НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О. В. ПАЛЛАДІНА

СКОК Марина Володимирівна

УДК 577. 27

Будова і функції нікотинових ацетилхолінових рецепторів в-лімфоцитів

03.00.04 – біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

Київ-2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України.

Науковий консультант — доктор біологічних наук, професор,

академік НАН України

КОМІСАРЕНКО Сергій
Васильович,

Інститут біохімії ім.
О.В.Палладіна НАН України,

директор інституту,
завідувач відділу

молекулярної імунології,

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

МАТИШЕВСЬКА Ольга Павлівна,

Київський національний
університет імені

Тараса Шевченка, професор
кафедри біохімії;

доктор біологічних наук,
професор,

член-кор. НАН України

ВЕСЕЛОВСЬКИЙ Микола
Сергійович,

Інститут фізіології ім.
О.О.Богомольця

НАН України, завідувач
відділу фізіології нейронних мереж;

доктор біологічних наук,

старший науковий
співробітник

МІНЧЕНКО Олександр
Григорович,

Інститут біохімії ім.
О.В.Палладіна НАН України,

завідувач відділу
молекулярної біології.

Провідна установа — Інститут експериментальної патології,
онкології і

радіобіології ім.
Р.Є.Кавецького НАН України,

лабораторія сигнальних
каскадів клітин.

Захист відбудеться 3 липня 2006 р. о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім.
О.В.Палладіна НАН України (01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії

ім. О.В.Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий 2 червня 2006 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук
Кірсенко О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Життєдіяльність організмів вищих тварин базується на гармонійній
взаємодії функціонально різних спеціалізованих систем. Прикладом є
нервова та імунна системи. Нервові клітини здатні до електричного
збудження, вони утворюються в ембріогенезі і посідають постійне місце в
головному і спинному мозку, автономних гангліях і сплетіннях. Лімфоцити,
напроти, утворюються постійно протягом життя, мігрують по організму і не
обмінюються електричними сигналами. Лімфоцити експресують унікальні
антиген-специфічні рецептори, різноманіття яких фактично відповідає
різноманіттю антигенів навколишнього середовища. За своєю складністю
імунна система наближається до нервової, яка теж генерує безліч типів
відповіді на базі обмеженої кількості типів клітин. В ході досліджень,
проведених в останні роки, було з’ясовано, що нервова і імунна системи
тісно пов’язані між собою і з ендокринною системою, утворюючи
функціональну нейро-імуно-ендокринну тріаду. Молекулярною основою такої
взаємодії є рецептори і медіатори, які використовують спільно всі три
системи. Так, нервові і імунні клітини мають рецептори до гормонів,
нервові і ендокринні клітини — до цитокінів, продукованих лімфоцитами, а
лімфоцити відповідають на медіатори нейронального походження, такі, як
ацетилхолін, ендорфіни, енкефаліни, речовина Р, а також адреналін і
норадреналін, і, відповідно, експресують рецептори до них. Вивчення
таких рецепторів допомагає зрозуміти механізми взаємозв’язку нервової та
імунної систем і спільні принципи їх функціонування.

Ацетилхолін продукується нервовими закінченнями холінергічних волокон,
які інервують первинні лімфоїдні органи – тимус і кістковий мозок. На
додаток, він синтезується самими лімфоцитами, тобто може бути їх
ауто/паракринним регулятором. Дія ацетилхоліну на клітини опосередкована
двома типами рецепторів: мускариновими і нікотиновими. Ми вибрали для
своїх досліджень рецептор нікотинового типу, тому що саме такі рецептори
опосередкують швидку синаптичну передачу в автономних гангліях, які
також були об’єктом нашої уваги. Крім того, вони є провідниками дії на
клітини нікотину, який потрапляє в організм людини при палінні тютюну,
тому вивчення ролі цих рецепторів в життєдіяльності лімфоцитів фактично
розкриває молекулярні механізми дії нікотину на імунну систему.

Нікотинові ацетилхолінові рецептори (нАХР) традиційно вивчали в м’язових
клітинах, пізніше – в нейронах центральної і автономної нервової
системи. За своєю будовою вони належать до суперродини іонних каналів,
що відкриваються лігандами, і складаються із п’яти однакових
(гомопентамери) або різних (гетеропентамери) субодиниць. В залежності
від комбінацій субодиниць нАХР мають різну фармакологічну чутливість,
іонну селективність і кінетичні характеристики каналу. В м’язових і
нервових клітинах нАХР виконують електропровідні функції, сприяючи
утворенню електричних потенціалів, і регулюють діяльність інших типів
рецепторів.

В останні роки з’являється все більше даних про наявність нАХР в
незбудливих тканинах: шкірі, епітелії дихальних шляхів, ендотелії судин
та клітинах крові. На відміну від нервових і м’язових клітин, в
незбудливих клітинах активація нАХР не призводить до електричного
збудження, а регулює базові клітинні функції, такі, як проліферація,
адгезія, міграція. Механізми функціонування нАХР в цих клітинах
остаточно не з’ясовано.

Функціональне значення нАХР для імунних процесів підтверджується
наявністю імунопатологій у людей і тварин, що вживають нікотин. На
початку наших досліджень в літературі існували дані про наявність нАХР в
Т-лімфоцитах і їх роль в імунних процесах, однак були практично відсутні
відомості стосовно В-лімфоцитів, які є головними провідниками
гуморального імунітету. Головним завданням нашої роботи стало визначити,
чи присутні нАХР в В-лімфоцитах, схожі вони чи відрізняються від
відповідних рецепторів нервових клітин і які функції виконують в імунній
системі.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано
у відділі молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна
НАН України протягом 1995-2005 рр. Дисертація безпосередньо зв’язана з
плановими дослідженнями відділу за бюджетними темами: „Дослідження
імунохімічної структури антигенів і розвитку імунної відповіді до них”
(1994 -1998), „Дослідження імунохімічної структури біологічно активних
білків та пептидів”, розділ ІІ „Вивчення будови та функцій нікотинових
та протеазо-активованих рецепторів на лімфоцитах”, ДР № 0104U003280
(1999 – 2003, 2004 – 2008) та „Протеомікс біологічно активних білків
людини, розробка методів одержання білків, важливих для діагностики і
лікування, розділ VIIІ – „Вивчення експресії нікотинових ацетилхолінових
рецепторів на лімфоцитах і їхньої ролі в нормі та за патологічних умов”,
ДР № 0102V006218 (2002 – 2006). Крім того, роботу було підтримано
міжнародними програмами Європейського співтовариства: РЕСО (грант
ERBCIPDCT940244): „Міастенія гравіс та моноклональні антитіла до
ацетилхолінового рецептору”, підрозділ „Моноклональні антитіла до
фрагментів нейронального нікотинового ацетилхолінового рецептору”
(1995-1997); INTAS-Ukraine (грант 0056): „Роль структури функціонально
важливих доменів в альфа-субодиницях різних нейрональних ацетилхолінових
рецепторів, що визначають їх фармакологію та фізіологічне значення”
(1997-2000); стипендії Олександра фон Гумбольдта (1998 – 1999), двох
стипендій EMBO (ASTF 9656 та 9953) за темою „Вивчення лімфоцитів у
мишей, нокаутних за генами альфа4, бета2 та альфа7 субодиниць
нікотинового рецептору” (2000-2003) та Українсько-французької програми
спільних досліджень „Дніпро” (договір М-115-2003) за темою „Структура і
функції нікотинових ацетилхолінових рецепторів В-лімфоцитів: потенційна
роль нікотину в імунітеті і канцерогенезі лімфоцитів” (2003-2004), а
також гранту УНТЦ-NASA (NN05) „Вплив мікрогравітації на клітини, що
продукують антитіла” (2002-2003). Відповідно, частину досліджень було
виконано дисертантом в лабораторії сигналингу лімфоцитів Інституту
Генетики Університету м. Кьольн, Німеччина, та у відділі рецепторів і
когніції Інституту Пастера в Парижі, Франція.

