НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

Семенюта Іван Володимирович

УДК 577.1+519.237.8+004.032.26

Дослідження інформативності клітинних моделей для попередньої оцінки
біологічної активності речовин

02.00.10 – біоорганічна хімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ -2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі медико-біологічних досліджень Інституту
біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України.

Наукові керівники

член-кореспондент НАН України,

доктор медичних наук, професор

Луйк Олександр Ігорович

доктор медичних наук, професор,

заслужений діяч науки і техніки України

Лук?янчук Віктор Дмитрович

Луганський державний медичний університет,

завідувач кафедри фармакології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

Бєленічев Ігор Федорович,

Запорізький державний медичний університет,

завідувач кафедри фармакології та медичної рецептури

доктор медичних наук

Жирнов Віктор Валентинович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України,

завідувач відділу сигнальних систем клітини

Провідна установа Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

відділи комбінаторної хімії, молекулярної та квантової біофізики

Захист відбудеться 15 червня 2007 року о 10 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії
та нафтохімії НАН України, 02660, Київ-94, вул. Мурманська, 1.

З дисертацією можна ознайомитись в науковій бібліотеці Інституту
біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, 02660, Київ-94, вул.
Мурманська, 1.

Автореферат розісланий 15 травня 2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради
Д.М. Федоряк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Пошук нових фізіологічно активних речовин (ФАР) та
створення на їх основі лікарських препаратів є одними з найбільш
важливих завдань сучасної біоорганічної хімії і фармакології (Thomas A.
Ban, 2006; Белоусов Ю.Б., 2006). У більшості випадків відкриття нової
ФАР є результатом емпіричного скринінгу десятків тисяч нових хімічних
сполук. Незважаючи на значні успіхи сучасної науки в справі пошуку та
дослідження властивостей біорегуляторів, створення нових лікарських
препаратів, як і раніше, вимагає значних витрат людських і матеріальних
ресурсів, причому значна частина витрат пов’язана зі скринінгом великої
кількості речовин на різні види біологічної активності. З літературних
джерел (Klech H., 2005) відомо, що провідні фармацевтичні компанії, для
створення та впровадження в медичну практику одного лікарського
препарату, синтезують та перевіряють понад 10000 хімічних сполук, на це
витрачається 12 –15 років роботи та близько 1 млрд. доларів США.

Актуальність даного дослідження обумовлена необхідністю пошуку нових
підходів до виявлення біологічної активності речовин, які б
забезпечували його оптимізацію шляхом суттєвого прискорення та
здешевлення. Особливої уваги, на нашу думку, заслуговує пошук
біологічних моделей, максимально інформативних та чутливих до дії
хімічних сполук різних класів, які б дозволяли з мінімальними затратами
часу та матеріальних ресурсів виявляти ФАР серед нових речовин.

Здавалось перспективним застосувати біологічні моделі не тільки для
скринінгу, а й для вивчення не менш складної проблеми дії ксенобіотиків
на живі організми, особливо в концентраціях, значно нижчих від гранично
допустимих (ГДК), оскільки зростаюче з кожним роком техногенне
забруднення навколишнього середовища ставить проблему контролю стану
довкілля на одне з перших місць (Ковальчук П.І., 2003). Особливий
інтерес становить вплив на живі організми таких сильнодіючих хімічних
агентів, як важкі метали (Mudryi I.V., 2002). Виходячи з цього, є
актуальним вивчення впливу катіонів важких металів на клітинному рівні в
концентраціях, нижче ГДК, що дотепер є маловивченими.

Таким чином, виходячи з вищесказаного, є актуальним пошук та
дослідження інформативних та чутливих біологічних моделей для
попередньої оцінки біологічної активності нових речовин, а також
вивчення впливу катіонів важких металів на ці біологічні моделі в
концентраціях, значно нижчих від ГДК.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є
розвитком досліджень по вивченню дії ФАР на сигнальні системи клітини та
функціональний стан різних біооб?єктів. Робота виконувалась в рамках
наукової теми «Вивчення неспецифічної дії ксенобіотиків як основи для
скринінгу біологічно активних речовин» (тема № 2.1.10.29-95, №
держ. реєстрації 0195U025780) відділу медико-біологічних досліджень
ІБОНХ НАН України та проекту Державної науково-технічної програми МОН
України «Створення принципово нової системи моніторингу навколишнього
природного середовища на основі сучасних фізико-хімічних методів
вимірювання та математичного моделювання впливу шкідливих факторів на
природні та штучні біооб?єкти» (шифр № 01.03/04646 «Біотест», № держ.
реєстрації 0198U001926).

Мета та задачі дослідження. Мета роботи ( пошук інформативних та
чутливих біомоделей для попередньої оцінки біологічної активності
речовин з використанням експериментальних та математичних методів.

Основні задачі дослідження:

Вивчити та зробити попередню оцінку ефектів ФАР з протилежними
біорегуляторними стереотипами на різних експериментальних біомоделях.

Оцінити рівень інформативності біомоделей за допомогою методів штучних
нейронних мереж (ШНМ) та кластерного аналізу.

Провести експериментальну оцінку чутливості біомоделей до дії катіонів
важких металів.

Розробити алгоритм ефективного пошуку та попередньої оцінки біологічної
активності нових речовин.

Об’єкт дослідження – біологічні моделі.

Предмет дослідження – біорегуляторна дія ФАР, що виявляється на різних
біологічних моделях.

Методи дослідження – метод розеткоутворення Т-лімфоцитів, електрофорез,
кластерний аналіз, метод штучних нейронних мереж, методи математичної
обробки результатів.

Наукова новизна отриманих результатів. Отримані нові дані про вплив ФАР
з протилежними біорегуляторними стереотипами на різні експериментальні
біомоделі та вказані елементи спільності в регуляції функціонального
стану досліджених біооб’єктів. За допомогою методів ШНМ та кластерного
аналізу виявлено найбільш інформативні біомоделі, що можуть
використовуватись для первинного тестування нових речовин. Вперше
показані вплив катіонів важких металів на імунокомпетентні клітини та
зміна функціонального стану лімфоцитів при їх дії в концентраціях,
значно нижче ГДК. Розроблено оригінальну стратегію пошуку та попередньої
оцінки біологічної активності синтезованих речовин, яка ґрунтується на
їх взаємодії з клітинними сигнальними системами.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані результати можуть
бути використані для розробки та впровадження в практику принципово
нової стратегії пошуку лікарських препаратів, яка ґрунтується на
первинному тестуванні потенційних ФАР за допомогою запропонованих
біомоделей, що дозволить з високим ступенем імовірності передбачати
спектр тих чи інших видів біологічної активності в нових хімічних
сполуках.

Ряд біомоделей, використаних в роботі, внаслідок значної чутливості до
деяких хімічних факторів, можуть бути використані для контролю стану
навколишнього середовища.

Особистий внесок здобувача. Проведення експериментальних досліджень
впливу ФАР на біомоделі, статистична обробка результатів, застосування
методу кластерного аналізу, розробка алгоритму ефективного пошуку та
попередньої оцінки біологічної активності нових речовин були здійснені
особисто здобувачем. Аналіз експериментальних результатів методом ШНМ з
різними модифікаціями був проведений спільно з к.х.н. Ковалішиним В.В.
Постановка завдань, обговорення результатів та формування висновків
відбувалося спільно з керівниками. Результати робіт, що опубліковані у
співавторстві та увійшли до дисертації, одержані особисто дисертантом.
Автор глибоко вдячний к.б.н. Метелиці Л.О., к.б.н. Чарочкіній Л.Л.,
к.б.н. Прокопенку Р.А., к.б.н. Калашниковій Л.Є. за методичну
допомогу при проведенні окремих фрагментів експериментальних досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи були
представлені на міжнародній науково-практичній конференції “Ліки —
людині” (Харків, червень 2001) і XVI науковій конференції з
біоорганічної хімії та нафтохімії (Київ, березень 2001), 1-й
Всеукраїнській науково-технічній конференції „Информационные процессы и
технологии. Информатика-2007” (Севастополь, квітень 2007).

