.

Динамічна взаємодія кальцієвих каналів плазматичної мембрани з внутрішньоклітинними кальцієвими депо в сенсорних нейронах щура (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
0 2845
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О. О. БОГОМОЛЬЦЯ

_____________________________________________________________

Степанова Інна Вікторівна

УДК 612.822:611.813.14

Динамічна взаємодія кальцієвих каналів плазматичної мембрани з
внутрішньоклітинними кальцієвими депо в сенсорних нейронах щура

03.00.02 – біофізика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі загальної фізіології нервової системи
Інституту Фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Наукові керівники: Академік НАН України, доктор біологічних наук,
професор, директор Інституту Фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України,
завідуючий відділом загальної фізіології нервової системи (ЗФНС), Костюк
Платон Григорович

Доктор медичних наук, провідний науковий співробітник Інституту
Фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Костюк Олена Платонівна

Офіційні опоненти: Член-кореспондент НАН України, доктор біологічних
наук, професор, зав. відділом фізіології нейронних мереж Інституту
фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Веселовський Микола
Сергійович.

Член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор, зав.
відділом біохімії м`язів Інституту біохімії ім. О.В. Паладіна НАН
України, Костерін Сергій Олексійович.

Провідна установа: Кафедра біофізики біологічного факультету
Національного університету імені Тараса Шевченка

Захист відбудеться 07.02.2006 р. о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.
О. Богомольця НАН України за адресою:01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фізіології ім.
О. О. Богомольця НАН України.

Автореферат розісланий 25.12.2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З. О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Кальцій є найбільш універсальним і розповсюдженим
вторинним посередником у клітині. Іони кальцію залучені у величезну
кількість клітинних процесів, котрі визначають народження клітини, її
життєдіяльність, патологічні зміни і загибель. В останні роки велика
увага приділяється внеску окремих кальційрегулюючих механізмів у
формування глобальних змін концентрації вільного внутрішньоклітинного
Са2+ ([Ca2+]i). Зокрема, встановлено, що практично в усіх типах клітин
амплітуда і швидкість захоплення Са2+ мітохондріями залежать не тільки
від амплітуди підвищення [Ca2+]i, але й від джерела його надходження у
клітину, а також від механізмів, за допомогою яких дане підвищення
відбувається (Babcock et.al., 1997). Мітохондрії можуть захоплювати як
кальцій, що входить через кальцієві канали плазматичної мембрани, так і
іони, що вивільняються з депо ендоплазматичного ретикулуму (ЕР). В той
же час ЕР у багатьох типах клітин здатен підсилювати кальцієвий сигнал,
що надходить від кальцієвих каналів плазматичної мембрани шляхом
механізму кальційіндукованого вивільнення Са2+ (calcium-induced calcium
release, CICR) (Shmigol et.al., 1995). Спустошення депо
ендоплазматичного ретикулуму здатне активувати йонні канали плазматичної
мембрани, проникні для Са2+, ініціюючи так званий депозалежний вхід Са2+
у клітину (Bolotina et.al., 2004). Такий вхід Са2+ є основним
механізмом, що забезпечує підвищення [Ca2+]i в незбудливих клітинах.
Донедавна вважалося, що в збудливих клітинах такий механізм регуляції
відсутній (Friel et.al., 1992), проте результати робіт останніх років
спростовують це положення. З’являється все більше доказів того, що
депозалежний вхід Са2+ відіграє важливу роль у забезпеченні кальцієвого
гомеостазу в багатьох збудливих, у тому числі й нервових клітинах
(Emptage et.al., 2001). Таким чином, наявні дані дозволяють говорити про
складну взаємодію мембранних і внутрішньоклітинних кальційрегулюючих
механізмів у процесі формування внутрішньоклітинних кальцієвих сигналів.

Досліджувані в роботі нейрони спінальних гангліїв малого та середнього
діаметру беруть участь у передачі больової інформації від відповідних
рецепторів, і саме зміни кальцієвого гомеостазу в цих клітинах
вважаються першопричиною виникнення больових синдромів при певних
патологічних станах (таких, як цукровий діабет). Тому детальний аналіз
впливу кальцієвих каналів плазматичної мембрани, мітохондрій і ЕР на
формування внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів, а також взаємодії
цих структур у процесі формування кальцієвих сигналів у сенсорних
нейронах, здогадно залучених у ноціцепцію, є дуже важливим і представляє
безсумнівний науковий інтерес і велике практичне значення.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
в рамках наукової програми Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН
України: “Молекулярні механізми, відповідальні за специфіку функцій
різних мозкових структур”.

