НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ,

OНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ім. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО

ПРОКОПЕНКО Ігор Вікторович

УДК: 616-006: 612.112.94:591.185.6

Чутливість нормальних та малігнізованих лімфоцитів до світлового
випромінювання видимої ділянки спектру

14.01.07 – онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і
радіобіології ім Р.Є.Кавецького НАН України, м. Київ.

Науковий керівник – доктор біологічних наук, професор

Гамалія Микола Федорович, завідувач відділу клітинної фотобіології та
фотомодуляції пухлинного росту Інституту експериментальної патології,
онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

Шляховенко Володимир Олексійович, завідувач відділу ензимології пухлин
Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.
Р.Є. Кавецького НАН України

доктор біологічних наук, професор

Серкіз Ярослав Іванович, провідний науковий співробітник відділу
радіобіології Інституту експериментальної радіології Наукового центру
радіаційної медицини АМН України

Провідна установа ? Національний медичний університет ім. О.О.
Богомольця, кафедра онкології, кафедра медичної та біологічної фізики,

м. Київ

Захист відбудеться “ 8 ” червня 2005 року о 15 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної
патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України за
адресою: 03022, Київ, вул. Васильківська, 45

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР

ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Автореферат розісланий “ 6 ” травня 2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук

Н.В.Бородай

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Останніми роками встановлено, що лазерне
червоне/інфрачервоне випромінення низької інтенсивності є своєрідним
загальним та місцевим біологічним стимулятором багатьох функцій
організму. Стимуляція репаративних процесів, підвищення неспецифічної
резистентності, покращення кисень-транспортної функції еритроцитів,
судинорозширюючий ефект при внутрішньосудинному застосуванні – це далеко
не повний перелік ефектів, що реєструються при лазерній
низькоінтенсивній терапії (Москвин С.В., 2000). Однак, її практичне
використання, подальший розвиток та удосконалення були б набагато
ефективнішими, якби рекомендовані фототерапевтичні підходи базувались на
розумінні первинних механізмів дії світлового випромінення.

Першими кроками до визначення фундаментальних механізмів, що можуть
лежати в основі лікувальної дії випромінення оптичного діапазону, стали
результати експериментів стосовно фоторегуляторних та фотостимулюючих
ефектів світла на модельних клітинних та тканинних системах нижчих
організмів. Важливим подальшим етапом у розвитку досліджень такого плану
послужила демонстрація світлозалежних змін функціональної активності в
органних та клітинних культурах хребетних (Vacca R.A., 1996, Whitmore
D., 2000; Golombek D.A., 2004), яка циклічно коливається протягом доби
(циркадіанні ритми). Більше того, деякі з цих культур проявляли
здатність реагувати на зміну світлового режиму, корелюючи піки своєї
активності. Визначення певної автономності циркадних ритмів зумовило
пошуки у клітинних культурах структур, які, виступаючи акцепторами
світлового опромінення, опосередковували корекцію цих ритмів.
Закономірна зміна функціональної активності клітин та їх органел при дії
видимого світла певних ділянок спектру робить необхідним визначення
молекулярної природи клітинних структур, які безпосередньо реагують на
світлове опромінення.

Таким чином, виявлення та ідентифікація клітинних акцепторів світлового
випромінювання, а в подальшому – з’ясування шляхів та механізмів
передачі сприйнятого фотосигналу, є актуальною науковою проблемою.
Вивчення світлової чутливості лімфоцитів людини, які були об’єктом
дослідження, та молекулярної природи фотореактивних клітинних
компонентів, є складовою частиною назрілої загальної проблеми вивчення
світлової чутливості незорових тваринних клітин як в нормі, так і при
малігнізації. Такий підхід відкриває шлях до розуміння механізму цих
процесів і можливого практичного, науково обгрунтованого використання
їх, зокрема, в лікувально- діагностичних цілях.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Обраний напрямок
дослідження безпосередньо пов’язаний з науково- дослідними роботами
відділу клітинної фотобіології та фотомодуляції пухлинного росту
Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.
Р.Є. Кавецького НАН України (завідувач відділом – М.Ф.Гамалія) за
темами: 2.28.2.8 «Вивчення біоритмологічних особливостей цитотоксичної
активності лімфоїдних клітин в онкологічних хворих та розробка підходів
до лазерної хронотерапії пухлин» (№ 0194U017019, 1994-1996 р.р.),
2.2.5.202 «Експериментальне обгрунтування та клінічна апробація
ритмоорієнтованої терапії раку молочної залози» (№ 0197U006234,
1997-1999 р.р.), 2.2.5.221 «Вивчення фоточутливості лімфоїдних клітин
при лімфолейкозах людини» (№ 0100U000665, 2000-2002 р.р.), а також із
виконанням дослідження за грантом від Фонду фундаментальних досліджень
«Вивчення світлозалежного циркадіанного годинника, відкритого у
лімфоцитах крові людини: молекулярна природа фоторецептора»(№
0104U008981, 2002-2005 р.р.).

