ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

КРІПКА ГАННА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 581.17; 581.557.24

Використання арбускулярних мікоризних грибів у фіторемедіації грунтів
від радіонуклідів

03.00.20 – біотехнологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті клітинної біології та генетичної інженерії
НАН України

Науковий керівник: академік НАН України

доктор біологічних наук, професор,

Гродзинський Дмитро Михайлович,

Інститут клітинної біології та
генетичної інженерії

НАН України,

завідувач відділу біофізики та
радіобіології

кандидат біологічних наук,

Сорочинський Борис Володимирович,

Український інститут експертизи
сортів рослин,

заступник директора

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

Горовий Леонтій Федорович,

Інститут клітинної біології та
генетичної інженерії

НАН України, завідувач
лабораторією клітинної

біології та біотехнології грибів

кандидат біологічних наук,

Гуральчук Жанна Захарівна,

Інститут фізіології рослин і
генетики НАН України,

старший науковий співробітник відділу

фізіології живлення рослин

Провідна установа: Національний ботанічний сад ім. М.М. Гришка

НАН України.

Захист дисертації відбудеться ” 24 ”листопада 2005 р. о 14 годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.202.01 при Інституті
клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою:
03143, м. Київ, вул. акад. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної
біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, м. Київ,
вул. акад. Заболотного, 148.

Автореферат розісланий ”21 ” жовтня 2005 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук

О.А. Кравець

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Ремедіація довкілля, що забруднене важкими
металами, радіонуклідами та іншими полютантами, є одним з напрямків
прикладної біотехнології. Cуттєвим доповненням до вже відомих технологій
ремедіації навколишнього середовища стало використання різноманітних
рослинних технологій. Перевага рослинних технологій обумовлена
можливістю вилучати рослини із забруднених місць, переробляти їх та
захоронювати вилучені токсиканти шляхом вже відомих технологічних
прийомів. Рослинні технології для оздоровлення навколишнього середовища
отримали загальну назву фіторемедіація [Salt, 1995]. Технологія
фіторемедіації базується на здатності окремих видів рослин накопичувати
у великій кількості певні хімічні елементи.

Ефективність самої фіторемедіації як прикладної біотехнології
значною мірою визначається вирішенням двох питань – використанням
рослин з великою біомасою (як правило, це культурні рослини для яких вже
добре відомі агротехнічні умови їх культивування) та шляхом активного
впливу на процеси поглинання полютантів в ризосфері з метою збільшення
кількості їх біодоступних форм. Використання класичних агрохімічних
прийомів не завжди дає бажаний ефект. Проведення хімічних обробок може
суттєво вплинути на показники родючості грунту, до того ж, вартість
такої обробки досить велика.

Очевидно, що подальше підвищення ефективності технології фіторемедіації
може бути отримане за допомогою сучасної біотехнології, що дозволяє
отримувати рослини, трансгенні за тією, чи іншою ознакою. Інший
підхід, що його може запропонувати енвайроментальна біотехнологія,
підвищення акумулюючої здатності рослин шляхом їх передпосівної
інокуляції різноманітними біопрепаратами, що виготовлені на основі
арбускулярних мікоризних грибів (АМ).

АМ гриби є неодмінною складовою ризосфер переважної більшості
трав’янистих рослин. Ці гриби, що утворюють тісний симбіотичний контакт
з кореневою системою рослин та живляться за рахунок їх метаболітів,
створюють безпосередній контакт між поверхнею коренів та частинками
грунту і додатково забезпечують великий потік мікроелементів, що
надходять в рослину з грунту [Del Val, 1999]. АМ гриби відіграють
велику роль у виживанні та розвитку рослин у несприятливих умовах. У
рослин, що ростуть на дуже забруднених грунтах, як правило,
відзначається високий рівень колонізації АМ грибами. Стійкість до Cu,
Zn, Cd, Pb у рослин, що ростуть на грунтах із високим вмістом цих
металів також може бути обумовлена симбіозом з мікоризними грибами
[Del Val, 1999; Ghazi , 2000].

Різні види АМ грибів демонструють різну активність щодо транспорту
мікроелементів у рослину, проте рослина-господар дещо обмежена у
“виборі” учасників симбіозу. Більше того, різні ізоляти одного і того
ж виду АМ грибів можуть по різному впливати на надходження окремих
металів у рослини. Участь арбускулярних мікоризних грибів у
транспорті мікроелементів у рослини є передумовою для виділення АМ
грибів, які можуть сприяти надходженню окремих мікроелементів у рослини
та подальшому використанню цих їзолятів у розв`язанні прикладних задач
фіторемедіації [Berthelin, 1995; Dupre, 2005; Joner, 1997; Leyval,
1995; Turnau, 1996; Weissenhorn, 1995].

Арбускулярні мікоризи можуть впливати на поведінку радіонуклідів
та інших токсикантів у навколишньому середовищі, оскільки можуть
включати їх у процес власного метаболізму і модифікувати кількість
радіонуклідів, що поглинаються рослинами [Крипка, 2002; Кріпка, 2003;
Сорочинський, 1999; Dupre, 2005; Entry, 1999; Rufyikiri, 2002]. Тому є
всі підстави припустити, що обробка рослин препаратами АМ грибів може
бути ефективним підходом для очищення грунтів від радіонуклідів.
Очевидно, що арбускулярні мікоризні гриби можуть модифікувати
біологічну доступність радіонуклідів, не завдаючи шкоди навколишньому
середовищу.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.
Робота виконувалась у рамках цільової програми відділу біофізики і
радіобіології Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН
України «Генетична та клітинна інженерія як основа нової «зеленої
революції» в рослинництві», що включала наукове обгрунтування та
розробку біотехнологічних підходів для вирішення проблем збільшення
продуктивності та адаптаційної здатності рослин. Номер державної
реєстрації — 0102 U 002963.

Мета та задачі дослідження. Мета роботи — дослідження
модифікуючих ефектів арбускулярних мікоризних грибів в фіторемедіації
радіоактивних забруднень.

