НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О. О. БОГОМОЛЬЦЯ

_____________________________________________________________

Палигін Олег Олександрович

УДК 577.352: 577.338

Дослідження квантових властивостей синаптичного вивільнення гамк в
культурі кори головного мозку щура

03.00.02 – біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у Міжнародному Центрі Молекулярної Фізіології НАН
України.

Науковий керівник: Член-кореспондент НАН України, доктор біологічних
наук, професор, заступник директора Міжнародного Центру Молекулярної
Фізіології НАН України, Веселовський Микола Сергійович.

Офіційні опоненти: Академік НАН України, доктор біологічних наук,
професор, заступник директора Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця
НАН України, Кришталь Олег Олександрович.

Кандидат біологічних наук, провідний науковий співробітник відділу
нейрохімії Інституту біохімії ім. О.В. Паладіна НАН України, Пархоменко
Миколай Тимофійович.

Провідна установа: Кафедра біофізики біологічного факультету
Національного університету ім. Т. Г. Шевченка

Захист відбудеться » 07 » жовтня
2004 р. о » 14 » годині на засіданні спеціалізованої вченої ради
Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за
адресою:01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім.
О. О. Богомольця НАН України за адресою:01024, м. Київ, вул. Богомольця,
4.

Автореферат розісланий » 20 » серпня
2004 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З. О.

загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Велика увага в сучасній біофізиці приділяється
вивченню механізмів, що приймають участь у процесах взаємодії нервових
клітин між собою. Значна роль у цих дослідженнях відводиться вивченню
хімічного впливу на нервові клітини нейромедіатора, що вивільняється у
синаптичну щілину. Дане явище опосередковується іонами кальцію, що
входять в клітину через потенціал-керовані канали в момент надходження
потенціалу дії в синаптичну терміналь або вивільняються із
внутрішньоклітинних депо. Процеси, що при цьому відбуваються, відіграють
виключно важливу роль в функціонуванні всього мозку. Вивчення квантових
властивостей вивільнення медіатора дає уяву про фундаментальні механізми
і взаємодії, що відбуваються в синапсі –результатом яких є передача чи
блокада нервового імпульсу.

Основні роботи по вивченню і модуляції синаптичних взаємодій присвячені
процесам вивільнення збуджуючих нейромедіаторів. Дослідженню
властивостей вивільнення ГАМК в центральній нервовій системі
приділяється набагато менше уваги. Наявні роботи, що включають в себе
аналіз процесів вивільнення ГАМК в синаптичній щілині, представлені в
основному на таких структурах мозку як гіппокамп. В той же час питання
про універсальність роботи гальмівних синаптичних контактів в різних
відділах нервової системи і, зокрема, в корі головного мозку лишається
відкритим. В більшості досліджень вивчення синаптичної передачі
проводиться на загальному (сукупному) рівні, де розглядається не
поодинокий синапс, а робота групи синапсів як одне ціле, внаслідок чого
лишається багато неясних моментів в питанні вивчення процесу вивільнення
і дії медіатора на рецептори. Основні ключові моменти в питанні
дослідження синаптичних взаємодій включають в себе: вивчення
молекулярної біології синапсів та мембранного транспорту, квантову
гіпотезу вивільнення медіатора, пластичність синапсу та вплив іонів
кальцію. Використання сучасних методів математичної обробки при аналізі
зареєстрованих гальмівних постсинаптичних струмів (ГПСС) дозволяє робити
адекватний висновок про квантовість процесу вивільнення медіатора та
оцінити рівень амплітуди одиничного ГПСС, викликаного вивільненням
окремої везікули (кванта) нейротрансмітера. Таким чином, дослідження
квантових властивостей синаптичного вивільнення ГАМК представляє
безсумнівний науковий інтерес та практичне значення в розумінні процесів
функціонування кори головного мозку і центральної нервової системи
вцілому.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота
виконана в рамках наукової програми Міжнародного центру молекулярної
фізіології НАН України: “Вивчення механізмів гальмівної синаптичної
передачі нейронів ЦНС”.

Мета і задачі дослідження. Мета даної роботи полягала в дослідженні
квантових властивостей синаптичного вивільнення гальмівного медіатору
ГАМК в умовах синаптично зв‘язаної культури кори головного мозку. Для
більш детального аналізу застосувати декілька експериментальних
електрофізіологічних методів: локальної стимуляції аксону інтернейрона,
локальної стимуляції поодинокої терміналі, та реєстрації спонтанних і
мініатюрних струмів. Для досягнення мети були поставлені наступні
задачі:

Дослідити кінетичні та фармакологічні властивості гальмівних струмів
кори головного мозку; за допомогою електрофізіологічних методів отримати
амплітудні розподіли гальмівних струмів, які виникають на
постсинаптичній мембрані нейрона.

За допомогою математичних методів автокореляційного аналізу та
біноміального розподілу дослідити амплітудні гістограми викликаних
гальмівних постсинаптичних струмів на наявність багатоквантового
розподілу.

В умовах лінійної зростаючої локальної стимуляції поодинокої терміналі
дослідити зміни в амплітуді постсинаптичних струмів.

Наукова новизна одержаних результатів. В даній роботі вперше на об(єкті
дисоційованої культури головного мозку низької густини були детально
вивчені і описані квантові властивості вивільнення гальмівного медіатора
ГАМК. Наявність низької густини культури дозволила розглянути гальмівну
взаємодію окремих пар синаптично зв(язаних нейронів. Завдяки
застосуванню методики локальної стимуляції вперше була проаналізована
робота окремого синаптичного контакту кори головного мозку.

В дисертаційній роботі досліджені параметри квантових процесів
вивільнення медіатора ГАМК та їх зміна в залежності від сили
деполяризації пресинаптичної терміналі і модуляції ймовірності
вивільнення нейромедіатора. Вперше отримані й охарактеризовані гальмівні
постсинаптичні струми від поодинокого синаптичного закінчення в нейронах
культури кори головного мозку. Проведено повний статистичний аналіз
вивільнення медіатора ГАМК в умовах різних типів стимуляції
пресинаптичних терміналій, а також спонтанного та мініатюрного
вивільнення. Отримані дані дозволяють охарактеризувати даний механізм
вивільнення як квантовий і визначити величину мінімального кванту
вивільнення медіатора ГАМК в корі головного мозку. Була показана
постійність кількісного вмісту одного кванту при різних умовах
стимуляції пресинаптичного закінчення. Отримані експериментальні дані
суттєво доповнюють сучасні уявлення відносно властивостей та механізмів
процесу вивільнення медіатора ГАМК в синаптичних контактах кори
головного мозку.

Практичне значення одержаних результатів. Результати дисертаційної
роботи перш за все представляють фундаментальний інтерес, оскільки
отримані нові дані стосовно механізмів роботи гальмівної синаптичної
передачі та її ролі у передачі сигналів між нейронами центральної
нервової системи. В роботі показано провідну роль медіатора ГАМК в
процесі гальмування в нейронах кори, вивільнення якого підкоряється
квантовій теорії і прямо опосередковано внутрішньоклітинною
концентрацією іонів кальцію, що дозволяє регулювати процеси гальмування
ЦНС шляхом модулювання процесів і структур, що відповідають за
підтримання рівня пресинаптичного кальцію. Крім того, в даній роботі
були об(єднані високоточні, найновіші електрофізіологічні методи з
ґрунтовним математичним апаратом, що дозволило більш детально
проаналізувати й зрозуміти процеси роботи гальмівної синаптичної
передачі в корі головного мозку і в центральній нервовій системі в
цілому.

Особистий внесок здобувача. Робота по конструюванню та налагодженню
електрофізіологічної установки, виготовленню підсилювача для вимірювання
постсинаптичних струмів і системи локальної аплікації, а також отримання
й обробка експериментальних даних, аналіз і узагальнення результатів
досліджень виконані особисто автором.