Мета дослідення. Метою роботи було дослідження молекулярної природи
процесів, що лежать в основі сприйняття світлового випромінювання
нормальними та злоякісними лімфоцитами крові людини та реалізуються у
фоторегуляції циркадіанної активності лімфоцитарних клітин.

Задачі дослідження:

Розробити індикаторні клітинні тести на світлову чутливість лімфоцитів
крові людини.

Розробити методичні підходи до виділення фоточутливого білкового
комплексу з лімфоцитарних клітин.

Отримати очищені препарати фоточутливого білкового комплексу з
нормальних та малігнізованих лімфоцитів.

Визначити фізико-хімічні характеристики та біохімічні особливості
білкового та хромофорного компонентів фоточутливого комплексу.

Охарактеризувати фотобіологічні особливості малігнізованих лімфоїдних
клітин.

Об’єкт дослідження — лімфоцити з крові здорових донорів та хворих на
хронічний В-клітинний лімфолейкоз.

Предмет дослідження — чутливість лімфоцитів людини до
низькоенергетичного світлового випромінювання видимої ділянки спектру.

Методи дослідження — біохімічні, біофізичні, імунологічні,
хронобіологічні, спектроскопічні, клітинно-культуральні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що чутливість
лімфоцитів до світла певних ділянок видимої частини спектру обумовлена
сполукою білкової природи, яка розташована на поверхневій мембрані
клітин.

Розроблено методичні підходи і оптимізовано спосіб виділення із
лімфоцитів та очищення фоточутливого білкового комлексу.

Визначені фізико- хімічні особливості апопротеїнової та хромофорної
частин отриманого фоточутливого білкового комплексу, встановлена його
альбуміноподібна природа.

Вперше охарактеризовані відмінності досліджених фотобіологічних
властивостей чутливої до світла білкової сполуки, що міститься в
малігнізованих лімфоцитах, у порівнянні з лімфоцитами здорових донорів.

Практичне значення одержаних результатів. Дане дослідження є
фундаментальною роботою, результати якого у перспективі можуть бути
використані для розробки більш ефективних, науково обгрунтованих
підходів до фототерапії злоякісних пухлин.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто поставлені мета роботи,
формуванні програми, завдань, обсягу та методів дослідження. Автором
зібрана та проаналізована сучасна література за темою дисертації.
Дисертантом самостійно виконані наукові дослідження, проведено
статистичну обробку та аналіз даних, теоретичне узагальнення
результатів, сформульовано основні наукові положення та висновки
дисертації.

Апробація результатів досліджень. Основні положення дисертації були
представлені та обговорені на: IV науково- практичній конференції
«Застосування лазерів в медицині та біології» (Львів-Київ, 1995); X
Міжнародній конференції «Применение лазеров в медицине и биологии»
(Харків, 1998); І-ій науково- практичній конференції «Нове в
медикаментозній терапії раку молочної залози» (Київ, 1998);
науково-практичній конференції «Сучасні аспекти біофізичної медицини»
(Київ, 2002); міжнародному симпозіумі „Актуальні проблеми біофізичної
медицини” (Київ, 2004).

Публікації. Результати дисертації опубліковано в 9 наукових роботах, в
тому числі в 4 статтях у провідних фахових виданнях, 1 науковому
збірнику та матеріалах 4 науково- практичних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду
літератури, матеріалів і методів досліджень, семи підрозділів власних
досліджень, аналізу та узагальнення отриманих результатів, висновків і
списку використаної літератури. Основний зміст дисертації викладений на
127 сторінках машинописного тексту, містить 7 таблиць та 24 рисунка.
Список використаної літератури включає 133 джерела, з них 47 вітчизняних
та 86 іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. У дослідах використовувались лімфоцити,
отримані з гепаринізованої периферійної крові здорових донорів –
добровольців, лімфоконцентрату, отриманого з крові хворих на В-клітинний
лімфолейкоз, та клітинних ліній Raji та Namalva. Для виділення
мононуклеарів використовували загальноприйнятий метод швидкого виділення
шляхом центрифугування цільної крові в градієнті густини (Boyum A.,
1974). Приблизно 70% клітинної суспензії мононуклеарів складають
Т-лімфоцити. При інкубації суспензії в пластикових чашках Петрі
відбувається адгезія моноцитів на полістироловій поверхні. Подвійна
інкубація суспензії кожна протягом 30 хв при 370С в атмосфері з 5% СО2
давала практично повну очистку супернатанта від моноцитів. Від
тромбоцитів звільнялися в два етапи: спочатку видаляли плазму; потім
мононуклеарну суспензію після видалення моноцитів піддавали
центрифугуванню 1000 об./хв протягом 3 хв. Для очистки даної фракції від
В-клітин використовували фільтрацію суспензії на нейлоновій ваті.

