УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

ІНСТИТУТ АГРОЕКОЛОГІЇ

ПЕРЕТЯТКО ТАРАС БОГДАНОВИЧ

УДК: 579.846.2:579.266.4

Екологічне значення сульфатвідновлювальних бактерій штучних водойм (на
прикладі яворівського родовища сірки)

03.00.16 – екологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана
Франка Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, професор

Гудзь Степан Петрович,

Львівський національний

університет імені Івана Франка,

завідувач кафедри мікробіології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

Козлова Ірина Панасівна,

Інститут мікробіології та вірусології

імені Д.К. Заболотного НАН України,

провідний науковий співробітник відділу

загальної та ґрунтової мікробіології

доктор сільськогосподарських наук,

старший науковий співробітник

Шерстобоєва Олена Володимирівна, Інститут агроекології
УААН,

завідувач відділу біологічного моніторингу

Захист відбудеться “ 3 ” жовтня 2007 року об 11 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.371.01 Інституту агроекології УААН за
адресою:

03143, м. Київ, вул. Метрологічна, 12.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту агроекології
УААН за адресою: 03143, м. Київ, вул. Метрологічна, 12.

Автореферат розіслано “28” серпня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат сільськогосподарських наук Я.В. Чабанюк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У природі відбувається кругообіг сполук сірки
(Кузнецов, 1972; Одум, 1975; Гриненко, Иванов, 1983). Усі реакції цього
процесу, за вийнятком асиміляційної сульфатредукції, здійснюють виключно
прокаріоти. Серед них особливе місце посідають сульфатвідновлювальні
бактерії, які здійснюють відновлення сульфатів до сірководню.

Дослідження останніх двох десятиліть суттєво змінили наші погляди на
сульфатвідновлювальні бактерії. Толерантність до кисню (Minz et al.,
1999) і можливість його використання як кінцевого акцептора електронів
(Cypionka, 2000), метаболічна активність сульфатвідновлювальних бактерій
в широкому діапазоні температур і кислотності середовища відкривають
широкі перспективи їх застосування в біотехнологічних процесах.

Антропогенний фактор має важливе значення у кругообігу сполук сірки.
Більше 50% загального виділення сірки з поверхні суші (спалювання
вугілля і нафти, розробка сіркових родовищ) обумовлене діяльністю людини
(Франк, Лушников, 2006).

Відкритий спосіб видобутку сірки у Яворівському родовищі зробив її
доступною для взаємодії з атмосферним киснем і різко стимулював
діяльність аеробних сіркоокиснюючих бактерій, продуктом життєдіяльності
яких є сульфати. Останні в свою чергу стимулюють розвиток та активність
сульфатвідновлювальних бактерій, які використовуючи сульфати як
акцептори електронів відновлюють їх до сірководню. Сірководень є
високотоксичною сполукою і його нагромадження в навколишньому середовищі
створює загрозу для існування усіх живих організмів (Postgate, 1984;
Розанова, Назина, 1989; Rabus et al., 2000).

Біогеохімічна діяльність сульфатвідновлювальних бактерій та їх
екологічна роль у сірковидобувних регіонах України практично не
досліджені. З огляду на це виникає гостра необхідність дослідження
сульфатвідновлювальних бактерій, які є важливою ланкою в циклі
перетворення сполук сірки. Це дасть можливість глибше пізнати процеси
перетворення сірки в регіонах її видобутку і прискорити процеси,
спрямовані на покращення екологічної ситуації в регіоні.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана в рамках наукових досліджень, які проводяться на кафедрі
мікробіології Львівського національного університету імені Івана Франка
за темою Бм-04Ф “Особливості мікробіологічних процесів метаболізму
сірки у сірковидобувних районах”, державний реєстраційний номер
0105U002213.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було встановити екологічне
значення сульфатвідновлювальних бактерій та їх розповсюдження у водоймі
Яворівського сіркового родовища, простежити закономірності відновлення
сульфатів до сірководню та визначити його вплив на прокаріотичну та
еукаріотичну мікробіоту.

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

провести моніторинг популяції сульфатвідновлювальних бактерій у різних
водоймах;

виділити сульфатвідновлювальні бактерії з водойми Яворівського сіркового
родовища та ідентифікувати їх;

дослідити аутекологію виділених штамів сульфатвідновлювальних бактерій;

дослідити вплив факторів середовища на інтенсивність сульфатредукції;

встановити залежність ферментативної активності D. desulfuricans Ya-11
від екологічних чинників;

дослідити вплив сірководню на прокаріотичні та еукаріотичні
тест-організми.

Об’єкт дослідження: функціонування сульфатвідновлювальних бактерій у
водоймах сірковидобувних регіонів.

Предмет дослідження: розповсюдження сульфатвідновлювальних бактерій у
різних водоймах; нагромадження сірководню D. desulfuricans Ya-11 та
вплив факторів середовища на цей процес; вплив сульфіду на прокаріотичні
та еукаріотичні мікроорганізми.

Методи дослідження: фізико-хімічні, хімічні, мікробіологічні,
цитологічні, біохімічні, генетичні, електронномікроскопічні,
статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. На основі вперше проведеного
екологічного моніторингу сульфатвідновлювальних бактерій у водоймі
Яворівського сіркового родовища та у водоймах, не пов’язаних з
видобутком сірки (озера Пісочне та Світязь Шацького національного
природного парку і заповідника “Розточчя”), що включав у себе контроль і
аналіз хімічного складу води, мікробіологічний контроль загальної
чисельності даної фізіологічної групи бактерій, отримано нові дані щодо
екології та кількісного складу сульфатвідновлювальних бактерій водойм.

Вперше з водойми Яворівського сіркового родовища виділено штами
сульфатвідновлювальних бактерій, які можуть засвоювати глюкозу як
джерело карбону. Вивчена аутекологія найбільш активного штаму D.
desulfuricans Ya-11. У клітинах D. desulfuricans Ya-11 виявлено вищу
питому активність АФС-редуктази порівняно з іншими, раніше описаними,
штамами цього виду. Вивчено оптимальні умови прояву високої активності
ферменту та встановлена його нуклеотидна специфічність. Вперше показано,
що сірководень виявляє токсичну і мутагенну дію на про- і еукаріоти (на
прикладі D. desulfuricans, S. typhimurium та

S. cerevisiae).

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати дають
можливість удосконалити методи виділення чистих культур
сульфатвідновлювальних бактерій. Виділена культура
сульфатвідновлювальних бактерій, що здійснює найбільш інтенсивне
відновлення сульфатів до сірководню порівняно з музейним штамом D.
desulfuricans К-45, депонованого в музеї Інституту мікробіології і
вірусології імені Д.К. Заболотного НАН України.