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи було визначення
наявності, субодиничного складу та функцій нАХР в В-лімфоцитах.

Для реалізації поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

Створити інструмент для вивчення – одержати функціонально активні
антитіла, специфічні до різних субодиниць нАХР.

За допомогою отриманих антитіл визначити субодиничну будову нАХР в
В-лімфоцитах та автономних гангліях різної локалізації.

Вивчити властивості та можливі функції нАХР в клітинних лініях
В-лімфоцитарного походження – мієломі та гібридомі.

Вивчити характер експресії нАХР та їх роль в процесах розвитку і
активації нормальних В-лімфоцитів.

Вивчити роль нАХР в процесах кровотворення.

Визначити значення нАХР, експресованого лейкоцитами периферичної крові,
як потенційного діагностичного маркера при хворобі Альцгеймера.

Об’єкт дослідження. Нікотиновий ацетилхоліновий рецептор, експресований
в нейронах автономних гангліїв та лімфоцитах.

Предмет дослідження. Субодинична будова та функції нАХР В-лімфоцитів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше виявлено експресію нАХР в
В-лімфоцитах за допомогою радіоактивних лігандів і отриманих нами полі-
та моноклональних антитіл, специфічних до певних субодиниць нАХР.
Антитіла, отримані проти синтетичних пептидів, специфічно зв’язуються з
відповідними ділянками різних субодиниць нАХР і блокують електропровідні
функції нАХР в нервових клітинах, тобто, фактично, є селективними
блокаторами різних за субодиничним складом субтипів нАХР.

Вивчено субодиничну будову нАХР В-лімфоцитів мишей. Показано, що як
трансформовані, так і нормальні В-лімфоцити експресують нАХР ??(????? і
?7(???4) субтипів. За своїми властивостями нАХР лімфоцитів схожі на
рецептори нервових клітин: нікотин впливає на кількість рецепторів,
представлених на мембрані, вони підлягають десенситизації за підвищення
концентрації внутрішньоклітинного кальцію, а передача сигналу всередину
клітини потребує відкриття іонного каналу.

Вперше проведений порівняльний аналіз субодиничної будови нАХР
В-лімфоцитів і нейронів автономних гангліїв. Показано, що головним
субтипом нАХР верхнього шийного та інтракардіального гангліїв щура і
нижнього брижового ганглію та підслизового сплетіння морської свинки є
??????????????-вмісні нАХР локалізовано переважно на нейронах
спеціальної морфологічної будови, а експресія ??-вмісних нАХР суттєво
відрізняється в гангліях різної локалізації, причому рецептори
останнього субтипу можуть бути як гомомерними, так і гетеромерними, і
виконувати регуляторні функції.

За допомогою одержаних моноклональних антитіл визначено амінокислотні
залишки, критичні для утворення епітопу, а також будову відповідної
ділянки нАХР. Показано, що фрагмент 181-192 ?3 субодиниці нАХР у складі
нативного рецептора має витягнуту конформацію.

Визначено роль нАХР в життєдіяльності клітинних ліній В-лімфоцитарного
походження. Показано, що в клітинах гібридом активація нАХР стимулює
проліферацію і опосередковано впливає на кількість продукованих антитіл.

Вперше визначено роль нАХР в розвитку нормальних В-лімфоцитів і розкрито
механізм участі нАХР в формуванні репертуару їх специфічностей.
Знайдено, що обидва субтипи нАХР сприяють виживанню нормальних
В-лімфоцитів в кістковому мозку, обмежуючи процеси відбору і сприяючи
розширенню імунного репертуару. Показано, що субтипи нАХР подібним чином
опосередкують і розвиток Т-лімфоцитів в тимусі. На відміну, розмір
популяцій зрілих Т- і В-лімфоцитів контролюється нАХР тільки ?7 субтипу.
Це дає підставу вважати, що саме рецептори субтипу ??(?????
опосередкують нервову регуляцію імунопоезу, в той час, як ?7-вмісні
рецептори переважно відповідають на ацетилхолін не-нейронального
походження.

Визначено роль нАХР В-лімфоцитів в регуляції імунної відповіді.
Знайдено, що рецептори субтипу ??(????? стримують активацію зрілих
В-лімфоцитів і, відповідно, обмежують гуморальну імунну відповідь.
Молекулярний механізм такого впливу пов’язаний з регуляцією кількості
антиген-специфічних рецепторів та костимуляторних молекул CD40. Таким
чином, вперше показано, що експресія і активація нАХР пов’язані з
експресією і функціонуванням головних активаційних молекул В-лімфоцитів.

Вперше показано роль нАХР в процесах кровотворення. Визначено, що як
?7-, так і ?4??-вмісні нАХР експресовано на попередниках мієлоїдного і
еритроїдного рядів клітин крові, причому, подібно до лімфоцитів,
присутність ?4?? нАХР є характерною для ранніх стадій їх
диференціювання, в той час, як зрілі форми експресують переважно
?7-вмісні рецептори. Останні регулюють утворення і дозрівання
попередників моноцитів і гранулоцитів, а нАХР ??-вмісного субтипу
впливають на розвиток попередників клітин червоного ряду.

Вперше продемонстровано, що при хворобі Альцгеймера зменшується
кількість нАХР в лейкоцитах периферичної крові і причиною такого
зменшення можуть бути автоімунна відповідь на нАХР.

Практичне значення роботи. Одержані результати свідчать про те, що
нікотинові рецептори відіграють важливу роль в процесах розвитку і
активації В-лімфоцитів. Фактично, вони розкривають молекулярний механізм
дії нікотину на утворення репертуару В-лімфоцитів і гуморальну ланку
імунної відповіді. Згідно з отриманими даними, нікотин сприяє
проліферації/виживанню попередників В-лімфоцитів, що розширює
потенційний спектр їх специфічностей, але пригнічує продукцію
сироваткових ІgG, тобто імунну відповідь на антигени оточення. Це
означає, що паління тютюну знижує опір організму потенційним інфекціям
на рівні В-лімфоцитів і одночасно сприяє автоімунним і В
лімфопроліферативним захворюванням. Крім того, наші дані вперше
показують, що нікотин, який потрапляє в організм при палінні, впливає на
процеси кровотворення.