Для виявлення маркерного антигену Т-лімфоцитів CD2 використовували
моноклональне антитіло Leu 5b або реакцію Е-розеткоутворення з
еритроцитами барана. Антиген CD19, характерний для В- лімфоцитів,
виявляли шляхом розеткоутворення з еритроцитами миші.

Для виділення фоточутливого білкового комплекса суспензію лімфоцитів
піддавали м’якій термічній обробці ( 60 хв. при 450С) або інкубації з
детергентом октилглюкозидом, в результаті чого після осадження клітин
фоточутливий білковий комплекс залишався в супернатанті. Концентрування
його відбувалося за допомогою діалізу проти 8%-го розчину
поліетиленгліколя 35000-40000. Для визначення концентрації білків
використовувались методика (Greenberg, 1982) та модифікований метод
Lowry (Markwell M.A., 1978).

Подальші етапи очистки білкового матеріалу включали препаративний
варіант вертикального електрофорезу в нативних умовах (лінійний градієнт
концентрації поліакриламіду в розділяючому гелі 7% – 22%) та
ізоелектричне фокусування; по закінченні процесу електрофорезу смугу
концентрованого білка евакуювали з гелю, використовуючи метод
електроелюції.

Дослідження фотоабсорбційних властивостей препаратів у видимій ділянці
спектру провадили, використовуючи спектрофотометри Specord M-40 (НДР) та
Beckman DU-70 (США). Диференціальні спектри отримували шляхом
комп’ютерної обробки прямих спектрів. Окремі спектри піддавали процедурі
математичного згладжування. Спектри флуоресценції фотореактивного білку
реєстрували за допомогою приладів Hitachi MF-4 та Hitachi 850 (Японія).
При дослідженні спектрів електронного парамагнітного резонансу
фоточутливого білкового матеріалу використовувались радіометри Varian- 4
(США) та ЕПР РЕ 1307 (НТО АН СРСР).

Для визначення імунологічних характеристик препаратів
застосовували реакцію подвійної радіальної імунодифузії (Фримель Г.,
1987), методи ракетного імуноелектрофорезу (Laurell, 1972) та
твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA) (Кэтти Д., 1991). При
цьому використовували антисироватку, отриману після імунізації кролів
очищеним фотореактивним білком.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Специфічна світлова чутливість Т- лімфоцитів периферичної крові людини
до низькоінтенсивного (щільність вихідної потужності 0,5 Вт/м2,
експозиція 60с) випромінення червоної області спектра як некогерентного
походження (ртутна лампа з монохроматором), так і когерентного (He-Ne
лазер), визначалась за Е- розеткоутворюючою активністю клітин. Це є
ознакою стану CD2 — антигену лімфоцитарної поверхневої мембрани, який
паралельно аналізували за допомогою моноклонального антитіла Leu 5b. При
опроміненні суспензії лімфоцитів червоним світлом (633 нм) низької
інтенсивності спостерігалось закономірне зростання кількості Е- розеток
в середньому на 10/12%, що на першому етапі роботи використовувалось у
якості індикаторного тесту на наявність світлової чутливості клітин.

Використовуючи цей підхід, був проведений розширений пошук щодо
молекулярної природи світлової чутливості лімфоцитів. Найбільш імовірним
місцем локалізації фотосприймаючої молекулярної структури в лімфоїдній
клітині могла бути поверхнева мембрана. І дійсно, проведеними
дослідженнями було показано, що м’яке прогрівання клітин (протягом 1 год
при 450С) веде до переходу фактора фоточутливості з поверхні клітинної
мембрани в інкубаційне середовище (рис. 1).

Рис. 1. Фоточутливість лімфоцитів за різних умов: 1-інтактні лімфоцити;
2- лімфоцити, в результаті термічної обробки та видалення супернатанту
позбавлені фоточутливості; 3- відновлення фоточутливості лімфоцитів
поверненням їх власного супернатанту; 4- відсутність фоточутливості
лімфоцитів при внесенні власного супернатанту, попередньо абсорбованого
еритроцитами барана.