Результати вивчення впливу різних чинників зовнішнього середовища на
життєдіяльність cульфатвідновлювальних бактерій можуть бути використані
для розробки шляхів регулювання рівня сірководню у водоймах
сірковидобувних районів, а також для розробки ефективних біотехнологій
для очистки середовища від сульфатів. Вивчення впливу різних факторів на
утворення сірководню дасть можливість знизити рівень забруднення
навколишнього середовища цією сполукою. Матеріали дисертаційної роботи
використовуються у лекційних курсах для студентів біологічного
факультету Львівського національного університету імені Івана Франка,
зокрема при викладанні курсу „Мікробіологія” та спецкурсу з екології
мікроорганізмів.

Особистий внесок здобувача. Згідно з поставленою метою і завданнями
здобувачем самостійно за темою досліджуваних питань опрацьовано значний
обсяг літератури, виділено чисті культури сульфатвідновлювальних
бактерій, проведено їх ідентифікацію, досліджено ріст та закономірності
сульфатредукції виділеними штамами сульфатвідновлювальних бактерій,
засвоєння ними органічних сполук, утворення сульфіду D. desulfuricans
Ya-11 за різних умов культивування, визначено активність АФС-редуктази
D. desulfuricans Ya-11 і встановлено мутагенну дію сульфіду на бактерії
та дріжджі.

Спільно з науковим керівником кандидатом біологічних наук, професором
С.П. Гудзем інтерпретовано одержані дані та сформульовано основні
положення дисертаційної роботи, підготовлено до друку наукові статті.

Якісне визначення десульфовіридину виконано спільно з к.б.н., с.н.с.

А.І. Піляшенком-Новохатнім (Інститут мікробіології і вірусології імені

Д.К. Заболотного НАН України), приготування зразків та
електронно-мікроскопічні дослідження – спільно з завідувачем
міжфакультетської лабораторії електронної мікроскопії к.б.н., с.н.с.
О.Р. Кулачковським (Львівський національний університет імені Івана
Франка). Хімічний аналіз води виконаний на кафедрі аналітичної хімії
Львівського національного університету імені Івана Франка.

Апробація результатів дисертації. Основні положення і результати
дисертації були представлені на 1-му (Установчому) Українському конгресі
з клітинної біології (з міжнародним представництвом) (Львів, 2004), ІІІ
(Х) з’їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004), Першій та
Другій Міжнародних конференціях студентів та аспірантів “Молодь і поступ
біології” (Львів, 2005, 2006), ІХ Міжнародному медичному конгресі
студентів і молодих учених (Тернопіль, 2005), 10-й Пущинській
міжнародній школі-конференції молодих вчених “Биология – наука ХХІ века”
(Пущино, 2006), Міжнародній конференції студентів та молодих науковців
“Сучасні проблеми мікробіології і біотехнології” (Одеса, 2007),
науково-практичній конференції молодих учених “Екологічні проблеми
сільськогосподарського виробництва” (Київ, 2007), наукових конференціях
професорсько-викладацького складу і наукових співробітників Львівського
національного університету імені Івана Франка (Львів, 2004, 2005, 2006,
2007), наукових семінарах кафедри мікробіології Львівського
національного університету імені Івана Франка.

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 16
друкованих праць, в тому числі у виданнях, рекомендованих ВАК України –
6 статей та 10 тез доповідей на міжнародних та регіональних
конференціях.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається із вступної
частини, огляду літератури, опису об’єктів та методів дослідження,
результатів досліджень та їх обговорення, підсумку, висновків, списку
використаних джерел (61 вітчизняних видань та 192 іноземних). Робота
викладена на 140 сторінках друкованого тексту, ілюстрована 19 таблицями
і 17 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

За даними аналізу результатів вітчизняних та іноземних авторів щодо
розповсюдження та біогеохімічної діяльності сульфатвідновлювальних
бактерій у штучних водоймах, що утворилися внаслідок промислового
видобутку сірки, відмічено відсутність даних про вплив факторів
середовища на утворення ними сульфіду і редукцію сульфатів та з’ясування
дії сульфіду на про- та еукаріотичну мікробіоту. На основі аналітичного
огляду наукової літератури обґрунтовано необхідність та перспективність
проведення досліджень за темою дисертації.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Відбір проб води та мулу здійснювали з різних глибин водної товщі: 30-40
м водойми Яворіського родовища сірки та 3-10 м озер Шацького
національного природного парку та природного заповідника “Розточчя”.

Кількісний склад сульфатвідновлювальних бактерій досліджуваних водойм
визначали за результатами посіву проб води та мулу на середовище
Кравцова-Сорокіна (Каравайко и др., 1972).

Визначення складових води проводили: фотометричним (Feзаг, SO42-,
HCO3-) методом (Лурье, 1984), а також полум’яно-емісійною
спектрофотометрією (K+ і Na) і титруванням (Ca2+ та Mg2+, Cl-, H2S)
(Крешков, 1961; Марченко, 1971). Концентрацію іонів водню у пробі
визначали за допомогою pH-метра МТ-58.

Ідентифікацію виділених культур сульфатвідновлювальних бактерій
проводили за морфо-фізіологічними і біохімічними ознаками, користуючись
визначником бактерій Берджі (Хоулт и др., 1997).

Визначення концентрації ацетату у середовищі проводили титруванням
(Бабко, П’ятницький, 1974; Лурье, 1984), сульфату — турбідометрично
(ГОСТ 26426-85, 1985).

Електронно-мікроскопічні дослідження проводили за Рейнольдсом (Reynolds,
1963).

Бактерії вирощували на рідкому або агаризованому мінеральному середовищі
Кравцова-Сорокіна (Каравайко та ін., 1972), Постгейта В і С (Postgate,
1984) в анаеробних умовах при температурі 28 0С впродовж 7-14 діб. Для
поглинання кисню використовували генератори GENbox anaer (Франція). При
вивченні здатності сульфатвідновлювальних бактерій засвоювати органічні
сполуки до середовища як джерело вуглецю вносили етанол і глюкозу,
органічні кислоти у вигляді солей натрію – мурашину, оцтову, молочну,
піровиноградну, пропіонову, фумарову, яблучну, лимонну, стеаринову,
олеїнову і бензойну, амінокислоти – аланін, гліцин, глутамін, серин,
триптофан, а також молеуклярний водень. Водень одержували з
використанням електролізеру (Карякин, 1947).

Визначення наявності десульфовіридину досліджуваних бактерій проводили з
використанням спектрофотометра SPEKOL 11 з флуорометричною приставкою FK
(Postgate, 1959).

Визначення активності ферментів здійснювали у безклітинних екстрактах.
Двічі відмиті клітини руйнували ультразвуком на ультразвуковому
дезінтеграторі УЗДН-2Т частотою 22 МГц протягом 5 хв. Інтактні клітини
та їх уламки осаджували центрифугуванням при 15 тис. об./хв протягом 45
хв., а отриманий супернатант використовували як безклітинний екстракт.

Концентрацію білка визначали за методом Лоурі (Lowry, 1951).