Апробація результатів дисертації. Загальні положення роботи доповідались
та обговорювались на конференції “Pharmacology of synaptic transmission
in nervous system” (16-18 липня 2002 р., Київ, Україна), на міжнародній
конференції “Intracellular signalling in excitable cells” (Вересень 2-4,
2002, Київ, Україна), конгресі “Polish Neuroscience Society Sixth
International Congress” (16-19 липня 2003 г., Варшава, Польща), на
міжнародній конференції IBRO CEERC School of Molecular Neurobiology (20
липня- 2 августа 2003 г., Варшава, Польща), на 33-ій міжнародній
конференції Society for Neuroscience (8-13 листопада 2003 г., Новий
Орлеан, США).

Публікації. За результатами роботи опубліковано три статті та тези
чотирьох доповідей у наукових журналах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду
літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень,
обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 225
найменуваннь. Робота викладена на 134 сторінках та ілюстрована 25
рисунками.

Основний зміст роботи.

У вступі обгрунтована актуальність дослідження квантових властивостей
синаптичного вивільнення ГАМК в корі головного мозку, сформульована мета
і задачі дослідження, наведені відомості про наукову новизну, практичну
цінність та апробацію отриманих результатів, публікацію матеріалів
дисертації.

Розділ 1 “Огляд літературних даних” присвячений висвітленню відомих
аспектів процесів квантового вивельнення в клітинах центральної нервової
системи, участі у них молекулярних механізмів білкових комплексів та
іонів кальцію. Розглянуті властивості дії ГАМК-ергічного синапса та
різновиди ГАМК рецепторів. Висвітлені особливості морфологічного устрою
кори головного мозку та формування синаптичних зв’язків у культурі.

Для досягнення поставленої мети у розділі 2 “Матеріали та методи
дослідження” описано використання наступних методичних підходів:

приготування первинної дисоційованої культури нейронів кори низької
густини;

метод внутрішньоклітинної фіксації потенціалу на постсинаптичному
нейроні в конфігурації „ціла клітина”;

методика зовнішньоклітинної електричної стимуляції напругою аксону
пресинаптичного нейрону;

метод локальної зовнішньоклітинної суперфузії для аплікації блокаторів
гальмівної синаптичної передачі;

методика зовнішньоклітинної електричної стимуляції поодинокої нервової
терміналі пресинаптичного нейрону;

математичні методики обробки результатів та побудова квантової моделі.

Приготування культури нейронів кори головного мозку щура.
Використовувались новонароджені щурі лінії Вістар. Тварин декапітували,
головний мозок поміщали в мінімальне середовище Ігла з додаванням 20 мM
HEPES, 25 од/мл натрієвої солі бензилпеніциліну та 25 мкг/мл
стрептоміцину сульфату. Кору відділяли за допомогою скальпеля і поміщали
в мінімальне середовище Ігла, після чого нарізали на шматочки товщиною
0,5 мм. Ферментативна обробка здійснювалась за допомогою 0,05%-ого
розчину трипсину. Після досягнення необхідного ступеня дисоціації
тканину промивали 10 мл культурального середовища, до складу якого
входили: мінімальне середовище Ігла, 10% конячої сироватки, 6 мкг/мл
інсуліну, бікарбонатний буфер (2.2 г/л NaHCO3), натрієва сіль
бензилпеніциліну – 25 од/мл, стрептоміцину сульфат – 25 мкг/мл.
Суспензію клітин необхідного відділу мозку отримували за допомогою
дисоціації пластиковими піпетками з діаметром, що послідовно
зменшувався. Клітини поміщали у чашки Петрі, попередньо обробивши їх
полі-L-орнітином. В скляне кільце діаметром 0,9 мм додавалось по 100 мкл
кожної суспензії. Чашки Петрі з суспензією клітин поміщали в інкубатор,
що містив повітряно-газове середовище, збагачене СО2 (5%), і підтримував
температурний режим 37(С. На третій день культивування в середовище
додавали 5 мкМ цитозин-A-D-арабіно-фуранозиду для пригнічення
проліферації гліальних клітин. Повна зміна середовища проводилась через
20 — 24 години. Електрофізіологічні дослідження проводились на 10-й –
14-й день культивування.

Реєстрація гальмівних постсинаптичних струмів. Для реєстрації ГПСС при
стимуляції аксону пресинаптичного нейрону використовувалась методика
фіксації потенціалу в конфігурації «ціла клітина». Локальна електрична
стимуляція здійснювалась за допомогою стимулятора з ізольованим виходом
(ISO-Flex, AMPI, Israel), стимулятор був заземлений на загальний з
підсилювачем індиферентний електрод. Струми реєструвались при
подразненні аксона імпульсами напруги тривалістю 300 або 500 мкс, з
частотою 0,2 Гц. Амплітуда напруги, що подавалась на вхід стимуляційної
піпетки коливалась від 30 до 60 В, зміна стимулюючого сигналу на виході
була лінійною в межах значень напруги, що подавалась на вхід.

При використанні методики локальної електричної стимуляції зони
синаптичного контакту, ТПСТ викликались короткими (3-5 мс) імпульсами
напруги, що пропускалась через скляну мікропіпетку з зовнішнім діаметром
кінчика близько 1 мкм, заповнену зовнішньоклітинним розчином. Реєстрація
ГПСС здійснювалась за допомогою методу “петч-клемп” в конфігурації „ціла
клітина”. Візуальна ідентифікація синаптичної терміналії відбувалась за
допомогою мікроскопу з 1000-кратним збільшенням, використовуючи об(єктив
з масляною імерсією. Для отримання найкращого контролю потенціалу і для
зменшення «дендритного фільтрування» для дослідження вибирались окремі
пресинаптичні терміналі, розташовані безпосередньо на сомі
постсинаптичної клітини або на відстані не більше 10-20 мкм від соми.
Компенсація послідовного опору була в межах 50-70%. Струми фільтрувались
за допомогою фільтру Бесселя с частотою зрізу 2-5 КГц.

Зовнішньоклітинний базовий розчин для дослідження гальмівних
постсинаптичних струмів, викликаних електричною стимуляцією аксону
містив (в мM): NaCl — 140, KCl -3, CaCl2 — 2, МgCl2 – 2, глюкоза — 30,
HEPES — 20, доводився до 7.4 додаванням Na-OH. В зовнішньоклітинний
розчин додавались блокатори DNQX – 20мкМ і D-APV – 20мкМ, атропін – 1мкМ
та тубокурарін – 20мкМ. При дослідженні гальмівних постсинаптичних
струмів, викликаних електричною стимуляцією окремої терміналі, в
зовнішньоклітинний розчин, до всього вищесказаного додавали, 0.25 мкМ
ТТХ. Спонтанні мініатюрні постсинаптичні струми вимірювались при всіх
перерахованих блокаторах з видаленням із зовнішньоклітинного розчину
Са2+. Внутрішньоклітинниий розчин для петч-піпетки містив у всіх
випадках (в мM): K-глюконат — 100, KCl — 50,EGTA — 5, MgCl2 — 5, HEPES —
20, доводився до 7.4 додаванням КOH.

У третьому розділі “Результати досліджень” шляхом математичного аналізу
постсинаптичних струмів експериментально визначені квантові параметри
вивельнення гальмівного медіатору ГАМК при моделюванні різних умов
стимуляції пресинаптичних терміналей.Опис кінетичних та фармакологічних
властивостей викликаних постсинаптичних струмів (вГПСС) кори головного
мозку. Для реєстрації вГПСС при стимуляції аксону в якості
постсинаптичної клітини вибирались пірамідні нейрони, що мали велику
сому (близько 30 мкм) та потужні базальні дендрити. В ролі
пресинаптичного нейрону виступали зіркоподібні та корзинчаті нейрони, що
часто зустрічаються в культурі кори головного мозку та утворюють
синаптичні контакти на пірамідних нейронах. ВГПСС реєструвались на
пірамідному нейроні при підтримуваному потенціалі –80 мВ, що помітно
зменшувало наявність натрієвих транзієнтів, що часто виникають в
постсинаптичній клітині в районі пику ГПСС через погану фіксацію
потенціалу на дендритах, де деполяризація, що викликається вхідним
постсинаптичним струмом, перевищує поріг активації Na+ каналів.

