Міністерство охорони здоров’я України

Харківська медична академія післядипломної освіти

ЮЩЕНКО Марина Леонідівна

УДК:616.832-044.2-022:577.15] — 07-092

Діагностичне та патогенетичне значення матриксної металопротеїнази-9 у
хворих на демієлінізуючі та інфекційні захворювання нервової системи

Спеціальність 14. 01. 15 — нервові хвороби

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Харків-2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському державному медичному університеті МОЗ
України

та Геттінгенському університеті Георга-Августа (Німеччина).

Науковий керівник: заслужений діяч науки України, доктор медичних наук,
професор Дубенко Євген Григорович, Харківський державний медичний
університет, професор кафедри нервових хвороб.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Деменко Василь Дмитрович, Харківська
медична академія післядипломної освіти МОЗ України, завідувач кафедри
невропатології та дитячої неврології;

доктор медичних наук, професор Волошина Наталія Петрівна, Інститут
неврології, психіатрії та наркології АМН України, завідуюча відділом
нейроінфекцій та патології вегетативної нервової системи.

Провідна установа: Інститут геронтології АМН України.

Захист відбудеться “24” 06 2004 р. О 10 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 64.609.01 при Харківській медичній
академії післядипломної освіти МОЗ України (61176, м. Харків, вул.
Корчагінців, 58).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Харківської медичної
академії післядипломної освіти МОЗ України (61176, м. Харків, вул.
Корчагінців, 58).

Автореферат розісланий “18” 05 2004 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат медичних наук, доцент В.Г.Марченко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Демієлінізуючі захворювання нервової системи до цього
часу залишаються найбільш актуальною проблемою сучасної неврології. В
останні роки відмічається зростання захворюваності на розсіяний склероз
(РС) у багатьох країнах світу, в тому числі і в Україні (С.М. Віничук,
О.А. Мяловицька, 2001, А.Ю. Руденко, 2002). Складність патогенезу РС,
прогресуючий перебіг захворювання та недостатня ефективність існуючих
схем лікування обумовили безперервний пошук нових методів терапії (Н.П.
Волошина та співавтори, 2002, 2003, Н.П. Волошина та І.А. Григорова,
2003, В.Д. Деменко, 2002, Л.А. Дзяк, 2003 та інші). Останнє нерозривно
пов’язано з поглибленим дослідженням різноманітних ланок патогенезу
даного захворювання, у вивченні якого зберігається ще достатньо білих
плям (І.А. Григорова та співавтори, 2002; Н.М.Грицай, 2003, Є.Г. Дубенко
та співавтори 2002, І.С. Зозуля, 2001 та інші). До цього часу не вивчена
роль у патогенезі РС матриксних металопротеїназ (ММП). Відомо, що ММП
приймають участь у процесах запалення, викликаючи деструкцію сполучної
тканини та підвищуючи проникність судинних стінок і гематоенцефалічного
бар’єра (ГЕБ), що сприяє міграції клітин та виходу протеїнів, антитіл і
комплементу у вогнища запалення (V.W. Yong і співавт., 1998; R. Paul і
співавт., 1998). Крім того, ММП здатні пошкоджувати основний білок
мієліну (K. Gijbels і співавт., 1993; S. Chandler і співавт., 1996).
Участь ММП у патогенезі РС припускалась давно (T. Inuzuka та співавт.,
1978, M.L. Cuzner та співавт., 1978.). Проте більшість проведених
досліджень базувалось на експериментах із тваринами та дослідженнях ММП
in vitro (D. Leppert і співавт.,1995, 1996, O. Stuve і співавт.,1996,
1997 та інші). Клінічні дослідження, вивчаючі патогенетичне і
діагностичне значення ММП, відсутні і досі. Ми не знайшли також і робіт,
присвячених дослідженню тканинних інгібіторів матриксних металопротеїназ
(ТІМП) у хворих на РС. В основному вони вичерпуються дослідженнями
синтетичних інгібіторів ММП при алергічному експериментальному
енцефаломієліті (A.K. Hewson і співавт.1995, . M.K. Matyszak і
співавт.1996, E. Redford, 1997).

При бактеріальних та вірусних менінгітах ММП також вивчались шляхом
експерименту (R. Paul і співавт., 1998, I. Azeh і співавт., 1998). При
цьому авторами використовувались лише якісні та напівкількісні методи
дослідження (імуногістохімія, цимографія), а отримані дані суперечні.

Таким чином, відсутність клінічних досліджень, переважно
експериментальний характер робіт, суперечні дані різних дослідницьких
робочих груп утруднюють оцінку ролі ММП у патогенезі демієлінізуючих та
інфекційних захворювань нервової системи. Не розкрите діагностичне
значення ММП та їх інгібіторів при даній патології. Все вищесказане і
визначає актуальність даної роботи та вимагає подальшого більш
поглибленого вивчення цього питання.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота
виконувалася відповідно до основного плану науково-дослідних робіт
Харківського державного медичного університету “ Вивчення загальних
закономірностей патоло-гічних процесів та розробка засобів їх корекції”
(№ 0198U002619). Автор вивчав питання діагностики і лікування РС та
інфекційних захворювань нервової системи.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи стало уточнення ролі ММП-9 та її
тканинного інгібітора (ТІМП-1) в патогенезі демієлінізуючих захворювань
нервової системи в порівнянні з інфекційними і розробка на основі цього
нових підходів у діагностиці та лікуванні розсіяного склерозу. Для
досягнення поставленої мети дослідження необхідно було вирішити наступні
задачі:

1. Вивчити концентрації ММП-9 та її тканинного інгібітора ТІМП-1 у
сироватці крові та лікворі пацієнтів контрольних груп.