Практичне значення мають результати про те, що нейродегенеративне
захворювання (хвороба Альцгеймера), для якого показано зниження
кількості нАХР в мозку, супроводжується також зниженням кількості цих
рецепторів на лейкоцитах периферичної крові. Це означає, що визначення
нАХР на клітинах крові може бути не-інвазійним діагностичним тестом, а
наявність автоантитіл проти нАХР в плазмі крові — одним із факторів
ризику і, можливо, показником етіології хвороби Альцгеймера.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота – завершене дослідження,
виконане автором відповідно до програми експериментальних досліджень,
спланованих, проведених і узагальнених протягом 1995-2005 рр.
Дисертантом особисто обґрунтовано концепцію роботи, розроблено
методологію експериментальних досліджень, зроблено пошук та аналіз даних
літератури, проведено науковий аналіз експериментальних даних,
сформульовано основні положення та висновки. Автором особисто одержані
результати досліджень, що викладені у підрозділах 3.1, 3.5 – 3.7: 3.1 –
в Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, 3.5 – 3.7 – в
Інституті Пастера в Парижі. Підрозділ 3.2 виконано у співробітництві з
лабораторією макромолекулярної фізики та хімії Політехнічної школи м.
Нансі, Франція (експерименти з двомірного ядерного магнітного резонансу
з використанням отриманих автором антитіл проводив д-р Р.Вандерессе);
підрозділ 3.3 – у співробітництві з відділом фізіології вегетативної
нервової системи Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України
(цитохімічні дослідження з використанням отриманих автором антитіл
проведено д-ром Л.Войтенко, електрофізіологічні – д-рами С.Войтенко,
С.Глушаковим, О.Пурнинь, О.Коваль та О.Грігоровим); підрозділи 3.4 і 3.9
– у співробітництві з молодшим науковим співробітником Л.М.Коваль
(Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна); підрозділи 3.1.3 і 3.5.2 — з
молодшим науковим співробітником О.Ю.Лихмус (Інститут біохімії ім.
О.В.Палладіна). В підрозділі 3.8 морфологічний аналіз відбитків
кісткового мозку, селезінки і мазків крові, підготовлених автором,
проведений доктором біологічних наук А.С.Зверковою (Інститут гематології
та трансфузіології МОЗ України). Синтез пептидів нАХР був проведений
співробітниками Еллінського Інституту Пастера (Афіни, Греція), відділу
хімії Університету м. Іоанніни (Греція) і лабораторії нейропептидних
рецепторів Інституту біоорганічної хімії ім. Шемякіна-Овчіннікова РАН
(Москва, Росія), рекомбінантний екстраклітинний домен ?? субодиниці
одержано з Еллінського Інституту Пастера. Зразки крові хворих на хворобу
Альцгеймера і здорових людей відповідного віку надано доктором медичних
наук Н.Ю.Бачинською (Інститут геронтології АМН України).

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень було оприлюднено
на наукових семінарах Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України
(1999 — 2004 рр.), сесії Відділення молекулярної біології, біохімії,
експериментальної та клінічної фізіології НАН України (2004 р.), VIII
Українському біохімічному з’їзді (м. Чернівці, 2002 р.), Третій
Українській конференції з перспективних космічних досліджень (Кацивелі,
Крим, 2003 р.), Першому (Інагураційному) Українському з’їзді з клітинної
біології (Львів, 2004 р.), а також на 17th Summer Meeting on Molecular
Biology “Immuno-Neuro-Endocrine Interactions”, ( Пенн Стейт, США, 1998
р.), 5th IUBMB Conference on the Biochemistry of Health and Diseases,
(Єрусалим, Ізраїль, 1998 р.), міжнародній конференції “Neuronal
Nicotinic Receptors: From Structure to Therapeutics “, (Венеція, Італія,
1999 р.), John Humphrey Advanced Summer Programme and Lecture Series in
Immunology (Пущино, Росія, 2000 р., 2002 р.), 26th European Peptide
Symposium, (Монпельє, Франція, 2000 р.), Конференції “Membranes and
Signaling”, (Київ, 2000 р.), ESN Conference on “Advances in Molecular
Mechanisms of Neurological Disorders”, (Перуджа, Італія 2001), 4th and
5th Parnas Conferences (Вроцлав, Польща, 2002 р. і Київ, 2005 р.), 12th
International Congress of Immunology and 4th Annual Conference of FOCIS,
(Монреаль, Канада, 2004 р.), XXth Congress of the International Society
on Thrombosis and Haemostasis, (Сідней, Австралія, 2005 р.) та
International Workshop “New Insights in Cell proliferation, Autophagy
and Apoptosis: Fundamental and Medical Aspects”, (Одеса, 2005 р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 39 друкованих праць, з них
один підручник, статей в періодичних наукових спеціальних виданнях
України, що включені в перелік, затверджений ВАК України, та міжнародних
наукових журналах – 22, тез доповідей — 16 .

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 299 сторінках
друкованого тексту і складається з вступу, огляду літератури (14
підрозділів), експериментальної частини, що включає розділ „Матеріали і
методи досліджень” (10 підрозділів), „Результати досліджень” (9
підрозділів) та „Обговорення результатів” (5 підрозділів), а також
заключення, висновків, списку використаної літератури (359 найменувань),
містить 13 таблиць, 88 рисунків, 256 сторінок основної текстової
частини.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури

В огляді літератури детально висвітлено сучасні дані про структуру
молекули та функції нАХР в центральній і автономній нервовій системі.
Представлено дані щодо ролі нАХР в утворенні нікотинової залежності та в
патогенезі нейродегенеративних захворювань. Також наведено дані про
наявність і функції нАХР в незбудливих клітинах, включаючи Т-лімфоцити,
і обґрунтовано доцільність досліджень, проведених в ході виконання
дисертаційної роботи.

Матеріали і методи

Антитіла проти ? і ? субодиниць нАХР отримували шляхом імунізації кролів
і мишей синтетичними фрагментами ??????????), ??(181-192), ??(180-191),
??(179-190), ??(190-200), ??(189-199), кон’югованими до гемоцианіну.
Гібридоми одержували за описаною методикою (Harlow and Lane, 1989).
Антитіла виділяли із сироватки крові та культуральної рідини афінною
хроматографією на відповідних пептидах, імобілізованих на АН-сефарозі.
Визначення специфічності та афінності антитіл проводили методом
сорбційного імуноферментного аналізу (ІФА).

Цитохімічне забарвлення як щойно виділених, так і культивованих нейронів
автономних гангліїв проводили антитілами проти субодиниць нАХР, які
проявляли пероксидазним кон’югатом антитіл проти імуноглобулінів кроля
або миші. Альтернативно, антитіла проти нАХР кон’югували з біотином, і
їх зв’язування виявляли авідином, міченим ізотіоцианатом флуоресцеїну
(ФІТЦ). Відповідно, клітини аналізували під світловим або флуоресцентним
мікроскопом.

Електрофізіологічні дослідження. Мембранні струми та потенціали,
викликані аплікацією ацетилхоліну, вивчали методом „петч-клемп” в
конфігурації ціла клітина. Синаптичну відповідь в нейронах нижнього
брижового ганглію вивчали подразнюючи пре-гангліонарний нерв
прямокутними поштовхами деполяризуючого струму, відповідь оцінювали з
використанням стандартної методики внутрішньоклітинного відведення
потенціалів.