Публікації. Основні результати роботи викладені в 4 статтях у наукових
фахових виданнях та 2 тезах доповідей на наукових форумах.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, огляду
літератури, опису методів досліджень, експериментальної частини, викладу
та обговорення результатів, висновків, списку літератури (196
найменувань) та 1 додатку. Дисертаційна викладена на 149 сторінках
друкованого тексту (з додатком), проілюстрована 22 таблицями та 20
малюнками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. З огляду на те, що дія ФАР на клітинні
сигнальні системи реалізується адекватною відповіддю, у першу чергу, на
клітинному рівні, з наступним поширенням відповіді на рівень органів,
систем органів та організму в цілому, то для об’єктивної оцінки ефектів
досліджуваних ФАР на клітинному рівні в роботі були використані клітини
крові, функції яких однозначно пов’язані з клітинними сигнальними
системами, а саме: лімфоцити, поліморфноядерні лейкоцити (ПМЯЛ), а також
тромбоцити. Виходячи з цього, використовували наступні модельні системи:
розеткоутворення Т-лімфоцитів, міграційні властивості ПМЯЛ, агрегацію
тромбоцитів, електрофоретичну рухливість нейтрофільних лейкоцитів, а
також метод електростимульованих фазних скорочень гладеньких м’язів
органу.

Для виявлення найбільш чутливих біооб’єктів вивчали кількісні та якісні
зміни функціонального стану в різних експериментальних моделях на фоні
впливу ФАР з відомими стереотипами дії на сигнальні системи клітини:
+I/–II – активатори аденілатциклазної та інгібітори Са-мобілізуючої
фосфоліпідної, –I/+II – інгібітори аденілатциклазної та активатори
Са-мобілізуючої фосфоліпідної клітинних сигнальних систем. В
експерименті були використані як відомі лікарські препарати різної
хімічної будови з різними фармакологічними властивостями, так і ряд
порівняно нових сполук.

Проводили дослідження чутливості лімфоцитів крові людини до катіонів
важких металів: Сd2+, Zn2+, Co2+, Cu2+ і Pb2+, які в експериментах, для
мінімізації аніонного впливу, використовували переважно у вигляді
хлоридів.

Для аналізу багаторядними ШНМ були використані експериментальні дані,
які відображають дію ФАР на модельні системи. Дані були попередньо
оброблені методами масштабувания та нормалізації, в наслідок чого, для
кожної з ФАР було отримано по 18 нормалізованих результатів. Для аналізу
ШНМ з активними нейронами також був використаний набір даних, що
складається з 18 вхідних ознак для кожної ФАР.

Результати дослідження та їх обговорення. З результатів дослідження
впливу ФАР на розеткоутворення Т-лімфоцитів, представлених у табл.1, для
ФАР класу +I/–II, у більшості випадків, встановлено достовірне
інгібування цього процесу. Виняток складають
біс-(в-хлоретил)-метатоліламін (МКДХЕА) в концентрації 10-6 моль/л, а
також кофеїн у концентрації 10-4 -10-5 моль/л, які активують процес
розеткоутворення (p(0,05). При дії ФАР класу –I/+II у більшості випадків
спостерігається активування цього процесу, за винятком обзидану, який у
концентрації 10-4-10-5 моль/л достовірно інгібує процес розеткоутворення
(p( 0,05).

Таблиця 1

Розеткоутворення Т-лімфоцитів під впливом ФАР (М±m, n =10)

Назва

ФАР Кількість розеток на 2·103 клітин

Концентрація ФАР, моль/л

10-4 10-5 10-6 10-5 ФАР+ 10-7 КТ*****

Атропін 2,4±0,1* 1,9±0,1* 3,4±0,1 3,1±0,1

BW-755С** 1,8±0,2* 2,0±0,2* 3,8±0,1* 2,5±0,1*

Ембіхін 2,0±0,2* 1,1±0,1* 2,6±0,2* 2,7±0,1

Теофілін 1,0±0,2* 1,3±0,2* 2,8±0,1 3,0±0,2

Кверцетин 2,4±0,1* 1,6±0,1* 2,5±0,1* 2,0±0,2*

Дімедрол 2,0±0,2* 2,9±0,3 2,6±0,2* 2,7±0,1

МКДХЕА*** 2,1±0,1* 2,4±0,2* 3,6±0,2* 2,4±0,2*

Ізадрин 2,0±0,2* 1,3±0,1* 2,6±0,2* 2,7±0,3

Форидон 2,7±0,5 2,8±0,1* 2,0±0,2* 2,9±0,1

Аспірин 2,1±0,1* 2,4±0,1* 3,2±0,2 2,0±0,2*

Вольтарен 1,2±0,1* 1,9±0,1* 2,7±0,1* 2,5±0,1*

Папаверин 1,7±0,1* 2,3±0,2* 2,7±0,2 3,5±0,2

Циклофосфан 1,0±0,2* 0,9±0,1* 2,2±0,1* 2,9±0,5

Кофеїн 4,0±0,2* 4,9±0,2* 2,8±0,2 3,5±0,1

Сульпірид 1,9±0,2* 1,9±0,1* 2,5±0,2* 3,2±0,2

Нітрендипін 2,0±0,2* 1,8±0,2* 2,5±0,1* 2,5±0,1*

Мілдронат 2,1±0,1* 1,7±0,1* 1,5±0,1* 3,0±0,2

Йохімбін 2,0±0,2* 3,0±0,2 3,2±0,1 3,1±0,1

Празозин 1,5±0,1* 2,2±0,2* 2,9±0,1 2,9±0,2

Галоперидол 1,4±0,1* 1,5±0,1* 1,8±0,2* 3,4±0,1

Фторацизин 2,2±0,1* 2,0±0,2* 2,8±0,1 2,9±0,3

Аміназин 2,9±0,1 3,1±0,2 3,1±0,2 3,0±0,2

Іміпрамін 2,0±0,2* 2,0±0,2* 2,6±0,1* 3,1±0,1

Дроперидол 2,0±0,2* 1,5±0,1* 3,0±0,2 3,0±0,2

Верапаміл 2,0±0,2* 2,2±0,1* 3,2±0,2 2,8±0,2

FMLP**** 2,5±0,1* 5,0±0,2* 6,0±0,2* 4,0±0,2*

Мезатон 3,8±0,1* 4,3±0,1* 3,2±0,1 3,5±0,2

Обзидан 2,5±0,1* 1,6±0,1* 3,0±0,2 3,0±0,2

Клонідин 4,8±0,2* 5,1±0,2* 4,0±0,2* 3,1±0,4

Контроль 3,1±0,1 3,1±0,1 3,1±0,1 2,9±0,2

Примітка. ( — розбіжності достовірні (Р( 0,05) у порівнянні з контролем,
** — 1-(3-трифторметил-феніл)-4,5-дигідро-1Н-піразол-3-іламін, *** —
біс-(в-хлоретил)-метатоліламін, **** —
форміл-метіоніллейцин-фенілаланін, ***** — коклюшний токсин.

При дії ФАР класу +I/–II на процес хемокінезу ПМЯЛ (табл.2), також
спостерігається у більшості випадків достовірне гальмування
хемокінетичних властивостей ПМЯЛ, за винятком теофіліну, що достовірно
активує цей процес в концентрації 10-6моль/л (p(0,05). Ця закономірність
зберігається й при вивченні хемотактичних властивостей ПМЯЛ (див.табл.2)
за умов активування аденілатциклазної та інгібування Са-мобілізуючої
фосфоліпідної клітинних сигнальних систем. При дослідженні впливу ФАР
класу –I/+II, необхідно відзначити в більшості випадків достовірну
активацію як реакції хемокінезу, так і реакції хемотаксису ПМЯЛ. Виняток
складає мезатон, який інгібує процес хемотаксису в концентрації
10-6моль/л (p( 0,05).