Рис. SEQ Рис. \* ARABIC \s 1 1 . Залежність амплітуди викликаного
постсинаптичного струму в нейроні кори головного мозку від величини
підтримуваного потенціалу на мембрані. Записи викликаних постсинаптичних
струмів (А), що реєструються при значеннях підтримуваного потенціалу від
–90 до +10 мВ з кроком в 10 мВ та їх вольт-амперна характеристика (Б).

Струми виникали у відповідь на прикладання коротких деполяризаційних
стимулів в безпосередній близькості від аксону інтернейрону. Збуджуючі
глутаматергічні струми блокувались шляхом додавання в розчин
антагоністів іонотропних глутаматних рецепторів 20мкМ DLAPV та 20 мкМ
DNQX. Амплітуда вГПСС лінійно залежала від підтримуваного мембранного
потенціалу постсинаптичної клітини (рис.1). Потенціал реверсії вГПСС,
визначений експериментально, складав –16 ( 3 мВ (n=5) і був вельми
близький до розрахованого по рівнянню Нернста потенціалу реверсії для
іонів хлору при використаних складах зовнішньо- та внутрішньоклітинного
розчинів.

Зовнішньоклітинне прикладання бікукуліну, за допомогою методу швидкої
локальної суперфузії, в концентрації 10 мкМ у всіх досліджуваних
нейронах призводило до швидкого та зворотного блокування постсинаптичних
струмів на протязі всього періоду аплікації. Також під час
фармакологічного тестування вивчались властивості вГПСС при прикладанні
1,4-бензодіазепінів. В якості речовини для тестування був вибраний
7-бром-5(орто-хлор)феніл-1,2-дигідро-3Н-1,4-бензодіазепін-2-он або
феназипам в концентрації 50 мкМ та 100 мкМ. Локальне прикладання
феназипаму в область синаптичного контакту призводило до сповільнення
спаду вГПСС.

Спад струмів найкращим чином апроксимувався одною експонентою з
середньою постійною часу 17 ( 5 мс (n=10). Тривалість наростаючої
частини струму (від моменту його виникнення до моменту досягнення
амплітудного значення, далі час до піку), в середньому складала 4.4 (
1.7 мс (n=10). Загальна кінетика струмів, зокрема їх час до пику, при
малих та близьких до максимальних амплітудах, було однаковим в межах
стандартної похибки. Значення синаптичної затримки (часового інтервалу
від переднього фронту стимулу до початку постсинаптичного струму) для
різних досліджуваних синапсів відрізнялись, однак їх середня величина не
перевищувала 4.5( 2.3 мс, а розподіли затримок для кожного із сімейств
струмів були унімодальними.

Таким чином, можна стверджувати, що в умовах культури кори головного
мозку на синаптично зв(язаних парах нейронів були досліджені властивості
вГПСС, що виникають в пірамідних нейронах кори при локальній стимуляції
аксону гальмівного інтернейрона. По кінетичним та фармакологічним
властивостям дані струми ідентифіковані як ГАМКА активовані гальмівні
струми.

Амплітудні розподіли вГПСС в умовах стимуляції аксону інтернейрона.
Амплітуди вГПСС при стимуляції аксону інтернейрона становили від межі
вимірювального мінімуму близько 7-8 пА до величин більших, ніж 500 пА
при підтримуваному потенціалі –80 мВ.

Рис. 2. Розподіли амплітуд викликаних гальмівних постсинаптичних
струмів. А — записи перших 50-ти струмів, зареєстрованих при
підтримуваному потенціалі -80 мВ. Б – гістограма амплітудного розподілу
постсинаптичних струмів. Кількість реєстрацій N=300. Товстою суцільною
лінією показана огинаюча, що представляє собою суму п(яти розподілів
Гауса (тонкі суцільні лінії). Перший пік з модою на нулі відповідає
реалізаціям без виникнення постсинаптичного струму. Максимуми
послідовних гаусіан розташовані на 11, 21, 33, 43, 51 пА, зліва направо,
відповідно. Середня відстань між піками 10 ± 1.6 пА.

Гістограма амплітудних наборів вГПСС для кожної пари досліджуваних
нейронів (n=10) спочатку апроксимувалась за допомогою набору Гаусових
функцій. Перший пік мультигаусового розподілу представляв собою
кількість відповідей без реалізацій, а решта піків – суперпозицію
незалежних квантових подій, тобто, кожна функція Гауса відповідала
певній порції кванту вивільнення з відповідною дисперсією. Максимуми
піків розташовувались дискретно з відповідним інтервалом, причому
відстань між першими двома піками, що відповідає одній порції кванта
вивільнення, дорівнювала середній відстані між кожним із піків в
гістограмі (рис 2). Однак, на ранніх стадіях культивування для
квантового аналізу постсинаптичних струмів вибирались клітини, в яких
максимальна амплітуда струмів досягала 200-300 пА. Такий достатньо
низький рівень амплітуд вГПСС досягався завдяки чіткої локальної
стимуляції аксону, низької густини культури та її ранньої стадії
розвитку (не більше 14 днів). З віком й, відповідно, розвитком
синаптичних зв(язків в культурі, амплітуда вГПСС сильно зростала, при
цьому практично не спостерігались струми малих амплітуд, що робило
непридатними такого чину реєстрації для процедури квантового аналізу.
Для визначення квантових параметрів (мінімального квантового вивільнення
q і середнього квантового вмісту m), отриманих експериментальних
гістограм вГПСС, що виникають при стимуляції аксону інтернейрона,
використовувався автокореляційний метод. Амплітудний розподіл для кожної
клітини представлявся в вигляді розподілу функції густини ймовірності.

Рис.3. Вверху амплітудний розподіл вГПСС, представлений в вигляді
розподілу функції густини ймовірності. Внизу відповідна автокореляційна
функція, стрілками показаний період автокореляції q.

Експериментальний амплітудний набір описувався двома конкурентними
розподілами: унімодальним і набором гаусових функцій. Із графіку
автокореляційної функції, отриманої із розподілу гаусового набору,
визначався період автокореляції qА. Середній період автокореляційної
функції і давав в результаті параметр одиничного квантового вивільнення
qА. Достовірність квантовості амплітудних розподілів визначалась методом
Монте-Карло, шляхом побудови кумулятивної функції числа оцінки значення
автокореляції.

Для всіх досліджуваних нейронів (N=15) середній рівень параметру
поодинокого квантового вивільнення складав =9.4(0.4 пА. Приклад
результатів автокореляційного аналізу для п(яти амплітудних наборів
вГПСС, що виникають на пірамідному нейроні при стимуляції аксону
інтернейрону, приведений в таблиці 1 (де — середній вГПСС, qА- рівень
одиничного квантового вивільнення, mА- середній квантовий вміст).

Таблиця 1.

Файл Автокореляційний метод

qА mА

R1n05c 18.7 9.8 1.91

T1n06c 29.2 9.6 3.04

W1o31c 57.4 9.13 6.27

F1n06c 17.2 9.18 1.87

Q1o31c 30.3 9.5 3.19

В наших дослідженнях при збільшенні середньої амплітуди вГПСС з віком
культури значення параметру поодинокого квантового вивільнення qА
ставало не однозначним. Очевидно, що збільшення числа синаптичних
контактів в культурі головного мозку щура, що розвивається, приводило до
неможливості точного визначення квантових параметрів амплітудного набору
вГПСС автокореляційним методом при локальній стимуляції аксону. Однак,
по приведеним даним можна впевненно говорити про те, що амплітудні
набори, отримані в наших умовах ранньої дисоційованої культури низької
густини, мали квантову природу з визначеним, характерним для більшості
досліджуваних наборів параметром поодинокого квантового вивільнення.

