіївна, Інститут
ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, головний науковий співробітник
відділу мікології

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса
Шевченка, кафедра мікробіології і загальної імунології, Кабінет
Міністрів України, м. Київ

Захист відбудеться ”21” грудня 2005 р. о 1200 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських
дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К.
Заболотного НАН України за адресою: Україна, Д 03680, Київ ДСП, вул.
Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: Україна, Д
03680, Київ ДСП, вул. Заболотного, 154.

Автореферат дисертації розіслано ”___” листопада 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема забруднення ґрунтів іонами важких металів є
актуальною в усьому світі, в тому числі і в Україні. В результаті
функціонування металургійних, гірничодобувних та інших підприємств важкі
метали разом з пиловими частинками та стічними водами потрапляють до
ґрунту, забруднюючи довкілля, що негативно відображається на стані
мікро- і мікобіоти.

Вивченням впливу іонів важких металів на видовий склад мікроскопічних
грибів сучасних ґрунтів займаються переважно у Росії [Зачиняева,
Лебедева, 2003; Марфенина, 2005]. В Україні такі дослідження практично
відсутні.

В літературі є лише поодинокі роботи по вивченню мікобіоти ґрунтів
стародавніх поселень [Кочкина и др., 2001; Марфенина, 2005]. Інформація
щодо видового складу мікроскопічних грибів стародавніх ґрунтів,
забруднених важкими металами, відсутня.

Відомо, що мікроскопічні гриби беруть участь у трансформації іонів
металів, яка здійснюється шляхом синтезу позаклітинних метаболітів,
сорбції іонів грибною клітиною, вилужування хімічних елементів із різних
матеріалів, зокрема залізо-бетонних споруд, що знаходяться у ґрунті
[Burgstaller et al., 1993; Gadd, 2000; Dighton, 2003].

Вищевикладене є підґрунтям для еколого-систематичного дослідження та
вивчення біологічної активності мікроскопічних грибів, виділених із
сучасних та стародавніх забруднених важкими металами ґрунтів України.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Основна частина
роботи виконана у відділі фізіології та систематики мікроміцетів
Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України
у відповідності з напрямком науково-дослідних робіт Інституту, зокрема з
темами: “Дослідити еколого-фізіологічну активність мікроміцетів в умовах
екстремальних антропогенних навантажень” (№ державної реєстрації
0100U004338) і “Фізіолого-біохімічні особливості трофіки міцеліальних
грибів” (№ державної реєстрації 0105U001411).

Дослідження деструкції бетону мітоспоровими грибами проводилось
комплексно з відділом ядерної геохімії і космохімії Інституту геохімії
навколишнього середовища НАН і МНС України у відповідності з темою
“Вивчення взаємодії мікробіологічних об`єктів з контейнерами для
зберігання та захоронення низько- і середньоактивних відходів” (№
державної реєстрації 0199U002225).

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи була еколого-систематична
характеристика мікроскопічних грибів, виділених із забруднених важкими
металами ґрунтів деяких областей півдня України, та оцінка їх
біологічної активності щодо іонів міді як основного забруднювача, а
також вилужування металів зі зразків бетону.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні
завдання:

1. Провести еколого-систематичний аналіз видового складу мікобіоти
сучасних та стародавніх ґрунтів деяких промислових регіонів півдня
України.

2. Встановити ступінь резистентності мікроскопічних грибів до іонів
міді.

3. Виявити хемотропічні реакції мікроскопічних грибів до іонів міді.

4. Визначити сорбційну здатність мікроскопічних грибів щодо іонів міді.

5. Дослідити деструкцію бетону деякими видами мітоспорових грибів.

Об`єктами дослідження були мікроскопічні гриби відділів Zygomycota,
Ascomycota та мітоспорові (анаморфні) гриби, які були виділені нами із
забруднених важкими металами сучасних та стародавніх ґрунтів.

Предметом дослідження було вивчення ряду еколого-систематичних ознак та
біологічних властивостей вищевказаних грибів.

Методи дослідження. Для вирішення поставлених задач використовували
класичні методи експериментальної мікології та фізико-хімічні методи
дослідження. Для вивчення хемотропізму щодо іонів міді, а також
деструкції бетону мікроскопічними грибами використовували модифіковані
нами методи агарових блоків.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні досліджено вплив
іонів важких металів на мікобіоту сучасних ґрунтів на території заводів
у м. Запоріжжя, м. Артемівськ (Донецька обл.), ділянці мідних покладів у
х. Картамиш (Луганська обл.) і території стародавніх плавильних горнів у
заповіднику “Ольвія” (Миколаївська обл.). Показано, що в цих ґрунтах
кількість темнозабарвлених видів мікроскопічних грибів становила 40 –
42,5 %, тоді як у ґрунтах заповідників “Мамай-гора” і “Михайлівська
цілина” – 13,3 – 24,1 %.

Виявлено 3 нових для мікобіоти України види: Gelasіnospora retispora
Cain, Wardomyces simplex Sugijama і Monodictys asperospora (Cooke et
Massee) M.B. Ellis та 12 рідкісних видів.

Серед досліджених 34 штамів 22 видів 12 родів мікроскопічних грибів було
виявлено 11 високорезистентних (8 видів 6 родів), 13 резистентних (12
видів 9 родів), 8 чутливих (7 видів 6 родів) і 2 надчутливих штами (1
вид) до іонів міді.

Досліджено прояв хемотропічних реакцій мікроскопічних грибів до іонів
міді та отримані кількісні показники швидкості їх радіального росту за
допомогою модифікованого нами методу агарових блоків. Серед вивчених 34
штамів 22 видів 12 родів мікроскопічних грибів виявлено 15 штамів, які
направлено росли до 2 – 10 мМ Cu2+, два – негативно тропічних та 17
штамів, які припиняли ріст у напрямку до 6 – 10 мМ Cu2+, що містились в
агарових блоках.

Вперше була розроблена модельна система, яка дала змогу встановити
відстань (4 см), на якій швидкість радіального росту досліджених видів
грибів достовірно зменшувалась у 1,5 – 2 рази при дії іонів міді у
концентраціях 6 – 10 мМ. Розроблена модельна система дає можливість
досліджувати різні види мікроміцетів на прояв цієї ознаки щодо іонів
інших металів.

Нами вперше проведено скринінг активних сорбентів іонів міді серед 72
штамів 29 видів 16 родів мікроскопічних грибів, виділених із сучасних і
стародавніх ґрунтів. Виявлено 4 найактивніших штами: Cladosporium
cladosporioides 77 і C. cladosporioides 716, Stachybotrys chartarum
357 і S. chartarum 424, сорбційна здатність яких становить 71,4 – 83,6
%.

Вперше показано, що серед досліджених 7 видів 4 родів (7 штамів)
мітоспорових грибів найактивнішими біодеструкторами бетону, що
використовується для контейнерів, призначених для зберігання низько- і
середньоактивних відходів, були штами Cladosporium cladosporioides 3,
Alternaria alternata 37 і Aspergillus niger 42.

Практичне значення одержаних результатів. Колекція штамів (318 штамів
116 видів 46 родів) мікроскопічних грибів, виділених із забруднених
важкими металами сучасних та стародавніх ґрунтів України,
використовується як базовий матеріал у відділі фізіології та систематики
мікроміцетів ІМВ НАНУ для проведення відповідних експериментальних
робіт.