Таблиця 2

Міграційні властивості ПМЯЛ під впливом ФАР (М±m, n = 4)

Назва

ФАР Кількість клітин, що проникли в пори фільтру

Концентрація ФАР, моль/л

Хемокінез Хемотаксис

10-4 10-5 10-6 10-5 ФАР

+ 10-7 КТ 10-4 10-5 10-6

Атропін 12,5±0,5 5,9±1,3* 6,5±0,5* 11,3±1,2 30,0±1,5 13,9±2,6* 16,5±1,0*

BW-755C 7,0±0,5* 7,9±0,8 8,2±0,5 9,1±0,9 17,0±0,5* 14,5±1,1* 20,8±0,5

Ембіхін 5,0±0,5* 6,0±0,5* 10,3±2,5 8,2±1,2* 8,0±1,0* 11,8±0,9* 21,1±1,5

Теофілін 12,3±1,0 8,7±1,0* 16,4±2,0* 14,2±1,0 17,8±1,0* 29,5±1,0
29,2±1,5

Кверцетин 5,0±0,5* 7,0±0,5* 6,2±1,0* 4,3±0,5* 12,0±0,5* 13,2±1,5*
13,0±2,0*

Дімедрол 7,9±1,0* 8,6±0,5* 8,6±0,5 5,5±0,5* 9,0±1,0* 9,2±1,0* 9,6±1,0*

МКДХЕА 1,0±0,1* 6,3±0,5* 7,0±0,5* 11,5±1,0 11,0±0,5* 11,0±2,0* 12,0±1,5*

Ізадрин 5,0±1,0* 12,4±1,5 12,0±0,5 18,1±0,5* 17,5±0,5* 11,2±0,5*
24,5±1,5

Форидон 6,0±0,5* 5,5±1,0* 1,0±0,1* 8,8±0,5* 9,0±0,5* 8,5±1,0* 6,5±0,5*

Аспірин 11,0±0,5 12,0±1,5 12,0±0,5 13,0±0,5 24,0±0,5 24,5±1,0 25,0±1,0

Вольтарен 6,0±0,5* 7,5±0,5* 8,0±0,5* 13,0±1,0 6,0±0,5* 7,3±1,0*
19,5±0,6*

Папаверин 9,0±1,0 11,0±1,0 12,0±0,5 12,5±0,5 24,3±1,0 24,5±0,5 26,0±1,0

Циклофосфан 2,0±0,5* 6,0±1,0* 3,0±0,5* 2,0±0,5* 21,5±0,5 17,5±0,5*
17,0±0,5*

Кофеїн 13,5±0,5 13,5±0,5 11,0±1,0 8,0±1,0* 29,5±0,5 35,5±1,5* 23,5±0,5

Сульпірид 12,5±1,5 12,5±1,5 14,0±1,0 12,5±1,0 21,0±1,0 21,5±1,5 21,0±0,5

Нітрендипін 13,5±0,5 10,2±1,5 12,5±0,5 11,0±0,5 15,5±0,5* 13,4±1,5*
21,0±0,5

Мілдронат 8,5±0,5* 8,0±0,5* 9,0±1,0 11,6±0,5 24,3±0,5 22,5±2,0 22,0±0,5

Йохімбін 7,5±0,5* 8,0±0,5* 9,5±0,5 9,6±1,0 17,0±1,0* 18,5±0,5* 25,5±1,0

Празозин 9,5±1,0 9,5±1,0 9,5±0,5 10,2±1,5 26,5±1,0 26,5±1,0 27,0±0,5

Галоперидол 14,1±1,3 11,5±1,5 11,5±1,0 6,0±1,0* 14,1±2,0* 20,0±0,5*
27,5±1,0

Фторацизин 6,5±0,5* 10,0±0,5 10,0±0,5 8,7±1,0* 26,0±1,0 23,0±0,5
24,0±1,0

Аміназин 14,0±0,5 10,0±0,5 10,0±0,5 6,4±0,5* 28,5±0,5 29,5±0,5 28,0±1,0

Іміпрамін 13,0±0,5 9,5±0,5 12,0±1,0 8,1±1,5 16,0±0,5* 14,0±1,0* 20,8±1,5

Дроперидол 12,0±1,0 10,8±1,0 14,0±1,5 9,1±1,5 18,0±1,0* 13,6±1,5*
19,6±1,0*

Верапаміл 11,4±1,0 10,3±0,5 13,6±1,0 10,2±0,5 15,5±0,5* 26,0±2,0
25,6±1,0

FMLP 14,5±0,5 16,0±1,0* 12,0±0,5 11,0±0,5 19,0±1,5* 20,0±2,0 24,0±2,5

Мезатон 17,6±1,5* 23,2±1,0* 21,0±2,5* 15,1±0,5 48,6±1,0* 50,4±1,5*
19,9±1,0*

Обзидан 17,5±1,5* 21,7±1,3* 15,5±0,9* 10,5±0,9 25,5±1,0 26,6±2,0
24,0±1,0

Клонідин 20,5±0,5* 24,2±2,3* 15,0±1,0* 20,4±0,5* 33,0±0,5* 36,5±0,5*
26,0±0,5

Контроль 11,3 ± 1,5 11,3 ± 1,5 11,3 ± 1,5 11,3 ± 1,5 26,0 ± 2,5 26,0 ±
2,5 26,0 ± 2,5

Примітка. ( — розбіжності достовірні (Р( 0,05) у порівнянні з контролем.

Аналіз результатів, отриманих при дії ФАР класу +I/–II на агрегацію
тромбоцитів (табл.3) показує, що у своїй більшості ФАР цього класу
сповільнюють агрегацію тромбоцитів за винятком празозину в концентрації
10-5моль/л, іміпраміну в концентрації 10-5 -10-6моль/л та сульпіриду в
концентрації 10-4 моль/л і 10-6моль/л, які достовірно прискорюють
вищевказаний процес. У свою чергу, ФАР класу –I/+II або сповільнюють
агрегацію тромбоцитів, або не чинять статистично достовірного впливу.

Таблиця 3

Агрегація тромбоцитів під впливом ФАР (М±m, n = 6)

Назва

ФАР Швидкість агрегації, D/хв*1000

Концентрація ФАР, моль/л

10-4 10-5 10-6

Атропін 9,5±0,3 7,8±0,2* 8,9±0,3

BW-755C 7,0±0,2* 9,9±0,6 10,7±0,5

Ембіхін 9,7±0,8 10,0±0,4 11,2±0,2

Теофілін 8,6±0,7 10,1±0,2 10,9±0,4

Кверцетин 9,1±0,4 9,8±0,4 11,9±0,3

Дімедрол 9,8±0,4 6,5±0,3* 7,6±0,4*

МКДХЕА 5,8±0,6* 7,6±0,3* 7,7±0,6*

Ізадрин 8,3±0,3 10,1±0,2 9,8±0,4

Форидон 8,5±0,2 9,6±0,4 9,0±0,4

Аспірин 6,3±0,2* 6,0±0,6* 6,8±0,1*

Вольтарен 0,3±0,04* 6,0±0,4* 7,2±0,5*

Папаверин 4,0±0,2* 6,0±0,3* 9,2±0,1

Циклофосфан 8,5±0,3 9,0±0,2 9,5±0,4

Кофеїн 3,4±0,3* 7,0±0,6* 10,1±0,4

Сульпірид 13,5±0,5* 9,5±0,2 12,5±0,3*

Нітрендипін 3,9±0,1* 9,8±0,3 9,3±0,2

Мілдронат 7,9±0,3* 8,4±0,5 8,4±0,2

Йохімбін 5,5±0,3* 7,2±0,1* 13±0,1*

Празозин 6,1±0,2* 16,2±0,3* 10,8±0,1

Галоперидол 5,0±0,2* 5,0±0,1* 9,8±0,2

Фторацизин 9,9±0,1 9,6±0,2 9,5±0,2

Аміназин 1,6±0,1* 2,3±0,1* 11,9±0,3

Іміпрамін 10,9±0,2 14,9±0,1* 14,2±0,2*

Дроперидол 3,3±0,2* 1,3±0,1* 5,6±0,2*

Верапаміл 10,6±0,2 8,6±0,1 8,1±0,2

FMLP 0,5±0,1* 3,9±0,2* 9,9±0,3

Мезатон 8,8±0,7 9,1±0,4 10,5±0,3

Обзидан 7,4±0,5* 9,9±0,1 7,4±0,6*

Клонідин 8,1±0,4 10,2±0,7 10,5±0,4

Контроль 10,1±0,9 10,1±0,9 10,1±0,9

Примітка. * — розбіжності достовірні (Р( 0,05) у порівнянні з контролем.