Спонтанні та мініатюрні ГПСС нейронів кори головного мозку в умовах
культури. Спонтанно виникаючі ГПСС досліджувались в умовах дисоційованої
культури низької густини, тому середня частота відповідей була достатньо
низькою (1 Гц) в більшості досліджуваних нейронів (n=20). У 10-12 денній
культурі, спонтанна активність була помітно нижча, ніж активність в
більш пізній період культивування.

Рис. 4. А – гістограма розподілу амплітуд спонтанних ГПСС в культурі
кори головного мозку (I-постсинаптичний струм в пА, N- кількість струмів
даної амплітуди). Кривими показана апроксимація даного розподілу
функціями Гауса в припущенні накладання незалежних квантових подій. Піки
розподілів функцій розташовані на 9.9 пА та 19.9 пА; Б — Приклади
гальмівної спонтанної активності.

Кінетичні и фармакологічні властивості спонтанних ГПСС були аналогічними
властивостям струмів, викликаних стимуляцією аксону інтернейрона. Так,
бікукулін в концентрації 5 мкМ повністю і зворотно блокував спонтанні
відповіді в усіх досліджуваних нейронах, а постійна часу спаду
дорівнювала 16( 1.8 мс, що досить близько до параметрів, отриманих при
аналізі вГПСС. На рис. 4 представлені приклади спонтанних ГПСС, а також
апроксимація амплітудної гістограми набором Гаусових функцій для однієї
із клітин. Аналіз амплітуд зареєстрованих мініатюрних постсинаптичних
струмів, дозволив оцінити рівень мінімального квантового вивільненні в
синаптичних терміналіях, розташованих на пірамідних нейронах кори
головного мозку щурів.

Рис.5. Гістограма амплітудного розподілу мініатюрних ГПСС в культурі
нейронів кори головного мозку (n=10). Кривими показана апроксимація
даного розподілу функціями Гауса. Вверху, набір реєстрацій мініатюрної
гальмівної активності в культурі нейронів кори головного мозку щура (ТТХ
0.25 (М, за відсутності Са2+ в зовнішньоклітинному розчині).

Зважаючи на практично повну відсутність в зовнішньоклітинному розчині
іонів Са2+ і блокади передачі потенціалу дії ТТХ, спонтанне вивільнення
везікул і, відповідно, реєстрація мініатюрної постсинаптичної відповіді,
відбувалась достатньо рідко, в середньому з частотою 0.3 Гц (n=10). Такі
умови зводили до мінімуму ймовірність синхронного вивільнення
нейромедіатора із синаптичних закінчень, що в умовах культури низької
густини робило реєстрацію мініатюрних ГПСС на рівні мінімально можливої
порції вивільнення кванту, і практично малоймовірним одночасне
вивільнення із декількох синапсів. Гістограма амплітудних розподілів
мініатюрних ГПСС була побудована для всіх досліджуваних нейронів кори
головного мозку (n=10). За припущенням про квантовість природи
вивільнення медіатора, отримана гістограма була описана двома Гаусовими
функціями (рис.5). Як видно на риснку, основна маса постсинаптичних
відповідей мала амплітуду близько 10 пА, доля струмів, що мали амплітуду
більше 15 пА була набагато меншою й виникнення другого піку на
гістограмі мало низьку достовірність. Відповідно цей факт свідчить про
те, що мінімальний квантовий рівень вивільнення нейромедіатора в умовах
низької концентрації Са2+ та відсутності потенціалів дії може бути
знайдений, як максимум першої найбільшої Гаусової функції — qМ=10.7(1.3
пА. Такий результат параметра одиничного кванту вивільнення співпадає в
межах похибки з отриманим в умовах локальної стимуляції аксону, що
підтверджує припущення квантовості вивільнення медіатора в синаптичних
закінченнях кори головного мозку.

ГПСС, викликані вивільненням ГАМК із поодинокої пресинаптичної
терміналі. Локальна стимуляція поодинокої синаптичної терміналі
здійснювалась у розчині, що містив нормальну концентрацію Са2+ (2 мМ), а
також за наявності ТТХ (0.25 мкМ), що блокує передачу потенціалу дії і,
відповідно, локалізує деполяризацію пресинаптичної клітини тільки у тій
ії частині, де прикладається збуджуючий стимул. ГПСС викликались
електричною стимуляцією зони синаптичного контакту короткими (3-5 мс)
імпульсами напруги, що пропускається через скляну мікропіпетку з
зовнішнім діаметром кінчика близько 1,5 мкм, заповнену
зовнішньоклітинним розчином. В експерименті стимулювались поодинокі
пресинаптичні терміналі, розташовані близько до соми (не більше 10-20
мкм), для кращого контролю фіксації потенціалу та зменшення дендритної
фільтрації (рис. 6).

Рис. 6. Схема локальної електричної стимуляції одиночної пресинаптичної
терміналії. На фотографії показано проекції стимулюючої (зверху) та
регеструючої (внизу) піпетки, також видні поодинокі синаптичні контакти,
що утворились на дендритному дереві пірамідного нейрона в процесі
розвитку клітин (об(єктив Plan-Neofluar ( 100, апертура 1.3, масляна
імерсія, фазовий контраст, Zeiss).

Амплітуди викликаних ГПСС становили від межі вимірювального мінімуму
близько 7-8 пА до величин більших, ніж 200 пА при підтримуваному
потенціалі –80 мВ. Отримані амплітудні набори представлялись в вигляді
гістограми, яка апроксимувалась набором Гаусових функцій, так як і в
випадку з гістограмами вГПСС, отриманих при електричній стимуляції
аксону гальмівного інтернейрона. Амплітуди викликаних ГПСС в усіх
досліджуваних поодиноких синапсах (n = 15) флуктували відносно
дискретних кратних величин пікових амплітуд, кожна з яких була описана
функцією Гауса. Перший пік з модою на 0 пА представляє собою події, коли
деполяризація пресинаптичної терміналії коротким імпульсом напруги, не
приводила до вивільнення нейромедіатора і постисинаптичний струм був
відсутній. На відміну від амплітудних наборів вГПСС, отриманих при
електричній стимуляції аксону пресинаптичного нейрона дані гістограми
мали затухаючий характер з максимальною модою на нульовому або першому
піку, а середній струм був помітно меншим (рис. 7).

Рис.7. Гістограма амплітудного розподілу викликаноих ГПСС зареєстрованих
в умовах стимуляції поодинокої терміналії. Кривими показана апроксимація
даного розподілу функціями Гауса. Вверху, приклад експериментальних
вГПСС..

Опис ймовірності багатоквантового вивільнення нейромедіатора із
поодинокої гальмівної синаптичної терміналії статистичними законами. Для
амплітудних розподілів з адекватно розташованими піками автокореляційна
функція виглядає як затухаюча хвиля з періодом, що відображає міжпікову
відстань. Якщо розподіл не квантовий і піки на функції густини
ймовірності виникають виключно за способу кінцевої вибірки, початкові
відстані між піками змініються значнішеі висота від піку до провалу
менша, ніж для функції густини ймовірності квантового розподілу.
Відповідно, амплітуда автокореляційної функції для неквантового
розподілу набагато менша, ніж для будь-якого квантового розподілу. Сума
амплітуд першого (не нульового) лага та другого піку, була вибрана як
характеристика якості побудови автокореляційної функції (оцінка значення
автокореляції). Для визначення квантовості даного описаного амплітудного
набору проводилась оцінка достовірного інтервалу для автокореляційної
функції методом Монте-Карло. Оцінки значення автокореляції для кожної
унімодальної вибірки амплітудного розподілу були впорядковані по
наростанню і приведені в вигляді загального, кумулятивного розподілу, в
якому оцінка значення автокореляції виміряної квантової амплітудної
вибірки була значно вищою.