Відповідно до цього були поставлені наступні завдання:

Перевірити можливість модифікації поглинання радіонуклідів
культивованими рослинами за допомогою АМ грибів.

Виділити та ідентифікувати штами арбускулярних мікоризних грибів з
ризосфери рослин, що відібрані в 30-км зоні ЧАЕС та характеризуються
великими показниками коефіцієнтів накопичення радіонуклідів.

На основі виділених спор АМ грибів отримати інокулюм з високою
інфекційною здатністю та охарактеризувати його.

Перевірити ефективність отриманого інокулюма з метою збільшення
накопичення радіонуклідів експериментальними рослинами.

Отримати підтвердження того, що арбускулярні мікоризні гриби задіяні в
транспорті радіонуклідів у рослини.

Об`єкт дослідження: арбускулярні мікоризні гриби порядку
Glomales, поглинання радіонуклідів рослинами.

Предмет дослідження: модифікуючи ефекти арбускулярних мікоризних
грибів на поглинання радіостронцію та радіоцезію рослинами, отримання та
характеризація інокулятів АМ грибів, що впливають на поглинання
радіонуклідів.

Методи дослідження включали морфометричні, мікробіологічні,
цитологічні, молекулярно-біологічні методи (полімеразну ланцюгову
реакцію та рестриктний аналіз) рослинного матеріалу та спор АМ грибів,
гамма-спекторометричні та радіохімічні методи визначення
радіоактивності, метод реєстрації характеристичного рентгенівського
випромінювання для аналізу локалізації радіоцезію в кореневій системі
рослин.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано вплив
арбускулярних мікоризних грибів на рівень поглинання радіостронцію та
радіоцезію рослинами в лабораторних та польових експериментах.
Встановлено, що ефективність використання АМ грибів визначається видом
рослини-господаря, типом грунту та умовами експерименту. Виділено та
ідентифіковано арбускулярні мікоризні гриби з ризосфери рослин, які були
відібрані у різних частинах 30- км Зони відчуження та зони безумовного
(обов’язкового) відселення ЧАЕС та характеризувалися при цьому великими
показниками коефіцієнтів накопичення радіонуклідів. За допомогою
морфометричних та молекулярних методів встановлено, що виділені АМ гриби
відносяться до виду Glomus geosporum (Nicolson та Gerdermann) та
Glomus intraradices (Schenck та Smith). На основі цих ізолятів АМ
грибів отримано інокулюм з високою інфекційною здатністю та
показано можливість його використання для модифікації накопичення
радіостронцію та радіоцезію рослинами. Методом реєстрації
характеристичного рентгенівського опромінення показано, що локалізація
радіоцезію в кореневій системі рослин співпадає з локалізацією структур
арбускулярних мікоризних грибів, що підтверджує пряму участь АМ грибів в
транспорті радіонуклідів в рослину.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені методичні
підходи, щодо використання АМ грибів для фіторемедіації радіонуклідних
забруднень. На основі виділених спор арбускулярних мікоризних грибів,
що були відібрані у різних частинах зони відчуження ЧАЕС, отримано їх
інокулюм з високою інфекційною здатністю та показано можливість його
використання для модифікації накопичення радіостронцію та радіоцезію
рослинами. Отримані препарати АМ грибів можуть до 10 разів
збільшувати надходження 137Cs в рослини, та майже в 4 рази
збільшують надходження 90Sr в рослини, що дає можливість використання
цих препаратів для фіторемедіації радіонуклідних забруднень.

Особиста участь автора в одержанні результатів, викладених в
дисертації. Дисертантом виконаний весь викладений в дисертації об’єм
експериментів по вивченню впливу арбускулярних мікоризних грибів на
здатність рослин поглинати радіонукліди, отримані та випробувані
інокуляти АМ грибів з Чорнобильської зони відчуження, проведено аналіз
отриманих результатів та сформульовано висновки. Спільно з науковими
керівниками проведено вибір напрямку досліджень та обговорення
результатів наукової роботи. Результати виконаних автором досліджень
відображені у публікаціях в співавторстві з науковими керівниками
завідуючим відділом академіком Гродзинським Д.М. та к.б.н. Сорочинським
Б.В., та співробітниками Кучмою О.М, Козировською Н.О.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові результати
доповідались на: Міжнародній конференції ”Fifteens Years after the
Chernobyl Accid. Lessons Learned” (Київ, 2001), ’’IV Congress on
Radiation Research’’ (Москва, 2001), на щорічній науковій конференції
інституту ядерних досліджень НАН України (Київ, 2001), ESNA XXXII
(Варшава, 2002), VIII конференції молодих вчених “Сучасні напрямки у
фізіології та генетиці рослин” (Київ, 2002 ), «2nd International
Workshop on Bioavailability of Soil Pollutants and Risk Assessment»
(Ascona, Switzerland, 2003), на ІІІ з’їзді з радіаційних досліджень
(Київ, 2003).

Публікації. Результати дисертаційних досліджень
представлено 13 друкованими працями, серед яких 6 статей у фахових
виданнях та 7 тез доповідей у збірках матеріалів вітчизняних та
міжнародних симпозіумів, конгресів, конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію побудовано за
загальною структурою. Дисертація викладена на 166 сторінках
машинописного тексту, ілюстрована 36 рисунками та 16 таблицями,
складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів,
розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих даних,
висновків та списку використаних джерел ( 183 найменувань).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень

У роботі використовували препарати арбускулярних мікоризних грибів
виду Glomus intraradices (штам GV), який був отриманий нами з
університету міста Кьольн, Німеччина. В подальшому інокулюм продукували,
культивуючи рослини чорнобривців (Tagetes patulus), що колонізували
отриманими препаратами АМ грибів. Експерименти проводили з рослинами
кукурудзи (Zea mays), райграсу (Lolium italicum), сорго (Sorghum
vulgare), люцерни (Medicago sativa), щириці ( Amarantus sp.). З
ризосфери рослин, які були зібрані з різних частин Чорнобильської
зони відчуження, були виділені спори АМ грибів, які використовували для
отримання інокулятів штамів АМ грибів-акумуляторів радіонуклідів з метою
їх подальшого використання в фіторемедіації забруднених грунтів.