2. Вивчити вміст ММП-9 та ТІМП-1, їх патогенетичне і діагностичне
значення у хворих з інфекційною патологією ЦНС (бактеріальний та
вірусний менінгіти).

3. Вивчити концентрації ММП-9 та ТІМП-1 у сироватці та лікворі хворих на
демієлінізуючі захворювання нервової системи (розсіяний склероз) у
порівнянні з інфекційною патологією ЦНС.

4. Вивчити динаміку вищеназваних показників у хворих на розсіяний
склероз та з інфекційною патологією в залежності від різних параметрів
спинномозкової рідини (цитоз, порушення бар’єрної функції, тощо).

5. Проаналізувати вміст ММП-9 та ТІМП-1 в лікворі та сироватці в
залежності від перебігу захворювання (реміттуючий та
первинно-прогресуючий РС).

6. Вивчити динаміку концентрації ММП-9 і її природного тканинного
інгібітора ТІМП-1 в процесі лікування хворих на РС .

7. Дати рекомендації щодо діагностики та лікування хворих на розсіяний
склероз із врахуванням отриманих даних.

Об’єкт дослідження: хворі на демієлінізуючі, інфекційні,
нейродегенеративні та інші захворювання нервової системи та здорові
особи (контрольна група).

Предмет дослідження: діагностика та патогенез димієлінізуючих та
інфекційних захворювань нервової системи.

Методи дослідження: загально-клінічне, неврологічне та лабораторне
обсте-ження, магнітно-резонансна томографія ЦНС, цимографія, ELISA
(«Ensyme-linked-immunosorbent-assay»), лікворна діагностика, вивчення
стану гематоенцефалічного бар’єра.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше вивчено вміст ММП-9 та
ТІМП-1 методом ELISA у лікворі та сироватці хворих на демієлінізуючі та
інфекційні захворювання нервової системи у порівнянні з контрольною
групою пацієнтів. Отримані дані зіставлені з даними лікворної
діагностики, лабораторними показниками активності запалювального
процесу.

Виявлені характерні для кожного з різновидів захворювань порушення
взаємовідношень між ензимом та його інгібітором. Встановлено високо
достовірні (р<0,001) кореляції між концентрацією ММП-9 в спинномозковій рідині та числом клітин в лікворі, які підтверджують, що підвищення вмісту MMП-9 в лікворі при запалювальних захворюваннях є наслідком клітинної міграції до ЦНС. Встановлена залежність вмісту ММП-9 у лікворі від клітинного складу спинномозкової рідини, що дало підстави вважати ММП-9 маркером імунокомпетентних клітин. Рекомендовано досліджувати вміст ММП-9 ліквору у разі неможливості дослідження цитозу при проведенні диференціальної діагностики неврологічної патології. Підвищення концентрації ММП-9 у лікворі вище 6 нг/мл рекомендовано розцінювати як ознаку інфекційно-запалювального процесу в ЦНС. Встановлені зміни імунологічних та біохімічних показників ліквору та сироватки, що характерні для періоду загострення розсіяного склерозу. Вивчена динаміка вмісту ММП-9 та ТІМП-1 в залежності від перебігу захворювання та в процесі лікування РС. Показане їх патогенетичне та діагностичне значення, дані рекомендації для практичного застосування. Практичне значення отриманих результатів. Встановлені концентрації ММП-9 та ТІМП-1 у сироватці здорових осіб, що має практичне значення при проведенні діагностики різноманітної патології нервової системи. Визначені основні лікворні та сироваточні діагностичні параметри, які характерні для загострення РС. Вироблені критерії, що дозволяють передбачити настання загострення (екзацербації) указаного захворювання. Обґрунтована тактика та диференційований підхід для призначення профілактичного лікування хворим на розсіяний склероз. Вироблені критерії ефективності лікування розсіяного склерозу. Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведено аналіз наукової літератури, виконано інформаційний пошук. Внесок здобувача в отримані результати наукових досліджень є основним і полягає у підборі та обстеженні хворих, самостійному проведенні основних досліджень ліквору та сироватки (цимографія, ELISA, лікворна діагностика, тощо). Автором самостійно проведено аналіз отриманих клінічних, інструментальних та лабораторних даних, виконано статистичну обробку результатів. Апробація результатів дослідження. Робота апробована на засіданні кафедри нервових хвороб Харківського державного медичного університету. Основні положення та матеріали дисертації доповідались й обговорювались на міжнародному конгресі молодих учених Каїрського університету (Єгипет) в 1998 р., 13-му та 15-му Європейських конгресах із вивчення та лікування розсіяного склерозу (Eсtrims 97 та Eсtrims 99) у Стамбулі (Туреччина) в 1997 р. та Базелі (Швейцарія) в 1999 р., наукових неврологічних конференціях університету Георга-Августа в Геттінгені в 2000 та 2001 роках. Частина даної дисертації була захищена 20 листопада 2000 року на медичному факультеті університету Георга-Августа (Геттінген) як дисертація на вчену ступінь доктора медицини за темою „Zusammenhang der Matrix-Metalloproteinase-9-Spiegel im Liquor cerebrospinalis mit der Zellzahl und der Blut-Liquor-Schrankenfunktion bei Patienten mit neurologischen Erkrankungen” („Взаємозв’язок рівня матриксної металопротеїнази-9 в спинномозковій рідині з кількістю клітин та функцією гематоенцефалічного бар’єра у пацієнтів із неврологічними захворюваннями”). Публікації. За темою дисертації опубліковано 11 робіт, серед них 5 самостійні – у фахових виданнях, затверджених ВАКом України, 2 у спеціалізованих закордонних журналах, отримано 1 деклараційний патент України на винахід, 3 роботи опубліковано в матеріалах медичних форумів. Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 146 сторінках тексту і складається зі вступу, огляду літератури, клінічної характеристика хворих і предмету та методів дослідження, власних досліджень, заключної частини, висновків, практичних рекомендацій, переліку посилань, котрий містить 125 джерел, в тому числі 23 роботи кирилицею та 102 латиницею (що складає 12 сторінок). Дисертація містить 5 додатків (обсяг 12 сторінок). Робота ілюстрована 27 таблицями та 7 рисунками (що складає 7 сторінок). ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ Матеріал і методи дослідження. Всього було обстежено 20 здорових осіб і 153 хворих з різноманітною неврологічною патологією. Серед останніх у 60 пацієнтів було діагностовано згідно критеріїв Позера достовірний РС та у 47 - інфекційні захворювання ЦНС (у 35 - бактеріальний менінгіт і у 12 – вірусний). Як групу порівняння досліджували 14 хворих боковим аміотрофічним склерозом (БАС) та 32 пацієнти з іншою неврологічною патологією, спинномозкова рідина яких характеризувалася відсутністю або наявністю ознак запалення та нормальною або порушеною функцією гематоенцефалічного бар’єра (ГЕБ). Проводилось загально-клінічне, неврологічне та загально-лабораторне обстеження хворих. До початку лікування виконувалась Т1 – зважена і Т2 – зважена магнітно-резонансна томографія (МРТ) та Т1 – зважена МРТ із гадолінієвим (Gd) контрастом. Лікворна діагностика включала цитологію, визначення інтратекального синтезу імуноглобулінів та олігоклональних волокон методом електрофоретичного фракціювання протеїнів у імуноблоті з агарози за методикою Hi. Schipper (1987). Ig A, M та G виявлялись методами імуногістохімічної нефелометрії (H. Reiber, 1980) та ELISA у відповідності з рекомендаціями H. Reiber (1995). ММП-9 і ТІМП-1 визначались методами ELISA та цимографії (I. Azeh, M. Mader, A. Smirnov, 1998). Локальний синтез специфічних антитіл проти вірусів кору, краснухи, герпесу (Нerpes simplex, Varicella Zoster) та MRZ-реакцію в лікворі хворих на РС вивчали методом ELISA за способами розробленими в нейрохімічній лабораторії Геттінгенського університету (H. Reiber, P. Lange, 1991). Визначення альбуміну сироватки та ліквору проводилось методом імуногістохімічної нефелометрії (H. Reiber, 1980) та використовувалось, поруч зі значеннями імуноглобулінів, для визначення функції гематоенцефалічного бар’єра, при цьому розрахунки проводились за математичними формулами у відповідності з рекомендаціями H. Reiber (1995). Значення QАЛЬБ <8х10-3 розцінювались як норма, значення QАЛЬБ >8х10-3 розцінювались як порушення функції гематоенцефалічного бар’єра.