.

< P T V X † F ? E b d   ¦ I . 0 2 4 6 8 : < T V X † ? - F ¤ ?птичних відповідей. Відповідна автокореляційна функція, внизу, величина кванту - q, була обрахована як середній період коливань автокореляційної функції, показано стрілками (q =9.6). Рис.9. Результат квантового аналізу амплітудного розподілу струмів, отриманих при стимуляції одиничної синаптичної терміналії (біноміальний метод). Товстою лінією показана біноміальна функція з параметрами (q= 10.12, P=0.256, n=9), тонкою – унімодальна функція, що описує практично отриманий амплітудний розподіл, представлений в вигляді функції густини ймовірності. Це говорить про те, що в межах достовірного інтервалу квантове представлення даного амплітудного набору краще, ніж унімодальне. Ця процедура забезпечувала рівень значимості, в якому квантова поведінка експериментальних даних може бути прийнятою. Параметр, що показує ймовірність для вибірки амплітуд, які були дійсно унімодальними, мав число оцінки значення автокореляції більше, ніж в наших експериментальних даних. Також при обробці даних, значення квантового розміру - qA, обраховувалось як середній період автокореляційної функції, похибку параметру квантового розміру визначало відхилення періоду коливань функції. Середній квантовий вміст - mA, обраховувався як відношення середньої амплітуди вГПСС , визначеної із
експериментальних записів струму до квантового розміру qA. Результати
автокореляційного аналізу представлені в таблиці 2.

Біноміальний аналіз амплітудного розподілу спочатку зводився до підбору
основних параметрів розподілу n, p, q. Критерій підбору оптимальних
біноміальних параметрів визначався за допомогою тесту подібності. Також
отримані параметри повинні були задовольняти критерію біноміального
узгодження: = p*n *q ( , де середня амплітуда вГПСС,
обчислена із підібраних методом подібності параметрів біноміального
розподілу, а практично отримана середня амплітуда вГПСС. Результат
квантового аналізу для декількох груп вГПСС, отриманих при локальній
стимуляції поодинокої гальмівної пресинаптичної терміналі кори головного
мозку приведений в таблиці 2.

Таблиця 2.

Файл Автокореляційний метод Біноміальна статистика

qА mА n P mB qB

K1n17 23.4 9.6 2.44 9 0.256 2.34 10.12 23.32

G2c01 17.3 10.19 1.7 12 0.146 1.75 10.15 17.73

R1n15 14.6 8.99 1.62 11 0.12 1.32 11.37 14.99

D1n12 7.4 9.48 0.78 3 0.256 0.77 9.76 7.52

S2321c 22.4 10.03 2.23 6 0.37 2.22 10.09 22.38

Для перевірки адекватності, так як і в випадку автокореляційного методу,
проводилось математичне порівняння якості опису практичного розподілу
отриманою біноміальною функцією і нормальним розподілом за допомогою (2
методу , в випадку неквантового розподілу параметр (2 методу був нижче
для нормального розподілу.

Динаміка вГПСС в залежності від амплітуди зовнішнього подразнюючого
стимулу, що прикладається до поодинокої синаптичної терміналі. В
дослідах з локальною електричною стимуляцією поодинокої синаптичної
терміналі кори головного мозку було помічено, що при лінійному зростанні
стимулу спостерігається зміна амплітуди постсинаптичної відповіді. Так,
при зростанні амплітуди стимуляції, в першій стадії, спостерігалось
підвищення середньої амплітуди постсинаптичної відповіді до максимуму,
наступне збільшення зовнішнього подразнюючого стимулу призводило до
спаду середньої амплітуди відповіді. Таким чином, зміна середньої
амплітуди вГПСС була дзвоноподібною при лінійному збільшенні локальної
стимуляції терміналі. На рисунку 10 представлений приклад зміни
амплітуди середнього вГПСС при лінійному збільшенні сили стимуляції
поодинокої терміналі пресинаптичного нейрона кори головного мозку щура.
Як і в усіх проведених дослідах (n=5) дана залежність середньої
амплітуди мала дзвоноподібний вид. Ймовірність виникнення вивільнення
при збільшенні стимулюючої напруги різко збільшувалась практично до
повної відсутності пропусків, тобто, на кожне прикладення стимулу
спостерігалось вивільнення медіатора, і тільки при максимальній силі
стимуляції спостерігалось невелике пригнічення ймовірності відповіді
(рис 11).

Рис. 10 Зміна середньої амплітуди вГПСС в залежності від сили стимулу,
прикладеного до поодинокої пресинаптичної терміналі (відповідна сила
стимула показана зверху). Остання відповідь — повернення до значення
стимуляції з максимальною відповіддю усередненого вГПСС.

Такий характер зміни вГПСС при зміні рівня деполяризації всередині
пресинаптичної терміналі, очевидно, пов(язаний з поведінкою Са2+
каналів, що регулюють концентрацію кальцію всередині нервової терміналії
та відповідно характер кількості готових до вивільнення везікул.

Варіації квантових параметрів при різній амплітуді зовнішнього
подразнюючого стимулу, прикладеного до поодинокої синаптичної терміналі.
Як було показано вище, характер гальмівної відповіді в досліджуваних
нейронах суттєво змінювався по амплітуді при різних умовах стимуляції
пресинаптичної області. Очевидно, що різний рівень деполяризації
пресинаптичного закінчення впливав на квантові параметри вивільнення
медіатора. Ці зміни були проаналізовані в наступних дослідах. На різних
етапах залежності вГПСС від сили стимулу, що змінювалась лінійно, були
побудовані амплітудні розподіли, кожний з яких було описано біноміальним
розподілом як квантовий процес вивільнення медіатора (Рис. 11 А,Б,В).

Таблиця 3

Амплітуда стимулу Середній вГПСС Параметри біноміального розподілу

В

, пА N p qB mB

13.5 А 19.33 6 0.32 9.93 1.92 19.05

17 Б 28.99 7 0.41 10.13 2.87 29.17

20 В 17.29 5 0.34 10.23 1.7 17.91

Отримані при квантовому аналізі параметри біноміального розподілу,
представлені в таблиці 3, відповідають амплітудам зовнішнього локального
стимулу (А-13.5В, Б-17В, В-20В), що прикладались до пресинаптичної
терміналії на різних етапах дзвоноподібної залежності на рис. 11 — Г.
Видно, що квантовий розмір qB лишався незмінним при будь-якій силі
деполяризації пресинаптичної терміналії, і збільшення амплітуди
відбувалось, в основному, за рахунок збільшення ймовірності вивільнення
— p. Також в таблиці 3 приведений характер зміни середнього квантового
вмісту mB, і умова відповідності квантових параметрів критерію
біноміального узгодження, де практично отримана середня амплітуда вГПСС
рівна добутку квантових параметрів n,p,qB ( ( ) Видно добру
відповідність між значеннями

Рис. 11. Ефект сили стимулу, що лінійно змінюється, прикладеного до
поодинокої синаптичної терміналі на амплітудний розподіл викликаних
постсинаптичних відповідей. А,Б,В — тонка лінія показує апроксимацію
експериментального розподілу амплітуд ГПСС біноміальним розподілом при
різних амплітудах локальної стимуляції. Г — дзвоноподібний графік
залежності середньої амплітуди вГПСС від сили стимулу поодинокої
синаптичної терміналі. Буквами відмічені амплітуди стимулу, для яких
було змодельовано біномвальний розподіл показаний на графіках А,Б,В.

середнього струму для виміряного в експерименті та розрахованого за
біноміальною моделлю, що описує гістограму вГПСС.