Питому активність 137Cs визначали на гамма-спектрометрі Canberra (США).
Визначення радіонукліду 90Sr виконували прямим методом за допомогою
радіометра NRR – 610, який передбачає попередню підготовку зразків
проб грунту та рослин і приготування досліджуваних зразків до
радіохімічного виділення 90Sr. Всі визначення радіоактивності в зразках
проводили в Чорнобильському науково-технічному центрі міжнародних
досліджень України, м. Чорнобиль.

Рівень колонізації рослин АМ грибами визначали під мікроскопом після
фарбування корінців лактофенолом блакитним. Кількісний аналіз
пофарбованих структур АМ грибів проводили методом, що був запропонований
Giovanetti and Mosse [1980], та методом з використанням п`яти класів
систем по Trouvelot [1986].

Виділення зразків ДНК з коріння рослин проводили СТАБ методом
[Varma, 1998]. Для проведення ПЛР використовували виділену попередньо з
мікоризованого коріння тотальну ДНК або ж окремі, попередньо
роздавлені, спори грибів. Ампліфікацію проводили з праймерами ITS1 та
ITS4. Ці праймери є комплементарними до генів рДНК, а саме до ділянок
внутрішніх транскрибуючих спейсерів (ITS) [White,1990]. Регіони ITS
являють собою консервативні послідовності, що мають високу
видоспецифічність [Bruns, 1991]. Завдяки високій багатокопійності їх
зручно використовувати для ампліфікації поодинокого гена [White, 1990].
Структура використаних праймерів:

ITS1-TCCGTAGGTGAACCTGCGG,

ITS4 — TCCTCCGCTTATTGATATGC.

Ампліфікацію проводили на ампліфікаторі “Терцик” (Росія). Режим
ампліфікації: денатурацію ДНК здійснювали при 94 оС на протязі 1,5
хв., після чого проводили 5 циклів ампліфікації в режимі 94 оС — 10
сек., 68 оС — 10 сек., 72 оС — 20 сек., та 40 циклів ампліфікації в
режимі 94 оС — 5 сек., 68 оС — 5 сек., 72 оС — 5 сек. та завершували
ампліфікацію при 72 оС протягом 5 хв. Отримані ITS — ампліфіканти
аналізували за допомогою рестриктного аналізу. Для рестрикції нами були
використані наступні ферменти AluI, HinfI, HpaII, BsuRI, TagI (MBI
Fermentas) [Hildebrant, 1999; Hildebrant, 2001; Redecker, 1997].
Електрофорез отриманих продуктів ампліфікації та після їх рестриктного
аналізу здійснювали в 1,7 % агарозі (Chemapol, Чехія) при 45 В/199 мА
протягом 40 хв.

За допомогою впровадженої методики реєстрації характеристичного
рентгенівського випромінювання [Лебедь, 2002] отримані PIXE (particle
induced X-ray emission) спектри і двокоординатні карти, що їм
відповідають, (250 х 250 мкм) розподілу Сs+ і К+ у тонкому
поперечному зрізі коренів кукурудзи (Zea mays), які були
попередньо інокульовані спорами АМ гриба G. intraradices. Ці
досліди проводили в Інституті ядерних досліджень, м. Краків, Польща.

Для отримання достовірних даних досліди повторювали 5 — 6 разів. На
графіках нанесені величини довірчих інтервалів, які відповідають
95%-вому рівню достовірності.

Результати досліджень та їх обговорення

Отримання та аналіз інокулята. Одним із завдань нашої роботи
було отримати та проаналізувати інокулят АМ грибів виду Glomus
intraradiсes, штам GV. Арбускулярні мікоризні гриби пропагують,
культивуючи їх з різними трав`янистими рослинами, що виступають у ролі
рослин-господаря. Субстрат для культивування, що містить грунт, спори,
частини коріння рослин та фрагменти гіфів грибів може бути використаний
як інокулюм для лабораторних та польових експериментів. Носіями для
отримання інокульому можуть виступати різноманітні пористі матеріали,
такі як перліт, цеоліт, церазит та інші. В наших експериментах ми
отримували інокулят, культивуючи рослини чорнобривців (Tagetes patulus).
Найкращі результати (колонізація більше 95%) були отримані із
застосуванням цеоліту як носія (рис. 1).

Спостереження за динамікою росту грибів дало можливість
визначити час максимального розвитку мікоризи, який становить близько 80
днів культивування (рис.1).

Коріння колонізованих АМ грибами рослин фарбували лактофенолом
блакитним, що давало змогу візуалізувати всі грибні структури: міцелій,
везикули, арбускули, коілс (рис.2).

Рис. 1. Динаміка колонізації рослин Tagetes patulus у процесі отримання
інокулята АМ грибів

Рис. 2. Загальний вигляд колонізованого АМ грибами
коріння чорнобривців

Для підтвердження того, що отриманий інокулят містить гриби
Glomus intraradiсes, проводили ПЛР аналіз зі специфічними праймерами
ITS1 та ITS4, комплементарними до генів рДНК, а саме до ділянок
внутрішніх транскрибуючих спейсерів (ITS).

Отримані продукти ампліфікації, а саме ампліфіканти розміром
560 п.н., характерні для Glomus intraradiсes ( White, 1990) та
підтверджують, що отриманий інокулят ідентичний вихідному
(рис.3).

Рис. 3. ПЛР — аналіз зі специфічними праймерами (ITS1 та ITS4) ДНК
спор, виділених з ризосфери Tagetes patulus з вихідного інокулята (1)
та отриманого інокулята (2), M- маркери МВ (Gene Ruler 100bp DNA
ladder plus)

Експерименти з інокулюмом арбускулярних мікоризних грибів виду
Glomus intraradiсеs. Метою першого етапу експериментів з АМ грибами
було відібрати рослини, які мали б високу спорідненість до
використаного виду АМ грибів і могли б при цьому продукувати велику
біомасу, що важливо для їх подальшого застосування у фіторемедіації.