Виявлені нами 4 найактивніші сорбенти: Cladosporium cladosporioides
(штами 77 і 716) і Stachybotrys chartarum (штами 357 і 424) можуть бути
перспективними при застосуванні для очистки стічних вод від забруднення
іонами міді.

Модифікований нами метод агарових блоків, використаний для дослідження
деструкції бетону під впливом мітоспорових грибів, може бути
застосований для вивчення біодеструкції інших будівельних матеріалів. На
основі отриманих результатів, з метою запобігання корозії бетону,
можливий підбір речовин, здатних пригнічувати синтез позаклітинних
метаболітів, зокрема органічних кислот, що продукують мікроскопічні
гриби.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана автором
особисто. Автором самостійно проаналізовано наукову літературу з теми
дисертації, проведено математичну та статистичну обробку одержаних
експериментальних даних, їх аналіз та порівняння з даними літератури, а
також підготовку результатів досліджень для їх опублікування. Здобувачем
особисто виділено 119 видів 52 родів (420 штамів) мікроскопічних грибів,
ідентифікацію яких проведено сумісно з к.б.н., н.с. В.О. Захарченко і
пров. інж. Л.В. Артишковою (ІМВ), які є співавторами відповідних
публікацій. Автором особисто проведено пошук найактивніших сорбентів
іонів міді серед мікроскопічних грибів; досліджено резистентність та
тропічні реакції останніх щодо іонів міді. Автором особисто модифіковано
метод агарових блоків, що дав змогу дослідити тропічні реакції грибів до
іонів міді та деструкцію бетону мітоспоровими грибами.

При дослідженні деструкції бетону мітоспоровими грибами консультативну
допомогу надавала к.б.н., ст.н.с. Фоміна М.О. (ІМВ); визначення
фізико-хімічних показників проведено спільно з н.с. Кадошніковим В.М. і
ст.н.с. Злобенком Б.П. (Інститут геохімії навколишнього середовища НАН і
МНС України), які є співавторами відповідних публікацій. У плануванні
основних напрямків роботи та обговоренні одержаних результатів приймала
участь науковий керівник д.б.н., проф. Жданова Н.М.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були
представлені на: II Международной научно-практической конференции
“Тяжелые металлы, радионуклиды и элементы-биофилы в окружающей среде”
(м. Семипалатинськ, Казахстан, жовтень, 2002); 1-м Международном
Конгрессе “Биотехнология – состояние и перспективы развития” (м. Москва,
Росія, жовтень, 2002); ІІ всеукраїнській конференції студентів та
аспірантів “Біологічні дослідження молодих вчених на Україні” (м. Київ,
березень, 2002); 7-й Пущинской школе-конференции молодых ученых
“Биология – наука XXI века” (м. Пущино, Росія, квітень, 2003); конкурсі
експериментальних робіт молодих дослідників в Інституті мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (листопад, 2003; лютий,
2005); 8-й Пущинской школе-конференции молодых ученых “Биология – наука
XXI века” (м. Пущино, Росія, травень, 2004); Международной конференции
“Современное состояние и перспективы развития микробиологии и
биотехнологии” (м. Мінськ, Бєларусь, травень, 2004); Международной
научной конференции “Современные проблемы загрязнения почв” (м. Москва,
Росія, травень, 2004); Х з`їзд Товариства мікробіологів України (м.
Одеса, вересень, 2004), 9-й Пущинской школе-конференции молодых ученых
“Биология – наука XXI века” (м. Пущино, Росія, квітень, 2005); 1-й
Міжнародній конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ
біології” (м. Львів, квітень, 2005); засіданні мікологічної секції
Українського Ботанічного товариства (Інститут ботаніки ім. Холодного НАН
України, квітень, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 16 наукових праць: 5
статей у наукових фахових виданнях та 11 тез.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 192
сторінках машинописного тексту і складається з розділів “Вступ”, “Огляд
літератури”, “Матеріали та методи досліджень”, “Результати досліджень”
(включає 5 розділів власних досліджень), “Заключна частина”, “Висновки”,
“Список використаних джерел”, який містить 304 найменувань, в тому числі
169 іноземних авторів. Робота містить 12 таблиць і 46 рисунків.

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Огляд літератури складається з 5 підрозділів. У першому з них
розкриваються поняття: гранично допустимі концентрації важких металів,
їх валові та рухомі форми, а також токсичність іонів міді, свинцю та
цинку. У другому підрозділі описано вплив іонів важких металів на
видовий склад мікроскопічних грибів ґрунту. Третій підрозділ присвячений
висвітленню механізмів резистентності мікроскопічних грибів до іонів
важких металів. У четвертому підрозділі розглянуті тропічні реакції
мікроскопічних грибів, зокрема хемотропізм та можливі його механізми. В
останньому підрозділі проаналізовано літературу по деструкції бетону
мікроорганізмами, в тому числі мікроскопічними грибами.

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об`єктами досліджень були 119 видів 52 родів (420 штамів) мікроскопічних
грибів, виділені нами із забруднених іонами важких металів ґрунтів та
заповідних територій. Резистентність та хемотропічні реакції досліджено
на 22 видах 12 родів (34 штамах) мікроскопічних грибів. Швидкість
радіального росту мікроміцетів до 6 – 10 мМ Cu2+, що містились в
агарових блоках, розміщених на відстані 2 – 6 см від грибного інокулюму,
вивчали у 5 видів р. Fusarium і Trichoderma (6 штамів). Для дослідження
сорбційної здатності мікроскопічних грибів до іонів міді були відібрані
29 видів 16 родів (72 штами), з яких 3 штами були музейними культурами
відділу фізіології та систематики мікроміцетів ІМВ НАН України. Для
вивчення деструкції бетону мітоспоровими грибами було обрано 7 видів 4
родів (7 штамів).

Матеріали досліджень. Для вивчення мікобіоти ґрунту деяких промислових
регіонів півдня України досліджували зразки чорноземних ґрунтів,
відібраних на глибині 0 – 5 і 18 – 20 см влітку 2002 р.: території
заводу чорної металургії “Запоріжсталь” (м. Запоріжжя), заводу
кольорових металів м. Артемівськ (Донецька обл.), ділянці покладів міді
у х. Картамиш (Луганська обл.). Контролем слугували зразки ґрунту
історичного заповідника “Мамай-гора” (Запорізька обл.) і ботанічного
заповідника “Михайлівська цілина” (Сумська обл.).

Для встановлення видового різноманіття мікроскопічних грибів стародавніх
ґрунтів досліджували зразки каштанових ґрунтів, відібрані на глибині 2,5
м на території заповідника “Ольвія” (Миколаївська обл.) безпосередньо у
місцях стародавніх (понад 2500 років) плавильних горнів та на відстані
25 м від них (контроль).

Вищевказані зразки ґрунту були люб`язно надані нам к. геол.-мінерал. н.,
ст.н.с. Інституту геохімії, мінералогії і рудоутворення НАН України В.Й.
Манічевим, за що ми йому щиро вдячні.

Для дослідження деструкції бетону мікроскопічними грибами
використовували зразки бетону, з яких виготовляють залізобетонні
контейнери марки КЗНП-2,1 для зберігання радіоактивних відходів.