Резюмуючи дані, отримані нами, а також Калашниковою Л.Є. і Прокопенком
Р.А., які опубліковані в спільних роботах (Семенюта И.В. и др., 2004) та
представлені в їх дисертаціях, при вивченні впливу ФАР на процес
електрофорезу нейтрофільних лейкоцитів і наведені в табл.4, необхідно
відзначити, що ФАР класу +I/–II у більшості випадків збільшують
електрофоретичну рухливість лейкоцитів, а ФАР протилежного класу
(–I/+II) — зменшують рухливість клітин в електричному полі.

Таблиця 4

Електрофоретична рухливість лейкоцитів та електростимульовані фазні
скорочення гладеньких м’язів органу під впливом ФАР (М±m, n = 4)

Назва

ФАР Амплітудні значення скорочуваності, мН Концентрація ФАР, моль/л
Електрофоретична рухливість клітин,

(мкм?см /В?с), при концентрації ФАР

10-4 моль/л

10-6 10-5 10-4

Нітрендипін 5,4±0,2* 5,0±0,2*1 0,6±0,1* 0,65±0,04*

Празозин 6,1±0,1 6,3±0,2 5,8±0,1 0,61±0,03*

Галоперидол 6,2±0,2 6,3±0,2 0,9±0,1* 0,75±0,06

Фторацизин 5,9±0,2 5,9±0,21 1,0±0,1*1 0,51±0,04*

Аміназин 6,1±0,2 6,7±0,3 2,3±0,1* 0,59±0,03*

Іміпрамін 6,0±0,2 6,5±0,31 1,2±0,1*1 0,65±0,06*

Дроперидол 5,9±0,3 6,0±0,31 1,4±0,2*1 0,70±0,04*

Верапаміл 5,4±0,2 2,6±0,3*1 2,3±0,1* 0,60±0,03*

FMLP 6,3±0,1 6,4±0,2 6,5±0,2 0,93±0,07*

Атропін 5,8±0,1 5,8±0,2 5,7±0,2 0,59±0,12*1

BW-755C 6,3±0,21 6,3±0,2 5,5±0,2* 0,68±0,04*1

Ембіхін 5,9±0,2 5,8±0,2 5,9±0,1 0,86±0,111

Теофілін 5,9±0,1 5,7±0,1*1 4,9±0,1*1 0,55±0,03*1

Кверцетин 5,8±0,2 4,3±0,1*1 1,5±0,2*1 0,55±0,06*1

Дімедрол 6,4±0,2 6,3±0,1 3,7±0,2*1 0,66±0,04*1

МКДХЕА 6,6±0,2 7,9±0,3* 8,5±0,4* 0,46±0,02*1

Ізадрин 5,7±0,1*1 4,8±0,1*1 4,7±0,2*1 0,48±0,03*1

Форидон 0,5±0,1* 0,45±0,1* 0,4±0,1* 0,55±0,04*1

Аспірин 5,9±0,1 5,9±0,2 5,7±0,2 0,55±0,08*1

Вольтарен 5,9±0,2 6,6±0,2 7,7±0,3*1 0,82±0,021

Папаверин 5,8±0,1 4,7±0,2*1 0,3±0,1*1 0,79±0,041

Циклофосфан 6,3±0,2 6,0±0,1 6,1±0,2 0,43±0,05*1

Кофеїн 5,8±0,2 5,8±0,1 5,7±0,1* 0,72±0,05*1

Сульпірид 6,5±0,2 6,4±0,2 6,2±0,2 0,76±0,021

Мілдронат 6,4±0,2 6,3±0,1 6,1±0,2 0,71±0,07*1

Йохімбін 6,4±0,2 5,2±0,2* 4,5±0,1* 0,78±0,021

Мезатон 6,4±0,2 7,3±0,2* 9,0±0,3* 0,98±0,03*1

Обзидан 6,3±0,2 6,1±0,1 4,0±0,1*1 1,19±0,07*1

Клонідин 5,9±0,1 6,6±0,1* 6,9±0,1*1 1,28±0,06*1

Контроль 6,1±0,1 6,1±0,1 6,1±0,1 0,84±0,03

Примітка. ( — розходження достовірні (Р( 0,05) у порівнянні з контролем,
1 – з дисертацій Калашникової Л.Є. та Прокопенка Р.А.

При вивченні впливу ФАР класу +I/–II на електростимульовані фазні
скорочення гладеньких м’язів органу (див.табл.4) у більшості досліджень
спостерігається зменшення амплітуди скорочення м’язів. Виняток складають
МКДХЕА в концентрації 10-4 -10-6 моль/л, вольтарен у концентрації 10-4
-10-5 моль/л, а також аміназин у концентрації 10-5 моль/л, які
достовірно підсилюють м’язові скорочення. ФАР класу –I/+II, у свою
чергу, у більшості випадків збільшують амплітудні значення
скорочуваності гладких м’язів органу, за винятком обзидану в
концентрації 10-4 моль/л, який чинить протилежну дію на процес
електростимульованих скорочень м’язів (p(0,05).

Дана закономірність між дією ФАР на трансмембранні сигнальні каскади та
отриманими функціональними відгуками модельних систем добре корелює з
даними в доступній літературі (Кухарь В.П. и др., 1991). При цьому, той
факт, що найбільш інформативними моделями є імунологічні реакції
(розеткоутворення Т-лімфоцитів, міграційні властивості ПМЯЛ) та
електрофоретична рухливість нейтрофільних лейкоцитів, не є винятком,
приймаючи до уваги відомості про чутливість імунокомпетентних клітин до
фізичних та хімічних факторів (Прокопенко В.В. и др., 1999). Серед
найменш інформативних біомоделей необхідно відзначити агрегацію
тромбоцитів та скорочуваність гладких м’язів органу. Важливо відзначити,
що як під час дії ФАР класу +I/-II, так і дії ФАР протилежного класу на
агрегацію тромбоцитів була отримана парадоксальна реакція, пов’язана зі
зниженням швидкості агрегації тромбоцитів в обох випадках, що можна
спробувати пояснити використанням тромбіну в якості індуктору агрегації,
який за даними літератури є інгібітором Са-мобілізуючої фосфоліпідної
системи та блокує дію ФАР класу -I/+II.

Дослідження дії хімічних агентів на клітинні реакції. Результати
дослідження впливу катіонів важких металів на процес розеткоутворення
Т-лімфоцитів, представлені в табл.5, вказують на достовірне гальмування
процесу розеткоутворення при мінімальних концентраціях катіонів, що
склали для катіонів Сd2+ і Co2+ — 10-4 ммоль/л, для Zn2+ і Cu2+ — 10-5
ммоль/л і для іонів Pb2+ ? 10-6 ммоль/л.

Ці факти, а також літературні дані (Луйк А.И. и др., 1999) дозволяють
зробити висновок про досить високу чутливість функціональних реакцій
лейкоцитарної популяції клітин крові до важких металів. Отримані дані
добре корелюють з результатами впливу фармакологічних агентів на процес
розеткоутворення, детально розглянутими раніше, а також підтверджують
припущення про значну чутливість лімфоцитів до ксенобіотиків взагалі.
Порівнюючи результати дослідження з діючими нормами ГДКв необхідно
відмітити, що інгібування процесу розеткоутворення в присутності
катіонів Zn2+, Co2+, Cu2+ і Pb2+ спостерігалося в концентраціях на 2-3
порядки нижче діючих норм ГДКв.