Аналіз отриманих результатів дає змогу зробити висновок, що
кукурудза, райграс та сорго мають найбільшу спорідненість з
використаними нами АМ грибами виду G.intrаradices, а саме із штамом GV.
Подальші дослідження з накопичення радіонуклідів ми проводили з
цими рослинами, та з рослинами чорнобривців, які також мали високі
показники колонізації АМ грибами.

Отриманий інокулят був використаний в експериментах з вивчення
впливу АМ грибів на акумулюючу здатність рослин стосовно
радіонуклідів. Рослини вирощували на різних типах грунту з різним
вмістом радіоцезію та радіостронцію: на дерново-підзолистому оглеєному
грунті, дерново-підзолистому супіщаному грунті та дерново-підзолистому
грунті.

Найбільший рівень накопичення радіонуклідів був отриманий в
експериментах на дерново-підзолистому супіщаному грунті. Це можна
пояснити тим, що у піщаному грунті як 137Cs так і 90Sr знаходяться в
більш рухомій, тому і в більш доступній для рослин формі (рис. 4, 5).

Вважаємо, що досить суттєвим є правильний вибір часу, коли
відбираються зразки для визначення радіоактивності, оскільки в кінці
сезону вегетації цілком можливий зворотний відплив метаболітів (як
радіоцезію, так і радіостронцію) з рослин в грунт [Кучма, 1994].

Рис. 4. Коефіцієнт накопи-чення 90Sr для рослин Zea mays, що
вирощували на різних грунтах після обробки

Рис. 5. Коефіцієнт накопи-чення 137Сs для рослин Zea mays, що
вирощували на різних грунтах після обробки АМ грибами

У рослин, що були оброблені АМ грибами спостерігаються певні зміни у
розподілі радіонуклідів між кореневою системою та надземною частиною.
Якщо для нормальних умов характерним є переважне накопичення цезію в
кореневій системі, а стронцію — в надземній частині рослин [Щеглов,
2004], то для рослин кукурудзи, колонізованих арбускулярними грибами,
спостерігається збільшення концентрації 137Сs у стеблах (рис.6), а для
рослин райграсу та сорго, після їх обробки мікоризними грибами,
збільшується рівень 90Sr в кореневій системі (рис.7).

Рис. 7. Вплив АМ грибів на перерозподіл 90Sr між частинами рослин

Отримані результати дають можливість припустити, що арбускулярні
мікоризні гриби впливають на перерозподіл цезію та стронцію між
органами рослин, що також може бути використано в певних
фіторемедіаційних цілях [Сорочинський, 1999].

Таким чином, використання АМ грибів дає змогу в лабораторних умовах
змінити накопичувальну здатність рослин щодо радіонуклідів. Вплив АМ
грибів залежить від виду рослин, що є учасником симбіозу, типу грунту,
на якому вирощуються рослини, та умов експерименту (стерильний та
нестерильний грунт).

Зауважимо, що в експериментах ми використовували для формування
симбіозу штам грибів, який був ефективним стосовно накопичення важких
металів, тому одним з наших завдань було виділити штами, ефективні щодо
радіонуклідів.

Виділення та аналіз АМ грибів з ризосфери рослин характерних
для Чорнобильської зони відчуження. З метою отримання штамів АМ
грибів, здатних впливати на накопичення радіонуклідів рослинами, нами
були проаналізовані зразки 30 видів рослин, що ростуть у різних частинах
Чорнобильської зони відчуження і відібрані рослини з високим рівнем
колонізації мікоризними грибами [Крипка, 2002, Кріпка, 2003]. Були
відібрані переважно трав’янисті рослини, що потенційно могли б бути
колонізовані АМ грибами і, крім того, поширені не тільки в зоні аварії,
а й на інших територіях.

Серед проаналізованих нами рослин, відібраних на різних типах грунту в
Чорнобильській зоні, до рослин з високим рівнем колонізації АМ грибами
можна віднести подорожник — Plantago major (рівень колонізації від
68,3% до 98,7%); звіробій — Hypericum perforatum (рівень колонізації від
32,0 % до 87,3 %); конюшину — Trifolium repens (рівень колонізації від
6,0 до 91,6 %) і скереду — Crepis tectorum (рівень колонізації від
46,6% до 86,0 %) (рис.8) [Крипка, 2002].

Рис. 8. Коріння рослин з Чорнобильської зони, колонізованих АМ
грибами:

p

r

|

~

°

?

?

\ ? Z

r

?r

t

v

x

z

|

°

?

?

?

?

O

???^ ` b d f h j l n † ? ? ¶ \

®

O

O

d?th`„7

O

d?th`„’

O

O

ph

O

O

O

O

O

1/2E???rRRR

O

O

.Xd????????oIoIoco3/4¬3/4oco3/4oaTHaTHaTHaTHaTHaTHaTHaTHaTHa¤a¤a¤a?—?

??? — Plantago major

Зауважимо, що рослини — представники одного і того ж виду,
можуть відрізнятися як за коефіцієнтом накопичення радіонуклідів, так і
за рівнем колонізації АМ грибами. Найбільші коефіцієнти накопичення
радіо-нуклідів було зареєстровано у рослин скереди Sr90 – 93,8 (рівень
колонізації АМ грибами — 86,0%, пункт відбору контрольний пункт
’’Дитятки’’), подорожника Sr90– 30,7 (рівень колонізації АМ грибами —
90,0%, пункт відбору — контрольний пункт ’’Дитятки’’), звіробою Cs137 –
5,2 (рівень колонізації АМ грибами — 72,0%, пункт відбору — 5 км від
контрольного пункту ’’Дитятки’’).

Тому саме з ризосфери цих рослин були виділені спори АМ грибів
для подальшої ідентифікації та отримання інокулюма.

За морфологічними ознаками спор (розмір, колір, форма),
характерних для арбускулярних мікориз, майже 90% виділених нами спор
можна віднести до роду Glomus.