Методи досліджень. Визначення валових та рухомих форм міді, свинцю та
цинку у зразках ґрунту здійснювали методом атомної абсорбції на
спектрофотометрі АА – 8500 F (Японія). Вилучення мікроскопічних грибів
проводили з використанням класичних методів [Методы,… 1982].
Ідентифікацію чистих культур мікроміцетів проводили з використанням
загальновизнаних визначників вітчизняних та зарубіжних авторів.

Еколого-систематичний аналіз стану мікобіоти проводили з використанням
відповідних екологічних показників: частоти трапляння мікроміцетів,
коефіцієнта подібності Сьоренсена-Чекановського, коефіцієнта
різноманіття Шенона та індекса домінування Симпсона [Одум, 1986;
Мирчинк, 1988].

Критерієм резистентності мікроскопічних грибів до іонів міді слугувала
швидкість їх радіального росту на агаризованому середовищі Чапека (ЧА)
та голодному агарі (ГА), до яких додавали 1 – 10 мM Cu2+. Швидкість
радіального росту грибів визначали кожні 24 год. протягом 14 діб
[Паников, 1991].

Для дослідження тропічних реакцій мікроскопічних грибів до іонів міді
використовували модифікований нами метод агарових блоків [Ritz, 1995],
перевагою якого є не лише спостереження за направленістю росту грибних
гіф до агарових блоків з іонами міді у концентраціях 2 – 10 мM, а і
визначення швидкості радіального росту мікроміцетів (рис.1). Модифікація
методу агарових блоків полягала у збільшенні відстані (2 – 6 см) між
грибним інокулюмом та агаровими блоками з іонами міді. Контролем
слугували агарові блоки без іонів міді.

Масштаб 1 см

Сорбційну здатність мікроскопічних грибів вивчали в умовах контакту (1
год) 0,5 мM водного розчину іонів міді (CuSO4Ч5H2O) та висушеної грибної
біомаси. Методом атомно-абсорбційної спектрометрії визначали кількість
іонів міді (%) у фільтраті після сорбції.

Деструкцію бетону під дією мітоспорових грибів вивчали за допомогою
модифікованого нами методу агарових блоків (рис.2).

Зразок бетону розміщували у лунці, яка була вирізана у центрі
агаризованого середовища ЧА. На поверхні середовища на відстані 1 – 2 мм
від зразка бетону розміщували агарові блоки з інокулюмом (d = 10 мм)
відповідних мікроскопічних грибів. Культивування здійснювали протягом 1
року. Для визначення вмісту Ca2+, Si4+, Al3+ і Fe3+ в міцеліальних
агарових блоках, вирізаних на відстані 10 мм від краю зразка бетону,
використовували емісійний спектральний аналіз на спектрофотометрі СТЕ-1
(Україна).

Хімічні групи у грибній біомасі та у кристалах, що утворились після
культивування мітоспорових грибів на поверхні бетону, визначено методом
ІЧ-спектроскопії на інфрачервоному спектрофотометрі UR-20 (Німеччина).
Мінеральний склад кристалів, що утворилися після культивування
мікроскопічних грибів на поверхні зразків бетону, встановлено за
допомогою методу рентгенівського фазового аналізу на дифрактометрі ДРОН
– 1,5 (Росія).

Фізіологічну активність мікроскопічних грибів вивчали шляхом
культивування їх у рідкому середовищі Чапека з додаванням подрібненого
бетону (5, 50 і 100 г/л) протягом 30 діб. Після центрифугування в
культуральній рідині методом потенціометричного титрування (0,01 н NaOH)
[ГОСТ…, 1971] визначали кількість органічних кислот, які продукувались
біомасою досліджених грибів.

Отримані в роботі дані оброблені статистично з використанням програм
Microsoft Excel_2003, GraphPadInstat і Minitab for Windows 12 з
використанням one-way ANOVA.

РОЗДІЛ 3. ЕКОЛОГО-СИСТЕМАТИЧНІ ОСОБЛИВОСТІ МІКРОСКОПІЧНИХ ГРИБІВ,
ВИДІЛЕНИХ ІЗ ҐРУНТІВ ДЕЯКИХ ПРОМИСЛОВИХ РЕГІОНІВ УКРАЇНИ

У зразках ґрунту, відібраних на території заводів і родовища міді,
кількість валових та рухомих форм міді, свинцю та цинку, перевищувала
гранично допустимі концентрації (ГДК) в декілька разів [Земельні
ресурси, 1998]. Кількість міді у порівнянні з іншими металами була
найбільшою, зокрема, у ґрунтах ділянки мідних покладів у х. Картамиш
вміст валових та рухомих форм міді перевищував ГДК в 28,5 і 147 разів
відповідно. На території заводу кольорових металів у м. Артемівськ і у
ґрунтах заповідника “Ольвія” на території стародавніх плавильних горнів
– майже у 10 разів.

Виділено та ідентифіковано 119 видів 52 родів (420 штамів)
мікроскопічних грибів, які віднесені до відділів Zygomycota, Ascomycota
та мітоспорових грибів. Останні були представлені найбільшою кількістю
видів (95 видів 36 родів), серед яких для мікобіоти України, новими є 3
види: Gelasіnospora retispora Cain, Monodictys asperospora (Cooke et
Massee) M.B. Ellis і Wardomyces simplex Sugijama та 12 рідкісними
видами.