Статистична оцінка даних проводилась з використанням комп’ютерної
статистичної програми Graph Pad-Prism 2.01. Застосовувалися Lineare
Regresions Analyse та Spearman Rank статистика.

Клінічна характеристика хворих: Серед 60 хворих на РС (23 чоловіки та 37
жінок віком від 18 до 64 років) переважали хворі з реміттуючим перебігом
захворювання (29), менше було пацієнтів з первинно-прогресуючим РС (19),
у 12 пацієнтів діагноз РС було встановлено вперше в житті. Захворювання
РС найбільш часто виникало в період від 20 до 30 років. Реміттуючий РС,
на відміну від первинно-прогресуючого, не розпочинався у пацієнтів віком
старше 49 років. Різною була і тривалість захворювання. Так реміттуючий
РС у 39+7,6% пацієнтів тривав більше 10 років, а первинно-прогресуючий
обмежувався тривалістю до 10 років. При обох варіантах перебігу РС
дебюту захворювання передував різної тривалості період латентного або
субклінічного перебігу демієлінізуючого процесу, діагностувати який на
даному етапі за допомогою традиційних методів неврологічної діагностики
було тяжко. Клінічні форми РС: церебральні, церебро-спінальні та
спінальні.

Провідні клінічні синдроми первинно-прогресуючого РС на момент
проведення дослідження відрізнялися більшою вираженістю, стійкістю,
високою питомою вагою враження пірамідних, стовбурних, мозочкових
систем, дисфункцією тазових органів, відсутністю синдрому дисоціацій,
перевагою усіх різновидів ністагму, гіперрефлексії, клонусів ступнів,
патологічних рефлексів, спастичної гіпертонії, інкоординації,
сфінктерних порушень. Внаслідок вказаних вище виражених неврологічних
порушень моторна функцію хворих на первинно-прогресуючий РС значно
страждала і становила в середньому 4,1 бала за шкалою EDSS.

Провідні клінічні синдроми реміттуючого РС в період останньої
екзацербації також характеризувалися поліморфізмом клінічних проявів зі
своєрідним угрупуванням симптомів порушення рухової сфери, уражень
мозочка, черепно-мозкових нервів, тазових розладів, тощо. Тяжкість стану
згідно шкали EDSS у них становила 4,2 бала, тобто була рівноцінна
тяжкості хворих при первинно-прогресуючому РС. Але, незважаючи на високу
частоту та вираженість неврологічної симптоматики у хворих на
реміттуючий РС, вона, на відміну від первинно-прогресуючого, носила
дисоційований, нестійкий і зворотний характер.

У 12 пацієнтів з дебютом вперше діагностованого РС відмічалася нестійка
мозочково-атактична та пірамідна неврологічна симптоматика, рідше
спостерігалися порушення зорового нерва. Діагностика у даної категорії
хворих базувалась на виявленні вогнищ демієлінізації при МРТ та
характерних для РС змінах в лікворі (інтратекальний синтез
імуноглобулінів, локальний синтез противірусних антитіл, тощо).