Експресію та субодиничний склад нАХР в лімфоцитах вивчали шляхом
зв’язування радіоактивних лігандів: 3Н-епібатидину і 125І-?
-бунгаротоксину, — а також антитіл проти субодиниць нАХР. Нормальні В
лімфоцити виділяли шляхом магнітного сортування. Зв’язування антитіл
оцінювали за допомогою клітинного ІФА або протокової цитофлуориметрії.

Афінне виділення ?4 субодиниці нАХР із мозку та селезінки щурів
проводили на антитілах проти ?4 субодиниці, імобілізованих на
АН-сефарозі перйодатним способом. Вуглеводний склад виділеної субодиниці
вивчали методом лектин-блотів з використанням біотинільованих лектинів,
специфічних до вуглеводних залишків різної природи.

Культивування клітин проводили в поживному середовищі RPMI 1640 з
додаванням 20 мМ L-глютаміну, 50 мкг/мл гентаміцину та 10% ембріональної
сироватки теляти. Проліферацію клітин оцінювали підрахуванням кількості
живих клітин в гемоцитометрі за допомогою трипанового синього або
фотометричним методом, за включенням тріазолілу блакитного.

Мишей, нокаутних за генами ???????та ?? субодиниць нАХР, утримували і
аналізували в Інституті Пастера в Парижі. Химерних мишей одержували
шляхом ін’єкції суміші клітин кісткового мозку мишей дикого типу і
нокаутних в опромінених реципієнтів дикого типу. Співвідношення клітин
різного походження у химерних мишей оцінювали за наявністю алотипічного
маркеру Ly 5.1 або Ly 5.2. Розмір клітинних субпопуляцій в кістковому
мозку, селезінці та тимусі мишей і експресію клітинних маркерів вивчали
методом протокової цитофлуориметрії з використанням біотинільованих
антитіл проти субодиниць нАХР, а також антитіл проти маркерів
диференціювання лімфоцитів, мічених флуоресцентними барвниками.

Кількість сироваткових імуноглобулінв та природних антитіл, а також
антитіл проти цитохрому с в сироватці крові мишей після імунізації
визначали методом сорбційного імуноферментного аналізу, а кількість
клітин, що продукують антитіла в селезінці, — методом імуноферментних
відбитків на планшетах, вкритих відповідними антигенами або антитілами
проти IgM та IgG.

Активацію В-лімфоцитів в культурі визначали за включенням 3Н-тимідину
після додавання антитіл проти CD40. Збагачення популяції В-лімфоцитів
проводили шляхом магнітного сортування на колонках Milteniy Biotech з
використанням магнітних кульок, кон’югованих з антитілами проти маркерів
CD43 (негативна селекція) або CD45R (B220) (позитивна селекція).

Лейкоцити периферичної крові людей виділяли центрифугуванням в градієнті
щільності фіколу. Їх адсорбували в лунках полістирольних планшетів
шляхом висушування при 37оС і аналізували методом клітинного ІФА з
антитілами проти субодиниць нАХР. Паралельно зразки плазми крові
аналізували на наявність антитіл проти нАХР методом звичайного
сорбційного ІФА, де як адсорбований антиген використовували
рекомбінантний екстраклітинний фрагмент ?4 субодиниці нАХР.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Отримання та характеристика антитіл проти синтетичних пептидів нАХР.
Оригінальність нашого підходу полягала в тому, що антитіла повинні були
поєднувати в собі високу селективність до гомологічних субодиниць нАХР і
функціональну активність. Дизайн антигенних пептидів було проведено за
відомою амінокислотною послідовністю ???????????????????та??? субодиниць
нАХР щура. Для синтезу було обрано фрагменти альфа-субодиниць, які
містили залишок цистеїну в положенні 192 (191 і 189 для субодиниць ?5
і??7, відповідно) та залишок тирозину в положенні 190 (188 для
субодиниці ?7). За даними численних досліджень, ці залишки входять до
складу сайту зв’язування ацетилхоліну. Фрагменти бета-субодиниць було
обрано за гомологічним положенням в послідовності і, відповідно,
розташуванням в будові нАХР. Як видно із таблиці 1, обрані фрагменти
різних субодиниць також суттєво відрізнялись за амінокислотним складом.

Таблиця 1.

Амінокислотні послідовності використаних синтетичних пептидів.

?? (181-192) APGYKHEIKYNC

???(181-192) AVGTYNTRKYDC

???(180-191) AMGSKGNRTDSC

???(179-190)

?2 (190-200)

?4 (189-199) IPGKRNEKFYEC

GRRNENPDDST

GRRTVNPQDPS

З метою підвищення імуногенності синтетичні пептиди було кон’юговано до
білкових носіїв: гемоцианіну равлика і бичачого сироваткового альбуміну,
— за допомогою глютарового альдегіду. Цей метод кон’югації виявився
кращим у порівнянні з використанням N-сукциніміділ 3-(2-піридилдітіо)
пропіонату, оскільки забезпечував більшу щільність пептидних епітопів на
поверхні білка та не викликав утворення антитіл проти сайту кон’югації.
Миші і кролі, імунізовані кон’югатами пептид-гемоцианін, продукували
антитіла, які зв’язували відповідний пептид, кон’югований до альбуміну,
і не впізнавали пептиди гомологічних субодиниць. Потенціальну перехресну
реактивність сироваткових антитіл було зведено до мінімуму після їх
афінного очищення на імобілізованих пептидах.

Відповідно, моноклональні антитіла, отримані до фрагментів ???і???
субодиниць, впізнавали свої антигенні пептиди, але не фрагменти інших
субодиниць (Рис.1).

Кролячі, афінно очищені антитіла проти пептидів бета-субодиниць також
вибірково зв’язували свої антигенні пептиди і не впізнавали фрагментів
інших субодиниць (Рис.2).

Зв’язування анти-пептидних антитіл з нативним нАХР на нервових клітинах.
Щоб з’ясувати, чи зв’язуються антитіла, отримані проти пептидних
фрагментів, з нативним рецептором, було використано клітини
феохромоцитоми РС-12, а також культивовані клітини автономних гангліїв,
які експресують нАХР різних субтипів. Методом протокової
цитофлуориметрії було показано, що клітини РС-12, які, як відомо із
літературних джерел, експресують ???????та??? субодиниці нАХР,
зв’язували антитіла проти пептидів ??(181-192), ?5(180-191),
?7(179-190) і не зв’язували антитіла проти пептиду ?4(181-192).

Культивовані клітини верхнього шийного ганглію щура, які також
експресують ??,????та??? субодиниці, демонстрували позитивне забарвлення
в цитохімічних експериментах з мАт 1D6 (Рис. 3, А), мАт 1Е10 та
кролячими антитілами проти пептиду ?? субодиниці. На відміну, антитіла
проти фрагменту??4(181-192) мітили клітини, які за своїми морфологічними
ознаками відрізнялись від нейронів, позитивних за міткою інших антитіл
(рис. 3, Б).