Аналіз отриманих результатів методами ШНМ та кластерного аналізу. Для
пошуку найбільш інформативних та чутливих біомоделей використовувався
метод ШНМ та кластерного аналізу. Для аналізу даних методом ШНМ
застосовувалось декілька модифікацій ШНМ: багаторядні ШНМ з прямим
розповсюдженням сигналів на основі методу послідовного видалення та
методу повного перебору ознак; ШНМ з активними нейронами на основі
методу повного перебору ознак та комбінації методу повного перебору з
методом ковзаючого контролю та попередньої оптимізації набору ознак
послідовним скороченням їхньої кількості. Основною відмінністю між
вищевказаними модифікаціями методу ШНМ є те, що в багаторядних ШНМ
кількість рядів мережі задається дослідником, а ШНМ з активними
нейронами мають активні нейрони, кількість яких задається алгоритмом
програми в залежності від поставленого завдання.

Таблиця 5

Розеткоутворення Т-лімфоцитів під впливом катіонів важких металів (М±m,
n = 4)

Досліджуваний катіон і його ГДКв, ммоль/л Концентрація Ме 2+

у пробі, ммоль/л Кількість Т-розеток на 102 клітин

Сd2+

9·10-5 10-4

10-5

10-6 22(0,5*

28(0,7

27(1,7

Zn2+

1,5·10-2 10-3

10-4

10-5

10-6 15(0,3*

21(0,5*

25(0,6*

28(0,8

Co2+

1,7·10-2 10-3

10-4

10-5

10-6 19(0,4*

23(0,5*

28(0,3

28(0,8

Cu2+

1,6·10-3 10-3

10-4

10-5

10-6 12(0,3*

22(0,5*

24(0,6*

26(0,6

Pb2+

5·10-4

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7 18(0,4*

20(0,5*

21(0,5*

21(0,5*

27(0,5

Контроль ? 28(0,7

Примітка. *- розбіжності достовірні (Р<0,05) у порівнянні з контролем. Оцінка інформативності ознак була зроблена на основі кількості правильно класифікованих ФАР. На наступній стадії досліджень була створена підсумкова таблиця, у якій на основі частоти повторюваності ознак по результатам аналізу ШНМ, оцінювався ступінь їхньої інформативності. На заключному етапі досліджень, для біомоделей, що вивчались, на основі отриманих результатів про інформативність ознак, була розрахована середня інформативність біомоделі, за результатами якої стало можливим об'єктивно зробити оцінку ступеня інформативності тієї чи іншої модельної системи. Розроблений та використаний у роботі алгоритм аналізу даних методом ШНМ представлено на рис.1. Рис.1. Алгоритм аналізу даних методами розпізнавання образів. 0 2 j " $ 2 - " $ d ? e I I & I & I & I & I & I & I & I & ^gng?g’gcg?g¶goaeaeaeae:«kdv I & I & h(h:hLh\hlhnhoaeaeaeae:«kd$ I & nh†h?h?h1/4hIhIhoaeaeaeae:«kdu I & I & I & I & I & I & I & I & I & I & I & I & I & I & I & ???? & I I ‡ ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ & ‡ ‡ & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & $If?kd & ? ?-?([email protected] & ?? E E ??????????? 22 вхідні ознаки, а в якості вихідних категорій були 2 умовні класи. Для поліпшення класифікаційної здатності, застосовували ШНМ з архітектурою 22-5-2 у вигляді ансамблю з 200 мереж. В результаті аналізу, кількість правильно класифікованих сполук склала 86 % (25 з 29). Оскільки класифікаційна здатність ШНМ застосовувалася для виявлення найбільш інформативних вхідних ознак, то основними критеріями оцінки інформативності використаних даних були: кількість правильно класифікованих ФАР, а також значення СКП при n-послідовних відкиданнях вхідних ознак. Раціональне використання значення СКП дозволяє досить об'єктивно оцінити класифікаційну здатність ШНМ та робити якісну оцінку інформативності вхідних параметрів. Вхідні ознаки, при відкиданні яких, значення СКП збільшувалося, мають більший внесок при класифікації на фоні інших, відповідно, мають найбільшу інформативність. При навчанні ШНМ на навчальній вибірці та перевірці результатів на контрольній вибірці значення СКП знаходилося в межах Е( 0,15. Отримані результати аналізу вказують на те, що значення СКП зменшується після відкидання ознак Х((2, 7, 8, 15, 18), тобто класифікаційна здатність, ШНМ поліпшується, отже, зазначені ознаки є найменш інформативними та зашумлючими вхідний набір ознак. З огляду на той факт, що вхідні ознаки Х((19-22) були додані до вхідного набору і мають певний суб'єктивний відтінок, вони не аналізувалися і надалі не будуть розглядатися. В свою чергу, найбільш інформативними є ті ознаки, при видаленні яких значення СКП збільшується. До цієї категорії відносяться ознаки Х((5, 6, 9, 12, 16, 17). На наступному етапі використовували метод перебору даних, який включає поперемінне видалення вхідних ознак з одночасним їх аналізом та комбінуванням. На відміну від попередніх досліджень, у даному випадку застосовували перебір вхідних ознак у різних комбінаціях та оцінку СКП класифікаційної здатності. У результаті був отриманий інший набір інформативних ознак Х((3, 6, 7, 14, 15, 18) і зменшене значення СКП до 0,0965. Таким чином, в результаті аналізу вхідних ознак багаторядними ШНМ двома модифікаціями було отримано два набори найбільш інформативних ознак № 1 - Х((5, 6, 9, 12, 16, 17) і набір №2 - Х((3, 6, 7, 14, 15, 18). Оскільки ці результати мають деяку неоднорідність, надалі аналіз наявних даних був продовжений ШНМ з активними нейронами. Використання ШНМ з активними нейронами. Вихідними категоріями, як і в попередній серії досліджень, були умовні 2 класи. Класифікуючу здатність ШНМ оцінювали по кількості правильно згрупованих препаратів, а також за значенням критерію варіації помилки прогнозу - RR. На першому етапі використовували метод повного перебору ознак, який передбачає пошук такої комбінації вхідних параметрів, при якій досягалася б найкраща класифікуюча здатність і найменше значення RR. Цей мінімум (RR=0,47) був знайдений для комбінації з п'яти ознак Х((2, 3, 4, 5, 6, 8, 16, 18). При цьому, класифікуюча здатність ШНМ склала 93 % (27 з 29 препаратів були класифіковані правильно). На другому етапі досліджень був зроблений повний перебір ознак з використанням методу ковзаючого контролю (МКК), який дозволяє оптимізувати вибір найбільш інформативних ознак та зменшити імовірність помилкових класифікацій. Найменше значення RR= 0,212 було отримано для групи з п'яти ознак Х((3, 4, 5, 6, 8, 18), а також був відзначений кращий результат класифікацій - 93 % (27 з 29 препаратів). Для подальшого підвищення класифікуючої здатності ШНМ, була зроблена оптимізація кількості ознак за допомогою методу послідовного скорочення вхідних параметрів. При цьому, на кожному етапі скорочення класифікація проводилася однорядною мережею та визначалося значення RR. Скорочення вхідного набору ознак продовжувалося до одержання оптимального набору, тобто такого, при якому значення RR було мінімальним. У результаті процесу оптимізації була отримана множина ознак Х(( 2, 4, 5, 6, 8, 13, 15, 18), якому відповідає значення RR=0,70381. Далі, для цього набору ознак була побудована ШНМ з активними нейронами, у якій відбувалося збільшення кількості рядів ШНМ до локального зниження RR, якому відповідає значення RR=0,301 та класифікуюча здатність - 90 % (26 з 29 препаратів правильно класифіковані). У табл.6 наведені результати аналізу ознак методом ШНМ із різними модифікаціями. Для визначення ступеня інформативності в останньому стовпці таблиці представлена інформативність ознак на підставі частоти їхньої повторюваності в результатах аналізу. Таблиця 6 Результати аналізу набору вхідних ознак багаторядними ШНМ та ШНМ з активними нейронами в різних модифікаціях Номер ознаки Багаторядні ШНМ зі зворотним розповсюдженням помилки ШНМ з активними нейронами Повторюваність даної ознаки в результатах аналізу, % Послідовне