В результаті порівняння списку видів мікроскопічних грибів за допомогою
коефіцієнта Сьоренсена-Чекановського показано, що видовий склад
мікроміцетів, виділених із ґрунтів досліджуваних територій, помітно
відрізняється (S < 0,5) (табл. 1), що, перш за все, обумовлено наявністю різної кількості іонів важких металів. У найбільш забруднених важкими металами ґрунтах на території заводу кольорової металургії у м. Артемівськ, ділянці мідних покладів у х. Картамиш та на території стародавніх плавильних горнів у заповіднику “Ольвія” кількість темнозабарвлених мікроскопічних грибів становила 40 – 42,5 %, (табл.1), що свідчить про промислову меланізацію мікобіоти ґрунту, тоді як у незабруднених ґрунтах цей показник становив 13,3 – 24,1 %. Таблиця 1 Екологічні показники порівняння списків видів мікроміцетів, виділених із сучасних та стародавніх ґрунтів Коефіцієнт подібності Сьоренсена-Чекановського (S) ЗАП АРТ КРТ МГ МЦ ОЧ Індекс меланізації мікобіоти, % Коефіцієнт Шенона (Н) Індекс Симпсона (С) ЗАП 0,33 0,31 0,37 0,23 30,0 3,16 0,053 АРТ 0,42 0,33 0,36 41,3 3,20 0,052 КРТ 0,35 0,34 42,5 3,40 0,036 МГ 0,44 24,1 3,13 0,057 МЦ 13,3 3,10 0,063 ОЗ 0,34 40,0 3,30 0,042 ОЧ 20,0 3,50 0,037 Примітки: ЗАП – м. Запоріжжя, АРТ – м. Артемівськ, КРТ – ділянка мідних покладів у х. Картамиш, МГ – заповідник “Мамай-гора”, МЦ – заповідник “Михайлівська цілина”, ОЗ - заповідник “Ольвія” (територія, забруднена важкими металами), ОЧ – заповідник “Ольвія” (незабруднена територія). У сучасних ґрунтах зі збільшенням забруднення видове різноманіття збільшувалось (у ділянці мідних покладів х. Картамиш Н = 3,40, у заповідниках (контроль) Н = 3,10-3,13) за рахунок підвищеної кількості меланінвмісних мікроскопічних грибів (табл.1), що підтверджується даними літератури [Зачиняева и др., 2003]. У стародавніх забруднених ґрунтах (ОЗ), навпаки, видове різноманіття грибів було меншим (Н = 3,3) у порівнянні з контролем (ОЧ), де Н = 3,5. У найбільш забрудненій важкими металами території (х. Картамиш) домінуючі види взагалі були відсутні, що підтверджується значеннями індекса Симпосона: С = 0,036 (табл.1). У менш забруднених ґрунтах м. Артемівськ (АРТ) на території заводу кількість домінуючих видів була більшою (С = 0,052). У ґрунтах заповідника “Михайлівська цілина” кількість домінуючих видів була найбільшою (С = 0,063). Оскільки в досліджуваних ґрунтах вміст іонів міді був значно вищим у порівнянні з кількістю свинцю і цинку, доцільним було вивчити резистентність мікроскопічних грибів, прояв їх хемотропічних реакцій та сорбційну здатність саме щодо іонів міді. РОЗДІЛ 4. РЕЗИСТЕНТНІСТЬ МІКРОСКОПІЧНИХ ГРИБІВ ДО ІОНІВ МІДІ Резистентність мікроскопічних грибів до іонів міді проявлялась на видовому та штамовому рівні і залежала від складу поживного середовища та концентрації іонів міді. При наявності у ГА 1 мM Cu2+ 15 штамів мікроскопічних грибів взагалі не росли; 18 штамів росли на ГА з 1 мM Cu2+ і не росли з підвищенням концентрації іонів міді у середовищі до 2 мM. Один із штамів, а саме Aspergillus ochraceus 278 не ріс навіть у контролі, тобто, за відсутності іонів міді у середовищі. За здатністю досліджених штамів мікроскопічних грибів рости на ЧА з різними концентраціями іонів міді (2 – 10 мМ) ми умовно розподілили їх на 4 групи, серед яких найбільшу кількість становили високо резистентні (11 штамів 8 видів 6 родів) та резистентні (13 штамів 12 видів 9 родів). Кількість чутливих штамів до іонів міді була меншою (8 штамів 7 видів 6 родів). Найменшу кількість штамів становила група надчутливих до іонів міді мікроскопічних грибів: Stachybotrys chartarum 357 і S. chartarum 424 (табл.2). Таблиця 2 Резистентність мікроскопічних грибів до іонів міді за умов росту на середовищі Чапека Чапека Високо резистентні Резистентні Чутливі Надчутливі (не здатні рости) 8 і 10 мM Cu2+ 4 і 6 мM Cu2+ 1 і 2 мM Cu2+ 1 мM Cu2+ Alternaria alternata 72 Aspergillus niger 42, 51 A. ustus 64 Fusarium oxysporum 137, 385 Humicola fuscoatra 36 Paecilomyces lilacinus 146, 284 P. marquandii 153 Trichoderma viride 614 Alternaria alternata 37 Aspergillus ochraceus 278 Cladosporium cladosporioides 716 Fusarium sambucinum 40 Humicola grisea 413 Oidiodendron cerealis 189 Penicillium funiculosum 94 P. thomii 707 P. velutinum 17, 465 Trichoderma harzianum 23 Ulocladium alternariae 218 U. botrytis 719 Aspergillus ochraceus 48 A. ustus 135 Cladosporium cladosporioides 77, 201 Curvularia clavata 627 Fusarium sambucinum var. cоeruleum 123 Penicillium thomii 332 T. harzianum 141 Stachybotrys chartarum 357 S. chartarum 424 Спільною ознакою для всіх мікроміцетів є зменшення швидкості їх радіального росту зі збільшенням концентрації іонів міді у середовищі. Наприклад, швидкість росту Humicola fuscoatra 36 на ЧА з 10 мM Cu2+ була у 5,2 рази меншою у порівнянні з контролем. Відповідно зменшувався і діаметр колонії грибів. На ЧА (контроль) діаметр колонії H. fuscoatra 36 становив 86 мм, а при додаванні 10 мM Cu2+ – 12 мм. РОЗДІЛ 5. ТРОПІЧНІ РЕАКЦІЇ МІКРОСКОПІЧНИХ ГРИБІВ ДО ІОНІВ МІДІ Прояв хемотропічних реакцій досліджених мікроскопічних грибів залежав від концентрації іонів міді в агарових блоках, таксономічної належності виду та складу поживного середовища. Швидкість радіального росту мікроміцетів до агарових блоків з іонами міді була меншою у порівнянні з контрольними агаровими блоками. Всі гриби колонізували контрольні блоки ГА і ЧА і направлено росли до ГА з 2 мМ Cu2+, але лише частково їх колонізували, що показано на прикладі Paecilomyces lilacinus 146 (рис.4 А, Б). Зі збільшенням концентрації іонів міді в агарових блоках до 4 мМ лише Paecilomyces lilacinus 146 (рис.4 А і В) і Сurvularia clavata 627 (рис.5 А і Б) проявили ознаку негативного хемотропізму (відвертання гіф від агарових блоків з іонами міді), решта досліджених видів грибів продовжували направлено рости до агарових блоків з іонами металу. До ГА з 6 – 10 мМ Cu2+ направлено росли 15 штамів 12 видів 7 родів мікроміцетів, що показано на прикладі Fusarium oxysporum 137 (рис.6 А і Б). У решти 17 штамів (12 видів 8 родів) грибів при наявності 6 – 10 мМ Cu2+ в агарових блоках спостерігали зупинку росту на 3 – 4-ту добу, яку відмічали протягом досліду, що показано на прикладі Penicillium thomii 332 (рис.7 А і Б). \ v TH H x EjEpE\G”G?GAeGueoioaOAEOAEOAEOAEioioioioioioioi3/4iueoioioi·i·i·i·i·ioi· i·i·i3/4i3/4i·i·i·i·iuei·i· P R T V X Z \ ^ h?BOe O O O $ O Ffi $ O O ue O ue O aeA EH ue h?BOe ??????????a harzianum 141 і Alternaria alternata 72 утворювались щільні міцеліальні тяжі (рис. 8 А); у Fusarium oxysporum 137 і A. ochraceus (штами 48 і 278) – галуження гіф грибів, що нагадують так звані “відьмині мітли” (рис.8 Б). У контролі морфологічних змін міцелію грибів не було виявлено. РОЗДІЛ 6. СОРБЦІЯ ІОНІВ МІДІ МІКРОСКОПІЧНИМИ ГРИБАМИ Види, що були представлені найбільшою кількістю штамів (незалежно від ступеня забрудненості ґрунту, з якого вони були виділені), за середніми значеннями сорбційної здатності щодо іонів міді можна розташувати наступним чином: C. сladosporioides (60,65 %) > T. harzianum (36,5 %) >
A. оchraceus (25,93 %) > F. оxysporum (21,75 %) > P. lilacinus (8,52
%). Найактивнішими є штами C. сladosporioides, що можна пояснити
наявністю меланінового пігменту у клітинній стінці [Жданова, 1986,
Fomina, Gadd, 2002].