Оскільки антитіла було отримано проти фрагменту, який містив елементи
сайту зв’язування ацетилхоліну, ми очікували, що вони будуть конкурувати
з ацетилхоліном і зменшувати його вплив на клітини. Дійсно, мАт 1D6
дозозалежно знижувало амплітуду струмів, індукованих ацетилхоліном, в
недисоційованих нейронах верхнього шийного ганглію щура; ефект
розвивався досить швидко і був майже не оберненим. Послідовне додавання
антитіл проти фрагментів різних субодиниць викликало додаткове зменшення
амплітуди мембранного струму кожним наступним антитілом (Рис. 4).

Ці дані свідчили на користь того, що антитіла, отримані проти пептидних
фрагментів нАХР, впізнають нативний рецептор, експресований на нервових
клітинах, розрізняють субодиниці рецептору і, завдяки своїй
функціональній активності, фактично є селективними блокаторами різних
субтипів нАХР. Такий висновок дозволив нам використати ці антитіла для
вивчення особливостей будови рецептору як такого, а також субодиничного
складу нАХР в нейронах автономних гангліїв і лімфоцитів.

Особливості будови нАХР, з’ясовані за допомогою антитіл проти пептидів
альфа- і бета-субодиниць. Дослідження взаємодії моноклональних антитіл
1D6 та 1Е10 з похідними пептидів ?3(181-192) і ?5(180-191), в яких
амінокислотні залишки почергово заміщали на залишки аланіну, дозволило
визначити залишки, що утворюють епітоп. В пептиді ??(181-192) найбільш
важливими для зв’язування антитілом 1D6 виявились залишки His-6 (186),
Pro-2 (182) та Asn-11 (191). В пептиді ?5(180-191) до складу епітопу
увійшли залишки Lys-5(184), Thr-9(188), Arg-8(187) та Ser-11(190). Таким
чином, для обох вивчених пар пептид-антитіло критичні для зв’язування
амінокислотні залишки знаходились в центральній частині пептиду.
Конформацію пептиду ??(181-192) в присутності антитіла 1D6 було вивчено
методом двомірного ядерного магнітного резонансу. Як показано на рис.5,
антитіло стабілізувало пептид у витягнутій конформації, причому
С-кінцева частина була більш жорсткою, ніж N-кінець. Було зроблено
висновок, що принаймні залишки 6-11 (186-191) пептиду знаходяться у
безпосередньому контакті з антитілом. Це співпадало із даними вивчення
похідних пептидів, а також із знаходженням імунодомінантних залишків
пептиду ?5(180-191).

Оскільки антитіла впізнавали пептид ?3(181-192) у складі нативного
рецептору, було припущено, що відповідний фрагмент нАХР також має
витягнуту конформацію. Це припущення знайшло підтвердження у зробленому
згодом рентгенструктурному аналізі ацетилхолін-зв’язуючого білка молюска
Limnea stagnalis, який є аналогом позаклітинного домену нАХР. Згідно із
моделлю, створеною на основі цього аналізу, фрагмент ?3(181-192) входить
до складу стрічки ?9 і дійсно має витягнуту вторинну і третинну будову
(Brejk et al., 2001).

На препаратах підслизового сплетіння морської свинки зв’язування антитіл
проти фрагменту ?7(179-190) в цитохімічних експериментах блокувалось
метиллікаконітином – специфічним блокатором ?7-вмісних нАХР. Це
дозволило дійти висновку, що сайт зв’язування метиллікаконітину включає
амінокислотні залишки фрагменту ?7(179-190).

Важливим результатом, отриманим в електрофізіологічних дослідженнях,
була здатність антитіл проти фрагментів ?5 і ?4 субодиниць блокувати
мембранні струми, індуковані ацетилхоліном, і пост-синаптичні
потенціали, викликані подразненням пре-гангліонарного нерва. Ці
субодиниці не містять сайтів зв’язування ацетилхоліну, а ?5 субодиниця
навіть не є сусідньою з цим сайтом. Функціональну активність антитіл в
цьому випадку можна було пояснити лише обмеженнями, які зв’язування
антитіла накладало на конформаційні зміни, що відбуваються при активації
рецептору. Як витікає із структурних моделей функціонування нАХР, при
відкритті іонного каналу всі п’ять субодиниць пентаметру повертаються
проти годинникової стрілки, в результаті чого діаметр центральної пори
збільшується. Блокувальна активність антитіл проти структурних
субодиниць, виявлена в наших експериментах, свідчить про важливість цих
субодиниць в функціонуванні рецептору і підтверджує гіпотезу про різні
конформаційні стани нАХР в процесі відкриття каналу.

Вуглеводний компонент і його роль для утворення нативної конформації
нАХР. Нікотиновий рецептор має декілька потенційних сайтів N- і
О-глікозилювання в N-кінцевому позаклітинному домені ??субодиниць, де
знаходяться також сайти зв’язування агоністів та конкурентних
антагоністів (Paterson and Nordberg, 2000). Дані про вуглеводний склад
нейрональних нАХР в літературі відсутні. Між тим, саме пост-трансляційні
модифікації могли б визначати особливості функціонування нАХР одного й
того ж підтипу в нервовій та імунній системах. Тому ми поставили
завдання порівняти склад вуглеводних залишків в ?4 субодиниці нАХР,
виділеній із мозку або селезінки щурів. Дослідження показали, що у
складі ?4-субодиниці нАХР знаходяться залишки галактози і
N-ацетилгалактозаміну, глюкози і N-ацетилглюкозаміну, манози і фукози,
приєднані до поліпептидного ланцюга N-глікозидними зв’язками, а також
залишки галактози, приєднані О-глікозидним зв’язком. В імуноблотінгу
визначаються дві ізоформи ?4-субодиниці, що відрізняються за складом
вуглеводних залишків і, вірогідно, відповідають різним ступеням
пост-трансляційних модифікацій. Оскільки залишки галактози
(N-ацетилгалактозаміну) визначались в обох ізоформах, можна вважати, що
саме вони першими приєднуються до аспарагінових залишків білкового
ланцюга. Пізніше галактозні компоненти ускладнюються залишками глюкози,
манози і фукози. Таким чином, ми вперше визначили якісний склад
вуглеводних залишків, що входять до складу ?4-субодиниці нАХР, і
продемонстрували наявність О-глікозилювання цього білка. Очевидно, що
немає суттєвої різниці в якісному складі вуглеводів, які глікозилюють
?4-субодиниці із мозку і селезінки. Можливо, різниця виявляється у
кількісному співвідношенні вуглеводних залишків, але з’ясування цього
питання потребує більш детальних досліджень.