видалення Повний перебір Повний перебір Повний перебір + МКК Оптимі-зація набору 1 0 2 + + 40 3 + + + 60 4 + + + 60 5 + + + + 80 6 + + + + + 100 7 + 20 8 + + + 60 9 + 20 10 0 11 0 12 + 20 13 + 20 14 + 20 15 + + 40 16 + + 40 17 + 20 18 + + + + 80 Проведений детальний аналіз отриманих результатів (див. табл. 6) показав, що серед найбільш інформативних ознак, у яких відсоток повторюваності в результатах аналізу дорівнює 60-100%, знаходяться наступні ознаки: Х((3, 4, 5, 6, 8, 18). Слід відмітити, що найбільш інформативною є ознака № 6, яка є результатом впливу ФАР у концентрації 10-5 моль/л на хемокінетичні властивості ПМЯЛ. Наступними, за ступенем інформативності, є ознаки № 5 та 18, які представляють собою дію ФАР у концентрації 10-4 моль/л на хемокінетичні властивості ПМЯЛ та електрофоретичну рухливість нейтрофільних лейкоцитів відповідно. Серед найбільш інформативних ознак мають місце також ознаки № 3 і 4, які є результатом впливу ФАР у концентрації 10-6 моль/л і 10-5 ФАР+10-7 КТ моль/л на процес утворення спонтанних Е - розеток Т-лімфоцитів, а також ознака №8, яка є наслідком дії ФАР у концентрації 10-5 моль/л + 10-7 моль/л КТ на процес хемокінезу ПМЯЛ. Серед ознак середньої інформативності знаходяться наступні модельні системи: скорочуваність гладеньких м'язів органу при дії ФАР у концентрації 10-4 - 10-5 моль/л (ознаки № 15 і 16), а також утворення спонтанних Е - розеток Т-лімфоцитів (№ 2) при дії ФАР у концентрації 10-5 моль/л. Ознаки що залишились, утворюють групу малоінформативних, в яку входять: вплив ФАР у концентрації 10-6 моль/л на хемокінез ПМЯЛ - (№ 7), дія ФАР у концентрації 10-4 моль/л на хемотаксис ПМЯЛ - (№ 9), дія ФАР у концентрації 10-4 - 10-6 моль/л на процес агрегації тромбоцитів - (№ 12 - 14), а також скорочуваність гладеньких м'язів органу при дії ФАР у концентрації 10-6 моль/л (№ 17). Слід відзначити, що існує ряд ознак, № 1, 10, 11, які мають повторюваність у результатах аналізу рівну 0%, тому, імовірніше всього, вони є неінформативними та зашумлюючими вихідний набір даних. Представлені результати аналізу ознак на предмет інформативності вказують на те, що дані, отримані при дії ФАР на одну і ту ж біомодель в діапазоні досліджених концентрацій, мають різний ступінь інформативності. З цієї причини, для проведення комплексної оцінки інформативності біомоделей, доцільно використовувати середню інформативність біомоделі. Тому на наступному етапі було визначено середню інформативність досліджуваних біомоделей на основі вищенаведених результатів аналізу ознак методом ШНМ. Результати визначення середньої інформативності досліджуваних біомоделей представлені на діаграмі (рис.2). При цьому, найбільш інформативними біомоделями виявились електрофоретична рухливість нейтрофільних лейкоцитів (Сn=80%) та хемокінез ПМЯЛ (Сn =65%). У числі біомоделей середньої інформативності знаходяться такі модельні системи, як розеткоутворення Т-лімфоцитів (Сn=40%), а також скорочуваність гладеньких м'язів органу (Сn =33%). А найменш інформативними модельними системами є агрегація тромбоцитів (Сn =20%) та хемотаксис ПМЯЛ (Сn =7%). Аналізуючи отримані результати необхідно відзначити той факт, що серед ознак високого та середнього ступеня інформативності мають місце модельні системи, які базуються на функціональних реакціях лейкоцитарної популяції клітин крові (електрофоретична рухливість нейтрофільних лейкоцитів, хемокінез ПМЯЛ, розеткоутворення Т-лімфоцитів), при цьому важливо підкреслити, що аналіз результатів впливу ФАР на хемотаксис ПМЯЛ не дозволив виявити достатнього ступеня інформативності даної модельної системи. Рис.2. Середня інформативність досліджуваних біомоделей в %. - розеткоутворення Т-лімфоцитів; - хемокінез ПМЯЛ; - хемотаксис ПМЯЛ; - агрегація тромбоцитів; - скорочуваність гладеньких м'язів органу; - електрофоретична рухливість нейтрофільних лейкоцитів. Таким чином, результати проведеного комплексного аналізу експериментальних даних впливу ФАР на модельні системи, за допомогою методу ШНМ із використанням ШНМ з прямим розповсюдженням сигналів та ШНМ з активними нейронами, вказують на те, що найвищий ступінь інформативності мають електрофоретична рухливість нейтрофільних лейкоцитів та хемокінез ПМЯЛ, при цьому, найменш інформативними біомоделями є агрегація тромбоцитів та хемотаксис ПМЯЛ. Проміжне положення займають реакція розеткоутворення Т-лімфоцитів та електростимульована скорочуваність гладеньких м'язів органу, які мають середній ступінь інформативності. Оцінка інформативності біомоделей методом кластерного аналізу. Метод кластерного аналізу є одним із сучасних методів аналізу даних, особливість якого полягає в тому, що алгоритм програми, аналізуючи матрицю даних, намагається знайти серед ознак подібні, використовуючи при цьому міру схожості. У якості останньої використовувався Евклідовий простір між ознаками. Для проведення кластерного аналізу також використовували нормалізовані експериментальні результати дослідження. Отримані результати інтерпретували в такий спосіб: якщо в результаті аналізу об'єкти (ФАР) групувалися в 2 кластери у відповідності зі стереотипом їхньої дії на клітинні сигнальні системи, то цю біомодель вважали інформативною, у противному випадку - неінформативною. На першому етапі був проведений кластерний аналіз даних по всіх досліджуваних у роботі біомоделях. Отримані результати кластерного аналізу по всіх біомоделях представлені на рис.3, на основі яких є можливість виділити об'єднання ФАР у два кластери, Рис.3. Кластерний аналіз об'єднаних даних. у відповідності зі стереотипом дії цих речовин на аденілатциклазну та Са-мобілізуючу фосфоліпідну системи. При цьому, виняток складають теофілін та кофеїн, які були некоректно віднесені програмою до ФАР класу -I/+II. Далі, на другому етапі досліджень послідовно аналізували експериментальні дані для кожної з біомоделей. Отримані при цьому результати дозволили виділити ряд біомоделей, що мають достатньо високий ступінь інформативності, а саме: розеткоутворення Т-лімфоцитів, хемокінез ПМЯЛ та електрофоретична рухливість нейтрофільних лейкоцитів, а також - низький ступінь інформативності - хемотаксис ПМЯЛ, агрегацію тромбоцитів та електростимульовані фазні скорочення гладких м'язів органу. Підсумкові результати пошуку найбільш інформативних біомоделей методами ШНМ та кластерного аналізу представлені у табл.7, на якій необхідно зазначити біомоделі, які мають високий ступінь інформативності: електрофоретична рухливість нейтрофільних лейкоцитів, хемокінез ПМЯЛ. Реакція розеткоутворення Т-лімфоцитів має середній ступінь інформативності. Тут також важливо підкреслити, що найменш інформативними з використаних біомоделей є агрегація тромбоцитів та хемотаксис ПМЯЛ. Проміжне положення займає біомодель скорочуваності гладеньких м'язів органу, що за допомогою методу ШНМ віднесена до категорії середньоінформативних, а методом кластерного аналізу - до неінформативних біомоделей. Таблиця 7 Порівняльні результати пошуку інформативних біомоделей методами ШНМ та кластерного аналізу. Тип біомоделі Порівняльні результати вивчення інформативності біомоделей методами ШНМ Кластерного аналізу 1.Електрофоретична рухливість нейтрофільних лейкоцитів Високоінформативна Інформативна 2.Хемокінез ПМЯЛ Високоінформативна Інформативна 3. Розеткоутворення Т-лімфоцитів Средньоінформативна Інформативна 4.Скорочуваність гладких м'язів Средньоінформативна Неінформативна 5.Агрегація тромбоцитів Неінформативна Неінформативна 6.