Групу хворих на інфекційні захворювання ЦНС становили 47 пацієнтів.
Серед останніх було 35 хворих із бактеріальним менінгітом (БМ) та 12 із
вірусним (ВМ). Клінічна картина у останніх характеризувалась гострим
початком, високою температурою (38-390С), порушенням загального стану
внаслідок інтоксикації та менінгеальними симптомами (головний біль,
ригідність потиличних м’язів, симптоми Керніга та/або Брудзинського). У
3 хворих спостерігались фокальні епілептичні напади, що свідчить про
втягнення в запальний процес паренхіми мозку (менінгоенцефаліт). У 4
хворих з менінгітом, викликаним вірусом Епштейна-Барра спостерігалась
ангіна зі збільшенням підщелепних та шийних лімфатичних вузлів. У 3
хворих на менінгіт, викликаний Varicella Zoster виявлялися зміни на
шкірі вздовж міжреберних нервів. Клінічна картина БМ на відміну від
вірусного характеризувалась більш тяжким станом хворих за рахунок
температури септичного характеру та вираженої інтоксикації, яка часто
супроводжувалась блюванням. У 8 хворих спостерігались порушення
свідомості у вигляді його сплутаності та галюцинацій. Для неврологічного
статусу був характерним виражений менінгеальний синдром з наявністю
локальних неврологічних дефіцитів. У 4 хворих відмічався епілептичний
синдром, у 2 хворих центральні геміпарези та порушення функції лицевого
нерва.

Результати дослідження та їх аналіз. У спинномозкових рідинах
контрольної групи значення MMП-9 знаходились нижче межі виявлення (<6 нг /мл), і тому вони класифікувались як негативні. У протилежність до цього, концентрації TIMП-1 у контрольних лікворах навпаки були більш високими і становили приблизно 55,2+6,7 нг /мл. Отже, концентрація ТІМП-1 перевершувала вміст ММП-9 щонайменше в 9 разів. За такої умови ензим був повністю зв’язаний з інгібітором і тому не мав можливості проявити свою активність. Концентрація ММП-9 у сироватці в нормі становила в середньому 1827+202,9 нг /мл. На відміну від ліквору, вміст ТІМП-1 в сироватці (637+264,7 нг /мл) не перевершував концентрацію в ній ММП-9 (1827+202,9 нг /мл), а навпаки був приблизно в 3 рази нижчим. Таке взаємовідношення між ензимом та його інгібітором достатнє, на нашу думку, щоб підтримувати ММП-9 сироватки в неактивному стані. Показники >3 свідчать про недостатню інгібуючу функцію ТІМП-1. Внаслідок цього
надлишок ензиму, що не зв’язаний з ТІМП-1, має можливість проявити свою
активність.

При інфекційних захворюваннях ЦНС відмічалося значне підвищення
концентрації ММП-9 як у лікворі, так і в сироватці хворих. У лікворі
воно було найбільш вираженим у хворих на БМ (294+155,8 нг /мл, р<0,05), тобто перевершувало норму в 49 разів. Одночасно із підвищенням рівня ММП-9 в лікворі відмічався виражений плеоцитоз (226,05+93,9 клітин в 1 мкл). Нами досліджувались та порівнювались дві групи пацієнтів: ПГ-1 з ознаками ізольованого порушення бар’єрної функції та ПГ-2 з ізольованим підвищенням клітин у спинномозковій рідині. За допомогою ELISA було встановлене чітке підвищення MMП-9 лише у пацієнтів з ізольованим підвищенням числа клітин у спинномозковій рідині. В той же час у пацієнтів із групи з порушенням бар’єрної функції ніякого підвищення MMП-9 не виявлялося. Кореляція між концентрацією MMП-9 та числом клітин у лікворі була високо достовірною (p<0,0001), в той час як кореляція між концентрацією MMП-9 та QАЛЬБ. була незначною, а кореляція між QММП-9 та QАЛЬБ. була ще менш суттєвою. Значення TIMП-1 у лікворі хворих на БМ (521,6+227,6 нг /мл) були вищими більше ніж в 9 разів у порівнянні зі значеннями контрольних спинномозкових рідин (55,2+6,7 нг /мл). Однак ця компенсаторна реакція організму у відповідь на підвищення вмісту у лікворі ММП-9 була явно недостатньою, оскільки рівень ензиму зростав, як було сказано, ще більше, а саме в 49 разів. Внаслідок цього відношення ТІМП-1 до ММП-9 знижалось до 1,8 (норма > 9), що характерно для активації ензиму.

`

x

z

|

¦

?

¬

? 3/4 A ae T

*

*

Z

\

^

`

x

z

|

?

¬

????T

V

b

???????

??????#????¤?$??

?????

??&??

???????????

7На відміну від чутливих до пошкодження клітин, MMП-9 ліквору
відзначається стабільністю та може бути виявленою незалежно від часу
отримання ліквору.

Концентрації ММП-9 та ТІМП-1 в сироватці обох груп (БМ та ВМ) були
підвищеними у порівнянні з нормою та суттєво не відрізнялися при обох
різновидах захворювань. Проте порушення відношення між ензимом та
інгібітором в бік переваги ММП-9 було більш вираженим при вірусних
захворюваннях.