Подальшу ідентифікацію АМ грибів проводили за допомогою
ПЛР-аналізу, використовуючи специфічні олігонуклеотидні праймери ITS1
та ITS4, що є комплементарними до рибосомального внутрішнього
транскрибуючого спейсера [White, 1990]. На рис. 9 наведені результати
електрофорезу препаратів ДНК спор, виділених з ризосфери рослин
скереди, звіробою, подорожника після ПЛР-тестування. ITS послідовності
дійсно тестуються в геномі спор, а отримані продукти ампліфікації
розміром 580 — 600 п.н. свідчать про те, що дані спори належать до АМ
грибів роду Glomus (рис.10) [Abbas, 1996, Крiпка , 2003].

Рис. 9. ПЛР – аналіз зі специфічними праймерами (ITS 1 та ITS 4) ДНК
одиничних спор, виділених з ризосфери Crepis tectorum (1), Plantago
major (2), Hypericum perforatum (3), М – маркери МВ (Gene Ruler 100bp
DNA ladder plus)

Для того, щоб визначити, до якого саме виду належать
виділені спори, отримані ITS — ампліфіканти аналізували шляхом
проведення рестриктного аналізу. Для рестрикції нами були використані
наступні ферменти рестрикції: AluI, HinfI, HpaII, BsuRI, TagI (рис.10).
Ці рестриктази вибрані тому, що вони дають змогу отримати фрагменти,
які є видоспецифічними для представників роду Glomus [Hildebrandt,
1999, Hildebrandt, 2000, Redecker, 1997].

Рис. 10. Рестрикційні фрагменти продуктів ампліфікації,
отриманих в процесі аналізу ДНК спор АМ грибів: А – Glomus
intraradices, Б — Glomus geosporum. Рестрикційний аналіз проводився з
ферментами AluI (лінія1), BsuRI (лінія 2), HinfI (лінія 3), HpaII
(лінія 4), TagI (лінія 5). М – маркер молекулярної ваги (Gene Ruler
100 bp DNA ladder plus, Fermentas)

Результати рестрикційного аназізу (рис.10), дають
можливість віднести виділені спори до двох видів АМ грибів, до Glomus
geosporum та Glomus intraradices [Hildebrandt, 1999, Hildebrandt,
2000, Redecker, 1997].

Виділені спори ми використали для отримання інокулята штамів АМ
грибів — акумуляторів радіонуклідів, з метою його подальшого
застосування у фіторемедіації забруднених грунтів [Кріпка, 2003].

У табл. 1 наведена інформація про рівень колонізації
рослин-господаря, що були використані для продукування інокулюма, в
кінці часу їх культивування. Високий рівень колонізації
експериментальних рослин свідчить про потенційно високу інфекційну
здатність отриманого інокулюма. Зокрема, на кінець сезону
вегетації реєстрували такі рівні колонізації: інокулят 1 — 76,67%,
інокулят 2 — 95,56%, інокулят 3 – 94,00%. Високий вміст арбускул у
колонізованому корінні вказує на хороший якісний стан мікоризи.

Здатність отриманого інокулюма АМ грибів модифікувати
накопичення радіонуклідів рослинами ми перевіряли в лабораторних умовах,
отримані результати наведені на рис.11 та в таблиці 2.

Таблиця 1

Колонізація експериментальних рослин Tagetes patulus ендогенними
чорнобильськими штамами АМ грибів

Опис Час культивування F% M% A% а%*

Інокулят 1 60 днів

73,33

5,33

65,94

3,52

85 днів

76,67

37,67

96,90

36,50

Інокулят 2 60 днів

86,67

22,77

94,52

21,52

85 днів

95,56

57,24

79,63

46,50

Інокулят 3 60 днів

76,67

23,53

97,18

22,87

85 днів

94,00

32,50

93,74

30,34

*F — частота колонізації, M –інтенсивність колонізації, А — відсотковий
вміст арбускул в колонізованому корінні, а – відсотковий вміст арбускул
в кореневій системі.

Опис: Інокулят 1 – спори, отримані з ризосфери Plantago major,
Інокулят 2- спори, отримані з ризосфери Hypericum perforatum, Інокулят
3 — cпори, отримані з ризосфери Crepis tectorum

Найбільші показники коефіцієнтів накопичення радіоцезію
(експерименти проводили з рослинами чорнобривців) були отримані при
використані інокулята 2 – він складав 2,0 на 60-й день культивування
(рівень колонізації АМ грибами 86,67%) та 2,6 на 85-й день (рівень
колонізації 95,56%). Такі показники коефіцієнта накопичення є на
порядок вищими у порівнянні з показниками у контрольних рослин, що не
були колонізовані мікоризними грибами. Для них коефіцієнти накопичення
137Cs становили 0,2 на 60-й день культивування та 0,18 на 85-й день,
відповідно.

Значне підвищення акумуляційної здатності рослин стосовно
радіостронцію спостерігалось при використанні інокулята 1 – коефіцієнти
накопичення (КН) становили 15,3 на 60-й день розвитку мікоризи (рівень
колонізації АМ грибами 73,33%) та 17,8 на 85-й день (рівень колонізації
при цьому був 76,67%). Для інокулята 3 – КН досягав 22,0 на 60-й день
(рівень колонізації — 76,67%) та 25,4 на 85-й день (рівень колонізації
— 94,0 %). В контролі коефіцієнти накопичення дорівнювали 7,5 та 8,3,
відповідно (рис. 11).