Хемотаксис ПМЯЛ Неінформативна Неінформативна Алгоритм раціонального пошуку ФАР. Вищенаведені результати аналізу експериментальних даних дозволяють стверджувати, що алгоритм пошуку ФАР повинен бути побудований у такий спосіб: потенційно активні в біологічному відношенні хімічні сполуки мають бути вивчені на декількох найбільш адекватних та інформативних біомоделях, з метою виявлення стереотипу дії на клітинні сигнальні системи, в залежності від якого прогнозується цілий спектр видів біологічної активності. Зокрема, первинне віднесення речовини до класу +I/-II дозволяє припускати в неї спазмолітичну, антипсихотичну, протизапальну, протипухлинну, анти-коагулянтну та антиалергічну дію. Для речовин класу -I/+II характерні переважно кардіо- та вазотонічні, психо- та імуностимулюючі, гіпоглікемічні та ін. ефекти. Після цього тестування ФАР мають пройти цілеспрямовані біологічні випробування на той чи інший вид біологічної активності. Алгоритм раціонального первинного скринінгу, з погляду взаємозв'язку ФАР та клітинних сигнальних систем, у загальному вигляді представлений на рис.4 . Рис.4. Алгоритм раціонального пошуку ФАР. Таким чином, отримані результати вказують на досить високу інформативність 3 біомоделей: електрофоретичної рухливості нейтрофільних лейкоцитів, хемокінезу ПМЯЛ, а також реакції розеткоутворення Т-лімфоцитів, що підтверджується комплексним використанням двох методів - ШНМ та кластерного аналізу. Це дає всі підстави стверджувати, що використання модельних систем, які базуються на основі функціональних реакцій лейкоцитарної популяції клітин крові в даному аспекті досліджень є виправданим і дозволяє рекомендувати їх для пошуку та попередньої оцінки БА нових речовин. Підтвердженням високої чутливості лімфоцитів до різних фізичних та хімічних факторів, є дослідження дії катіонів важких металів (Сd2+, Zn2+, Co2+, Cu2+, Pb2+) на реакцію розеткоутворення Т-лімфоцитів. Результати дослідів показали, що всі досліджені катіони в діапазоні діючих концентрацій, інгібують процес розеткоутворення, виявляючи при цьому відповідний стереотип дії (+I/-II). Слід підкреслити, що катіони Zn2+, Cu2+ та Pb2+ гальмують процес розеткоутворення Т-лімфоцитів в концентраціях на 2-3 порядки нижчих ГДКв. Експериментально виявлена висока чутливість дослідженої біомоделі до іонів важких металів дозволяє запропонувати її для проведення моніторингу забруднення навколишнього середовища катіонами важких металів. Таким чином, використання запропонованого в роботі алгоритму раціонального пошуку ФАР, що базується на ієрархічній класифікації ФАР, відкриває нові методологічні підходи до аналізу спектрів БА нових речовин, дозволяючи при цьому вирішити цілий ряд складних проблем, а саме: істотно прискорити стадію скринінгового відбору потенційних ФАР та значно здешевити етапи перевірки їх БА. ВИСНОВКИ В дисертації представлено нове рішення наукової задачі та ряд теоретичних узагальнень відносно розробки нового методу ефективного пошуку та попередньої оцінки біологічної активності нових речовин з використанням клітинних біомоделей. Дослідження та оцінка ефектів ФАР з протилежними біорегуляторними стереотипами на різних експериментальних біомоделях показали високу чутливість клітинних моделей, на основі функціональних реакцій, до різноманітних ФАР. Відповідно до одержаних даних, ФАР класу -I/+II у переважній більшості випадків активують функціональні процеси біомоделей, а ФАР протилежного класу - інгібують. Визначений ступінь інформативності досліджуваних біомоделей за допомогою методів ШНМ та кластерного аналізу, з використанням експериментальних результатів взаємодії з ФАР. Встановлено, що найбільш інформативними є біомоделі на основі імунологічних реакцій - розеткоутворення Т-лімфоцитів, міграційні властивості ПМЯЛ та електрофоретична рухливість нейтрофільних лейкоцитів. Показано інгібуючу дію катіонів важких металів (Сd2+, Zn2+, Co2+, Cu2+ и Pb2+), як факторів забруднення навколишнього середовища, на розеткоутворення Т-лімфоцитів, в діапазоні досліджених концентрацій, які значно нижче ГДКв, що дозволяє використовувати дану біомодель для моніторингу екологічного стану. На основі отриманих результатів впливу ФАР на модельні системи та їх біорегуляторного стереотипу розроблено алгоритм ефективного пошуку та попередньої оцінки БА нових речовин, який базується на визначенні стереотипу дії потенційно активних хімічних сполук на клітинні сигнальні системи, передбаченні, відповідно до стереотипу дії, видів БА та подальших цілеспрямованих біологічних випробуваннях. СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ Луйк А.И., Прокопенко В.В., Танчук В.Ю., Холодович В.В, Семенюта И.В. Общие свойства фармакологических агонистов и антагонистов внешнемембранных рецепторов // Вопр. мед. химии.- 1999.- Т.68, № 6.- С.514 – 524. Луйк А.И., Прокопенко В.В., Набока Ю.Н., Метелица Л.А., Могилевич С.Е., Чарочкина Л.Л., Семенюта И.В. Молекулярные, надмолекулярные и клеточные биомодели как объекты экологического мониторинга // Доповіді НАН України.- 1999.- № 10.- С.160 -165. Семенюта И.В., Метелица Л.А., Чарочкина Л.Л., Могилевич С.Е. Исследование чувствительности клеточных реакций к физиологически активным веществам методом кластерного анализа // Вісн. ЛДПУ.-2001. – T.43, №11.- С. 95 –102. Семенюта И.В., Метелица Л.А., Калашникова Л.Е., Прокопенко Р.А.. Исследование чувствительности биомоделей для первичного тестирования потенциально физиологически активных веществ методом кластерного анализа // Биополимеры и клетка. – 2004.- Т.20, №6. – С. 535 – 542. Семенюта І.В. Дослідження чутливості клітинних реакцій до фізіологічно активних речовин методом кластерного аналізу / Матеріали науково-практичної конференції, 14 червня 2001 р., Харків // Ліки–людині. –2001.- Т.15, № 1-2.- С.43- 44. Семенюта И.В., Ковалишин В.В. Использование искусственных нейронных сетей для анализа экспериментальных результатов воздействия ФАВ на биологические модели. – 1-я Всеукраинская научно-техническая конференция „Информационные процессы и технологии. Информатика-2007”. Тезисы докладов. – Севастополь, 24-27 апреля 2007 г. – С. 25-27. Анотація Семенюта І.В. Дослідження інформативності клітинних моделей для попередньої оцінки біологічної активності речовин. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 02.00.10 - біоорганічна хімія. Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ, 2007. Дисертацію присвячено розробці нового методу ефективного пошуку та попередньої оцінки біологічної активності нових речовин з використанням клітинних біомоделей. Проведено дослідження та оцінка ефектів ФАР з протилежними біорегуляторними стереотипами на різних експериментальних біомоделях. Показана висока чутливість клітинних моделей на основі функціональних реакцій лейкоцитів, до різних ФАР. За допомогою методів ШНМ та кластерного аналізу визначений ступінь інформативності досліджуваних біомоделей. Найбільш інформативними є біомоделі на основі імунологічних реакцій - розеткоутворення Т-лімфоцитів, міграційні властивості ПМЯЛ та електрофоретична рухливість нейтрофільних лейкоцитів. Показаний інгібуючий вплив катіонів важких металів (Сd2+, Zn2+, Co2+, Cu2+ і Pb2+), як факторів забруднення навколишнього середовища, на розеткоутворення Т- лімфоцитів, у діапазоні досліджених концентрацій, що є значно нижчими за ГДК. На основі отриманих результатів впливу ФАР на модельні системи та їх біорегуляторного стереотипу розроблено алгоритм ефективного пошуку та попередньої оцінки БА нових речовин. Ключові слова: біомоделі, фізіологічно активні речовини, штучні нейронні мережі, кластерний аналіз, скринінг. Аннотация Семенюта И.