Активність АФС-редуктази визначали за кількістю відновленого цитохрому с
за одиницю часу (Bramlett, Peck, 1975), каталази — за кількістю
розкладеного пероксиду водню за одиницю часу (Luck H., 1963), а
супероксиддисмутази — за швидкістю окиснення кверцитину (Костюк та ін.,
1990).

Для визначення токсичності сульфіду використовували бактеріальні та
дріжджові культури. Сульфід додавали у середовище в концентраціях 0,05-5
г/л.

Для визначення мутагенної активності сульфіду використовували

S. typhimurium TA-98 та S. cerevisiae D-67-S. У першому випадку
мутагенну активність сірководню визначали з допомогою тесту Еймса, який
дозволяє реєструвати здатність досліджуваної речовини індукувати
зворотні мутації від ауксотрофності до прототрофності за гістидином
(Ames, 1972). Про мутагенну дію сірководню на дріжджі судили за появою
ауксотрофних мутантів.

Статистичну обробку отриманих результатів проводили з використанням
програми “Microsoft Excel 2003” (Тюрин, Макаров, 1995; Лапач, 2001).
Вибір тактики статистичної обробки і підготовку даних для аналізу
здійснювали, базуючись на загальноприйнятих методах (Лакин, 1990) при
рівні достовірності Р < 0,05. Графічне відображення одержаних результатів, набір і макетування тексту здійснювали з допомогою програм “Microsoft Excel 2003” і “Microsoft Word 2003” РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ Розповсюдження сульфатвідновлювальних бактерій у різних водоймах. Встановлено, що у водах, збагачених сульфатами, інтенсивність сульфатредукції не лише визначає швидкість розвитку фотосинтезуючих і безбарвних сіркобактерій, але є каталізатором кругообігу речовин біотопу в цілому (Намсараев и др., 1984). Висока концентрація сульфатів у водоймі Яворівського сіркового родовища (1,7 г/л) за наявності органічних речовин створює сприятливі умови для життєдіяльності сульфатвідновлювальних бактерій. Чисельність сульфатвідновлювальних бактерій у нижніх шарах водної товщі кар’єру становить 1,42-1,52?106 кл./мл, а в мулі – 4,71?106, що свідчить про їхнє широке розповсюдження у даній водоймі та відповідно, характеризує протікання процесу дисиміляційної сульфатредукції. У контрольних водоймах (озерах Пісочне та Світязь Шацького національного природного парку та водойм на території природного заповідника “Розточчя”) кількість сульфатвідновлювальних бактерій була значно меншою. Так, їх кількість у мулі не перевищувала 1,23?102, 0,97?102 та 2,39?102, відповідно, а у воді була ще меншою, що на чотири порядки нижче порівняно з кількістю сульфатвідновлювальних бактерій у водоймі Яворівського сіркового родовища. Вміст сірководню коливався в межах від 20 до 80 мг/л. У верхніх шарах води його вміст складав 8,52 мг/л. Концентрація сірководню найбільша на глибині 40м (рівень наповнення - 50м) і складала майже 80 мг/л, що обумовлено діяльністю сульфатвідновлювальних бактерій, життєдіяльність яких зв’язана з анаеробними зонами водойм. Відносно низька концентрація сульфіду у верхніх шарах з одного боку є причиною окиснення його киснем повітря, а з іншого – діяльністю сіркоокиснюючих бактерій. Таким чином, відкрите промислове видобування сірки призвело до інтенсифікації процесів її окиснення, зростання вмісту сульфатів, підвищення чисельності сульфатвідновлювальних бактерій, і як наслідок цього, посилення процесів, що ведуть до нагромадження сірководню в навколишньому середовищі. Виділення чистих культур сульфатвідновлювальних бактерій із штучних водойм та їх ідентифікація. Із зразків води і мулу, відібраних із водойми Яворівського сіркового родовища, виділені чисті культури сульфатвідновлювальних бактерій. Для виявлення колоній сульфатвідновлювальних бактерій у середовище додавали залізо у формі солі Мора. Це сприяло утворенню в середовищі FeS і наданню колоніям чорного кольору. За цією ознакою відібрано 95 культур. Для виділення чистих культур проводили багатократні посіви із окремих колоній. Усі відібрані культури в процесі росту виділяли сірководень, але відрізнялися за швидкістю росту. Відібрано 15 культур, які використовували у подальших дослідженнях. Усі культури на основі морфо-фізіологічних (рис. 1) та біохімічних ознак ідентифіковані як Desulfovibrio desulfuricans . Рис. 1. Електронно-мікроскопічні фотографії клітин досліджуваних культур сульфатвідновлювальних бактерій: № 1(1), 3(2), 4(3), 5(4), 8(5), 9(6), 11(7) та 15(8). Вплив екологічних факторів середовища на утворення сульфіду D.desulfuricans Ya-11. Результати експериментів з дослідження росту та сульфатредукції виділеними штамами показали, що максимум нагромадження біомаси бактеріями спостерігався на 10 добу культивування. Збільшення часу культивування до 14 діб не супроводжувалося зростанням біомаси досліджуваних штамів (табл. 1). За рівнем нагромадження біомаси культури суттєво відрізнялися між собою. Так, наприклад, біомаса D.desulfuricans Ya-11 в цих умовах складала 4,05 г/л, в той час як D. desulfuricans Ya-7 вона була в 3 рази меншою. Таблиця 1 Ріст і нагромадження сульфіду різними штамами сульфатвідновлювальних бактерій Штами Біомаса, г/л Концентрація S2-, мМ D. desulfuricans К-45 3,204 ± 0,157 5,606 ± 0,230 D. desulfuricans Ya-1 2,625 ± 0,105 5,013 ± 0,142 D. desulfuricans Ya-2 1,589 ± 0,064 2,251 ± 0,098 D. desulfuricans Ya-3 2,250 ± 0,124 4,409 ± 0,149 D. desulfuricans Ya- 4 2,720 ± 0,135 6,740 ± 0,257 D. desulfuricans Ya-5 1,712 ± 0,085 5,147 ± 0,230 D. desulfuricans Ya- 6 1,536 ± 0,068 1,232 ± 0,047 D. desulfuricans Ya-7 1,308 ± 0,046 0,254 ± 0,012 D. desulfuricans Ya-8 1,857 ± 0,095 5,918 ± 0,254 D. desulfuricans Ya-9 1,458 ± 0,086 0,725 ± 0,037 D. desulfuricans Ya-10 1,627 ± 0,125 3,568 ± 0,158 D. desulfurican Ya-11 4,051 ± 0,197 7,015 ± 0,299 D. desulfuricans Ya-12 1,859 ± 0,107 3,256 ± 0,125 D. desulfuricans Ya- 13 1,458 ± 0,071 1,325 ± 0,054 D. desulfuricans Ya- 14 1,325 ± 0,064 0,812 ± 0,037 D. desulfuricans Ya-15 1,368 ± 0,052 0,552 ± 0,020 Штам D. desulfuricans Ya-11 за нагромадженням біомаси перевищув музейний штам D. desulfuricans К-45 на 20%. Крім того, D. desulfuricans Ya-11, найбільш інтенсивно здійснювала дисиміляційну сульфатредукцію, так як в середовищі культивування нагромаджувалася найбільша кількість сульфіду. Вплив температури. В природних умовах водний температурний режим постійно змінюється. Тому, використавши відмиті клітини, ми дослідили як протікає процес сульфатредукції за різних температур (табл. 2). Як видно з табл. 2, із зниженням температури до 40 С процес сульфатредукції D.desulfuricans Ya-11 не припиняється. Вплив рН. Для визначення впливу рН на D. desulfuricans Ya-11 бактерії вирощували в анаеробних умовах при рН 5,0-10,0. В усіх варінтах бактерії культивували при 28 0С. Встановлено, що найбільш інтенсивний ріст бактерій і нагромадження сірководню спостерігається при рН 7,5-8,0. Зниження кислотності середовища, як і її зростання супроводжувалося пониженням швидкості росту бактерій і виділення ними сульфіду. Подібні результати отримані Фурутані та ін., які показали, що при низьких значеннях рН процес дисиміляційної сульфатредукції і виділення сірководню суттєво сповільнюються (Furutani et al., 1984). Вплив О2. .Вирощування сульфатвідновлювальних бактерій в аеробних і анаеробних умовах показало, що аерація призводить до загибелі клітин. Однак нетривалий контакт клітин D. desulfuricans Ya-11 з киснем не супроводжується їх відмиранням, що, очевидно, пояснюється високою активністю ферментів антиоксидантного захисту – каталази та супероксиддисмутази (табл. 3). Таблиця 3 Каталазна та супероксиддисмутазна активність клітин D. desulfuricans Ya-11 в анаеробних та аеробних умовах Умови вирощування Каталазна активність Супероксиддисмутазна активність ммоль?хв-1?мг-1 білка Анаеробні 0,173 ± 0,009 25,2 ± 0,15 Аеробні 0,088 ± 0,005 31,8 ± 0,18 Висока каталазна активність виявлена і в інших сульфатвідновлювальних бактерій, зокрема, Desulfovibrio vulgaris ( HYPERLINK "http://www.blackwell-synergy.com/action/doSearch?action=runSearch&type= advanced&result=true&prevSearch=%2Bauthorsfield%3A(Krekeler%2CDaniel)" Krekeler et al., 1998), D. oxyclinae (Dos Santos et al., 2000), D. gigas (Брюханов и др., 2002) та представників роду Desulfotomaculum (Брюханов и др., 2002). Види Desulfovibrio та Desulfotomaculum є домінуючими сульфатвідновлювальними бактеріями при затопленні грунтів, зустрічаються у прісних та морських осадах, в кишечнику тварин, тобто, у місцях з можливим періодичним виникненням аеробних умов. Що стосується супероксиддисмутази, її активність була на 26% вищою при вирощуванні бактерій у аеробних умовах, ніж у анаеробних (табл. 3.). У літературі також є дані про те, що каталазна та супероксиддисмутазна активність виявлена у екстрактах клітин бактерій, вирощених анаеробно (Брюханов, Нетрусов, 2004). Висока активність каталази і супероксиддисмутази за відсутності кисню свідчить про конститутивну їх експресію. Експресія ферментів антиоксидантного захисту навіть в анаеробних умовах захищає клітини від токсичних продуктів відновлення кисню, що утворюються при раптовій кисневій експозиції (Брюханов, Нетрусов, 2004). Активність сульфатвідновлювальних бактерій залежно від концентрацій сульфату та органічної речовини в середовищі. Показано, що у вихідному середовищі, що містило 10,9 мМ сульфату, ріст бактерій досягав максимуму вже на третю добу культивування, після чого його рівень незначно знижувався, що могло свідчити про зниження метаболічних процесів у клітинах через нестачу акцептора електронів (рис. 2, а). Дослідження динаміки використання сульфатів цими бактеріями показало, що на цей час культура практично повністю (> 97%) використовувала сульфат з
середовища, що могло бути причиною припинення росту бактерій після
третьої доби культивування (рис. 2, а). Збільшення вмісту сульфату у
1,5-2,0 рази показало, що підвищення його концентрації у середовищі не
супроводжувало зростання біомаси (рис. 2, б, в). Незважаючи на наявність
у середовищі ще доволі високої концентрації акцептора електронів,
характер росту культури не змінювався. Залишалося припустити, що іншим
лімітуючим фактором