А
Б

Рис. 11. Акумуляція 90Sr (А) та 137Cs (Б) рослинами Tagetes patulus
після їх інокулювання АM грибами з Чорнобильської зони

Таблиця 2

Вплив передпосівної інокуляції рослин Tagetes patulus різними штамами АМ
грибів на вміст радіонуклідів протягом сезону вегетації

Варіант досліду Час вегетації Рівень колонізації, % Радіоактивність
рослин,

Бк/кг сухої маси

% виносу

137Cs

90Sr

137Cs

90Sr

Контроль 60 днів

1,66

370

8900

0,1

3,4

85 днів

0

365

9850

0,2

6,3

Інокулят 1 60 днів

73,33

900

18000

0,3

5.7

85 днів

76,67

1200

21000

0,7

14,3

Інокулят 2 60 днів

86,67

2800

6000

2,3

5,3

85 днів

95,56

3500

6300

2,6

5,2

Інокулят 3 60 днів

76,67

2040

26000

0,9

21,2

85 днів

94,00

2300

30000

1,2

25,9

Результати експериментів з ендогенними чорнобильськими штамами
АМ грибів демонструють зростання рівня поглинання 137-Cs (інокулюм
2) та 90-Sr (інокулюм 1 та інокулюм 3). Коефіцієнти накопичення
радіонуклідів, отриманих в цих експериментах, є вищими ніж показники,
що отримані нами в лабораторних умовах для цих же рослин Tagetes
patulus після їх обробки грибами Glomus intraradices, штам GV.

При використанні отриманого нами інокулята частка поглинутих з
грунту 137Cs та 90Sr також була значно вищою, в порівнянні з
результатами, отриманими з штамом GV грибів Glomus intraradices. Якщо
в експериментах з Glomus intraradices найбільший рівень накопичення
137Cs при вирощуванні чорнобривців не перевищував 0,07%, а для
кукурудзи — 0,11%, то при використанні інокуляту 2 цей показник становив
для рослин чорнобривців 2,6%, а з інокулятом 3 — 1,2%. Частка
поглинутого з грунту 90Sr в експериментах з грибами Glomus intraradices
не перевищувала при вирощуванні чорнобривців 2,65%, а кукурудзи —
0,9%. При використанні інокулята 1 цей показник досяг 14,3%, а
інокулята 3 – 25,9% (табл. 2) [Кріпка , 2003].

Ми можемо зробити висновок, що інокулюм, отриманий з
ендогенних чорнобильських штамів грибів, може бути успішно використаний
в експериментах з модифікації поглинальної здатності рослин відносно
радіоцезію та радіостронцію.

В той же час, надзвичайно важливо мати прямі докази того, що
радіонукліди, що попадають в кореневу систему рослин з грунту, можуть
безпосередньо акумулюватися у структурах АМ гриба.

Для вирішення цього питання ми використовували техніку
реєстрації характеристичного рентгенівського випромінювання; досліди
проводилися на ядерному скануючому мікрозонді. Експерименти зі
скануючим ядерним мікрозондом дають змогу вирішувати багато питань щодо
елементного складу та локалізації тих або інших хімічних елементів у
досліджуваній структурі, оскільки не потребують механічної руйнації
біологічного (або іншого) об’єкта. За допомогою методики реєстрації
характеристичного рентгенівського випромінювання нами було отримано
PIXE (particle induced X-ray emission) спектри і двокоординатні
карти, що їм відповідають (250 х 250 мкм), розподіли Сs+ і К+ у
тонкому поперечному зрізі коренів кукурудзи (Zea mays), попередньо
інокульованих спорами АМ грибів Glomus intrаradices. На рис. 12
наведені мікро-PIXE зображення, що описують внутрішньокореневу
локалізацію Cs+ і К+ у коренях кукурудзи з АМ грибами (А і Б,
відповідно, для Cs+ і K+ ) та без АМ грибів (В і Г для Сs+ і для К+,
відповідно). У тих частинах кореневої системи, в яких детектувались
структури АМ грибів (арбускули або везикули), Сs+ і К+ сконцентровані в
певних місцях у кореневій системі і розташування таких компартментів
відповідає локалізації структур АМ грибів у межах кореня. У свою чергу,
в тих сегментах кореневої системи, де були відсутні арбускулярні
мікоризні гриби, К+ і Cs+ розподілені рівномірно по всьому сегменту
кореня [Крипка, 2004].

Таким чином, отримані результати підтверджують, що локалізація Сs+ і К+
у рослинних тканинах дійсно співпадає. Це може бути обумовлено
подібністю в механізмах їх транспорту і перерозподілу у рослині. У разі
колонізації рослин АМ грибами, Cs+ і K+ локалізуються переважно у
структурах гриба. Тобто, АМ гриби, очевидно, беруть безпосередню
участь у транспорті K+ і Сs+ в рослину.

Рис.12. Елементні мікро-PIXE зображення розподілу Cs+ и К+ в частинах
коріння рослин, що містять структури АМ грибів та без структур АМ
грибів (А – розподіл Сs+, Б — розподіл К+ у коріннях рослин, що містять
структури АМ грибів; В – розподіл Сs+, Г — розподіл К+ у коріннях
рослин, в яких відсутні структури АМ

грибів)

ВИСНОВКИ

В наших експериментах ми вперше показали можливість застосування
арбускулярних мікоризних грибів для підвищення ефективності
фітоекстракції радіонуклідів. Для цього були виділені та
охарактеризовані арбускулярні мікоризні гриби з Чорнобильської зони
відчуження, підібрані умови для найбільш повної і ефективної
реалізації технології фітоекстракції радіонуклідів в комплексі з
обробкою рослин арбускулярними мікоризними грибами. Отримані в роботі
результати можуть бути використані для впровадження технології
фітоекстракції радіонуклідів як в лабораторних, так і в польових умовах.

Доведено, що обробка культивованих рослин чорнобривців, кукурудзи, сорго
та райграсу арбускулярними мікоризними грибами впливає на інтенсивність
поглинання радіостронцію та радіоцезію рослинами. Цей ефект
зареєстровано як в лабораторних умовах, так і в польових
експериментах.

Ефективне використання АМ грибів в фітоекстракції радіонуклідів
визначається видом рослини-господаря, типом грунту, наявністю інших
мікроорганізмів у грунті та тривалістю сумісного культивування системи
гриб-рослина.