У хворих на РС в цілому, включаючи різні варіанти перебігу
(первинно-прогресуючий і реміттуючий РС та хворі з дебютом
захворювання), на відміну від БМ та ВМ відмічався тільки незначний
плеоцитоз. Він коливався у межах від 6 до 29 клітин /мкл (медіана
11,5/мкл). Бар’єрна функція була або незміненою, або злегка порушеною
(медіана QАЛЬБ. х 10-3=8,5). Концентрації ММП-9 та ТІМП-1 в лікворі
суттєво не відрізнялись від контрольних, що можна пояснити відсутністю
плеоцитозу та суттєвого порушення функції ГЕБ. Вивчення вмісту ММП-9 у
сироватці в залежності від перебігу захворювання показало достовірне її
підвищення як при реміттуючому, так і при первинно-прогресуючому РС.
Проте, у хворих із первинно-прогресуючим РС вміст ММП-9 мав тенденцію до
більш низьких значень порівняно з реміттуючим варіантом захворювання.
Вміст ТІМП-1 в сироватці хворих із загостренням реміттуючого РС був
достовірно підвищений у порівнянні з контролем (р<0,05), що можливо відображало компенсаторну реакцію організму у відповідь на підвищений рівень ендогенної пептидази - ММП-9. Подібне одночасне зростання у сироватці рівнів ММП-9 та ТІМП-1 призводило до того, що нормальне взаємовідношення між інгібітором та ензимом (<3) зберігалось. На відміну від сказаного, у хворих з первинно-прогресуючим перебігом РС концентрація ТІМП-1 у сироватці, незважаючи на підвищений рівень ММП-9, суттєво не відрізнялась (р>0,05) від рівня інгібітора у осіб контрольної
групи. Вказане свідчить про виснаження компенсаторного механізму
регуляції активності ММП при хронічних патологічних станах, до яких
можна віднести і РС із первинно-прогресуючим перебігом. Враховуючи більш
низькі значення вмісту ММП-9 у даної категорії хворих, порівняно з
реміттуючим РС, взаємовідношення між ММП-9 та ТІМП-1 теж було порушеним
незначно (3,1) у порівнянні з контролем (<3). Тобто, у хворих з первинно-прогресуючим перебігом РС відмічалась незначна активація ензиму (ММП-9), чого не встановлено нами при реміттуючому варіанті захворювання. Крім вмісту ММП-9 і ТІМП-1 нами було проаналізовано інші параметри ліквору та сироватки в період загострення у 29 хворих з реміттуючим перебігом РС. В залежності від клініки та даних МРТ у вказаних хворих була діагностовано переважно цереброспінальну форму захворювання і лише в 9% діагностовано церебральну та ще у 4% спінальну. З наведених в табл. 1 даних видно, що в період загострення у хворих на реміттуючий РС виникали помірний лімфоцитарний плеоцитоз із домішкою IgG-позитивних плазматичних клітин та легке порушення проникності ГЕБ, спостерігався інтратекальний синтез імуноглобулінів (переважно IgG), виявлялись олігоклональні IgG-волокон та підвищувався титр антитіл до вірусів кору, краснухи, герпесу або реєструвалася MRZ-реакція. Зміни концентрації ензиму ММП-9 та його інгібітора ТІМП –1 у процесі лікування були проаналізовані нами окремо у пацієнтів із реміттуючим і первинно-прогресуючим перебігом, оскільки вони отримували різну терапію. Хворі на реміттуючий РС лікувались за традиційними схемами у поєднанні з плазмаферезом (ПФЗ), а хворі на первинно-прогресуючий РС - (-інтерфероном. Застосовувався препарат Betaferon фірми Schering дозою 8 млн. IU (міжнародних одиниць). Betaferon вводився підшкірно через день протягом 12 місяців. Дослідження рівнів концентрації ММП-9 у сироватці крові методом ELISA проводили до початку терапії інтерфероном-(-1b та через 1, 2, 3, 6, 9 і 12 місяців лікування. Проведені нами дослідження показали, що лікування хворих на РС (- інтерфероном та за традиційними схемами у поєднанні з ПФЗ призводило до стабілізації РС приблизно в 62-63% випадків відповідно. При цьому ефективність лікування ПФЗ залежало від кількості сеансів. У хворих, які отримали 5 сеансів ПФЗ (максимальне число в наших спостереженнях), результати лікування виявилися Таблиця 1 Біохімічні та імунологічні показники ліквору у хворих із загостренням розсіяного склерозу (n=29) Показник ліквору Міжнаро-дно прийнята норма Число хворих з відхиленням від норми Медіана та розмах показника Кількість клітин в 1 мм3 <4 клітин 14(48,3+9,4%) 11,5/мм3 (6 –29) Плазматичні клітини Відсутні 10(34,5+9%) 3,5%(0,1- 5%) Загальний білок в мг/л 200-400 мг/л 12(41,4+9,3%) 594 мг/л Альбумін в мг/л До 340 мг/л 7(24,1+8,1%) 369 (350-405) мг/л Q альб. х 10-3 Менше 8 7(24,1+8,1%) 8,5(7,3-12,8) Інтратекальний синтез Ig Ig A у % Ig M у % Ig G у % Відсутні Відсутні Відсутні 6 (20,7+7,7%) 4(13,8+5,3%) 15(51,7+9,4%) 28,5%(17-35%) 40,5%(30-51%) 38%(22-95%) Олігоклональні волокна (Ig G фракція) Відсутні 18(62+9,2%) + Індекс антитіл: - пр.кору -пр.краснухи -пр.herpes zoster -пр.herpes simplex 0,7-1,3 0.7-1,3 0,7-1,3 0,7-1,3 17(58,6+9,3%) 16(55,1+9,4%) 12(41,3+9,3%) 1(3,4+3,4%) 2,95(1,7-13,1) 3,55(1,6-6,7) 3,75(1,5-13,9) 1,9 MRZ-реакція Відсутня 15(51,7+9,4%) + кращими ніж у пацієнтів, які отримали тільки 3 сеанси (мінімальне число сеансів у наших дослідженнях). З проведених нами досліджень також випливає, що незалежно від обраного нами методу лікування хворих на РС досягнення стабілізації процесу супроводжувалось зменшенням концентрації ММП-9 у сироватці пацієнтів до норми та нормалізацією взаємовідношення між ферментом та його інгібітором (<3). У тих хворих, де лікування виявилось неефективним, продовжували визначатись підвищені показники вмісту ММП-9 у сироватці а відношення ензиму до інгібітора становило величину >3.