Мета і завдання дослідження. Мета даної роботи полягала у оцінці того,
яким є внесок кальцієвих каналів плазматичної мембрани різних типів
(потенціалкерованих, рецепторкерованих та депоактивованих), ЕР,
мітохондрій, а також взаємодії цих кальційрегулюючих механізмів у процес
формування кальцієвих сигналів у нейронах СГ, вірогідно залучених у
процеси ноціцепції. З урахуванням цього були поставлені наступні
завдання:

Використовуючи метод флуоресцентної кальційметрії, встановити внесок
мітохондрій у зміни амплітуди та кінетичних характеристик кальцієвих
транзієнтів, викликаних:

деполяризацією плазматичної мембрани,

вивільненням Са2+ з депо ЕР,

активацією капсаіцинчутливих рецепторів плазматичної мембрани,

активацією депокерованих кальцієвих каналів плазматичної мембрани.

Порівняти ефективність захоплення та вивільнення Са2+ мітохондріями при
надходженні іонів з позаклітинного середовища та вивільненні їх з депо
ЕР.

Визначити участь ЕР у формуванні досліджуваних кальцієвих транзієнтів та
встановити зв’язок між вивільненням Са2+ з депо та входом іонів з
позаклітинного середовища.

Провести порівняльний аналіз депоактивованих кальцієвих транзієнтів, які
викликаються вивільненням Са2+ при активації ріанодинових та
інозитолтрифосфатчутливих рецепторів ЕР, а також при пасивному
спустошенні ЕР за умов блокування роботи його АТФаз.

На базі одержаних даних дійти висновків щодо взаємного впливу різних
кальційрегулюючих механізмів у процесі формування внутрішньоклітинних
кальцієвих транзієнтів у досліджуваних нейронах.

Наукова новизна одержаних результатів. У даній роботі вперше визначено
кінетичні характеристики функціонування мітохондрій і ЕР в процесі
активності здогадно ноціцептивних соматосенсорних нейронів щура,
викликаної деполяризацією плазматичної мембрани. Показано, що
характеристики функціонування згаданих органел є важливими для
нормальної роботи клітини і саме вони зазнають змін при розвитку
експериментально-індукованого діабету. Виявлено, що обмін Са2+ у
мітохондріях залежить від джерела підвищення концентрації іонів в
цитозолі. Крім того, уперше досліджені характеристики входу Са2+,
активованого спустошенням депо ЕР, висунуті припущення щодо можливої
природи різниці кінетичних характеристик активації таких сигналів та
ролі мітохондрій у їх формуванні. У роботі досліджено чутливість
внутрішньоклітинних кальцієвих депо до капсаіцину, визначено значні
відмінності в чутливості ванілоїдних рецепторів плазматичної мембрани і
ЕР, а також досліджено участь мітохондрій у формуванні
капсаіциніндукованих кальцієвих сигналів. Показано складний
взаємозв’язок різних кальційрегуляторних механізмів у формувані
внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані в роботі результати
мають як теоретичне, так і практичне значення. Докладніше визначення
кількісних характеристик мембранних та внутрішньоклітинних
кальційрегуляторних механізмів, а також розуміння їх взаємодії у
процесах формування внутрішньоклітинних кальцієвих сигналів значно
розширюють наші уявлення про механізми кальцієвого гомеостазу в нейронах
спінальних гангліїв малого та середнього діаметру. Оскільки досліджувані
в роботі нейрони передають больову інформацію, детальне вивчення
процесів формування кальцієвих сигналів в них є необхідним для розуміння
того, як формується такий сигнал в нормальних умовах. Порівняння роботи
мітохондрій та ЕР в контрольних умовах та при патологічних станах (в
роботі – модель діабету) поліпшить розуміння розвитку порушень у
передачі сенсорної інформації при різних захворюваннях. Вивчення впливу
різних хімічних речовин на функціонування систем, що підтримують
кальцієвий гомеостаз, робить можливим застосування таких сполук у
клінічній практиці.

Особистий внесок здобувача полягає у виконанні всього обсягу
експериментальних досліджень, поданих у дисертаційній роботі,
статистичному опрацюванні результатів, підборі та обробці даних
літератури, а також, за участю наукових керівників, у плануванні
напрямків досліджень та аналізі одержаних результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідалися
на: конференції фізіологічного товариства Угорщини “Оксидативний стрес і
клітинна сигналізація”, Будапешт, Угорщина, 2003; IV Національному
конгресі патофізіологів України, Чернівці, 2004; літній школі IBRO
“Сенсорна і інтегративна нейронаука: від рецепторів до поведінки”,
Москва, Росія, 2004; літній школі IBRO “Рецептори. Канали.
Посередники.”, Ялта, Україна, 2004, HYPERLINK
“..\\..\\..\\..\\..\\meetings\\2005_neurosci\\neurosci.gif” III
Конференції Українського Товариства Нейронаук, травень 2005 р., Донецьк
; літній школі IBRO “Дослідницькі стратегії щодо вивчення комплексних
нервових сітей.”, Дебрецен, Угорщина, 2005, а також на семінарах сектору
молекулярної фізіології інституту фізіології ім. О.О. Богомольця.