Будова і розташування нАХР на нейронах автономної нервової системи.
Використання отриманих нами антитіл в імуноцитохімічних та
електрофізіологічних експериментах дозволило визначити субодиничний
склад і особливості розташування нАХР на нейронах декількох автономних
гангліїв: верхнього шийного та інтракардіального гангліїв щура і
нижнього брижового ганглію та підслизового сплетіння кишківника морської
свинки. Найбільш поширеними в усіх гангліях виявились ??-????- і
??-субодиниці, для нижнього брижового ганглію було також визначено
наявність ??-субодиниці. Ці дані було підтверджено електрофізіологічними
дослідженнями: антитіла, які зв’язувались з нейронами певних гангліїв,
були здатні модулювати мембранні струми, індуковані ацетилхоліном, або
збуджуючі пост-синаптичні потенціали, викликані подразненням
пре-гангліонарних нервів. Було з’ясовано, що нейрони всередині ганглію і
між гангліями різної локалізації відрізнялись за своїми морфологічними
ознаками і, відповідно, експресували різні набори нАХР. Зокрема,
субодиничний склад нАХР великих (діаметром близько 50 мкм) гангліонарних
нейронів відрізнявся від такого в дрібних (6-18 мкм) клітинах. В
верхньому шийному і інтракардіальному гангліях дрібні клітини зв’язували
антитіла проти ?4-субодиниці, в нижньому брижовому ганглії – антитіла
проти ?4- і ?7-субодиниць.

Послідовна аплікація антитіл проти різних субодиниць в цитохімічному
пофарбуванні і в електрофізіологічних дослідженнях дозволила визначити
взаємне розташування цих субодиниць на клітині. Так, всі клітини
верхнього шийного ганглію несли подвійну мітку при використанні пар
антитіл проти пептидів ?3, ?5 і ?7 субодиниць. Це означало, що
відповідні субодиниці входять до складу різних рецепторів, розташованих
досить далеко один від одного, або знаходяться у складі одного
рецептору, але з різних боків пентаметру, як, наприклад, ?3 і ?5
субодиниці. Однак послідовне використання пари антитіл проти ?3- і
?5-субодиниць в електрофізіологічних експериментах показало, що вони
дають додатковий ефект. Це означало, що субодиниці входять до складу
різних рецепторів, тобто є рецептори, що містять ?5-субодиниці, але не
містять ?3-субодиниці. За нашими даними, ?5-субодиниця могла входити до
складу гетеромерного рецептору ?7?5. В нейронах підслизового сплетіння
морської свинки, напроти, послідовна аплікація антитіл проти ?3- і
?5-субодиниць не давала додаткового ефекту в електрофізіологічних
дослідженнях. Це ясно вказувало на те, що в цих клітинах ?3- і
?5-субодиниці об’єднані в один головний субтип рецептору. Подвійне
забарвлення антитілами проти ?5- і ?7- субодиниць у комбінації з
метиллікаконітином виявило в нейронах підслизового сплетіння наявність
трьох субтипів нАХР: гетеромерного ?3?5 (подвійна мітка для ?5- і
?7-специфічних антитіл, низька чутливість до МЛА); гомомерного ?7
(подвійна мітка для ?5- і ?7-специфічних антитіл, висока чутливість до
МЛА) і гетеромерного ?7?5 (конкуренція антитіл проти ?5- і
?7-субодиниць, висока чутливість до МЛА). Таким чином, в нейронах
підслизового сплетіння морської свинки вперше було показано наявність
гетеромерних ?7- вмісних нАХР, які раніше було визначено у верхньому
шийному (Cuevas and Berg, 1998) і інтракардіальному (Kirchgessner and
Lin, 1998) гангліях щура за їх фармакологічною чутливістю та швидкістю
десенситизації. Загалом, субтипи нАХР, знайдені нами в нейронах
автономних гангліїв, представлено в таблиці 3.

Широкий спектр знайдених субтипів нАХР, природно, ставив питання про
доцільність такого різноманіття і функції окремих субтипів. За
літературними даними, вони відрізняються за своїми кінетичними
властивостями і фармакологічною чутливістю, але знайти зв’язок між
субтипами нАХР і фізіологічними функціями, які вони опосередковують,
досі не вдається. Використання нашого експериментального підходу, який
об’єднував структурний і функціональний аналіз, дозволило зрозуміти
деякі деталі функціонування певних субтипів нАХР в автономних гангліях.

Таблиця 2.

Субтипи нАХР (переважно, за комбінаціями альфа-субодиниць),
представлені в нейронах автономних гангліїв.

Тип ганглію Представлені субтипи нАХР

Верхній шийний ????????????????????? (?? — на дрібних клітинах)

Інтракардіальний ????????????????????? (більшість клітин – дрібні)

Нижній брижовий ?????? (?? і ?7 – на дрібних клітинах)

Підслизове сплетіння ????????????????

По-перше, ми показали, що один і той самий нейрон ганглію, як правило,
експресує декілька субтипів нАХР. Використання в функціональних тестах
блокувальних антитіл, специфічних до різних субодиниць нАХР, дозволило
нам визначити внесок кожного субтипу в загальну клітинну відповідь. Так,
у верхньому шийному ганглії максимальне пригнічення амплітуди мембранних
струмів, індукованих ацетилхоліном, викликали антитіла проти
??-субодиниці (до 80%), тобто очевидно, що ??-вмісний субтип нАХР був
головним в реалізації мембранної провідності під дією ацетилхоліну в
цьому ганглії. Натомість, в підслизовому сплетінні ??-специфічні
антитіла пригнічували мембранні струми всього на 24%, а головним
субтипом був ?3?5, який відповідав за 60-65% провідності. В нижньому
брижовому ганглії суперфузування препарату розчином, що містив суміш ?3-
і ?5-специфічних антитіл, повністю усувало синаптичні відповіді
нейронів, тобто синаптичну передачу було опосередковано виключно ?3?5
субтипом нАХР. Додавання ж до розчину антитіл проти ?? субодиниці або
метиллікаконітину – специфічного блокатору ??-вмісних нАХР — призводило
до збільшення синаптичної відповіді! При цьому, як зазначалось вище, ??
субодиниця була представлена не на головних гангліонарних нейронах, від
яких проводили реєстрацію відповіді, а на дрібних клітинах, які
оточували великі нейрони. Це означало, що в нижньому брижовому ганглії
??-вмісні нАХР локалізовані поза-синаптично і їх блокування призводить
до полегшення синаптичної передачі, тобто в фізіологічних умовах такі
рецептори виконують гальмівну роль.

Отримані нами дані свідчать про те, що кожен із обстежених гангліїв має
індивідуальний склад нейронів і, відповідно, набір нАХР. Загальним для
всіх гангліїв є присутність субтипу ?3?5(??). Найбільші розбіжності
стосуються ?4- і ??-вмісних нАХР, які часто локалізовані на окремих
типах клітин. Навіть в межах одного ганглію внесок окремих субодиниць
суттєво різнився від нейрону до нейрону, що вказувало на функціональну
гетерогенність нейронів всередині ганглію. Представлені дані дають
підставу вважати, що кожний субтип нАХР має спеціальне функціональне
навантаження і набір експресованих субтипів певним чином відображає
функціональні особливості нейронів і гангліїв.