Величина квантового розміру при збільшенні частоти стимуляції поодинокої
синаптичної терміналі. В нормальних умовах стимуляція, що
застосовувалась в приведених вище дослідах, не викликала пригнічення
амплітуди вГПСС з часом. Дана частота була вибрана не випадково;
вважається, що при такій дії на терміналь не відбувається насичення
рецепторів при вивільненні медіатора та не виснажується пресинаптичний
пул, що містить готові до вивільнення пресинаптичні везікули. В
наступній серії дослідів ми збільшили частоту стимуляції до 1 Гц. Така
частота стимуляції приводила до зменшення амплітуди вГПСС з часом
практично до нуля, однак після невеликої паузи амплітуда відновлювалась.
Для побудови амплітудних гістограм та наступної оцінки квантових
параметрів за допомогою біноміальної статистики були вибрані дві різні
групи струмів – на початку стимуляції, де була більша ймовірність
вивільнення і в кінцевій фазі, де загальна амплітуда ГПСС спадала.
Біноміальний аналіз показав, що в обох випадках, незважаючи на зменшення
амплітуди, параметр одиничного квантового вивільнення лишався незмінним
і в середньому складав 10.3(0.7 пА. Можливо, що при частоті стимуляції
такого порядку з часом відбувається виснаження готових до вивільнення
докінгових везікул, що зменшує амплітуду вГПСС, але при цьому кількість
кванту вивільнення не змінюється. Даний факт свідчить не тільки на
користь самої квантової природи вивільнення медіатора в даних синапсах,
але і припускає наявність не однієї, а декількох, до десятка, везікул,
що готові до вивільнення.

Обговорення результатів. Методика дослідження синаптичної передачі
вперше була розроблена для нейро-м(язових з(єднань, далі цю модель було
пристосовано для дослідження синаптичних з(єднань в ЦНС. Однак, існують
деякі відмінності між цими двома системами, і на даний момент немає
універсальної моделі, яка адекватно описує роботу синаптичної передачі в
різних структурах.

При аналізі отриманих данних, як у дослідах з локальної стимуляції
аксона, так і при стимуляції поодинокої синаптичної терміналі видно, що
кількість подій була різною у різних амплітудних розподілах. Так як
амплітуда постсинаптичної відповіді пропорційна кількості вивільненого
нейротрансмітера, можна припустити, що трансмітер вивільняється
дискретними, приблизно рівними порціями, сумація яких приводять до
мультипікового амплітудного розподілу. В більшості робіт вивчення
вивільнення медіатора та його квантова модель розглядається на
фізіологічному, природному рівні, коли ймовірність вивільнення велика,
тобто велика кількість подій, що спостерігаються і, таким чином,
кількість квантів. Однак, із збільшенням амплітуди флуктуація піків
амплітудного розподілу і, відповідно, кванту буде сильно змінюватись, що
приводить до неоднозначних суперечливих результатів. Таким чином, при
високих ймовірностях вивільнення медіатора квантова природа процесу стає
менш очевидною. Використана в нашій роботі методика локальної стимуляції
поодинокої синаптичної терміналі виводить наші дослідження на рівень
одного синапсу, зменшуючи ймовірність вивільнення медіатора і збільшуючи
точність визначення кванту. Також, в противагу ідеї, що в поодинокому
синапсі може вивільнятися тільки одна везікула в ряді робіт показано, що
окремі синапси можуть вивільняти велику кількість везікул у відповідь на
один потенціал дії.

Використана в роботі експериментальна конфігурація дозволяє локально
стимулювати поодиноку синаптичну терміналь; згідно базовій ідеї
квантової моделі одна синаптична терміналь повинна відповідати одній
активній зоні. Однак, багатопіковий амплітудний розподіл означає, що
поодинока синаптична терміналь не є ідентичною одній активній зоні з
одним місцем вивільнення тільки для однієї везікули. На доказ даного
твердження отримані багатопікові набори, що представлені в вигляді
функції густини ймовірності, були описані двома конкурентними моделями.
Перша, біноміальна, представляє собою теорію квантової природи
вивільнення медіатора, та нормальна, яка свідчить на користь
неквантовості. Якість опису практичного амплітудного набору, і,
відповідно, вибір теоретичної моделі як вірної, був перевірений за
допомогою критерію достовірності Пірсона ((2-розподілу) для відповідних
функцій, в більшості досліджуваних амплітудних наборів біноміальна
модель описувала практичний розподіл кращим чином. При побудові
автокореляційної функції, як в випадку амплітудних розподілів, отриманих
шляхом стимуляції аксону, так і в випадку стимуляції поодинокої
синаптичної терміналії, також проводилось порівняння квантовості або
неквантовості розподілу. На користь квантової моделі виступала функція,
що описує практично отриманий амплітудний розподіл набором Гаусових
функцій, де кожна окрема функція Гауса виражала квант вивільнення з
визначеною дисперсією. Число оцінки значення автокореляції, що
відображає якість побудови автокореляційної функції і, як наслідок,
вибір на користь квантової або неквантової моделі, було отримано для
мультигаусової функції і для 250 різних унімодальних функцій, що
описують даний розподіл. Загальна оцінка для кожного конкретного
амплітудного набору представлялась в вигляді кумулятивної функції, де в
випадку квантового розподілу параметр числа оцінки значення
автокореляційної функції був незмінно вищим. Як видно, отримані нами
дані свідчать на користь багатоквантової моделі вивільнення медіатора.

Отримані результати по апроксимації амплітудних розподілів багатопіковою
квантовою моделлю означають, що стимульована поодинока терміналь має або
одну активну зону з декількома місцями вивільнення, або декілька
активних зон з декількома можливими місцями вивільнення в кожній.

В деяких сучасних дослідженнях прямо показано, що в окремому
центральному синапсі існує тільки одна активна зона, в якій відбувається
вивільнення тільки однієї везікули, навіть коли ймовірність вивільнення
одиниці. Звичайно, окрема активна зона може вивільняти багато везікул за
певний час. Після того, як везікула вивільняється, ймовірність
наступного вивільнення падає практично до нуля на протязі наступних
3-5 мс, і потім збільшується до свого нормального значення ще на протязі
3-5 мс. Згідно цим експериментам, сайт вивільнення є окрема активна зона
і ймовірність р відповідає ймовірності вивільнення в цій активній зоні
однієї докінгової везікули. Як наслідок, більшість центральних
збуджуючих синапсів мають тільки одну активну зону, і, таким чином, сайт
вивільнення є цілим синапсом, а ймовірність вивільнення приблизно
лінійно залежить від кількості докінгових везікул. Проведені нами
експерименти в умовах локальної стимуляції поодинокої терміналі з
частотою близько 1 кГц показали, що постсинаптичний струм дійсно швидко
зменшується по амплітуді практично до нуля і після невеликої перерви
відновлює своє попереднє значення. Однак, таке зменшення
постсинаптичного струму не відбувалось миттєво після декількох
стимуляцій, а виснажувалось поступово, хоча і за короткий час.
Аналізуючи амплітудні набори вГПСС на двох умовних часових етапах
стимуляції — на початку затухання струму, при достатньо великій
ймовірності вивільнення і в процесі її спаду, практично до нуля, в
контексті біноміальної моделі квантового вивільнення медіатора із
одиничної синаптичної терміналі, була показана незмінність – постійність
розміру кванту медіатору, що вивільняється, на обох часових проміжках.
Даний факт свідчить не тільки на користь самої квантової природи
вивільнення медіатора в даних синапсах, але і припускає наявність не
однієї, а декількох, до десятка, везікул, готових до вивільнення, інакше
постсинаптичний струм затухав би миттєво. Цей висновок підтверджують
сучасні морфологічні дослідження електронної мікроскопії. Так, квантовий
ультраструктурний аналіз в збуджуючих синапсах гіппокампу показав, що
наявність готових до вивільнення, докінгових везікул в синаптичних
з(єднаннях доходить до 30 одиниць, в залежності від розміру даної
активної зони, а в середньому складає до 10 везікул. Цікаво також
відмітити, що кількість докінгових везікул лінійно залежить від розміру
активної зони, в кожному конкретному синаптичному з(єднанні. Хоча при
порівняльному аналізі культуральних нейронів і нейронів в зрізах було
відмічено, що кількість причеплених везікул в синаптичних з(єднаннях
культуральних клітин завжди менша (практично у два рази) за відсутності
відмінностей в розмірах активних зон. При цьому кількість активних зон,
що спостерігалась в синаптичних з(єднаннях в культурі була більшою, ніж
у зрізах. Слід відмітити, що дані морфологічні ультраструктурні
дослідження синаптичних з(єднань, як і більшість, відносяться до
збуджуючих синапсів, хоча в якійсь мірі вони можуть бути інтерпретовані
і для гальмівних з(єднань. Взагалі розмір синаптичних контактів в різних
відділах мозку відрізняється, що в рамках розглянутої теорії
багатоквантового вивільнення може відігравати велику роль та потребує
подальших майбутніх досліджень.