При цьому позбавлені супернатанту седиментовані лімфоцити зберігали
Е–розеткоутворюючу здатність майже на рівні контрольних неопромінених
клітин, однак фотореактивність (підвищення цієї здатності під дією
червоного світла) зворотньо втрачалась. Після повернення супернатанту до
прогрітих лімфоцитів їх фоточутливість негайно відновлювалась.

В ході подальших досліджень для ідентифікації досліджуваного фактора
було застосовано електрофоретичні методи. Результати електрофорезу в
поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрія
(ПААГ-ДСН-електрофорез) супернатанта лімфоцитів указували на значну
гетерогенність білкового складу середовища інкубації клітин. На рис.2
продемонстровано послідовні ступені очистки дослідного матеріалу. Смуги
з електрофореграми послідовно вирізали, а білковий матеріал елюювали з
поліакриламіду. Одержані фракції після концентрування білку діалізом
проти розчину поліетиленгліколя

1 2 3
4

Рис. 2. Електрофорез у поліакриламідному гелі (градієнт концентрації
7%-22%) в присутності ДСН: 1-супернатант непрогрітих лімфоцитів; 2-
маркери молекулярної ваги — 92,5 кДа; 67 кДа; 46 кДа; 30 кДа; 21,5
кДа; 14,3 кДа; 3- концентрований супернатант прогрітої суспензії
лімфоцитів перед застосуванням препаративного електрофорезу в нативних
умовах; 4- фотореактивний білковий матеріал після стадії препаративного
електрофорезу.

Рис. 3. Відновлення фотореактивності прогрітих лімфоцитів ізольованим
білковим матеріалом:

1 – нативні лімфоцити; 2 – лімфоцити, позбавлені фоточутливості після
термічної обробки;

3 – відновлення світлової чутливості лімфоцитів після повернення
цілісного супернатанту;

4 – відновлення фоточутливості лімфоцитів при внесенні ізольованого
білкового матеріалу.

На наступному етапі роботи білковий препарат із молекулярною масою
близько 67 кДа був напрацьований у кількості, достатній для дослідження
його фізико- хімічних властивостей. Зокрема, методом ізоелектричного
фокусування було визначено, що білковий препарат складається із двох
ізоформ з різними ізоелектричними точками- 4,7 та 4,9.

рІ 4,7

рІ 4,9

Рис. 4. Ізоелектричне фокусування фоточутливого білкового матеріалу.

Обидві ізоформи виявляють світлову чутливість, хоча (як з’ясувалось
пізніше) не зовсім однакову. Шляхом імунізації кролів були отримані
антисироватки як до нерозділеного препарату, так і до його ізоформ, що
дало змогу використовувати для досліджень метод твердофазного
імуноферментного аналізу ELISA.

Таблиця 1.

Фотореактивність білкового матеріалу нормальних

лімфоцитів за допомогою отриманих антисироваток
(ELISA).

Антисироватка до: А405 (контроль) А405 (опромінення

білку) Зміна зв’язування (% до контролю)

нерозділеного білку 0,35±0,01 0,39±0,02 112,25

білку із рІ 4,7 0,36±0,02 0,32±0,01 86,8

білку із рІ 4,9 0,41±0,02 0,49±0,02 121,92

Як видно з Табл. 1, при опроміненні виділеного фоточутливого матеріалу
гелій-неоновим лазером спостерігалось максимальне посилення імунної
реакції у разі використання антисироватки до білку із рІ 4,9. Реакція із
сироваткою до нерозділеного білку була слабшою. У варіанті з
антисироваткою проти білку з рІ 4,7 після лазерного опромінення
спостерігалось деяке послаблення імунної відповіді в порівнянні з
контрольними (неопроміненими) пробами.

»

$

&

(

?(

*

,

.

0

2

J

~

?

Oe0



O

”y

Oe0



O

O

$

O

$

O

hEBA

O

µ

O

O

O

O

O

µ

µ

O

O

O

µ

ультати вказували на високу гомологію обох зразків.

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 5. Електрофореграма білків, підданих обмеженому протеолізу: 1-
сироватковий альбумін людини; 2- трипсин; 3- обробка трипсином САЛ
протягом 5 хв; 4- маркери молекулярної маси 200 кДа, 97,4 кДа, 67 кДа,
46 кДа, 30 кДа, 21,5 кДа, 14,3 кДа; 5- обробка трипсином фоточутливого
білкового матеріалу 3 хв; 6- обробка трипсином фоточутливого білкового
матеріалу 5 хв; 7– фоточутливий білковий матеріал.