Все вище сказане свідчить про безпосередню участь ММП-9 та її інгібітора
ТІМП-1 у патогенезі демієлінізуючих захворювань й повинно враховуватись
при проведенні лікування з метою прогнозу розвитку захворювання у
подальшому. Так, якщо нормалізації взаємовідношення між ММП-9 та ТІМП-1
у процесі лікування не досягнуто, то незважаючи на позитивну
клініко-неврологічну динаміку в розвитку РС лікування доцільно
продовжити. З іншого боку, якщо у пацієнтів з РС в період ремісії
захворювання спостерігається підвищення вмісту ММП-9 та ТІМП-1 у
сироватці вище встановленої нами норми, то це є підставою для
призначення їм профілактичного лікування для запобігання розвитку
можливого загострення РС.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведені теоретичне узагальнення та нове рішення задачі –
уточнення ролі ММП-9 та її тканинного інгібітора ТІМП-1 у патогенезі
демієлінізуючих захворювань нервової системи у порівнянні з іншими
інфекціями ЦНС та розробка на основі цього нових підходів до діагностики
та критеріїв ефективності лікування розсіяного склерозу.

2. При загостренні РС у лікворі реєструвався цілий ланцюг параметрів, що
вказують на екзацербацію процесу: плеоцитоз лімфоцитарного характеру з
домішкою IgG-позитивних плазматичних клітин, легке порушення проникності
гематоенцефалічного бар’єра, інтратекальний синтез імуноглобулінів,
олігоклональні IgG-волокна та підвищений титр антитіл до вірусів кору,
краснухи простого герпесу й оперізуючого лишаю, MRZ-реакція.

3. ММП-9 у спинномозковій рідині хворих на розсіяний склероз та
нейродегенеративні захворювання (БАС) не виявлялася. У пацієнтів із
інфекційною патологією ЦНС на відміну від хворих на РС та БАС виявлялось
суттєве зростання концентрації ММП-9 у лікворі при недостатньому
зростанні вмісту її інгібітора — ТІМП-1, що свідчило про порушення
ензимного гомеостазу.

4. Підвищення вмісту ММП-9 у лікворі не залежало від стану бар’єрної
функції, а знаходилось у прямій залежності від вираженості плеоцитозу, а
також клітинного складу. Вміст ММП-9 був найвищим у хворих з
гранулоцитарним плеоцитозом (бактеріальний менінгіт) та найнижчим у
хворих із переважно лімфоцитарним (вірусні захворювання). Тому ММП-9
може розглядатися як маркер імунокомпетентних клітин, а визначення її у
лікворі застосовуватись як альтернативний метод дослідження при
проведенні диференціальної діагностики між інфекційними та
неінфекційними захворюваннями центральної нервової системи.

5. Рівні ММП-9 та ТІМП-1 у сироватці крові були підвищеними як у хворих
із інфекційною патологією (БМ, ВМ), так і у хворих на РС. При
демієлінізуючій патології вони були нижчими, ніж при інфекційній. При
загостренні реміттуючого РС відбувалося одночасне зростання вмісту ММП-9
та ТІМП-1 у сироватці без порушення нормального взаємовідношення між
ензимом та інгібітором, що свідчить про збереження ензимного гомеостазу.

6. Для хворих на первинно-прогресуючий розсіяний склероз було
характерним порушення взаємовідношення між ензимом та його інгібітором
сироватки, що свідчило про виснаження компенсаторних механізмів
регуляції активності ММП.