Згідно кальцієвої гіпотези нервовий імпульс приводить до входу іонів
кальцію в пресинаптичну терміналь, де вони звя(зуються з
кальцій-чутливою молекулою (сенсором), що приводить до збільшення
ймовірності злиття везікул з мембраною. Існує залежність між середньою
кількістю медіатора (середнім квантовим вмістом), що вивільняється при
поодинокому потенціалі дії та концентрацією двовалентних іонів. При
цьому припускається, що кальцієвий сенсор може звя(зувати до чотирьох
іонів кальцію і місця зв(язування є незалежними та ідентичними. Катц та
Міледі (1969) показали, що транзієнтний вхід іонів кальцію, який
викликається нервовим імпульсом, прямо, безпосередньо визначає процес
вивільнення медіатора. Із вищесказаного випливає, що для того, щоб
впливати на умови, що приводять до вивільнення нейротрансміттера,
необхідно змінювати величиною потоку Са2+, що входить в пресинаптичну
терміналь. Кількість нейротрансмітера, що вивільняється із
пресинаптичної терміналі, прямо пропорційна кількості Са2+, яка входить
в терміналь при проходженні потенціалу дії. Раніше на нервово-м(язовому
з(єднанні в умовах фіксації потенціалу було показано, що
потенціалкерований кальцієвий струм викликає в синапсі вивільнення
нейротрансміттера так, що амплітуда усереднених збуджуючих
постсинаптичних струмів збільшується або зменшується, повторюючи форму
вольт-амперної характеристики кальцієвого струму в пресинаптичній
терміналі. Відомо, що іони Са2+ відіграють важливу роль в процесі
вивільнення нейромедіатора та надходження Са2+ із зовнішньоклітинного
середовища відбувається через високопорогові канали, що присутні в
пресинаптичній терміналі. Очевидно, що в наших дослідах при стимуляції
поодинокої терміналі лінійне збільшення амплітуди стимулу викликало
лінійну зміну деполяризації потенціалу всередині синаптичної терміналі,
що в свою чергу нелінійно змінювало надходження іонів Са2+ через
високопорогові канали та відповідно модулювало кількість вивільнення
нейромедіатора. Іншими словами, зміна середньої амплітуди вивільнення
вГПСС повністю модулюються вольт-амперною характеристикою
високопорогових каналів, що регулюють динаміку Са2+ в пресинаптичному
закінченні. В наших експериментах було отримано подібну залежність
амплітуди гальмівних постсинаптичних струмів в культурі кори головного
мозку від величини стимулюючого струму. Подібні результати також були
отримані на гальмівних синаптичних відповідях в культивованих нейронах
гиппокампа. Із проведеного біноміального аналізу гістограм амплітудних
наборів вГПСС на різних етапах стимуляційної залежності було показано,
що зміни в амплітуді пов(язані зі збільшенням ймовірності вивільнення
медіатора, що, очевидно, збільшувалась в зв(язку з збільшенням входу
іонів кальцію в пресинаптичну терміналь. Важливим фактом квантового
аналізу амплітудних розподілів вГПСС в дослідах з лінійним збільшенням
локального імпульсу, що стимулює поодиноку терміналь є те, що при різних
величинах стимулу квантовий розмір не змінювався. Таким чином,
мінімальна порція кванта не залежала ні від рівня деполяризації
пресинаптичної терміналії ні від кількості іонів Са2+.

В даних дослідженнях ми охарактеризували квантову природу синаптичної
передачі в гальмівних синапсах нейронів кори головного мозку.
Застосування методу зовнішньої локальної стимуляції поодинокої
пресинаптичної терміналі та реєстрація викликаних відповідей на
постсинаптичному нейроні дає новий якісний рівень оцінки квантових подій
та спостереження процесів, що відбуваються при вивільненні
нейротрансміттера. Аналіз отриманої постсинаптичної активності
проводився декількома незалежними статистичними методами, застосування
яких в наступному, як математичного апарата для аналізу синаптичних
подій, дозволить більш точно аналізувати механізми, що відбуваються в
процесі вивільнення медіатора.

ВИСНОВКИ

В умовах культури кори головного мозку на синаптично зв(язаних парах
нейронів були досліджені властивості викликаних ГПСС, що виникають в
пірамідних нейронах кори при локальній стимуляції аксону гальмівного
інтернейрона. По кінетичним та фармакологічним властивостям дані струми
ідентифіковані як ГАМКА активовані гальмівні струми.

Автокореляційний аналіз амплітудних розподілів викликаних ГПСС на ранній
стадії розвитку культури кори головного мозку (10-12 день) показав, що
ці розподіли в більшості досліджуваних клітин мають полімодальний
характер.

В умовах мінімальної ймовірності вивільнення медіатора за відсутності в
зовнішньоклітинному розчині іонів Са2+ та за наявності блокатора
передачі потенціалу дії ТТХ, були зареєстровані мініатюрні
постсинаптичні струми, амплітудні розподіли яких носили унімодальний
характер з середнім значенням 11.0(2.1 пА.

Дослідження поодинокої гальмівної синаптичної терміналі, що розташована
поблизу або безпосередньо на сомі пірамідних нейронів кори головного
мозку, методом зовнішньої електричної стимуляції показало, що
вивільнення нейромедіатора ГАМК в даних нейронах носить квантовий
характер. Вивільнення медіатора статистично описувалось біноміальною
моделлю з розміром кванта постсинаптичної відповіді 10.3 (0.7 пА.

Оцінений рівень одиничного квантового вивільнення в умовах реєстрації
спонтанних мініатюрних гальмівних струмів співпадав з отриманим
квантовим періодом при математичному аналізі мультипікових амплітудних
гістограм вГПСС (біноміальний та автокореляційний методи), що свідчить
на користь адекватності вибору математичної моделі опису вивільнення
медіатора як багатоквантового процесу в гальмівних синапсах кори
головного мозку.

Показано, що лінійне збільшення інтенсивності амплітуди стимуляції
поодинокої гальмівної синаптичної терміналі приводить до нелінійної
(дзвоноподібної) зміни величини вивільненого нейромедіатора, що прямо
залежить від кількості іонів Са2+, що входять в клітину через
потенціалкеровані іонні канали та регулюють процес вивільнення
синаптичних везікул.

Різний рівень деполяризації поодинокої пресинаптичної терміналі в
гальмівному синапсі кори головного мозку не змінює величину кванта
вивільнення нейромедіатора, при цьому змінюється лише величина
середнього квантового вмісту і, як наслідок, збільшується середній
постсинаптичний струм.

Перелік опублікованих праць здобувача за темою дисертації.

Палигін О.О. Медведєва Ю.В. Федулова С.А. Веселовський М.С.
ГАМК-опосередковане гальмування в культивованих нейронах кори головного
мозку щурів. Нейрофізіологія 2002, т.34, № 1, ст. 33-41.

Paligin O.A. Medvedeva Y.V. Moskalyuk A.A. Fedulova S.A. Veselovsky N.S.
Quantum properties of GABA release in cultured neurons from the rat
cortex. Нейрофізіологія, 2002, т.34, № 2/3, ст. 209-211.