Публікації. За результатами роботи опубліковано п’ять статей у наукових
журналах та тези трьох доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду
літератури, опису методів та результатів досліджень, обговорення
результатів, висновків та списку використаних джерел із 220 найменувань.
Робота викладена на 150 сторінках та ілюстрована 31 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обгрунтовано актуальність дослідження взаємодії входу Са2+ з
позаклітинного середовища до цитозоля клітини через потенціалкеровані,
рецепторкеровані та депоактивовані кальцієві канали плазматичної
мембрани з функціонуванням мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму у
процесі формування внутрішньоклітинних кальцієвих сигналів,
сформульовані мета і завдання дослідження, наведені відомості про
наукову новизну, практичну цінність та апробацію отриманих результатів,
публікацію матеріалів дисертації.

Розділ 1 “Огляд літературних даних” присвячений висвітленню відомих
аспектів функціонування мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму як
активних внутрішньоклітинних кальцієвих депо, а також висвітлено процес
взаємодії цих органел при формуванні кальцієвих транзієнтів в різних
типах клітин. Висвітлено аспекти, пов’язані зі змінами в кальцієвій
сигналізації досліджуваних нейронів при діабеті. Надано основні
характеристики ванілоїдних рецепторів, які є полімодальними детекторами
больових стимулів, що експресуються у плазматичній мембрані сенсорних
нейронів малого та середнього діаметру. Наведено відомості про
депоактивований вхід Са2+ у клітини та його фізіологічну роль, а також
можливу участь ванілоїдних рецепторів у формуванні таких сигналів.

Для досягнення поставленої мети у розділі 2 “Матеріали та методи
дослідження” описано використання наступних методичних підходів:

ферментативне виділення ізольованих нейронів спінальних гангліїв (СГ);

флуоресцентний метод вимірювання концентрації іонів Са2+;

метод експериментального моделювання діабету (стрептозотоциніндукований
діабет);

метод локальної аплікації фармакологічних речовин на клітини СГ;

обробка отриманих результатів з використанням стандартних методів
варіаційної статистики.

Ферментативне виділення ізольованих нейронів DRG.

В експериментах використовували щурів лінії Вістар віком 1-1,5 місяці.
Процедура декапітації щура проводилась у відповідності з вимогами НАН
України по використанню експериментальних тварин. Виділялись грудні і
поперекові спинномозкові ганглії. Нейрони СГ ізолювались шляхом
піпетування гангліїв після їх ферментативної обробки у базовому
зовнішньоклітинному розчині Tyrode (склад розчинів наведений нижче) з
додаванням 1 мг/мл протеїнази (тип XXIII, Sigma, США) і 0,5 мг/мл
колагенази (тип IA, Sigma, США) протягом 35 хвилин (370 С).Клітини
використовувалися в експерименті протягом 6-8 годин після виділення.
Контрольні експерименти показали, що ізольовані таким методом нейрони
зберігають свої основні характеристики протягом 24 годин.

Флуоресцентний метод вимірювання концентрації іонів Са2+. Для реєстрації
змін концентрації вільного внутрішньоклітинного кальцію
використовувалась методика двохвильової флуоресцентної кальційметрії з
використанням мембранопроникної естерифікованої форми флуоресцентного
барвника indo1. Ізольовані нейрони СГ інкубували протягом 30 хв при
температурі 370 С в розчині, що містив 10 мкМ indo1/am. Після цього
клітини відмивали чистим зовнішньоклітинним розчином і залишали в
темряві при кімнатній температурі на 30 хв для деестерифікації барвника.
Збудження флуоресцентного зонду здійснювалось при довжині хвилі 360 нм
за допомогою ртутної лампи та відповідних фільтрів. Реєстрація емісії
проводилась у двох діапазонах: 395-410 нм (F400) і 490-510 нм (F500) за
допомогою двох фотопомножувачів. Сигнали з фотопомножувачів подавали на
вхід аналогового ділителя (DIV100, Burr Broun, США), який у реальному
часі обчислював співвідношення флуоресцентних сигналів на двох довжинах
хвиль: R = F400/F500 . Це співвідношення пропорційне концентрації
внутрішньоклітинного кальцію ([Ca2+]i) і не залежить від концентрації
барвника у клітині. Для точного обчислення [Ca2+]i нами
використовувалася наступна формула:

[Ca2+]i = Kd · B · (R – Rmin) / (Rmax – R),

де Kd – константа дисоціації індикатору з кальцієм; B – коефіцієнт,
обумовлений оптичними характеристиками установки, дорівнює
співвідношенню F5000/F500s (F5000 – інтенсивність флуоресценції indo-1 у
відсутності кальцію, F500s – інтенсивність флуоресценції indo-1 при
насичуючій концентрації Са2+ ); Rmin – співвідношення F400/F500 у
відсутності кальцію; Rmax – співвідношення F400/F500 при насичуючій
концентрації іонів. Всі значення концентрацій представлені у вигляді
середніх значення ?середньоквадратичне відхилення (SEM); n є кількістю
досліджених клітин. Достовірність статистичних відмінностей при
міжвибірковому порівнянні визначалась за допомогою критерія Ст’юдента
(Т-тесту). Відмінності вважали достовірними при Р?0,05. Апроксимацію
кривих наростання кальцієвих транзієнтів виконували за формулою:

)),

де [Ca2+]i – концентрація Са2+ в цитозолі клітини в даний момент часу,
[Ca2+]i o – базальний рівень кальцію, t0 – початковий момент часу ?1 –
стала часу наростання транзієнта, А – амплітудний коефіцієнт.

Модель стрептозотоциніндукованого діабету. У моделі експериментального
діабету використовувались щури віком 21 день. Стан діабету викликався
внутрішньочеревинною ін’єкцією стрептозотоцину (СТЗ), розчиненому у
фізіологічному розчині (ізотонічний розчин 0,9% NaCl для ін’єкцій), із
розрахунку 80 мг/кг. Щури з СТЗ-індукованим діабетом та контрольні
тварини того самого віку утримувались в однакових умовах з однаковим
раціоном протягом усього періоду розвитку захворювання. Експерименти
проводилися на тваринах через 3-4 тижні після ін’єкції стрептозотоцину.
Концентрацію глюкози в плазмі крові, взятої із хвостової вени, виміряли
за допомогою оптичного сенсора глюкози Глюкотренд (Roche Diagnostics
Gmb., Mannheim, Німеччина). Із групи щурів з діабетом бралися тварини з
рівнем глюкози в плазмі крові, більшим, ніж 18 мМ.

У третьому розділі “Результати досліджень” експериментально визначені
особливості кальцієвої сигналізації у нейронах СГ малого та середнього
діаметру, кінетичні кальційобмінні властивості внутрішньоклітинних
кальцієвих депо в залежності від джерела надходження Са2+ до цитозолю.

Вклад мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму в кальцієвий
транзієнт, викликаний деполяризацією плазматичної мембрани.
Внутрішньоклітинна концентрація іонів кальцію [Ca2+]i в нейронах СГ
місячних щурів за відсутності зовнішніх впливів підтримувалася на
постійному (базовому) рівні. Середнє значення останнього складало 118?9
нМ (n = 40). Аплікація гіперкалієвого розчину (50 мМ KCl) тривалістю 3 с
викликала короткочасне підвищення [Ca2+]i, котре надалі буде називатися
“кальцієвим транзієнтом”. Викликаний деполяризацією кальцієвий транзієнт
мав фазу швидкого наростання тривалістю 3 с і фазу спаду, що
характеризувалася складною кіне-тикою. Протягом перших 8 с відбувалося
швидке зниження концентрації іонів кальцію до пев-ного значення, що
потім збері-галося протягом 3–4 хв, утворю-ючи другу фазу спаду
каль-цієвого транзієнта, так звану фазу плато. Пікові значення
кальцієвих транзі-єнтів, викликаних деполяризацією плазматичної
мембрани, складали в середньому 377±21 нМ. Повторна аплікація
гіперкалієвого розчину після відновлення внутрішньо-клітинного рівня
Ca2+ до базової концентрації викликала кальцієвий транзієнт, що
достовірно не відрізнявся за характеристиками від попе-реднього (Рис.1).
Для оцінки участі ендоплазматичного ретикулуму (ЕР) у формуванні
транзієнтних змін концентрації Са2+ у цитозолі деполяризація
плазматичної мембрани здійснювалася після преаплікації 1 мкМ
тапсигаргіну – блокатора кальцієвої АТФ-ази ЕР.

Амплітуда кальцієвого транзієнта в цьому випадку знижувалася до 246±17
нМ (n=8, Р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020