Вперше виділено та ідентифіковано арбускулярні мікоризні гриби з
ризосфери рослин з великими показниками коефіцієнтів накопичення
радіонуклідів, що були відібрані у різних частинах зони відчуження
ЧАЕС. За допомогою морфометричних та молекулярних методів установлено,
що ці нові ізоляти АМ грибів належать до видів Glomus geosporum та
Glomus intraradices.

На основі виділених спор АМ грибів отримано їх інокулюм з високою
інфекційною здатністю та показана можливість його використання для
модифікації накопичення радіонуклідів рослинами.

Установлено, що отримані нами препарати АМ грибів можуть в 10 разів
збільшувати надходження 137Cs у рослини та майже в 4 рази
збільшують надходження 90Sr у рослини.

Методом реєстрації характеристичного рентгенівського випромінювання
показано, що локальна сконцентрованість радіоцезію в кореневій системі
рослин співпадає з локалізацією структур арбускулярних мікоризних
грибів, що підтверджує пряму участь АМ грибів у поглинанні та
транспорті радіонуклідів в клітини кореневої системи рослин.

Для впровадження технології фітоекстракції з використанням АМ грибів
важливо враховувати специфічність впливу АМ грибів на поглинання певних
елементів, в залежності від місця їх відбору, тому виділення ізолятів
АМ грибів потрібно здійснювати безпосередньо з грунтів, на яких будуть
проводитись подальші роботи по фіторемедіації.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Крипка А.В, Сорочинський Б.В., Гродзинський Д.М Молекулярные и
клеточные аспекты развития арбускулярных микоризных симбиозов и их
значение в жизнедеятельности растений // Цитология и генетика.-2002, №
4.-С.72-79.

Крипка А.В., Кучма А.Н, Сорочинский Б.В. Арбускулярные микоризные грибы
из Зоны отчуждения ЧАЭС и их возможная роль в поступлении радионуклидов
в растения // Зб. наукових праць Інституту ядерних досліджень.- 2002.-
№ 2(8).-С.140-144. (Здобувачем поставлено завдання, відібрано зразки,
здійснено цитогенетичний аналіз, обговорення результатів досліджень,
написано статтю).

Крiпка Г.В., Сорочинський Б.В. Використання арбускулярних мікоризних
грибів для фіторемедіації забруднених земель // Бюл.екол.стану
Чорнобильської зони відчуження.- 2003.-№2.-С.53-58.

Крiпка Г.В., Сорочинський Б.В. Отримання та випробування інокулятів
арбускулярних мікоризних грибів з метою модифікації поглинання
радіонуклідів рослинами // Зб. наукових праць Інституту ядерних
досліджень.- 2003.- №2(10).-С. 80-84.

Крипка А,В., Сорочинский Б.В., Лекки Я., Стахура З., Гродзинский Д.М.
Компартментализация радиоцезия в корневой системе растений может быть
обусловлена их симбиозом с арбускулярными микоризними грибами //
Доповіді НАН України.-2004.-N8.-С.167-171. (Здобувачем поставлено
завдання, проведено аналіз на ядерному мікрозонді, здійснено
обговорення результатів досліджень, написано статтю).

Сорочинський Б.В., Крiпка Г.В., Годована К.В, Кучма М.Д , Козировська
Н.О., Гродзинський Д.М. Вплив арбускулярних мікоризних грибів на
поглинання рослинами радіостронцію та радіоцезію // Доповіді НАН
України.-2002.-N12.С.146-149. (Здобувачем розроблено експериментальну
частину, здійснено цитогенетичний та молекулярний аналіз, написано
статтю).

Sorochinsky B., Kripka A., Kozyrovska N., Bothe H. The use of
mycorrhizal fungi for the phytoremediation of radionuclides //
International Conference ”Fifteens Years after the Chernobyl Accid.
Lessons Learned” (18-20 April, 2001).- Kiev, 2001.- P. 2-123.

Сорочинский Б.В., Крипка А.В., Козыровская Н.А., Боте Г.
Биотехнологические подходы к изменению доступности радиостонция и
радиоцезия растениям // IV Съезд по радиационным исследованиям ( 20-24
ноября, 2001).- Москва, 2001.- т.2.- С.680.

Кріпка Г.В., Сорочинський Б.В. Арбускулярні мікоризи з зони відчуження
ЧАЕС та їх можливий вплив на акумулюючу здатність рослин по відношенню
до радіонуклідів // VIII конференція молодих вчених “Сучасні напрямки у
фізіології та генетиці рослин”(23-25 жовтня 2002 р). — Київ, 2002.-
C.20.

Kripka A., Sorochinsky B, Bothe H. Effects of arbuscular mycorrhizal
fungi on radionuclides transport in herbaceous plants // ESNA XXXII
annual meeting (10-14 September 2002).-Warsaw, 2002.- P.123.

Кріпка Г.В., Сорочинский Б.В. Получение и испытание инокулятов
арбускулярных микоризных грибов с целью модификации поглощения
радионуклидов растениями // III зїзд з радіаційних досліджень
(радіобіологія і радіоекологія) ( 21-25 травня 2003 р.).- Київ, 2003.
— C. 396.

Kripka A, Sorochinsky B, Bothe H. Arbuscular mycorrhizal fungi can
affect radionuclides transport into herbaceous plants // 2nd
International Workshop on Bioavailability of Soil Pollutants and Risk
Assessment (2-7 February 2003).- Centro Stefano Franscini Ascona,
Switzerland, 2003.- P.64.

Shevchenko T., Kripka A., Stoliarchuk I., Sorochinsky B., Polischuk V.
Inhibition of plant virus infection in ontogenesis of Nicotiana tabacum
plants under influence of mycorrhizal fungi Glomus intraradices // II
International conference on plant ontogenesis in natural and transformed
environments. Physilogical, biochemical and ecological aspects (18-21
August 2004).- L`viv, 2004.- P.306.

АНОТАЦІЯ

Кріпка Г.В. Використання арбускулярних мікоризних грибів у
фіторемедіації грунтів від радіонуклідів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата
біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 – біотехнологія.- Інститут
клітинної біології та генетичної інженерії Національної академії наук
України, Київ, 2005.