Таким чином, було встановлено, що апопротеїнова частина
світлосприймаючого комплексу лімфоцитів за рядом його фізико- хімічних
властивостей наближається до сироваткового альбуміну і досить щільно
зв’язана із поверхневою мембраною лімфоїдної клітини. Чутливість цієї
білкової молекули до видимого світла певних спектральних ділянок
свідчить на користь того, що її апопротеїнова компонента має бути
з’єднана із певною хромофорною групою. Для визначення природи цього
хромофору було проведено комплекс спектральних досліджень із
використанням методів диференційної абсорбційної та флуоресцентної
спектроскопії (рис. 6).

Рис. 6. Спектри флуоресценції фотореактивного білкового матеріалу: А-
флуорофор І-го типу; Б-

флурофор ІІ-го типу (1- лінія спектру збудження, 2- емісії).

Аналізуючи спектри флуоресценції дослідних зразків, було виявлено
присутність у них флуорофорів двох типів. Флуорофори першого типу (рис.
6, А) виявлялись при довжині хвилі збудження 289 нм та характеризувались
максимумом флуоресценції при 329 нм (що співпадає зі спектром
сироваткового альбуміну). Для флуорофорів другого типу (рис. 6, Б)
характерним було збудження при 425 нм та наявність максимума
флуоресценції біля 520 нм, що вказвало на присутність у білку додаткової
хромофорної структури. Разом із результатами, отриманими методом
диференційної абсорбційної спектроскопії, наведені спектральні
характеристики дозволили припустити тетрапірольну природу цієї
структури, що підтверджується, зокрема, схожими спектральними
властивостями альбумін- білірубінового комплексу.

Виходячи із одержаних даних щодо молекулярної природи світлової
чутливості лімфоцитів з крові здорових донорів, були проведені
порівняльні дослідження для з’ясування питання про можливі
фотобіологічні особливості злоякісних лімфоцитів з крові хворих на
хронічний В- клітинний лімфолейкоз. Показано, що фоточутливий білок
присутній і в лімфоцитах з крові від хворих на лейкоз. Була проведена
кількісна оцінка білкового матеріалу, що виділявся з лімфоцитів від
хворих на В- ХЛЛ, та нормальних лімфоцитів з крові здорових донорів.
Виявилось, що за рівних умов з лімфоцитів лейкозних хворих виділялося
значно менше фоточутливого білка, ніж з нормальних лімфоцитів. Так, щоб
одержати 1 мг білка з нормальних лімфоцитів, необхідно в середньому 1,3
х 108 клітин. А для отримання 1 мг фоточутливого білка від хворих на
хронічний В-клітинний лімфолейкоз потрібні 2 х 109 клітин. Таким чином,
лімфоцити, виділені з крові здорових донорів, очевидно, містять
приблизно у 15 разів більше доступного для виділення фоточутливого
білка, ніж лімфоцити від хворих на цю форму лейкозу.

Проведені досліди також показали, що імунологічні властивості
фоточутливого білкового препарату, виділеного з крові здорових донорів,
в значній мірі відрізнялися від зразків, отриманих з лімфоконцентрату
хворих на хронічний В- клітинний лімфолейкоз. При тестуванні за
допомогою трьох отриманих у роботі антисироваток реакція на світлове
опромінення у малігнізованих лімфоцитів мала протилежну спрямованість
порівняно з лімфоцитами здорових донорів (табл. 2).

Таблиця 2.

Зміна зв’язування антисироваток білковими препаратами із нормальних та

малігнізованих лімфоцитів при опроміненні низькоенергетичним червоним
світлом.

Антисироватка до: Зміна зв’язування антисироваток при опроміненні білку
(% до неопроміненого контролю)

Білок нормальних

клітин

Білок малігнізованих

клітин

нерозділеного білку 112,3 72,5

білку із рІ 4,7 86,8 86

білку із рІ 4,9 121,9 93

За своїми фізико- хімічними характеристиками білок, отриманий із
злоякісних лімфоцитів, виявився близьким до білку, виділеного з
нормальних лімфоцитів, хоча мав і певні відмінності, вірогідно, на рівні
конформаційних особливостей хромофорно- білкового комплексу. Зокрема,
було встановлено, що спектр флуоресценції білка, виділеного із
лімфоконцентрату хворих на хронічний В- клітинний лімфолейкоз (максимум
емісії 460 нм при максимумі у спектрі збудження 400 нм) відрізнявся від
спектра білкового матеріалу, отриманого із крові здорових донорів
наявністю максимума флуоресценції 520 нм при збудженні світлом з
довжиною хвилі 425 нм (рис.7).