Автономні ганглії є „проміжними станціями”, що передають сигнали від
центральної нервової системи до периферичних органів: гладеньких м’язів
і залоз. Фактично, нАХР отримують сигнали від пре-гангліонарних нервів і
трансформують їх для подальшого проходження до органів-мішеней. При
цьому кожен нейрон отримує декілька пре-гангліонарних входів, а із
одного ганглія, як правило, виходить декілька нервів до різних за
природою органів: судин, стінок кишок або залоз. Результати наших
досліджень показують, що молекулярною основою гетерогенності
пре-гангліонарної інервації та функціональної пост-гангліонарної
активності може бути спектр субтипів нАХР, представлених на
індивідуальних нейронах в межах одного ганглію. З нашої точки зору,
набір нАХР у певному нейроні (ганглії) залежить від джерела
пре-гангліонарної інервації. Здається вірогідним припустити, що набір
субтипів нАХР, представлених в ганглії, є подібним до такого у відділі
центральної нервової системи, із якого походять нейрони цього ганглію і
із якого вони отримують сигнали.

По відношенню до головної мети роботи, результати, отримані на нейронах
автономних гангліїв, мають важливе порівняльне значення. Вони
демонструють, що на одній клітині може бути представлено декілька
субтипів нАХР, які виконують різні функції. Вони також дають змогу
припустити, що субтипи нАХР, представлені на лімфоцитах, певною мірою
залежать від інервації імунних органів.

D

f

i

o oe A

D

F

H

J

L

N

f

?

?

i

i

?

o

o

8 A A >

&^( * , . 0 yooyyyyyyyyyyyyyyyyyyycccc

&

a$

l

n

Oe0”y@

¬

Oe0”y@

¬

Oe0”y@

¬

Oe0”y@

¬

Oe0”y@

¬

вмісних нАХР). При цьому кількість центрів зв’язування епібатидину була
однаковою у нормальних В-лімфоцитів і клітин мієломи (12,200 ± 3,200 і
10170 ± 1100, відповідно), а кількість центрів зв’язування
?-бунгаротоксину — вдвічі більшою у пухлинних клітин, які постійно
діляться (6,730 ± 370), ніж у нормальних В-лімфоцитів, що знаходяться у
спокої (3,130 ± 750). Це дало нам підставу вважати, що присутність
нАХР, які зв’язують ?-бунгаротоксин, певним чином пов’язана з
проліферативними процесами в клітинах. Використання специфічних антитіл
показало, що як нормальні, так і малігнізовані В-лімфоцити експресують
переважно ?4-, ?7- і ?2- субодиниці.

Аналіз даних функціональних тестів та літературних даних про дозволені
сполучення субодиниць свідчив, що вони можуть бути поєднані в
комбінаціях (?4)2(?2)3 і (?7)5. Таким чином, подібно до нейронів
автономних гангліїв, В-лімфоцити експресували різні субтипи нАХР. Хоча
з лімфоцитами ми не проводили подвійного забарвлення, зв’язування
антитіл з гомогенними клітинами гібридом і очищеними популяціями
нормальних В-лімфоцитів свідчить про те, що в одній клітині експресовані
обидва субтипи. І лімфоцити, і нейрони гангліїв експресували ?7-вмісні
нАХР. З іншого боку, в лімфоцитах ми не знайшли ?3?5?4-субтипу
рецептору, який є найбільш характерним для автономних гангліїв.
Натомість, було знайдено ?4?2-вмісний субтип, який є головним в
центральній нервовій системі і, за нашими даними, зустрічається на
окремому морфологічному типі нейронів автономних гангліїв. На відміну
від автономних гангліїв, в мозку нАХР не задіяні в електричній відповіді
нейронів, а регулюють здебільшого діяльність інших (наприклад,
допамінових) рецепторів. ?7-вмісні нАХР також часто локалізовані
поза-синаптично (як в нижньому брижовому ганглії) і виконують
регуляторну роль. Оскільки електричну відповідь лімфоцитів на нікотинові
агоністи не зафіксовано, доцільним було припустити, що знайдені нами
субтипи нАХР виконують регуляторні функції. Тому перш за все ми вивчили
вплив нікотину на життєдіяльність В-лімфоцитів.

Роль нАХР в регуляції проліферації лімфоцитів. Нікотин, присутній в
культурі клітин гібридоми протягом 4-5 днів, сприяв їх проліферації
(рис. 7А).

Напроти, ?-кобратоксин і „слабкий токсин”, які є конкурентними
антагоністами ?7-вмісних нАХР, пригнічували проліферацію клітин
гібридоми і підвищували кількість секретованих ними антитіл. Цього не
відбувалося під дією нейротоксину 2, який переважно блокує нАХР
м’язового типу. При цьому продукція антитіл зменшувалась під дією
нікотину і збільшувалась під дією токсинів. Оскільки для клітин
гібридоми існує дві можливості: поділ або секреція антитіл, — отримані
результати означали, що ?7-вмісні нАХР приймають участь в регуляції
проліферації цих клітин. Пряме визначення кількості антитіл, зв’язаних
в клітинному ІФА, показало, що клітини гібридоми, які вийшли із
клітинного циклу і міцно прикріпилися до дна культурального флакону,
містили значно менше ?4- і ?7-вмісних нАХР, ніж клітини, що інтенсивно
ділилися (рис. 8).

Подібно до нервових клітин, механізм дії нАХР в клітинах гібридоми був
пов’язаний з відкриттям іонного каналу: блокатор відкритого каналу
бензогексоній дозозалежно пригнічував проліферативну активність в
присутності нікотину і запобігав стимулюючій дії нікотину на
проліферацію. З іншого боку, здатність антитіл проти ?? субодиниць
стимулювати проліферацію гібридоми SP-2/0 свідчила про те, що
проліферативний сигнал може бути генерований шляхом конформаційних
перетворень в молекулі нАХР або її димеризації. Оскільки, згідно до
моделей функціонування нАХР, відкриття іонного каналу супроводжується
значними конформаційними змінами в молекулі рецептору, доцільно
припустити, що саме вони є джерелом внутрішньоклітинних сигналів,
вірогідно, разом з катіонами, які потрапляють в клітину крізь іонний
канал.

Нікотин також підвищував кількість клітин, що продукують антитіла, в
культурі спленоцитів миші, імунізованої гемоцианіном равлика. Оскільки у
вивчений термін (3-4-й день після імунізації in vivo) попередники
плазматичних клітин проходять декілька циклів поділу, було зроблено
висновок, що нікотин сприяв їх проліферації подібно до малігнізованих
аналогів – клітин гібридоми.

Загалом, отримані дані свідчать про те, що нАХР ?7 субтипу, експресовані
В-лімфоцитами, передають в клітину сигнал проліферації і механізм
активації потребує відкриття іонного каналу або конформаційних змін
молекули рецептора.