Дисертація присвячена вивченню впливу арбускулярних
мікоризних грибів на поглинання радіонуклідів рослинами. В лабораторних
та польових умовах вивчено вплив відомих ізолятів АМ грибів Glomus
intraradices на поглинання радіоцезію та радіостронцію різними видами
культивованих рослин і показано, що обробка експериментальних рослин
препаратами АМ грибів може модифікувати транспорт радіонуклідів у
рослини. Вперше виділено та ідентифіковано арбускулярні мікоризні
гриби з ризосфери рослин з великими показниками коефіцієнтів накопичення
радіонуклідів, що були відібрані у різних частинах зони відчуження ЧАЕС
і установлено, що ці нові ізоляти АМ грибів належать до видів Glomus
geosporum та Glomus intraradices. На основі виділених спор АМ грибів
було отримано їх інокулюм та показана можливість його використання для
збільшення накопичення радіонуклідів рослинами. За допомогою методу
реєстрації характеристичного рентгенівського випромінювання показано, що
локальна сконцентрованість радіоцезію в кореневій системі рослин
співпадає з локалізацією структур арбускулярних мікоризних грибів, що
підтверджує пряму участь АМ грибів у поглинанні та транспорті
радіонуклідів в клітини кореневої системи рослин. Обговорюються питання
про те, що для впровадження обробок АМ грибами в технології
фітоекстракції важливо враховувати специфічність впливу АМ грибів на
поглинання тих чи інших елементів, тому виділення ізолятів АМ грибів
потрібно здійснювати безпосередньо з грунтів, на яких будуть
проводитись подальші роботи по фіторемедіації.

Ключові слова: фіторемедіація, фітоекстракція,
радіостронцій, радіоцезій, арбускулярні мікоризні гриби.

Kripka A.V. Use of the arbuscular mycorrhizal fungi for the
phyroremediation of radioactive conaminants.- Manuscript.

Thesis on PhD degree on the speciality 03.00.20 – biotechnology.
– Institute of cell biology and genetic engineering, National academy
of sciences of Ukraine, Kyiv, 2005.

The dissertation is aimed to analyze the radionuclides uptake
by plants after the arbuscular mycorrhizal fungi treatments. The
existing Glomus intraradices isolates have been used for the
investigation of radiocaesium and radiostrontium transport into the
cultivated plans both in the laboratory conditions and field
experiments. It was shown that such treatments might affect the
radionuclides transport into plants. Arbuscular mycorrhizal fungi from
the different parts of the Chernobyl exclusion zone were first
isolated. These AM fungi were collected from those plant species which
have demonstrated high accumulation properties. It was shown with a
number of methods that these new AM fungi isolates are represented
with Glomus geosporum and Glomus intraradices species. The AM fungi
inocula was obtained from the isolated spores and this inocula was
used for the modification of radionuclides transport into the plants. It
was done the PIXE-analysis for the distribution of caesium ions in
plant root tissues which support the direct participation of AM fungi in
the radionuclide transport because on the coincidence between the local
caesium location and AM fungi structures distribution inside the root.
The questions on the AM fungi treatment’s efficacy for the radionuclides
phytoremediation were discussed. It’s suggested that new AM fungi
isolated must be obtained directly from the soils which will be
subjected for further phytoremediation.

Key words: phytoremediation, phytoextraction, radiostrontium,
radiocaesium, arbuscular mycorrhizal fungi.

Крипка А.В. Использование арбускулярных микоризных грибов в
фиторемедиации почв от радионуклидов. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата
биологических наук по специальности 03.00.20 – биотехнология. — Институт
клеточной биологии и генетической инженерии Национальной академии наук
Украины, Киев, 2005.

Диссертация посвящена изучению влияния арбускулярных
микоризных грибов на поглощение радионуклидов растениями. В
лабораторных и полевых условиях изучено влияние известных изолятов АМ
грибов Glomus intraradices на поглощение радиоцезия и радиостронция
разными видами культурных растений и показано, что обработка
экспериментальных растений препаратами АМ грибов может модифицировать
транспорт радионуклидов в растения. В работе показано, что эффективное
использование АМ грибов в фитоэкстракции радионуклидов определяется
видом растения — хозяина, типом почв, наличием других микроорганизмов в
почве и продолжительностью совместного культивирования системы
гриб-растение. Впервые выделено и идентифицировано арбускулярные
микоризные грибы из ризосферы растений с высокими показателями
коэффициентов накопления радионуклидов, которые были отобраны в
разных частях зоны отчуждения ЧАЭС. По морфологическим характеристикам
спор (размер, цвет, форма), характерных для арбускулярных микоризных
грибов, около 90% выделенных нами спор можно отнести к роду Glomus.
Методами ПЦР и рестриктного анализа новые изоляты АМ грибов были
идентифицированы как виды Glomus geosporum и Glomus intraradices.
На основе выделенных спор АМ грибов было получено их инокулюм и показана
возможность его использования для увеличения накопления радионуклидов
растениями. Показано, что полученные изоляты АМ грибов могут в 10 раз
увеличивать поступление в растения радиоцезия и почти в 4 раза
увеличивают поступление радиостронция. С помощью метода регистрации
характеристического рентгеновского излучения показано, что локальная
сконцентрированность радиоцезия в корневой системе растений совпадает с
локализацией структур арбускулярных микоризных грибов, что подтверждает
прямое участие АМ грибов в поглощении и транспорте радионуклидов в
клетки корневой системы растений. Обсуждаются вопросы о том, что для
внедрения обработок АМ грибами в технологии фитоэкстракции важно
учитывать специфичность влияния АМ грибов на поглощение тех или других
элементов, и поэтому выделение изолятов АМ грибов необходимо
осуществлять непосредственно из почв, на которых будут проводить
дальнейшие работы по фиторемедиации.

Ключевые слова: фиторемедиация, фитоэкстракция,
радиостронций, радиоцезий, арбускулярные микоризные грибы.

Похожие записи