а б

Рис. 2. Використання сульфату (-?-), нагромадження біомаси (-?-) і
утворення сульфіду (-?-) D.desulfuricans Ya-11 у середовищі з різною
концентрацією сульфату:

а – 10,9 мМ; б – 16,3 мМ; в – 21,8 мМ.

є відсутність окиснюваних органічних сполук — донорів електронів. У
наступних експериментах ми збільшили вміст лактату до 5 г/л на фоні
високого вмісту сульфату в середовищі (10,9 мМ) (рис. 3.). Результати
цього експерименту свідчать, що підвищення вмісту донора і акцептора
електронів не супроводжується суттєвим зростанням біомаси.

Рис. 3. Використання сульфату (-?-), нагромадження біомаси (-?-) та
утворення сульфіду (-?-) D. desulfuricans Ya-11.

Відомо, що представники різних видів сульфатвідновлювальних бактерій не
однаково реагують на вміст сульфіду у середовищі (Розанова, Назина,
1989). У дослідах з D. desulfuricans Ya-11 при збільшенні вмісту
сульфатів і лактату у середовищі у два рази виділення сульфіду клітинами
зростало незначно і було лише на 25 % вищим порівняно з контрольним
середовищем (рис. 2). Зниження темпів росту бактерій і зменшення рівня
сульфіду могло бути свідченням інгібуючої дії останнього на метаболізм
бактерій, тому в наступних експериментах ми додавали до середовища різні
концентрації сульфіду.

Виявилось (рис. 4, а), що при концентраціях 0,8 і 1,6 мМ помітних змін в
характері росту бактерій не спостерігалось. Збільшення концентрації
сульфіду до

a

V ‚ 1/4 A D

t

?

?

oe

TH

a

V ? 3/4

D

F

?

?

?

¤

????

”yW

A

????

”yW

A

????

”yW

A

????

”yW

A

????

”yW

A

????

”yW

A

????

”yW

A

????

”yW

A

????

”yW

A

????

”yW

A

????

”yW

A

????

”yW

A

????

”yW

A

????

”yW

A

????

”yW

A

????

”yW

A

”yW

A

?kdz

?

?

??

??

P

¤P…kd?

P

/ б

Рис. 4. Вплив додатково внесеного сірководню на ріст

D. desulfuricans Ya-11: а – сірководень вносили перед засівом культурою
бактерій,

б – після трьох діб росту. Стрілкою показаний час внесення сульфіду в
середовище.