А
Б

Рис. 7. Спектри флуоресценції фоточутливого матеріалу (А)-
малігнізованих лімфоцитів, та (Б)- лімфоцитів здорових донорів (1 —
спектр збудження, 2 — емісії).

Також вивчався вплив лазерного опромінювання на клітини двох лімфоїдних
ліній: Raji та Namalwa (В-клітинні лінії, одержані з лімфоцитів від
хворих з лімфомою Беркіта). При опроміненні гелій-неоновим лазером
розеткоутворююча активність з еритроцитами миші у лімфоцитів цих ліній
змінюється по-різному (Табл. 3).

Таблиця 3.

Вплив випромінювання гелій-неонового лазера на

М- розеткоутворюючу активність лімфоцитів клітинних ліній.

Клітинна лінія Розеткоутворення

початковий рівень(%) Розеткоутворення після опромінення (%) Зміна
розеткоутворення внаслідок опромінення (% від початкового рівня)

Raji 23,1±1,6 33,3±2,2 +44,1

Namalwa 31,6±0,9 25,1±1,5 -20,5

Клітини лінії Namalwa реагують на опромінення подібно лімфоцитам,
виділеним з крові хворих на хронічний В- клітинний лімфолейкоз, а саме —
зниженням розеткоутворення проти вихідного рівня. Лімфоїдні клітини
Raji, навпаки, демонструють позитивну динаміку розеткоутворення, схожу
на реакцію нормальних лімфоцитів.

Отже, в результаті проведених досліджень було встановлено, що лімфоцити
людини, як нормальні, так і малігнізовані, проявляють специфічну
спектрально-залежну чутливість до світлового випромінення видимої
області спектру. Було показано, що структура, яка реагує на опромінення,
розташована на поверхні мембрани і має хромопротеїдну природу.

ВИСНОВКИ

Було досліджено природу явища фоточутливості лімфоїдних клітин, виділено
і очищено білковий препарат, який опосередковує світлову чутливість, та
отримано дані відносно структури апопротеїнової та хромофорної частин
ізольованого хромопротеїду.

Показано, що лімфоцити периферичної крові здорових донорів виявляють
спектрально- залежну чутливість до видимого світла як когерентного, так
і некогерентного, яка може бути тестована за зміною експресії антигенів
CD2 та CD19.

Розроблені методичні підходи до виділення із лімфоцитів донорської крові
та очищення до електрофоретичної гомогенності фоточутливого
молекулярного агента, що опосередковує цю фоточутливість.

Встановлена білкова природа отриманого препарата, з’ясована його
молекулярна маса (67 кДа), визначені його альбуміноподібні властивості.

Методом ізоелектричного фокусування показано, що виділений білок існує у
двох ізоформах з рІ 4,7 та рІ 4,9.

Проведені спектроскопічні дослідження свідчать про тетрапірольну
структуру хромофорної частини фоточутливого білкового комплексу.

Показана наявність досліджуваного фоточутливого білка в лімфоцитах із
крові хворих на хронічний В- клітинний лімфолейкоз.

Світлове опромінення злоякісних лімфоцитів, отриманих із крові хворих на
В- клітинний лейкоз, приводить до пригнічення їх активності за умов, в
яких відбувається активізація лімфоцитів здорових донорів.

Малігнізовані клітини лінії Namalwa реагують на світлове опромінення
подібно лімфоцитам, виділеним із крові хворих на лейкоз, тоді як клітини
лінії Raji відповідають подібно нормальним лімфоцитам.

На підставі одержаних спектроскопічних даних зроблено припущення про
відмінності в структурі апопротеїнового компоненту дослідженого
хромопротеїду злоякісних лімфоцитів у порівнянні з нормальними.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Гамалея Н.Ф., Федорчук А.Г., Прокопенко И.В. Лазерная иммуномодуляция:
вовлечение клеточных путей сигнальной трансдукции // Фотобиология и
экспериментальная фотомедицина.-1999.-№ 1.-С. 44-49. (Особистий внесок
дисертанта: приймав участь в дослідах та обробці наукових даних,
написанні і оформленні статті).

Прокопенко І.В., Рудих З.М., Сусак Я.М., Гамалія М.Ф. До методики
визначення та отримання дельта — фракції білірубіну крові // Лабораторна
діагностика.- 2002.-№ 4.-С.45-48. (Особистий внесок дисертанта: проводив
експериментальні дослідження, обробив та оформив наукові результати).

Рудых З.М., Прокопенко И.В., Стадник В.Я., Скивка Л.М., Шишко Е.Д.,
Гамалея Н.Ф. Реакция системы крови доноров на внутривенное лазерное
облучение // Український журнал гематології та
трансфузіології.-2003.-№1.-С.23-27. (Особистий внесок дисертанта:
приймав участь у проведенні експериментальних досліджень, написанні і
оформленні статті).