Сорбційна здатність мікроскопічних грибів до іонів міді проявлялась на
штамовому рівні. Найактивнішими сорбентами іонів міді були Cladosporium
cladosporioides (штами 77 і 716) і Stachybotrys chartarum (штами 357 і
424), сорбційна здатність яких знаходилась у межах 71,4 – 83,6 %.

В цілому, штами, які були вилучені із сучасних ґрунтів, сорбували іони
міді достовірно (F = 43,74, P = 0,001) більше, ніж виділені зі
стародавніх ґрунтів – 31,69 і 10,55 % відповідно. Меланінвмісні штами із
сучасних та стародавніх ґрунтів (незалежно від рівня забруднення)
сорбували іони міді в середньому достовірно (F = 10,77, Р = 0,001) в
більшій мірі (30,10 %), ніж світлозабарвлені (18,46 %).

РОЗДІЛ 7. ДЕСТРУКЦІЯ БЕТОНУ МІТОСПОРОВИМИ ГРИБАМИ

У дослідах по вивченню біологічної активності мікроскопічних грибів на
прикладі руйнування ними бетону з використанням модифікованого нами
методу агарових блоків було показано, що їх ріст на бетонних зразках уже
після 1 місяця культивування супроводжувався формуванням щільних
міцеліальних тяжів (рис.9 А) та продукуванням крапель ексудату (рис.9
Б). Через 1 рік контакту гриба на поверхні зразка бетону були помітні
кристали білого кольору (рис.9 В).

Примітки: 1 – міцеліальні тяжі, 2 – краплини ексудату, 3 – кристали

У процесі росту грибів у модельній системі протягом 1 року деструктивна
дія мікроміцетів на поверхню бетону проявлялась в набуханні,
знебарвленні чи зміні кольору цементу, розчиненні клінкерних зерен,
утворенні тріщин.

За наведеними вище показниками найактивнішими деструкторами бетону були
Aspergillus niger 42, Alternaria alternatа 37 і Cladosporium
cladosporioides 3, які в різній мірі вилужували з бетону хімічні
елементи (табл. 3).

Таблиця 3

Вилужування грибами хімічних елементів із бетону

Штами Вміст металів у поживному середовищі, %

Ca2+

Si4+

Al3+

Fe3+

Aspergilus niger 42 2,0 0,45 0,2 0,2

Alternaria alternata 37 0,45 0,25 0,2 0,08

Cladosporium cladosporioides 3 0,4 0,2 0,15 0,05

Результати ІЧ – спектроскопічних досліджень показали, що спектри зразків
кристалів мали смуги поглинання, характерні для Ca – О – та ? Si – O
– груп, що вказує на наявність у зразках солей кальцію та кварцу (SiO2)
відповідно. Наявність у кристалах та краплинах ексудату = С = О , ? С
– C ?, – О – Н і ? C – H груп свідчить про те, що краплини ексудату
– це жирні кислоти типу R – COOH, де R – алкільний радикал, а кристали
– солі цих органічних кислот.

При дослідженні фізіологічної активності мікроскопічних грибів в
присутності подрібненого бетону (5, 50 і 100 г/л) показано, що
накопичення біомаси мікроміцетами залежить від таксономічної належності
виду та кількості подрібненого бетону в поживному середовищі (табл. 4).
Після культивування грибів протягом 30 діб у контролі і за присутності 5
г/л подрібненого бетону значення рН середовища зменшилось з 5,2 до 2,1 –
2,4 та 2,4 – 3,0 відповідно, що обумовлено продукуванням органічних
кислот досліджуваними мікроміцетами.

Таблиця 4

Накопичення біомаси мікроміцетами та зміна рН культуральної рідини при
наявності подрібненого бетону в поживному середовищі

Кількість бетону, г/л Aspergillus niger 42

Aspergillus flavipes 38

Cladosporium cladosporioides 3

Біомаса, г/л

рН

Біомаса, г/л

рН

Біомаса, г/л

рН

0 2,8 2,2 5,0 2,4 3,6 2,1

5 3,6 2,5 3,8 3,0 5,0 2,4

50 4,3 6,2 2,7 7,0 6,2 2,8

100 3,0 6,0 2,0 7,3 3,5 7,4

В більшій кількості органічних кислот продукував A. niger 42 – 1,17 ·
10-2 г-екв./г, дещо менше – A. flavipes 38 (0,90 · 10-2 г-екв./г),
найменшу кількість органічних кислот утворював C. cladosporioides 3
(0,67 · 10-2 г-екв./г біомаси).

Зі збільшенням кількості подрібненого бетону до 50 і 100 г/л при
культивуванні мікроскопічних грибів значення рН культуральної рідини
збільшилось до 6,0-7,4. Це обумовлено наявністю у поживному середовищі
продуктів вилужування – Ca2+, Si4+, Al3+, Fe3+, що входять до складу
бетону. При наявності у середовищі 100 г/л подрібненого бетону у всіх
досліджених грибів реєстрували максимальне вилужування вказаних
елементів. Лише A. flavipes 38 за даних умов вилужував з бетону найменшу
кількість Ca2+ (5,0 мг/г) і Fe3+ (0,75 мг/г).

РОЗДІЛ 8. ЗАКЛЮЧНА ЧАСТИНА

Нами вперше на Україні досліджено мікобіоту сучасних та стародавніх
ґрунтів, забруднених важкими металами. Показано, що в цих ґрунтах
переважали темнозабарвлені мікроскопічні гриби (40 – 42,5 %), на відміну
від ґрунтів заповідників (13,3 – 24,1 %), що свідчить про промислову
меланізацію мікобіоти, яка слугує біоіндикаційним показником забруднення
довкілля [Жданова, 1990].

Аналізуючи резистентність вилучених мікроскопічних грибів та їх
сорбційну здатність щодо іонів міді, зазначимо, що ці ознаки не завжди
корелюють між собою. Так, Stаchybotrys chartarum 357 і S. chartarum 424,
сорбційна здатність яких становить 83,6 і 71,4 %, є надчутливими до
іонів міді в умовах визначення резистентності. В таких умовах штам
Cladosporium cladosporioides 77 є чутливим, а C. cladosporioides 716 –
резистентним до іонів міді, сорбційна здатність яких становить 81,9 і
73,2 % відповідно. Отримані нами дані узгоджуються з даними літератури.
Зокрема, резистентні штами Saccharomyces cerevisiae поглинали іони міді
та кадмію менше, ніж чутливі до цих металів штами [Ross, 1995].
Мідь-толерантні штами Rhizopus stolonifer, Cunninghamella blakeslеeana
i Mucor rouxii зв`язували значно більшу кількість іонів міді в біомасі,
ніж відповідні чутливі штами [Garcia-Toledo et al., 1985]. Крім того,
авторами показано, що резистентність грибів до іонів міді визначається
домінантним алелем гену CUP [Cervantes et al., 1994].

Хемотропічні реакції мікроскопічних грибів до іонів міді нами досліджені
на більшій кількості видів, ніж це відомо з даних літератури [Fomian et
al., 2000, 2003]. Негативна дія іонів міді на мікроміцети проявлялась у
формуванні щільних міцеліальних тяжів та утворенні так званих
“відьминих мітел”, що спостерігали також інші автори [Fomina et al.,
2005].