Палигін О.О. Медведєва Ю.В. Федулова С.А. Веселовський М.С. Квантовые
характеристики синаптического выброса ГАМК в условиях стимуляции
еденичной синаптической терминали нейронов в культуре коры головного
мозга крыс. Нейрофізіологія 2004, т.36, № 3, ст. 187-193.

Тези доповідей:

Paligin O.A. Medvedeva Y.V. Fedulova S.A. Veselovsky N.S. Assesment of
the reliability of amplitude fluctuations of the single inhibitory
synapse in cultured rat cortex neurons // Intracellular signalling in
excitable cells.- Kiev (Ukraine).- 2002.- p. 17.

Paligin O.A. Medvedeva Y.V. Fedulova S.A. Veselovsky N.S. Effect of
stimulus intensities on evoked inhibitory postsynaptic currents in
single synapses of hippocampal neurons // Polish Neuroscience Society
Sixth International Congress.- Warsaw (Poland).-Acta Neurobiologiae
experimentalis.-2003.-V.63.- № 3.- p. 244.

Paligin O.A. Medvedeva Y.V. Fedulova S.A. Veselovsky N.S. Quantum
properties of GABA release in cultured neurons from the rat cortex //
IBRO CEERC School of Molecular Neurobiology Communicating Between
Synapse and Nucleus: From Receptors to Genes to Extracellular Matrix.-
Warsaw (Poland).-2003.- p.28.

Paligin O.A. Medvedeva Y.V. Fedulova S.A. Veselovsky N.S. GABA release
at a single inhibitory terminal of cultured rat cortex neurones //
Neuroscience meeting.- New Orleans (Louisiana,USA).-2003.- P.16.

Анотації.

Палигін О.О. Дослідження квантових властивостей синаптичного вивільнення
ГАМК в культурі кори головного мозку щура. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.02 – біофізика. Інститут фізіології ім. О.О.
Богомольця НАН України, Київ, 2003.

Дисертацію присвячено дослідженню квантових властивостей синаптичного
вивільнення ГАМК в умовах локальної електричної стимуляції
пресинаптичних закінчень нейронів кори головного мозку. Показано, що
оцінений рівень одиничного квантового вивільнення в умовах реєстрації
спонтанних мініатюрних гальмівних струмів співпадав з отриманим
квантовим періодом при математичному аналізі мультипікових амплітудних
гістограм викликаних гальмівних постсинаптичних струмів (біноміальний та
автокореляційний методи). В умовах стимуляції поодинокої пресинаптичної
терміналі в гальмівному синапсі кори головного мозку лінійне збільшення
інтенсивності амплітуди стимуляції приводило до нелінійної
(дзвоноподібної) зміни величини вивільненого нейромедіатора Більш того,
різний рівень деполяризації поодинокої пресинаптичної терміналі не
змінює величину кванта вивільнення нейромедіатора, при цьому змінюється
лише величина середнього квантового вмісту. Отримані дані дозволяють
припустити адекватність математичної моделі опису вивільнення медіатора
як багатоквантового процесу в гальмівних синапсах кори головного мозку.

Ключові слова: культура нейронів кори, ГАМК-активовані струми,
біноміальний розподіл, автокореляція, квантові характеристики.

Палыгин О.А. Исследование квантовых свойств синаптического выброса ГАМК
в культуре коры головного мозга крысы. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 03.00.02 – биофизика. Институт физиологии им. А.А.
Богомольца НАН Украины, Киев, 2003.

Диссертация посвящена изучению квантовых свойств синаптического
высвобождения ГАМК в условиях локальной электрической стимуляции
пресинаптических окончаний нейронов коры головного мозга. Показано, что
оцененный уровень одиночного квантового выброса в условиях регистрации
спонтанных миниатюрных тормозных токов совпадал с полученным квантовым
периодом при математическом анализе мультипиковых амплитудных гистограмм
вызванных тормозных постсинаптических токов (биномиальный и
автокорреляционный методы). В условиях стимуляции одиночной
пресинаптической терминали в тормозном синапсе коры головного мозга
линейное увеличение интенсивности амплитуды стимуляции приводило к
нелинейному (колокообразному) изменению величины высвобожденного
медиатора. Более того, при разном уровне деполяризации одиночной
пресинаптической терминали не изменялась величина кванта выброса
нейромедиатора, при этом изменялась только величина среднего квантового
содержания. Полученные данные позволяют предположить адекватность
математической модели описывающей выброс медиатора как многоквантовый
процесс в тормозных синапсах коры головного мозга.

Ключевые слова: культура нейронов коры, ГАМК-активируемые токи,
биномиальное распределение, автокорреляция, квантовые характеристики.

Paligin O.A. Quantum properties of synaptic GABA release in cultured
neurons from the rat cortex. – Manuscript.

Thesis for a candidate’s degree of the speciality 03.00.02 – biophysics.
— Bogomoletz Institute of Physiology of the National Academy of Sciences
of Ukraine, Kyiv, 2003.

This dissertation is devoted to investigation of quantal properties of
synaptic GABA release using local stimulation of presynaptic terminal in
rat cortex neurones. The cultured synaptically connected cortical
neurons were investigated using the whole-cell patch-clamp technique, at
a holding potential of –80mV. Inhibitory postsynaptic currents (IPSC)
were elicited by stimulation axon of interneurone. Practically complete
and reversible block of evoked postsynaptic currents was observed after
the application of 10 (M bicuculline The average amplitude of evoked
postsynaptic currents depended on membrane potential and reversed at
potential -16 ( 3 mV (n=5) close to equilibrium potential (for given in-
and outside concentrations) of Cl- calculated by the Nernst equation. We
concluded that registreted currents were mediated by GABA. The amplitude
of stimulus-evoked inhibitory postsynaptic currents fluctuated from a
measurable minimum of about 7 pA to 500 pA. Fitting amplitude histograms
wits several Gaussian curves resulted in peaks that were equidistant
wits the mean space of 9.4(0.4 pA (n=15), which was assumed as one
quantum analysed by the autocorrelation method.

Currents arose in responses to gradual activation of neurotransmitter
release by direct extracellular electrical stimulation of a single
presynaptic terminal by short (3ms) depolarization pulses with frequency
0,2 s-1. Stimulus-evoked inhibitory postsynaptic currents fluctuated
with regard to discrete aliquot values of their peak amplitudes from a
measurable minimum of 5pA to 220pA, and assumed as superimposition of
statistically independent quantal events. Fitting amplitude histograms
of evoked inhibitory postsynaptic currents with several Gaussian curves
resulted in peaks that were equidistant with the mean space of 10.3 (0.7
pA (n=6), which was assumed as one quantum (quantum size) to construct
the binomial distribution. Spontaneous miniature inhibitory postsynaptic
currents were observed in Ca2+-free TTX-containing solution. The
distribution of miniature inhibitory postsynaptic currents was skewed to
larger current amplitudes and could be fitted reliably by one Gaussian
with the mean of 11.0(2.1 pА (n=10). In experiments on a single
presynaptic terminal, linear increase of the stimulating pulse amplitude
caused different behaviour of IPSC. In a range of small intensities of
stimulating pulses, the amplitudes of evoked IPSC reached some maximal
value. A further linear increase of stimulating pulse intensity resulted
in the reversible decrease of the amplitudes of evoked IPSC, thus
amplitudes with high quantal value were decreased. Accordingly, average
amplitudes of evoked IPSCs had bell-shaped dependence on intensity of
stimulating voltage.

These data demonstrates that mathematical model of neuromediator release
is quite consistent with experimental data obtained for multyquantal
release from inhibitory synaptic terminal of rat cortex neurones.

Key words: rat cortex culture, GABA-activated currents, binomial
distribution, autocorrelation, quantal characteristics.

PAGE 21

Похожие записи