Прокопенко І.В., Шишко Є.Д., Гамалія М.Ф. Фоточутливість лімфоцитів
людини // Український журнал гематології та трансфузіології.- 2004.-№6.-
С.24-26. (Особистий внесок дисертанта: виконав експериментальні
дослідження та обробив і оформив наукові результати).

Гамалія М.Ф., Рудих З.М., Федорчук О.Г., Шишко Є.Д., Прокопенко І.В.,
Поліщук Є.І. Низькоенергетичне лазерне випромінювання в корекції
гомеостазу / «Шляхи та перспективи розвитку експериментальної онкології
в Україні» під ред. Чехуна В.Ф.// Київ: ДІА, 2001.-С.203-211.

Прокопенко И.В., Кондричин И.Г., Гамалея Н.Ф. Действие лазерного
излучения на лимфоциты крови человека // Тез. докл. IV конф.
»Применение лазеров в медицине и биологии».-Львів- Київ, 1995.-С.5-6.

Кондричин И.Г., Прокопенко И.В. Изучение физико- химических свойств
фоточувствительного материала из лимфоцитов крови человека // Сб. докл.,
тез. и методик по лазерной медицине. – Киев, 1995.-С.65-66.

Прокопенко И.В., Гамалея Н.Ф., Кондричин И.Г. Получение и первичная
характеристика 70 кДа белка из лимфоцитов крови лейкозных больных //
Тез. докл. X Межд. конф. «Применение лазеров в медицине и биологии».-
Харьков, 1998.- С.10-11.

Сківка Л.М., Латиш Г.Г., Федорчук О.Г., Прокопенко І.В. Циркадіанні та
сезонні особливості активності природних кілерів у хворих на рак
молочної залози // Мат. І наук.-практ. конф. «Нове в медикаментозній
терапії раку молочної залози».- Київ, 1998.-С.73-74.

АНОТАЦІЯ

Прокопенко І.В. Чутливість нормальних та малігнізованих лімфоцитів до
світлового випромінювання видимої ділянки спектра. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 14.01.07 – онкологія. – Інститут експериментальної
патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України,
Київ, 2005.

Дисертацію присвячено вивченню дії оптичного випромінювання видимої
області спектра на нормальні та злоякісні лімфоцити людини.

В роботі показано, що лімфоцити, ізольовані із периферичної крові
здорових донорів, проявляють високу специфічну (спектрально-залежну)
чутливість до видимого, зокрема червоного, світла, як когерентного, так
і некогерентного. Встановлено, що ця чутливість зумовлена індивідуальною
сполукою, яка знаходиться на поверхневій мембрані клітин. Розроблені
методи виділення фоточутливої сполуки, та здійснена її очистка до
гомогенного стану. Сукупність проведених фізико-хімічних, біохімічних та
імунологічних досліджень дозволила встановити, що виділена фоточутлива
сполука є хромопротеїдом, апопротеїнова частина якого має
альбуміноподібну природу. Дані диференційно-абсорбційної та
флуоресцентної спектроскопії вказують на тетрапірольну структуру
хромофорної компоненти дослідженого білка.

Показано, що злоякісні лімфоцити, отримані з лімфоконцентрату
периферичної крові хворих на хронічний В-клітинний лімфолейкоз, і
малігнізовані клітини ліній Raji та Namalwa також здатні реагувати на
світлове випромінення, проте реакція лімфоцитів від лейкозних хворих має
протилежний напрям у порівнянні з лімфоцитами здорових донорів.
Фоточутливий білок, виділений із злоякісних лімфоцитів, за комплексом
фізико-хімічних, біохімічних та імунохімічних характеристик є близьким
до білка нормальних лімфоцитів, хоча отримані результати свідчать про
певні відмінності в їх апопротеїновій частині.

Ключові слова: нормальні та малігнізовані лімфоцити, хронічний
В-клітинний лімфолейкоз, клітинні лінії Raji та Namalwa, світлова
чутливість, альбуміноподібний білок, хромофор.

АННОТАЦИЯ

Прокопенко И.В. Чувствительность нормальных и малигнизированных
лимфоцитов к световому излучению видимой области спектра. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по
специальности 14.01.07 – онкология. – Институт экспериментальной
патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецького НАН Украины,
Киев, 2005.

Диссертация посвящена изучению влияния оптического излучения видимой
области спектра на нормальные и злокачественные лимфоциты человека.