Нами вперше була розроблена модельна система, що дала змогу встановити
відстань (4 см), на якій швидкість радіального росту видів рр. Fusarium
і Trichoderma достовірно зменшувалась у 1,5 – 2 рази при дії іонів міді
у концентраціях 6 – 10 мМ. Розроблена модельна система дає можливість
досліджувати різні види мікроміцетів на прояв цієї ознаки щодо інших
іонів металів.

Одним із проявів біогеохімічної активності мікроскопічних грибів є
вилужування іонів металів із важкодоступних субстратів [Huang et al.,
1985; Hyvarinen et al., 2002]. У наших дослідах за допомогою
модифікованого нами методу агарових блоків показана здатність грибів
направлено рости, колонізувати та руйнувати зразки бетону, з якого
виготовляють контейнери, що призначені для зберігання та захоронення
радіоактивних відходів. Найактивнішими біодеструкторами бетону були
Cladosporium cladospoioides 3, Alternaria alternata 37 і Aspergillus
niger 42, які вилужували Сa2+, Si4+, Al3+і Fe3+ зі зразків бетону.
Модифікований нами метод агарових блоків є перспективним для дослідження
деструкції не лише зразків бетону, а і інших будівельних матеріалів.

ВИСНОВКИ

1. Виділено та ідентифіковано 119 видів 52 родів (420 штамів)
мікроскопічних грибів. Серед них виявлено 3 нових для мікобіоти України
види: Gelasіnospora retispora Cain, Wardomyces simplex Sugijama і
Monodictys asperospora (Cooke et Massee) M.B. Ellis та 12 рідкісних
видів.

2. У забруднених важкими металами ґрунтах спостерігали промислову
меланізацію мікобіоти – кількість темнопігментованих видів
мікроскопічних грибів становила 40 – 42,5 %.

3. За критерієм швидкості радіального росту 34 штамів 22 видів 12 родів
грибів на агаризованому середовищі Чапека з концентрацією іонів міді 2 –
10 мМ Cu2+ виявлено 11 високорезистентних, 13 резистентних, 8 чутливих і
2 надчутливих штамів до іонів міді. Резистентність мікроскопічних грибів
до іонів міді проявлялась на видовому та штамовому рівнях і залежала від
концентрації металу та наявності поживних речовин у середовищі.

4. За допомогою модифікованого нами методу агарових блоків серед
досліджених 34 штамів 22 видів 12 родів мікроскопічних грибів виявлено
15 штамів, що направлено росли та частково колонізували агарові блоки з
2 – 10 мМ Cu2+, 2 – негативно тропічних та 17 штамів, які на 3 – 4-у
добу припиняли ріст у напрямку до агарових блоків з іонами міді.
Хемотропічні реакції мікроскопічних грибів до іонів міді проявлялись на
штамовому рівні і залежали від складу поживного середовища і
концентрації іонів міді.

5. Вперше розроблена та запропонована модельна система, яка дала змогу
встановити відстань (4 см), на якій швидкість радіального росту видів
рр. Fusarium і Trichoderma достовірно знижувалась в 1,5 – 2 рази за умов
дії іонів міді у концентраціях 6 – 10 мМ Cu2+.

6. Негативна дія іонів міді на мікроскопічні гриби проявлялась у
зниженні швидкості їх росту та морфологічних змінах міцелію, а саме: у
формуванні щільних міцеліальних тяжів у Alternaria alternata 72,
Aspergillus ochraceus 278 і Trichoderma harzianum 141 та порушенні
характеру галуження (утворенні “відьминих мітел”) у Fusarium oxysporum
137 і A. ochraceus (штами 48 і 278).

7. В результаті скринінгу 72 штамів 29 видів 16 родів мікроскопічних
грибів, виділених із сучасних і стародавніх ґрунтів, виявлено
найактивніші сорбенти іонів міді: Cladosporium cladosporioides (штами 77
і  716) та Stachybotrys chartarum (штами 357 і 424), сорбційна здатність
яких становить 71,4 – 83,6 %.

8. Найактивнішими біодеструкторами бетону серед досліджених мітоспорових
грибів були Cladosporium cladosporioides 3, Alternaria alternata 37 і
Aspergillus niger 42, які продукували органічні кислоти та вилужували
Сa2+, Si4+, Al3+і Fe3+ зі зразків бетону.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Олишевская С.В., Фомина М.А., Кадошников В.М., Подгорский В.С.
Выщелачивание кальция, кремния, алюминия и железа при росте микромицетов
в присутствии измельченного бетона в условиях глубинного культивирования
// Мікробіол. журн. – 2004. – Т.66, № 6. – С. 64-72. (Здобувачем
самостійно проведено експериментальні дослідження по вивченню впливу
подрібненого бетону на накопичення біомаси мікроміцетами, продукування
ними органічних кислот та вилужування хімічних елементів із бетону).

2. Фоміна М.О., Олішевська С.В., Кадошніков В.М., Злобенко Б.П.,
Підгорський В.С. Колонізація і деструкція бетону мітоспоровими грибами у
модельному експерименті // Мікробіол. журн. – 2005. – Т.67, № 2. – С.
96-104. (Здобувачем особисто модифіковано метод агарових блоків для
вивчення деструкції бетону мітоспоровими грибами, проведені
експериментальні дослідження та здійснено аналіз отриманих результатів).

3. Олішевська С.В., Захарченко В.О. Мікобіота ґрунту
історично-археологічного заповідника “Ольвія” Миколаївської обл.
(Україна) // Укр. ботан. журн. – 2004. – Т. 61, № 6. – С. 57-64.
(Здобувач брала участь у виділенні та ідентифікації мікроскопічних
грибів, аналізі одержаних результатів).

4. Олішевська С.В., Захарченко В.О., Артишкова Л.В., Жданова Н.М. Деякі
еколого-фізіологічні особливості мікроскопічних грибів, виділених з
ґрунтів, забруднених іонами міді // Вісник Одеського нац. ун-ту. Сер.
Біологія. – 2005. – 10, № 3. – С. 287-292 (Здобувачем особисто
модифіковано метод агарових блоків для вивчення хемотропічних реакцій
мікроміцетів до іонів міді. Автором самостійно досліджено резистентність
мікроскопічних грибів до іонів міді).

5. Олішевська С.В., Фоміна М.О., Манічев В.Й. Сорбція іонів міді
мікроскопічними грибами, виділеними із забруднених важкими металами
сучасних та археологічних ґрунтів України // Доповіді АН України. –
2005. – № 12. – С. 170-174. (Здобувачем особисто здійснено скринінг
активних біосорбентів іонів міді серед 72 штамів 29 видів 16 родів
мікроскопічних грибів).

6. Кадошников В.М., Олишевская С.В., Маничев В.И. Микрофлора в
современных и древних почвах промышленных зон Украины // Тяжелые
металлы, радионуклиды и элементы-биофилы в окружающей среде: Докл. конф.
Том 1 – II Междунар. научно-практич. конф., 16 –17 октября 2002 г.,
Семипалатинск, Казахстан. – С. 245-249.