7. Стабілізація РС супроводжувалась зниженням вмісту ММП-9 у сироватці
та нормалізацією порушених взаємовідношень між ММП-9 та ТІМП-1. При
неефективному лікуванні зберігалися підвищений вміст ММП-9 і ТІМП-1 та /
або порушення співвідношення між ними. Визначення концентрації ММП-9 і
ТІМП-1 у сироватці хворих на розсіяний склероз може служити критерієм
ефективності терапії та показником, що дозволяє прогнозувати розвиток
можливої екзацербації та бути підставою для призначення профілактичного
лікування.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Вміст ММП-9 у лікворі може використовуватися як
диференціально-діагностичний критерій при відсутності можливості
дослідження цитозу спинномо-зкової рідини. Підвищення концентрації ММП-9
у лікворі вище норми (< 6 нг /мл) слід розцінювати як ознаку інфекційно-запалювального процесу в ЦНС. 2. Визначення концентрації ММП-9 і ТІМП-1 у сироватці хворих на розсіяний склероз може служити критерієм ефективності терапії. Якщо в процесі лікування не досягнуто нормалізації вмісту ММП-9 і ТІМП-1 та взаємовідношення між ними, то незважаючи на позитивну клініко-неврологічну динаміку терапію доцільно продовжити. 3. Підвищення концентрації ММП-9 та ТІМП-1 в сироватці хворих розсіяним склерозом вище норми (1827 нг /мл та 637 нг /мл відповідно) навіть при відсутності неврологічної симптоматики та інших лабораторних ознак є свідченням загострення хвороби та потребує призначення лікування для запобігання подальшому прогресуванню запального процесу. Перелік робіт, опублікованих за темою дисертації 1. Ющенко М.Л. Диференційоване застосування плазмаферезу в лікуванні хворих на розсіяний склероз // Експериментальна і клінічна медицина. - 1999.-т.2, № 1.-с.104-115 2. Ющенко М.Л. Матрикс металлопротеиназы при заболеваниях нервной системы воспалительного и невоспалительного генеза // Медицина сегодня и завтра.- 2000.- № 1.-с.69-72 3. Ющенко М.Л. Биохимические и иммунологические изменения в ликворе больных рассеянным склерозом в период обострения заболевания // Український вісник психоневрології.-2000.-т.8, № 3.-с.25-27 4. Ющенко М.Л. Динамика содержания матрикс металлопротеиназы-9 и ее тканевого ингибитора ТIМP-1 в сыворотке больных рассеянным склерозом при лечении ?-интерфероном // Медицина сегодня и завтра.- 2001.-№ 1.- с.94-96 5. Ющенко М.Л. Роль содержания эндогенных протеиназ и их тканевых инги-биторов в диагностике обострений рассеянного склероза // Врачебная практика.- 2001.- № 1 с. 71-73 6. Деклараційний патент на винахід 31310А, Україна, МКИ А 61 М 1/10, А 61 М 1/14, А 61 М 1/36. Спосіб лікування хворих на розсіяний склероз / Дубенко Є.Г., Ющенко М.Л., Лопатченко Є.К.- № 98084235; заявлено 04.08.1998, опубл. 29.03.2000 Бюл. № 2; опубл. 15.12.2000 Бюл. № 7-11 (Ющенко М.Л особисто відбирались хворі на РС для лікування плазмафарезом, проаналізовані результати лікування, оформлена заявка на винахід). 7. Yushchenko M., Mader M., Bitsch A., Kitze B., Bogumil T., Dressel A., Kolb A., Elitok E., Bahner D., Poser S. and Weber F. Treatment with interferon-?1b (IFN-?1b) suppressed serum level of matrix metallopro-teinase-9 (MMP-9) in patients with primary progressive multiple sclerosis (PPMS) // Multiple sclerosis. Clinicel and laboratory research: Ectrims / Actrims 99 15th congr. of the Europ.Comm. for Treatment and Research in Multiple Sclerosis: 4th Annual Meeting of America’s Comm. for Treatment and Research in Multiple Sclerosis Basel / Switzerland September 15-18, 1999 Joint RIMS-CMSC Symposium Basel / Switzerland September 14-16, 1999.-№ 67 (Ющенко М.Л. особисто проведено дослідження вмісту ММП-9 та ТІМП-1 методом ELISA та цимографії в лікворі та сироватці хворих, проаналізовано отримані результати). 8. Wоlfgang Beuche, Maryna Yushchenko, Michael Mader, Malgorzata Mali-schewska, Klaus Felgenhauer, Frank Weber Matrix metalloproteinase-9 is elevated in serum of patients with amyotrophic lateral sclerosis // NeuroReport.- 2000.-Vol. 11, № 16.- p.3419-3422 (Ющенко М.Л. особисто проведено дослідження вмісту ММП-9 та ТІМП-1 методом ELISA та цимографії в лікворі та сироватці хворих, проаналізовано отримані результати). 9. Maryna Yushchenko, Frank Weber, Michael Mader, Ulrike Scholl, Malgorzata Malischewska, Hayrettin Tumani, Klaus Felgenhauer, Wоlfgang Beuche Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in human cerebrospinal fluid (CSF): elevated levels are primarily-related to CSF cell count // Journal of Neuroimmunology.-2000.- 110,1-2.- p.244-251 (Ющенко М.Л. особисто проведено дослідження ММП-9 методом ELISA та цимографії у лікворі та сироватці хворих, проаналізовано отримані результати). 10. Yushchenko M., Weber F., Malischewska M., Azeh I., Tumani H. Felgenhauer K., Mader M., Beuche W. Matrix-Metalloproteinase-9 (MMP-9) im Liquor: Die Konzentration korreliert primar mit der Zellzal und nicht mit der Schrankenfunktion // Abstracts 7 Forschungskonferenz der Neurologischen Klinik und Poster Follow-up des Neurologen-Kongresses 99.-Gottingen, 3.2 – 5.2.2000 (Ющенко М.Л. особисто проведено дослідження вмісту ММП-9 у лікворі та сироватці хворих). 11. Maryna Yushchenko, W. Beuche, Malgorzata Malischewska, K. Felgenhauer, M. Mader und F. Weber Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) im Serum von Patienten mit amyotrophischer Lateralsclerose // Abstracts Abschiedssymposium fur prof. Dr. K.Felgenhauer 8 Forschungskonferenz der Neurologischen Klinik 3. Poster Follow-up Baden – Baden.- Gottingen, 18.1 – 20.1.2001(Ющенко М.Л. особисто проведено визначення вмісту ММП-9 та ТІМП-1 у сироватці та лікворі хворих). АНОТАЦІЯ Ющенко М. Л. Діагностичне та патогенетичне значення матриксної металопротеїнази-9 у хворих на демієлінізуючі та інфекційні захворювання нервової системи.- Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14. 01. 15 - нервові хвороби .