3 мМ супроводжувалося зниженням темпів росту культури. При концентраціях
сульфіду 6,3 і 9,4 мМ ріст бактерій інгібувався повністю. Додавання
сульфіду в цих концентраціях до культури бактерій, що знаходилася у фазі
логарифмічного росту викликало припинення росту (рис. 3, б) і зниження
густини суспензії бактерій майже в 4 рази. Очевидно, сірководень не
тільки пригнічує ріст бактерій, що має місце у представників
Desulfotomaculum (Розанова, Назина, 1989), а й викликає лізис клітин.
Таким чином, культура D. desulfuricans Ya-11 виявилася чутливою до
підвищених концентрацій сульфіду у середовищі. Її ріст повністю
пригнічується за наявності у середовищі 6 мМ сульфіду.

Засвоєння органічних сполук D. desulfuricans Ya-11. Досліджено здатність
D. desulfuricans Ya-11 засвоювати форміат, лактат, піруват, пропіонат,
фумарат, малат, цитрат, метанол, етанол, ацетат, гліцерин, глюкозу,
олеат, стеарат та бензоат. Рівень нагромадження біомаси бактерій у
середовищах з цими речовинами відрізнявся. Із цього широкого спектру
органічних сполук досліджувані бактерії росли лише у середовищах з
лактатом, піруватом, фумаратом, малатом, цитратом, етанолом та глюкозою.
Крім того, бактерії добре росли у середовищі з молекулярним воднем у
присутності вуглекислоти та ацетату. Отже, D. desulfuricans Ya-11 здатні
до хемолітогетеротрофного росту.

ref SHAPE \* MERGEFORMAT Крім органічних кислот з різною довжиною
вуглецевого ланцюга і спиртів,

D. desulfuricans Ya-11 здатні засвоювати деякі амінокислоти.

Здатність сульфатвідновлювальних бактерій утилізувати широкий спектр
органічних речовин за наявності у середовищі високої концентрації
сульфатів потрібно враховувати під час проведення ремедіаційних робіт у
сірковидобувних регіонах, у тому числі й у разі створення зон відпочинку
на місці найбільшого у світі Яворівського сіркового кар’єру, оскільки
нагромадження сірководню вище допустимих норм зробить його непридатним
для використання.

Вплив на ферментативну активність D. desulfuricans Ya-11 різних факторів
середовища. У безклітинних екстрактах D. desulfuricans Ya-11, одержаних
при обробленні клітин ультразвуком, виявлена доволі висока активність
АФС-редуктази (6,02 мкмоль? хв-1?мг-1 білка) (табл. 4), що свідчить про
активну участь цих бактерій у дисиміляційній сульфатредукції.

При цьому виявили, що 80% від загальної активності ферменту припадало на
розчинну фракцію і лише 20% її активності виявлено в осаді. З цього
випливає, що фермент, очевидно, локалізований в цитоплазмі, проте
одержані результати не є остаточними і не заперечують мембранної
локалізації АФС-редуктази

D. desulfuricans Ya-11 (Aldrich et al., 1987). Безклітинний екстракт D.
desulfuricans Ya-11 проявляв вищу АФС-редуктазну активність порівняно з
ферментом інших штамів D. desulfuricans (Fritz et al., 2000).

На рис. 5 показана залежність активності АФС-редуктази від концентрації
сульфату у середовищі. Збільшення вмісту сульфату до 10,9 мМ
супроводжується збільшенням активності ферменту. Подальше зростання
концентрації сульфату не призводить до зростання активності ферменту.

Рис. 5. Активність АФС-редуктази D. desulfuricans Ya-11 за різних
концентрацій сульфату у середовищі.

Встановлено, що максимальну активність фермент виявляв при температурі
300 С (рис. 6, а). рН-оптимум досліджуваного ферменту припадає на 9,5
(рис. 6, б). Подібні результати отримані для АФС-редуктази інших
сульфатвідновлювальних бактерій (Stille, Truper, 1984).

а б

Рис. 6. Вплив температури (а) та рН (б) на активність АФС-редуктази

D. desulfuricans Ya-11

Визначення нуклеотидної специфічності АФС-редуктази D. desulfuricans

Ya-11 показало, що активність ферменту була найвищою за наявності
аденозинмонофосфату в реакційній суміші (табл. 5). Активність
АФС-редуктази в присутності аденозиндифосфату, аденозинтрифосфату, а
також мононуклеотидів цитозину, тиміну та урацилу була значно нижчою.
Лише за наявності в інкубаційній суміші гуанозинмонофосфату вона сягала
38% від контролю (табл. 5).

Подібні результати були одержані в експериментах з АФС-редуктазою
Thiobacillus thіоparus та Thiocapsа roseopersicina (Lyric, Suzuk, 1970;
Truper, Rogers, 1971).

Таблиця 5

Активність АФС-редуктази D. desulfuricans Ya-11 за наявності різних
нуклеотидів

Нуклеотиди Активність

мкмоль/ хв?мг білка %

АМФ 4,22 ± 0,08 100

АДФ 0,64 ± 0,18 15,17

АТФ 0,59 ± 0,05 13,98

ЦМФ 0,35 ± 0,05 8,29

ГМФ 1,60 ± 0,22 37,91

УМФ 0,26 ± 0,03 6,16

Таким чином, у клітинах D. desulfuricans Ya-11 виявлена висока
активність АФС-редуктази, що вказує на важливу роль цих бактерій у
процесах нагромадження сірководню у штучних водоймах, які утворилися
внаслідок промислового видобутку сірки.

Вплив сульфіду – продукту життєдіяльності сульфатвідновлювальних
бактерій — на еукаріотичну та прокаріотичну мікробіоту на прикладі

S. typhimurium i S. cerevisiae. Додавання сульфіду до середовища
викликало збільшення кількості колоній ревертантів S. typhimurium TA-98,
максимум утворення яких спостерігався при концентрації сульфіду 200-300
мг/л. Результати дослідження мутагенної дії сірководню на S. typhimurium
показали, що сульфід у концентраціях 100-300 мг/л виявляє мутагенну дію,
яка характеризується як слабка (Дуган, 1998) (табл. 6).

Таблиця 6

Вплив сульфіду на появу ревертантів S. typhimurium TA-98

Концентрація сульфіду, мг/л Кількість колоній

(Хд) Хд/Хк

0 87,5 ± 6,25 –

25,0 96,5 ± 9,7 1,1

50,0 107,0 ± 8,9 1,2

75,0 154,0 ± 12,0 1,8

100,0 182,0 ± 13,5 2,1

200,0 207,5 ± 13,0 2,4

300,0 287,4 ± 21,5 3,3

Результати експериментів по виживанню дріжджів S. cerevisiae під впливом
сульфіду показали, що сульфід у концентрації 50 мг/л навіть при 45 хв
обробленні клітин не виявляв помітної інгібуючої дії на дріжджі (рис.
7).