В. Исследование информативности клеточных моделей для предварительной оценки биологической активности веществ. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 02.00.10 - биоорганическая химия. Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 2007. Диссертация посвящена разработке нового метода эффективного поиска и предварительной оценки биологической активности новых веществ с использованием клеточных биомоделей. Проведено исследование и оценка эффектов ряда ФАВ с противоположными биорегуляторными стереотипами на 6 экспериментальных биомоделях: образовании спонтанных Е-розеток Т-лимфоцитов, хемокинезе и хемотаксисе ПМЯЛ, электрофоретической подвижности нейтрофильных лейкоцитов, агрегации тромбоцитов и сократимости гладких мышц органа. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ФАВ класса –I/+II в подавляющем большинстве случаев активируют функциональные процессы биомоделей, а ФАВ противоположного класса ? ингибируют. При этом, по результатам экспериментальных исследований, наиболее информативными моделями, в которых наблюдаются максимальные различия при действии ФАВ противоположных классов, являются иммунологические реакции (образование спонтанных Е-розеток Т-лимфоцитов, миграционные свойства ПМЯЛ), а также электрофоретическая подвижность нейтрофильных лейкоцитов. Среди наименее информативных биомоделей, в которых наблюдаются минимальные различия при действии ФАВ противоположных классов, необходимо отметить агрегацию тромбоцитов и сократимость гладких мышц органа. Важно отметить, что полученные результаты указывают на снижение скорости агрегации тромбоцитов как ФАВ класса +I/–II, так и ФАВ противоположного класса. Продемонстрировано эффективное использование методов распознавания образов, в частности ИНС и кластерного анализа, для решения классификационных задач, на примере оценки степени информативности исследуемых биомоделей с использованием экспериментальных результатов взаимодействия с ФАВ. Для этого применяли как многорядные ИНС с обратным распространением ошибки, так и ИНС с активными нейронами, при этом использовали несколько методик работы с исходными данными: последовательное удаление, полный перебор и оптимизация набора признаков. В целях контроля полученных результатов употребляли метод скользящего контроля и критерий вариации ошибки. На втором этапе использовали метод кластерного анализа, который основан на иерархической классификации с использованием эвклидовой метрики. Результаты кластерного анализа были представлены в виде дендрограмм. Суммирующие результаты, полученные при комплексном использовании методов ИНС и кластерного анализа указывают на высокую информативность 3 биомоделей, электрофоретической подвижности нейтрофильных лейкоцитов, хемокинеза ПМЯЛ, а также реакции образования спонтанных Е-розеток Т-лимфоцитов. Среди наименее информативных необходимо отметить агрегацию тромбоцитов и сократимость гладких мышц органа, а также хемотаксис ПМЯЛ. Подтверждено предположение о высокой чувствительности лейкоцитов к различным физическим и химическим факторам при изучении действия катионов тяжелых металлов (Сd2+, Zn2+, Co2+, Cu2+, Pb2+), как факторов загрязнения окружающей среды, на реакцию образования Т-розеток лимфоцитов. В результате чего показано, что все катионы, в диапазоне действующих концентраций, ингибируют процесс образования Т-розеток, проявляя при этом соответствующий стереотип действия на клеточные сигнальные системы (+I/-II). Достоверное торможение процесса образования Т-розеток наблюдалось при следующих минимальных концентрациях катионов: для катионов Сd2+ и Co2+ - 10-4 ммоль/ л, для Zn2+ и Cu2+ - 10-5 ммоль/л и для ионов Pb2+ в концентрации 10-6 ммоль/л. При этом важно подчеркнуть, что ингибирование процесса розеткообразования в присутствии катионов Zn2+, Cu2+ и Pb2+ наблюдалось в концентрациях на 2-3 порядка ниже действующих норм ПДКв. Высокая восприимчивость реакции образования Т-розеток лимфоцитов к тяжелым металлам позволяет предложить её для проведения контроля загрязнения окружающей среды катионами тяжелых металлов. На основании полученных данных был разработан алгоритм эффективного поиска и предварительной оценки биологической активности новых веществ. Предполагаемый алгоритм поиска ФАВ построен следующим образом: потенциально активные в биологическом отношении химические соединения должны быть изучены на нескольких наиболее адекватных и информативных биомоделях, с целью выявления стереотипа действия на клеточные сигнальные системы, в зависимости от которого, прогнозируется целый спектр видов БА. Важно заметить, что первоначальное отнесение вещества к классу +I/-II позволяет предполагать у него спазмолитическое, противовоспалительное, противоопухолевое, антитромботическое, антиаллергическое действие. Для веществ же класса –I/+II характерны кардиотоническое, спазмогенное, иммуностимулирующее, сахароснижающее действие. После этого “тестирования”, ФАВ проходят целенаправленные биологические испытания на тот или иной вид биологической активности. Ключевые слова: биомодели, физиологически активные вещества, искусственные нейронные сети, кластерний анализ, скрининг. Semenyuta I.V. Research of informing of cellular models for preliminary estimation of biological activity of matters. – Manuscript. Dissertation for the candidate of biological sciences degree in speciality 02.00.10 – bioorganic chemistry. Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry NAS of Ukraine, Kyiv, 2007. The dedicated dissertation is to development the new method of the effective search and the preliminary estimation of the new biological potency matters using the cellular biomodels. The research and estimation of physiologically active substances effects with inverse bioregulatory stereotypes on different experimental biomodels was realized. The high sensitivity of cellular models on the basis of functional reactions of leucocytes to the different physiologically active matters was shown. The degree of informing researched biomodels is determined by using artificial neural networks methods and cluster analysis. The most informative are biomodels on a basis of the immunological reactions - the E-rosette formation of T-lymphocytes, the migration properties of leucocytes and the electrophoretic mobility of the leucocytes. The inhibiting influence of heavy metals cations (Сd2+, Zn2+, Co2+, Cu2+ and Pb2+), as the factors of environmental pollution, on E-rosette formation of lymphocytes, in a range of the investigated concentrations which are much lower MCLw was shown. Based on obtained results of physiologically active matters influence on the modelling systems and bioregulatory stereotype of them the algorithm of the effective search and preliminary estimation of biological activity of new substances was developed. Keywords: biomodels, physiologically active matters, artificial neural networks, cluster analysis, screening. PAGE 1 Аналіз методами ШНМ та кластерного аналізу Середня інформативність біомоделі Набір даних Оцінка інформативностіість ознак Потенційно активні хімічні сполуки Визначення стереотипу дії на клітинні сигнальні системи Передбачувані види БА Цілеспрямовані біологічні випробування

Похожие записи