В работе показано, что лимфоциты, изолированные из периферической крови
здоровых доноров, проявляют высокую специфическую
(спектрально-зависимую) чувствительность к видимому, в частности
красному, свету, как когерентному, так и некогерентному. Установлено,
что эта чувствительность обусловлена индивидуальным соединением,
которое связано с поверхностной мембраной клеток. Мягкое прогревание
клеточной суспензии ведет к отсоединению фактора фоточувствительности от
поверхности клеточной мембраны и переходу его в инкубационную среду.
Разработаны методы выделения фоточувствительного соединения, и
осуществлена его очистка до гомогенного состояния. Применение
электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) позволило определить
молекулярный вес соединения, который равен 67 кДа. В результате
использования метода изоэлектрического фокусирования было показано, что
исследуемое соединение состоит из двух изоформ с различными
изоэлектрическими точками – 4,7 и 4,9. Иммунизация кролей с последующим
получением антисывороток к фоточувствительным соединениям позволила
применять методы твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) и
электропереноса (Вестерн-блоттинг) для дальнейшей характеристики
образцов. Было показано, что изоформы фоточувствительного соединения
по-разному реагируют на облучение: иммунная реакция с антисывороткой 4,7
ослабевает на 13,2% по сравнению с необлученной, с антисывороткой 4,9
стимулируется на 21,9%, а с неразделенной антисывороткой стимулируетя на
12,3%. Комплекс проведенных физико-химических, биохимических и
иммунологических исследований позволил установить, что выделенное
фоточувствительное соединение представляет собой хромопротеид,
апопротеиновая часть которого имеет альбуминоподобную природу. Данные
дифференциально-абсорбционной и флуоресцентной спектроскопии указывают
на тетрапиррольную структуру хромофорной компоненты исследуемого белка.

Показано, что злокачественные лимфоциты, полученные из лимфоконцентрата
периферической крови больных хроническим В-клеточным лимфолейкозом, и
малигнизированные клетки линий Raji и Namalwa, также способны
реагировать на световое облучение, однако реакция лимфоцитов лейкозных
больных имеет противоположное направление по сравнению с лимфоцитами
здоровых доноров. Фоточувствительный белок, выделенный из
злокачественных лимфоцитов, по исследованным физико-химическим,
биохимическим и иммунологическим характеристикам близок к белку
нормальных лимфоцитов, хотя полученные результаты свидетельствуют о
некоторых различиях в их апопротеиновой части.

Ключевые слова: нормальные и малигнизированные лимфоциты, хронический
В-клеточный лимфолейкоз, клеточные линии Raji и Namalwa, световая
чувствительность, альбуминоподобный белок, хромофор.

SUMMARY

Prokopenko I.V. Sensitivity of normal and malignant human lymphocytes to
light irradiation in the visible range of spectrum. – Manuscript.

The thesis for a Degree of Candidate of Biological Sciences on
Speciality 14.01.07 – Oncology. – R.E.Kavetsky Institute of Experimental
Pathology, Oncology and Radiobiology NAS of Ukraine, Kyiv, 2005.

The dissertation is devoted to the study of the influence of optic
irradiation in the visible region of spectrum on normal and malignant
human lymphocytes.

The work demonstrates that lymphocytes isolated from peripheral blood of
healthy donors reveal high specific spectral-dependent sensitivity to
the visible (in particular – red) light, coherent as well as
noncoherent. It has been shown that such sensitivity is mediated by
individual compound placed on the surface cell membrane. The methods for
isolation of photosensitive compound were developed, and its
purification for homogenous purity has been performed. By combined
physicochemical, biochemical and immunological approach it has been
demonstarated that the isolated photosensitive compound is presented by
chromoproteid where apoprotein part possesses albumin-like nature. The
data of differential-absorbtion and fluorescent spectroscopy point on
the occurrence of tetrapyrrolic structure of chromophore component of
the studied protein.

It is shown that malignant lymphocytes isolated from lymphoid
concentrate of peripheral blood of patients with chronic B-cell
lympholeucosis, and malignant cells of Raji and Namalwa lines are also
able to react on light irradiation; however, the reaction of lymphocytes
of the patients with leucosis is opposite to that of lymphocytes of
healthy donors. Photosensitive protein isolated from malignant
lymphocytes possesses similar physicochemical, biochemical and
immunological characteristics to those of protein from normal
lymphocytes, but some differences in their apoprotein parts have been
revealed.

Key words: normal and malignant human lymphocytes, chronic B-cell
lympholeucosys, Raji and Namalwa cell lines, light sensitivity,
albumin-like protein, chromophore.

PAGE \* Arabic 22

А

Б

1

2

1

2

1 2

Похожие записи