Рис. 7. Вплив різних концентрацій сульфіду на виживання S. cerevisiae
D-67-S.

Підвищення вмісту сульфіду до 1 г/л при такому ж часі експозиції
викликало загибель більше 80 % клітин, а концентрація сульфіду 5 г/л
повністю інгібувала ріст клітин при їх обробленні протягом 15 хв.

Для дослідження мутагенної дії сульфіду на дріжджі використовували його
концентрацію 1 г/л і тривалість оброблення 45 хв., що як видно з рис. 7,
забезпечувало 16 % виживання клітин. Отже, сульфід у концентраціях
більше 1 г/л виявляє сильну токсичну дію на дріжджі.

Було обстежено 93 тис. колоній і виявлено, що 21 з них при перенесенні
на мінімальне середовище не росли. Багаторазові пересіви їх у рідке
мінімальне середовище підтвердило, що вони є ауксотрофними мутантами.

Таким чином, одержані нами результати показують, що сірководень виявляє
токсичну дію на прокаріотичну і еукаріотичну мікробіоту, а у випадку

S. typhimurium і S. сerevisiae вперше встановлена його мутагенна дія.

ВИСНОВКИ

У дисертації вивчена екологія сульфатвідновлювальних бактерій,
досліджені мікробіологічні і хімічні характеристики водойми Яворівського
сіркового родовища, морфо-фізіологічні та біохімічні властивості
виділених культур сульфатвідновлювальних бактерій, що дозволило
з’ясувати їх роль у процесі нагромадження сірководню та вивченню його
впливу на про- і еукаріотичну мікробіоту.

1. Проведений екологічний моніторинг сульфатвідновлювальних бактерій у
водоймах Яворівського сіркового родовища та озер Пісочне та Світязь
Шацького національного природного парку і заповідника “Розточчя”, який
показав, що їх кількість у водах сірковидобувного регіону на чотири
порядки вища, ніж у водоймах, що не зазнали техногенного впливу,
пов’язаного з видобутком сірки.

2. Промисловий відкритий спосіб видобутку сірки сприяє нагромадженню
значних кількостей сульфатів у водоймі Яворівського сіркового родовища.
Їх рівень у три рази перевищує гранично допустимі концентрації; вони
активізують розвиток і діяльність сульфатвідновлювальних бактерій, що
супроводжується нагромадженням сірководню у навколишньому середовищі до
80 мг/л.

3. Із водойми Яворівського сіркового родовища виділено 15 штамів
сульфатвідновлювальних бактерій, які на основі морфо-фізіологічних та
біохімічних властивостей ідентифіковані як Desulfovibrio desulfuricans.

4. Вивчена аутекологія найбільш активного штаму D. desulfuricans Ya-11,
оптимальні умови росту і розвитку якого: температура – 28-350 С, рН –
7,5-8,0, відсутність вільного кисню у середовищі.

Донорами електронів для виділених бактерій можуть слугувати молекулярний
водень, лактат, піруват, глюкоза, етанол, фумарат, цитрат і деякі
амінокислоти; акцептором електронів служить сульфат. Сірка не
використовується ними як акцептор електронів. Усі виділені культури в
процесі росту нагромаджують у середовищі ацетат. Виділені штами здатні
до хемолітогетеротрофного росту. Вони окиснюють молекулярний водень і
використовують ацетат і вуглекислий газ на асиміляційні потреби.

Показано, що виділені культури в процесі росту утворюють сірководень,
кількість якого еквімолярна кількості засвоєного сульфату.

У D. desulfuricans Ya-11 виявлена висока активність АФС-редуктази.
Максимальна активність ферменту спостерігається за температури 300 С і
рН — 9,5. АФС-редуктаза D. desulfuricans Ya-11 виявляє нуклеотидну
специфічність до АМФ. При заміні АМФ на інші нуклеотиди активність
ферменту знижувалась у 3-15 разів. До 80% активності АФС-редуктази
виявлено у цитоплазмі. Синтез АФС-редуктази регулюється концентрацією
сульфату у середовищі.

Встановлено, що сірководень пригнічує ріст і відновлення сульфату у

D. desulfuricans Ya-11. За наявності в середовищі 6 ммоль сірководню
спостерігається повне пригнічення росту і відмирання клітин. Присутність
сірководню у середовищі викликає появу зворотніх мутантів у S.
typhimurium і ауксотрофних мутантів у S. cerevisiae.

Список опублікованих автором праць за темою дисертації

1. Гудзь C.П., Гнатуш С.О., Перетятко Т.Б., Паляниця Б.Ю., Коструба
М.Ф., Подопригора О.І., Клим І.Р. Динаміка змін титру
сульфатвідновлювальних бактерій та вмісту сульфатів і сірководню у водах
кар’єру Яворівського сіркового родовища в процесі його затоплення //
Вісник Львів. ун-ту. Серія біол. – 2004. – Вип. 37. – С. 185-189
(Узагальнення літературних джерел, проведення експериментальної роботи,
участь у написанні статті).

2. Перетятко Т.Б., Галушка А.А., Гнатуш С.О., Мороз О.М., Подопригора
О.І., Клим І.Р., Гудзь С.П. Використання органічних сполук
сульфатвідновлювальними бактеріями роду Desulfovibrio // Науковий вісник
Ужгородського університету. Серія Біологія. – 2006. – Вип. 18. — С.
157-160 (Аналіз та узагальнення літературних даних, проведення
мікробіологічних досліджень, узагальнення та інтерпретація результатів,
участь у написанні статті).

3. Перетятко Т.Б., Гнатуш С.О., Гудзь С.П. Сульфатвідновлювальні
бактерії Яворівського сіркового родовища // Мікроб. журнал. – 2006. – Т.
68, № 5. — С. 87-93 (Проведення експериментальної роботи, аналіз та
узагальнення літературних джерел, аналіз результатів, участь у написанні
статті).

4. Галушка А.А., Перетятко Т.Б., Гудзь С.П. Бактерії циклу сірки та їх
роль у природі // Вісник Львів. ун-ту. Серія біол. – 2007. – Вип. 43. –
С. 61-77 (Участь в аналізі даних і написанні статті).

5. Перетятко Т.Б., Гнатуш С.О., Гудзь С.П. Утворення сульфіду
Desulfovibrio desulfuricans Ya-11 за різних умов культивування // Вісник
Львів. ун-ту. Серія біол. – 2007. – Вип. 43. – С. 180-184 (Проведення
експериментальної роботи, аналіз та узагальнення літературних джерел,
аналіз результатів, участь у написанні статті).

6. Перетятко Т.Б., Гудзь С.П. АФС-редуктаза Desulfovibrio desulfuricans
Ya-11 // Біологічний вісник. – Харків. – 2007. – Т. 11, № 1. – С. 64-66
(Аналіз та узагальнення літературних даних, проведення експериментальної
роботи, інтерпретація отриманих результатів, участь у написанні статті).