- Харківська медична академія післядипломної освіти МОЗ України, Харків 2004. За допомогою ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) вивчався вміст ММП-9 та її тканинного інгібітора (ТІМП-1) в лікворі та сироватці 153 хворих на різноманітну неврологічну патологію. Високі концентрації ММП-9 встановлені у лікворі хворих на інфекційну патологію ЦНС, які корелювали з числом клітин в спинномозковій рідині та були найвищими при захворюваннях із гранулоцитарним плеоцитозом (бактеріальний менінгіт) і найнижчими з переважно лімфоцитарним(вірусний менінгіт). У хворих на демієлінізуючі захворювання ММП-9 у лікворі була відсутня (< 6 нг/мл). Концентрації ММП-9 та ТІМП-1 в сироватці були підвищеними при всіх різновидах неврологічних захворювань. Показана динаміка ММП-9 та ТІМП-1 у сироватці хворих на розсіяний склероз (РС) в залежності від перебігу захворювання, лікування, тощо. Запропоновані критерії ефективності лікування та прогнозу загострення РС. Надані рекомендації щодо профілактики загострень РС. Ключові слова: матриксна металопротеїназа-9 (ММП-9), тканинний інгібітор матриксних металопротеїназ (ТІМП-1), демієлінізуючі та інфекційні нервові захворювання. АННОТАЦИЯ Ющенко М. Л. Диагностическое и патогенетическое значение матриксной металлопротеиназы-9 у больных демиелинизирующими и инфекционными заболеваниями нервной системы.- Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01. 15 - нервные болезни.- Харьковская медицинская академия последипломного образования МЗ Украины, Харьков, 2004. С помощью ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) изучалось содержание ММП-9 и ее тканевого ингибитора (ТИМП-1) в ликворе и сыворотке 153 больных с разнообразной неврологической патологией (женщин - 69, мужчин – 84). Возраст пациентов колебался от 18 до 84 лет (медиана 45,4). У пациентов с инфекционной патологией ЦНС обнаруживалось повышение концентрации ММП-9 в ликворе, особенно выраженное у больных бактериальным менингитом (БМ) и менее выраженное при вирусной патологии ЦНС (ВМ). Повышение содержания ММП-9 не зависело от состояния функции гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), а находилось в прямой зависимости от выраженности плеоцитоза и клеточного состава ликвора. ММП-9 в ликворе может рассматриваться в качестве маркера иммунокомпетентных клеток, поскольку наиболее высокое содержание ее определялось у больных с гранулоцитарним плеоцитозом и наименее низкое - у больных с преимущественно лимфоцитарным. Концентрация ТИМП-1 в ликворе больных с инфекционной патологией также была повышенной, но меньшей степени чем ММП-9. Вследствие этого нарушалось характерное для нормы взаимоотношение между ингибитором и энзимом в сторону активации последнего. В ликворе больных рассеянным склерозом (РС) ММП-9 методом ELISA не выявлялась. При обострении РС регистрировались показатели ликвора, указывающих на экзацербацию процесса: лимфоцитарный плеоцитоз с примесью IgG-положительных плазматических клеток, нарушение проницаемости ГЭБ., интратекальный синтез иммуноглобулинов, олигоклональные IgG-волокна и повышенный титр антител к вирусам кори краснухи опоясывающего лишая, реже к вирусу простого герпеса, MRZ-реакция. Содержание ММП-9 и ТИМП-1 в сыворотке крови было повышенным и при демиелинизирующих и при инфекционных заболеваниях ЦНС. Наибольшие их значения в сыворотке характерны для больных инфекционными заболеваниями, при которых также нарушались нормальные взаимоотношения между энзимом и его ингибитором. У больных ремитирующим РС концентрации ММП-9 и ТИМП-1 в сыворотке повышались при обострении, однако они были ниже, чем при инфекционной патологии, а нормальные взаимоотношения между энзимом и его ингибитором сохранялись. У больных первично-прогрессирующим РС повышение ММП-9 в сыворотке было менее выраженным по сравнению с ремитирующим, но поскольку концентрация ТИМП-1 существенно не изменялась, то взаимоотношения между энзимом и его ингибитором были нарушенными в сторону повышения активности ММП-9. Последнее свидетельствовало об истощении компенсаторных механизмов при первично-прогрессирующем течении РС. Стабилизация РС в процессе лечения сопровождалась снижением содержания ММП-9 и нормализацией нарушенных взаимоотношений между ММП-9 и ТІМП-1. При неэффективном лечении РС сохранялись повышенное содержание ММП-9 в сыворотке и нарушение соотношения между ММП-9 и ТІМП-1 в сторону преобладания активности энзима. Таким образом, концентрации ММП-9 и ТИМП-1 в сыворотке крови больных РС могут служить критериями эффективности лечения. Их повышение по сравнению с нормой позволяет прогнозировать развитие возможного обострения РС и является основанием для назначения профилактического лечения. Ключевые слова: матриксная металлопротеиназа-9 (ММП-9), тканевой ингибитор металлопротеиназ (ТИМП-1), демиелинизирующие и инфекционные заболевания нервной системы. SUMMARY Yushchenko М. L. Diagnostic and pathogenetic significance of matrix metalloproteinase-9 in patients with demyelinating and infectious diseases of nervous system.- Manuscript. The thesis to quest for scientific degree of a Candidate of Medical Sciences on speci-аlity of 14.01.15 – Nervous Diseases.- Kharkiv Medical Academy of Postgraduate Education, Kharkiv, 2004. The concentration of matrix metalloproteinases-9 (MMP-9) and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase (TIMP-1) was investigated by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and zymography in serum and cerebrospinal fluid (CSF) of 153 patients with various neurological disorders. High MMP-9 concentration was determined in CSF of patients with infectious diseases of nervous system. The concentration of MMP-9 in liquor correlated with CSF cells count and was higher in diseases with granulocyte infiltration of CNS (bacterial meningitis) and less pronounced in the patients with mainly lymphocyte pleocytosis (viral meningitis). In the patients with demyelinating diseases MMP-9 levels in CSF was considerably low (< 6 ng/ml). The concentration of MMP-9 and TIMP-1 was significantly increased in serum of patients with all neurological diseases. The changes of MMP-9 and TIMP-1 in serum of patients with multiple sclerosis (MS) are shown depending on current of diseases, treatment and other. The criteria of efficiency treatment patients with MS and predict development of exacerbation MS is offered. The recommendations are given concerning prevention of exacerbation MS. Key words: Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), tissue inhibitor of matrix metalloproteinase (TIMP-1), demyelinating and infectious diseases of nervous system PAGE 2

Похожие записи