7. Кадошников В.М., Олишевская С.В., Фомина М.А., Соботович Э.В.,
Яценко В.Г., Гречановская Е.Е. Биодеструкция бетонных контейнеров в
результате жизнедеятельности почвенных микромицетов // Биотехнология –
состояние и перспективы развития: Сб. тез. – 1-ый Междунар. Конгресс, 14
– 18 октября 2002 г., Москва, Россия.– С. 315-316.

8. Олішевська С.В., Фоміна М.О., Кадошніков В.М. Біодеструкція бетонних
контейнерів для зберігання і захоронення радіоактивних відходів як
результат життєдіяльності грунтових мікроміцетів // Біологічні
дослідження молодих вчених на Україні: Зб. тез. Вип. 1 – ІІ Всеукр.
Конф. студ. та асп., вересень 2002 г., Київ, Україна. – С. 34-35.

9. Олишевская С.В., Маничев В.И., Захарченко В.А., Артышкова Л.В.
Влияние тяжелых металлов на микобиоту почв Запорожской области //
Биология – наука XXI века: Сб. тез. – 7-я Пущ. шк.-конф. молодых учен.,
14 – 18 апреля 2003 г., Пущино, Россия. – С. 286-287.

10. Олишевская С.В., Фомина М.А., Кадошников В.М. Деструкция бетона под
воздействием микромицетов // Биология – наука XXI века: Сб. тез. – 8-я
Пущ. шк.-конф. молодых учен., 17 – 21 мая 2004 г., Пущино, Россия. – С.
157.

11. Олишевская С.В., Захарченко В.А., Маничев В.И., Жданова Н.Н.
Тяжелые металлы как фактор антропогенного воздействия на видовой состав
микромицетов // Биология – наука XXI века: Сб. тез. – 8-я Пущ.
шк.-конф. молодых учен., 17 – 21 мая 2004 г., Пущино, Россия. – С. 157.

12. Олишевская С.В., Захарченко В.А., Леган А.М., Маничев В.И.
Сравнительная характеристика микобиоты древних и современных почв
Украины, загрязненных тяжелыми металлами // Современное состояние и
перспективы развития микробиологии и биотехнологии: Сб.тез. – Междунар.
конф., 26 – 28 мая 2004 г., Минск, Беларусь. – С. 31-32.

13. Олишевская С.В., Жданова Н.Н., Маничев В.И., Леган А.Н. Изучение
влияния тяжелых металлов на микобиоту почв некоторых промышленных
регионов Украины // Современные проблемы загрязнения почв: Сб.тез.
–Междунар. науч. конф., 24 – 28 мая 2004 г., Москва, Россия. – С.
249-251.

14. Олішевська С.В. Деякі еколого-фізіологічні особливості
мікроскопічних грибів, виділених з грунтів, забруднених Cu2+ // Х з`їзд
Товариства Мікробіологів України: Зб. тез., 15 – 17 вересня 2004 р.,
Одеса, Україна. – С. 293.

15. Олишевская С.В., Иванова Т.П., Жданова Н.Н. Тропические реакции
гифальных грибов к ионам меди // Биология – наука XXI века: Сб. тез. –
9-я Пущ. шк.-конф. молодых учен., 18 – 22 апреля 2005 г., Пущино, Росия.
– С. 207.

16. Олішевська С.В., Іванова Т.П. Резистентність та тропічні реакції
мікроскопічних грибів до іонів міді в оточуючому середовищі // Молодь і
поступ біології: Зб. тез. – Перша Міжнар. конф. студ. та асп., 11 – 14
квітня 2005 р., Львів, Україна. – С. 156-157.

АНОТАЦІЯ

Олішевська С.В. Еколого-систематична характеристика та біологічна
активність мікроскопічних грибів, виділених із забруднених важкими
металами ґрунтів України. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології і
вірусології НАН України, Київ, 2005.

Вивчено вплив іонів важких металів на видовий склад ґрунтових
мікроскопічних грибів; досліджено резистентність, хемотропічні реакції
та сорбційну здатність мікроміцетів щодо іонів міді, а також деструкцію
бетону мітоспоровими грибами.

Виділено та ідентифіковано 119 видів 52 родів (420 штамів)
мікроскопічних грибів, серед них виявлено 3 нових для мікобіоти України
види та 12 рідкісних видів. У найбільш забруднених важкими металами
ґрунтах кількість темнозабарвлених мікроміцетів становила 40 – 42,5%,
тоді як у ґрунтах заповідників – 13,3 – 24,1 %.

Мікроскопічні гриби нами умовно розподілено на високо резистентні,
резистентні, чутливі та надчутливі до іонів міді. За допомогою
модифікованого нами методу агарових блоків виявлено 15 штамів, що
направлено росли до 2 – 10 мМ Cu2+, два – негативно тропічних та 17
штамів, які на 3 – 4-ту добу припиняли ріст у напрямку до іонів міді.
Вперше розроблена модельна система, яка дала змогу встановити відстань
(4 см), на якій швидкість радіального росту видів рр. Fusarium і
Trichoderma достовірно зменшувалась у 1,5 – 2 рази при дії іонів міді у
концентраціях 6 – 10 мМ.

Виявлено 4 найактивніших сорбенти іонів міді: Cladosporium
cladosporioides (штами 77 і 716) і Stachybotrys chartarum (штами 357 і
424), сорбційна здатність яких знаходилась у межах 71,4 – 83,6 %.

Найактивнішими біодеструкторами бетону були Cladosporium cladospoioides
3, Alternaria alternata 37 і Aspergillus niger 42, які продукували
органічні кислоти і вилужували Сa2+, Si4+, Al3+і Fe3+ зі зразків бетону.

Ключові слова: мікроскопічні гриби, ґрунт, важкі метали, іони міді,
резистентність, хемотропізм, сорбція, бетон.

АННОТАЦИЯ

Олишевская С.В. Эколого-систематическая характеристика и биологическая
активность микроскопических грибов, выделенных из загрязненных тяжелыми
металлами почв Украины. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт микробиологии и
вирусологии НАН Украины, Киев, 2005.

Диссертация посвящена изучению влияния ионов тяжелых металлов на
видовой состав почвенных микроскопических грибов; исследованию
резистентности, хемотропических реакций, уровня сорбции ионов меди, а
также деструкции бетона митоспоровыми грибами.

Выделено и идентифицировано 119 видов 52 родов (420 штаммов)
микроскопических грибов, среди которых выявлено 3 новых для микобиоты
Украины вида: Gelasonospora retispora Cain, Wardomyces simplex Sugijama
і Monodictys asperospora (Cooke et Massee) M.B. Ellis и 12 редкостных
видов.

В наиболее загрязненных тяжелых металлами почвах наблюдали промышленную
меланизацию микобиоты, т.е. количество темноокрашенных микромицетов
составляло 40 – 42,5%, в сравнении с почвами заповедников “Мамай-гора” и
“Михайловская целина” – 13,3 – 24,1 %.

Критерием резистентности микроскопических грибов к ионам меди была
скорость их радиального роста при культивировании на агаризованных
средах с добавлением 2 – 10 мM Cu2+. Исследуемые грибы мы условно
отнесли к высокорезистентным (11 штаммов), резистентным (13 штаммов),
чувствительным (8 штаммов) и сверхчувствительным (2 штамма) к ионам
меди.