7. Паляниця Б.Ю., Перетятко Т.Б., Мороз О.М., Кулачковський О.Р., Гудзь
С.П., Гнатуш С.О. Морфофізіологічні особливості клітин культур
сіркометаболізуючих бактерій // 1-й (Установчий) Український конгрес по
клітинній біології (з міжнародним представництвом), Львів (Україна). –
25-28 квітня, 2004. – С. 262.

8. Перетятко Т.Б., Паляниця Б.Ю., Гудзь С.П., Гнатуш С.О., Мороз О.М.,
Кулачковський О.Р. Морфо-фізіологічні характеристики нових
сіркоокиснюючих та сульфатредукувальних бактерій // ІІІ (Х) з’їзд
Товариства мікробіологів України. – Одеса, ОНУ імені І.І. Мечнікова,
15-17 вересня 2004 р. – С. 229.

9. Паляниця Б.Ю., Перетятко Т.Б., Гудзь С.П., Гнатуш С.О., Яворська
Г.В., Звір Г.І., Мороз О.М. Утворення сірководню клітинами культур
сульфатредукувальних бактерій та його окиснення сіркоокиснюючими
бактеріями // ІІІ (Х) з’їзд Товариства мікробіологів України. – Одеса,
ОНУ імені І.І. Мечнікова, 15-17 вересня 2004 р. – С. 228.

10. Перетятко Т.Б., Гудзь С.П., Гнатуш С.О., Мороз О.М., Галушка А.А.
Дисиміляційна сульфатредукція і утворення сірководню бактеріями,
виділеними з водойм сіркових родовищ // Перша Міжнародна конференція
студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології”. — Львів, ЛНУ імені
Івана Франка, 11-14 березня 2005 р. – С. 171.

11. Галушка А.А., Перетятко Т.Б. Продуктивність утворення сульфід-іону
сульфатредукувальними бактеріями // ІХ Міжнародний медичний конгрес
студентів і молодих учених. — Тернопіль, 21-22 квітня 2005 р. – с. 216.

12. Галушка А.А., Перетятко Т.Б., Гудзь С.П. Деякі закономірності
сульфатредукції у водоймах сірковидобувних регіонів // Друга Міжнародна
конференція студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології”. — Львів,
ЛНУ імені Івана Франка, 21-24 березня 2006 р. – С. 283.

13. Кучерепа О.І., Перетятко Т.Б., Мороз О.М., Звір Г.І.
Сірковідновлювальні бактерії Desulfuromonas acetoxidans, виділені з
Яворівського сіркового родовища // Друга Міжнародна конференція
студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології”. — Львів, ЛНУ імені
Івана Франка, 21-24 березня 2006 р. – С. 300-301.

14. Перетятко Т.Б., Галушка А.А., Гудзь С.П. Диссимиляционная
сульфатредукция в водоемах Прикарпатского месторождения серы // 10-я
Пущинской международная школа-конференция молодых учених “Биология –
наука ХХІ века”, посвященная 50-летию Пущинского научного центра РАН. —
Пущино, 17-21 апреля 2006 г. — С. 206.

15. Halushka A., Peretjatko T., Gudz S. About the ability of hydrogen
sulfide to cause mutations in Saccharomyces cerevisiae // The young
scientists’ and students’ international scientific conference “Modern
problems of Microbiology and Biotechnology”. — Odessa, 28-31, May 2007.
— P. 15.

16. Перетятко Т.Б. Екологія сульфатвідновлювальних бактерій водойм
Яворівського родовища сірки // Науково-практична конференція молодих
учених “Екологічні проблеми сільськогосподарського виробництва”. – Київ,
22-24 травня 2007 р. – С. 86-87.

АНОТАЦІЯ

Перетятко Т.Б. Екологічне значення сульфатвідновлювальних бактерій
штучних водойм (на прикладі Яворівського родовища сірки). – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.16 – екологія (біологічні науки). – Інститут
агроекології НАН України, Київ, 2007.

Вперше проведений екологічний моніторинг сульфатвідновлювальних бактерій
у водоймі, що знаходиться на території сіркових родовищ Прикарпаття.
Встановлено, що їх кількість у водоймі сірковидобувного регіону в
десятки тисяч разів перевищує їх чисельність в озерах Шацького
національного природного парку та озер заповідника “Розточчя”. Із
водойми Яворівського сіркового родовища виділені культури бактерій, які
ефективно здійснюють дисиміляційне відновлення сульфатів. Виділені
бактерії ідентифіковані як Desulfovibrio desulfuricans.

Встановлені оптимальні умови для росту D. desulfuricans Ya-11.
Температурний оптимум знаходиться в області 28-350 С, рН — 7,5-8,0.
Клітини D.desulfuricans Ya-11 чутливі до наявності кисню, однак
короткотривала експозиція з киснем не призводить до їх загибелі.

Вивчено динаміку використання виділеними культурами сульфатів і
перетворення їх до сірководню. Найбільш ефективне його утворення
спостерігалося у штаму D. desulfuricans Ya-11. Максимальне утворення
сульфіду мало місце при концентрації сульфату 16,3 мМ. Високі
концентрації сірководню виявляють інгібуючу дію на ріст D. desulfuricans
Ya-11.

Досліджена АФС-редуктазна активність D. desulfuricans Ya-11. Понад 80%
активності ферменту виявлено у розчинній фракції. АФС-редуктазна
активність клітин в процесі росту регулюється концентрацією сульфату в
середовищі і залежить від наявності АМФ. Максимальна активність ферменту
спостерігається при 300 С і рН середовища 9,5.

Сірководень виявляє токсичну дію на D. desulfuricans і S. сerevisiae, а
у

S. typhimurium та S. сerevisiae він індукує утворення мутацій.

Ключові слова: водойма, родовище, сірка, сульфатвідновлювальні бактерії,
сульфати, сірководень, токсичність, мутагенність.

АННОТАЦИЯ

Перетятко Т.Б. Экологическое значение сульфатвосстанавливающих бактерий
искусственных водоемов (на примере Яворовского месторождения серы). –
Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.16 – экология (биологические науки). – Институт
агроэкологии НАН Украины, Киев, 2007.

Впервые проведенный экологический мониторинг сульфатвосстанавливающих
бактерий в водоеме, который находится на территории Прикарпатского
месторождения серы. Установлено, что их количество в десятки тысяч раз
превышает их численность в озерах Шацкого национального природного парка
та заповедника “Розточчя”. Из водоема Яворовского месторождения серы
выделены культуры бактерий, эффективно осуществляющие дисимиляционное
восстановление сульфатов. Выделенные бактерии идентифицированные как
Desulfovibrio desulfuricans.

Установлены оптимальные условия для роста D. desulfuricans Ya-11.
Температурный оптимум находится в области 28-350 С, рН – 7,5-8,0. Клетки
D. desulfuricans Ya-11 чувствительны к присутствию кислорода.
Кратковременный контакт их с кислородом не вызывает гибели клеток D.
desulfuricans Ya-11.

Изучено динамику использования выделенными культурами сульфатов и
превращении их в сероводород. Наиболее эффективное образование
сероводорода наблюдается у штама D. desulfuricans Ya-11. Максимальное
его количество образуется при концентрации сульфата 16,3 мМ. Высокие
концентрации сероводорода оказывают ингибирующее действие на рост D.
desulfuricans Ya-11.

Исследована АФС-редуктазная активность D. desulfuricans Ya-11.
Установлено, что более 80% активности фермента находится в растворимой
фракции. АФС-редуктазаная активность клеток в процессе роста
регулируется концентрацией сульфата в среде и зависит от наличия АМФ.
Максимальная активность фермента наблюдается при 300 С и рН среды 9,5.

Сероводород оказывает токсическое действие на D. desulfuricans Ya-11 и
S. сerevisiae, а для S. typhimurium и S. сerevisiae он индуцирует
образование мутаций.

Ключевые слова: водоем, месторождение, сера, сульфатвосстанавливающие
бактерии, сульфаты, сероводород, токсичность, мутагенность.

SUMMARY

Peretjatko T.B. Ecological significance of sulfate-reducing bacteria of
the artificial wells (on the example of Yavoriv sulfur deposit). –
Manuscript.

Thesis for a candidate’s degree by speciality 03.00.16 – ecology
(biological sciences). – Institute of agroecology of Ukrainian NAS,
Kyiv, 2007.

The thesis is devoted to research of sulfate-reducing bacteria role in
sulfate reduction and hydrogen sulfide storaging in the waters of
Yaviriv silfeur mine. The ecology of sulfate-reducing bacteria is
studied in the dissertation work, the microbiological and chemical
characteristics of Yavoriv storage lake, morphological, physiological
and biochemical properties of isolated cultures of sulfate-reducing
bacteria are investigated, which allowed us to establish their role in
the process of hydrogen sulfide accumulation. The influence of the
latter on pro- and eukaryotic microbiota is also investigated.

During the industrial stripping of sulfur deposits, especially in the
careers, the access of oxygen is opened, and it facilitates the rapid
oxidation of elemental sulfur to sulfates. It leads to the contamination
of environment by sulfates. Provided with the presence of organic
compounds, the activity of sulfate-reducing bacteria is increased
sharply, and consequently the environment is contaminated.

The ecological monitoring of sulfate-reducing bacteria is held for the
first time in the well, which is situated at the territory of
Prykarpattja sulfur deposit. Their number in the well of sulfur career
is established to ten thousands times exceed their number in the lakes
of Shatsk national park and preserve «Roztochcha».

The cultures of bacteria, which actively perform the dissimilatory
reduction of sulfates, are isolated from Yavoriv sulfur deposit wells.
On the base of obtained cyto-morphological and physiological
characteristics they are identified as Desulfovibrio desulfuricans.

The optimal conditions for the growth of D. desulfuricans Ya-11 are
established. The temperature optimum lies within 28 and 35 єC, pH – 7,5
and 8,0. The cells of

D. desulfuricans are sensitive to the presence of oxygen in the medium,
but the short-term exposure to oxygen doesn’t lead to their death due to
the high activities of catalase and superoxide dismutase.

The dynamics of sulfates usage and their transformation to hydrogen
sulfide by isolated cultures is investigated. The most effective
producer of hydrogen sulfide was

D. desulfuricans Ya-11 strain. The maximal production of sulfide was,
when the concentration of sulfate was 16,3 mM. The increasment of
sulfate and lactate concentrations in the medium didn’t lead to the
increasment of biomass and sulfide concentration. The high
concentrations of hydrogen sulfide have the abscopal influence on the
growth of D. desulfuricans Ya-11.

The ability of D. desulfuricans Ya-11 to utilize lactate, pyruvate,
fumarate, malate, citrate, ethanol and glucose is investigated. Besides,
D. desulfuricans Ya-11 is able to the chemolitogeterotrophic growth. The
ability of the sulfate-reducing bacteria to utilize the wide range of
organic compounds has to be taken into consideration in the process of
remediation works in sulfur-mining regions in the case of the presence
of high sulfates concentrations in water, particularly when constructing
the recreation areas in the former world largest Yavoriv sulfur career,
because the accumulation of hydrogen sulfide there at concentrations
which exceed the permissible one will make it unsuitable for usage.

The D. desulfuricans Ya-11 APS-reductase activity is investigated. More
than 80% of enzyme activity is detected in the soluble fraction. The
activity of cell aps-reductase in the process of growth is regulated by
the concentration of sulfate in the medium and depends on the presence
of AMP. In the presence of other nucleotides the activity of the enzyme
is abruptly decreasing. The maximal activity of enzyme is observed at 30
єC and pH 9,5. In that way, the high activity of D. desulfuricans Ya-11
APS reductase indicates on the significant role of these bacteria in the
processes of hydrogen sulfide accumulation in the artificial wells,
which have aroused as the consequence of the industrial sulfur mining.

Hydrogen sulfide is toxic for D. desulfuricans and S. cerevisiae, and in
S. typhimurium and S. cerevisiae it causes the mutations.

Key words: well, deposit, sulfur, sulfate-reducing bacteria, sulfates,
hydrogen sulfide, toxicity, mutagenicity.

Підписано до друку 22.08.2007. Формат 60х84 1?16

Обл.-вид. арк.0,9. Набір комп’ютерний.

Наклад 100 прим. Зам. № 21

УкрІНТЕІ, Київ-680, вул. Горького, 180

PAGE 1

Таблиця 2

Ріст і нагромадження сульфіду відмитими клітинами D.desulfuricans Ya-11
залежно від температури (концентрація клітин складала 1 г/л)

Температура

культивування, 0 С Концентрація утвореного сульфіду, мМ

4 0,953 ± 0,064

10 1,503 ± 0,074

15 2,347 ± 0,157

28 3,489 ± 0,215

35 3,357 ± 0,241

Сульфід, мМ

Сульфат, мМ

Сульфід, мМ

Біомаса, г/л

Біомаса, г/л

Час, доби

Сульфат, мМ

Час, доби

Біомаса, г/л

Сульфід, мМ

Сульфат, мМ

Час, доби

Біомаса, г/л

Біомаса, г/л

Час, доби

Час, доби

Біомаса, г/л

Таблиця 4

Активність АФС-редуктази D. desulfuricans Ya-11

Фракції Питома активність ферменту,

мкмоль/ хв?мг білка

Безклітинний екстракт 6,02 ± 0,34

Окремі фракції:

розчинна

4,29 ± 0,41

осадова 1,14 ± 0,06

Активність АФС-редуктази,

мкмоль/ хв ·мг білка

рН

Температура, 0С

Активність АФС-редуктази,

мкмоль/ хв ·мг білка

Похожие записи