Модифицированный нами метод агаровых блоков [Ritz, 1995] позволил
наблюдать за направленностью роста грибных гиф к агаровым блокам c
ионами меди в концентрациях 2 – 10 мM, а также измерять скорость их
радиального роста. Выявлено 15 штаммов, которые направленно росли к 2 –
10 мМ Cu2+, два – негативно тропичных и 17 штаммов, которые на 3 – 4-е
сутки останавливали рост в направлении к ионам меди.

Резистентность и хемотропические реакции микроскопических грибов к ионам
меди проявлялись на штаммовом уровне и зависели от состава питательной
среды и концентрации ионов меди в ней. С увеличением концентрации ионов
металла в среде и агаровых блоках средняя скорость радиального роста
грибов уменьшалась.

Нами разработана и предложена модельная система, с помощью которой
установлено расстояние (4 cм), на котором скорость радиального роста
видов рр. Fusarium и Trichoderma достоверно уменьшалась в 1,5 – 2 раза
при действии ионов меди в концентрациях 6, 8 и 10 мМ в сравнении с
контролем.

В результате скрининга 72 штаммов 29 видов 16 родов микроскопических
грибов выявлено 4 наиболее активных сорбента ионов меди: Cladosporium
cladosporioides (штаммы 77 и 716) и Stachybotrys chartarum (штаммы 357 и
424), уровень сорбции которых находился в пределах 71,4 – 83,6 %.

Применяя модифицированный нами метод агаровых блоков для изучения
биодеструкции бетона, показано, что наиболее активными биодеструкторами
были Cladosporium cladospoioides 3, Alternaria alternata 37 и
Aspergillus niger 42, которые продуцировали органические кислоты и
выщелачивали Сa2+, Si4+, Al3+ и Fe3+. Модифицированный метод является
перспективным для исследования деструкции не только образцов бетона, но
и других строительных материалов.

Ключевые слова: микроскопические грибы, почва, тяжелые металлы, ионы
меди, резистентность, хемотропизм, сорбция, бетон.

ABSTRACT

Olishevska Snezhana. Ecological-taxonomic characteristics and biological
activity of microfungi isolated from heavy metal polluted Ukrainian
soils. – Manuscript.

Thesis for a candidate`s degree on specialization 03.00.07 –
microbiology. – Institute of microbiology and virology of National
Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2005.

The aim of the work was to investigate the influence of heavy metals on
diversity of soil microfungi; resistance, chemotropism and sorption
abilities of micromycetes in relation to copper ions; and degradation of
concrete by mitosporic fungi.

It was isolated and identified 119 species 52 genus (420 strains) of
micromycetes. We have found 3 new and 12 rare species for Ukrainian
micobyota. The quantity of dark-colored micromycetes was greater (40 –
42,5 %) in the most heavy metal polluted soils than in reserve soils
(13,3 – 24,1 %).

All the microfungi were divided on four groups: high resistant,
resistant, sensitive and supersensitive to copper ions strains. We
modified method of tessellated agar tiles to study chemotropic reactions
of micromycetes to copper ions. It has been found 15 strains, which grew
to 2 – 10 mМ Cu2+, 2 negative chemotropic strains and 17 strains with
inhibited growth to copper ions. The radial growth rate of Fusarium and
Trichoderma species towards agar tiles with 6, 8 and 10 mM Cu2+ situated
on the 4 cm distance from fungal inoculum was in 1,5 – 2 times less than
their growth rate towards control agar tiles.

The most efficient sorbents were fungi Cladosporium cladosporioides
(strains 77 and 716) and Stachybotrys chartarum (strains 357 and 424) –
sorption ability was 71,4 – 83,6 %.

The most efficient biodestructors were strains Cladosporium
cladospoioides 3, Alternaria alternata 37 and Aspergillus niger 42,
which produced organic acids and leached Сa2+, Si4+, Al3+ and Fe3+ from
concrete samples.

Кey words: microfungi, soil, heavy metals, copper ions, resistance,
chemotropism, sorption, concrete.

Рис. 1. Ріст Trichoderma harzianum 23 на ЧА у напрямку до агарових
блоків з різними концентраціями іонів міді

Примітки: 1 – ГА з 4 мМ Cu2+,

2 – ГА з 6 мМ Cu2+,

3 – ГА з 8 мМ Cu2+,

4 – ГА з 10 мМ Cu2+.

Рис. 2. Модельна система досліду при рості Aspergillus repens 28 на
поверхні бетону через 1 місяць після інокуляції

Примітки:

1 – чашка Петрі з агаризованим середовищем Чапека;

2 – зразок бетону;

3 – агарові блоки інокулюму мікроскопічних грибів.

1

2

Масштаб 1 см

Встановлено, що на відстані 6 і 5 см від грибного інокулюму до агарових
блоків з іонами міді швидкості радіального росту досліджених штамів до
ЧА (контроль) та ГА з 6, 8 і 10 мM Cu2+ достовірно не відрізнялись
(рис.3). На відстані 4 см швидкість радіального росту грибів достовірно
зменшувалась у 1,5 – 2 рази при дії іонів міді в порівнянні з контролем.
Зі зменшенням відстані до 2 см швидкість радіального росту грибів до
вказаних концентрацій іонів міді в агарових блоках була меншою у 2 – 4
рази за контроль.

Рис.3. Швидкість радіального росту Trichoderma viride 614 до агарових
блоків з різною концентрацією іонів міді, розташованих на різній
відстані від грибного інокулюму

В

Б

А

Примітки: на рис.4. – 8: а – край агаризованого поживного середовища, б
– відстань (2 мм) від краю поживного середовища до краю агарового блоку
з іонами міді, в – край агарового блоку з іонами міді

Рис.4. Ріст на ГА Paecilomyces lilacinus 146 у напрямку до контрольних
блоків ГА (А), ГА з 2 мМ Cu2+ (Б), ГА з 4 мМ Cu2+ (В)

Б

Рис.5. Ріст на ГА Curvularia clavata 627 у напрямку до контрольних
блоків ГА (А), до ГА з 4 мМ Cu2+ (Б)

Рис.6. Ріст Fusarium oxysporum 137 на ГА у напрямку до контрольних
блоків ГА (А) і до ГА з 6 мМ Cu2+ (Б)

Рис.7. Ріст Penicillium thomii 332 на ЧА у напрямку до контрольних
блоків ГА (А) і до ГА з 8 мМ Cu2+ (Б)

Б

А

А

Рис.8. Ріст Alternaria alternata 72 на ЧА (А) і Aspergillus ochraceus 48
на ГА (Б) до ГА з 2 мМ Cu2+

Масштаб 1 см

Рис. 9. Ріст Aspergillus versicolor 26 (А), Aspergillus flavipes 38 (Б)
через 1 місяць і Aspergillus niger 42 через 1 рік після інокуляції (В)

Примітки:

Уевелліт (CaC2O4·H2O) – 0,233; 0,365 Е;

Уедделіт (CaC2O4·2H2O) – 0,277; 0,197 Е

Кварц (SiO2) – 0,115; 0,181 Е

Дифрактограми, отримані за допомогою рентгенівського фазового аналізу,
свідчать, що білі кристалічні утворення – це гідратовані оксалати
кальцію: уевелліт (CaC2O4·H2O) і уедделіт (CaC2O4·2H2O) (рис.10).

Похожие записи