Роль нАХР в розвитку і диференціюванні В-лімфоцитів. Вивчення експресії
різних субодиниць нАХР в процесі диференціювання В-лімфоцитів в
кістковому мозку і селезінці показало, що найвищий рівень ?4-вмісних
нАХР спостерігається в пре-В-лімфоцитах і послідовно знижується при їх
дозріванні в кістковому мозку та виході на периферію. Напроти, рівень
??7-вмісних нАХР поступово підвищується по мірі диференціювання і сягає
максимуму в зрілих В-лімфоцитах селезінки (рис 9.). Профіль зв’язування
?5-специфічних антитіл повторював такий для ?4 субодиниці в кістковому
мозку, але потім знов підвищувався, йдучи паралельно до ?7 субодиниці.
Ці дані свідчили про те, що ?5 субодиниця входить до складу ???? нАХР в
кістковому мозку і до складу ?7-вмісних нАХР в селезінці. Крім того,
вони означали, що нАХР з’являється на досить ранніх стадіях розвитку
В-лімфоцитів і, можливо, відіграє роль в диференціюванні цих клітин. Для
перевірки цієї гіпотези було використано дві експериментальні моделі:
мишей, нокаутних за генами ??7- або ?2-субодиниць нАХР, і химерних
мишей, імунна система яких містила суміш клітин дикого типу і нокаутних
за генами нАХР.

Як показано на рис.10, кістковий мозок мишей, нокаутних за геном
?2-субодиниці, містив суттєво менше В-лімфоцитів, ніж кістковий мозок
мишей дикого типу. Напроти, миші дикого типу, що вживали нікотин з
питною водою, мали більше В-лімфоцитів, ніж ті, що пили чисту воду.
Ефект нікотину не спостерігався у ??2-нокаутних мишей. Ці дані
однозначно свідчили, що сигнал від ??2-вмісного нАХР сприяє поширенню
популяції В-лімфоцитів в кістковому мозку.

На відміну, в селезінці на кількість В лімфоцитів не впливали ні
нікотин, ні відсутність ?2 субодиниці. Більше того, ефект нікотину
спостерігався лише у тварин, клітини яких не містили ?? субодиниці. Ці
дані свідчили, що поширення пулу зрілих В-лімфоцитів регулюється нАХР
іншого, ніж ?2-вмісний субтипу, що узгоджувалось із характером експресії
субодиниць (рис. 9). Крім того, це давало можливість припустити, що
субтипи нАХР в зрілих В-лімфоцитах виконують різні, можливо, навіть
антагоністичні функції.

Тварини, нокаутні за генами субодиниць нАХР, не містять відповідних
субтипів нАХР в усіх органах і тканинах тіла, включаючи мозок і
автономні ганглії. Зважаючи на тісні зв’язки нервової та імунної систем,
ми не могли виключити, що визначені зміни в складі В-лімфоцитів є
результатом нервової або нервово-ендокринної регуляції. Тому наступним
кроком було створено химерних мишей, у яких певні субтипи нАХР були
відсутні тільки в частині клітин крові. За даними, отриманими на
нокаутних мишах, найбільш чутливими до дії нікотину і відсутності гену
?2-субодиниці виявились пре-В і незрілі В-лімфоцити. Ці субпопуляції
було детально досліджено у химерних мишей. Як показано на рис.11А,
відсутність як ??7-, так і ?2-субодиниць була несприятливою для
поширення субпопуляцій попередників В-лімфоцитів в кістковому мозку.
Напроти, розвиток моноцитів (макрофагів) не залежав від присутності
нАХР.

Після виходу В-лімфоцитів на периферію (в селезінку) розмір популяції
залежав головним чином від??7-вмісних нАХР (рис. 11Б). Ці дані також
відповідали характеру експресії субодиниць нАХР в процесі розвитку
В-лімфоцитів (рис.9) і узгоджувались з результатами, отриманими на
нокаутних мишах (рис. 10). Вони означали, що після виходу із кісткового
мозку знижується як експресія, так і функціональне навантаження ?4(?5)?2
субтипу нАХР, а роль ?7-вмісного субтипу залишається незмінною. Крім
того, ?? і??? субодиниці очевидно входять до складу різних рецепторів,
тобто гетеромерний ??-вмісний субтип може містити ???і ?? субодиниці,
утворюючи пентаметр ????????????. У Т-лімфоцитів химерних мишей
спостерігалась закономірність, подібна до В-лімфоцитів: поширення
незрілих подвійно негативних (CD4- CD8-) попередників в тимусі залежало
від обох субтипів нАХР, а по мірі дозрівання, в зрілих CD4+ і CD8+
Т-лімфоцитах тимусу і селезінки залишався важливим лише ?7-вмісний
субтип. Для пояснення цього феномену ми звернулись до прикладу
автономних гангліїв, про які відомо, що рівень експресії певних субтипів
нАХР залежить від інервації і знижується після аксотомії. Первинні
лімфоїдні органи, кістковий мозок і тимус, інервуються холінергічними
нервами. Є прямі дані, що порушення цілісності нервів, які входять
всередину кісток чи тимусу, впливає на процеси кровотворення (Artico et
al., 2002; Mignini et al., 2003). В селезінці, на відміну від тимусу і
кісткового мозку, не знайдено холінергічних нервових закінчень
(Bellinger et al., 1993). Тому вихід клітин на периферію (або в
медулярну зону тимусу) фактично означає відміну холінергічної інервації,
що може пояснити зниження кількості ?4(?5)?2 нАХР. В такому випадку
можна припустити, що нАХР саме цього субтипу опосередковують нервову
регуляцію диференціювання лімфоцитів в первинних лімфоїдних органах. На
відміну, ?7-вмісні нАХР виконують дещо інші функції, ймовірно,
відповідаючи на ендогенний ацетилхолін, що продукується самими
лімфоцитами. Це добре узгоджується з описаними функціями різних субтипів
нАХР: ?7-вмісні рецептори, на відміну від субтипу ?3?4 в гангліях (і
?4?2 в мозку), відіграють важливу роль в регуляції росту і
диференціювання нейронів (Broide and Leslie, 1999).

Визначення важливої ролі нАХР для утворення попередників В-лімфоцитів
поставило питання, за яким механізмом реалізується ця роль. В процесі
розвитку пре-В-лімфоцити діляться, а також підлягають селекції, в
результаті якої частина клітин знищується шляхом апоптозу. Зокрема,
відбраковуються клітини, які занадто сильно зв’язують антигени, присутні
в оточенні, і, відповідно, можуть стати потенційно авто реактивними. Як
показано вище, нАХР опосередковували проліферативні сигнали в нормальних
зрілих В-клітинах і гібридомах. Ми також вивчили роль нАХР у виживанні
В-лімфоцитів в кістковому мозку. Виявилось, що у мишей, нокаутних за
генами ?7- або ?2-субодиниць нАХР, достовірно більше попередників
В-лімфоцитів підлягало апоптозу, ніж у мишей дикого типу (рис 12.). Це
означало, що В-лімфоцити нокаутних мишей підлягали більш суворому
відбору, ніж лімфоцити мишей дикого типу.

Оскільки процеси відбору фактично формують антиген-специфічний репертуар
імунних клітин, можна було очікувати, що у нокаутних мишей такий
репертуар буде вужчим, ніж у мишей із нормальним вмістом нАХР. Для
з’ясування цього питання ми вивчили рівень сироваткових імуноглобулінів
і природних антитіл у мишей, нокаутних за генами нАХР, у порівнянні з
мишами дикого типу.

Сироваткові імуноглобуліни і природні антитіла у нокаутних мишей. В цих
експериментах було вивчено вміст імуноглобулінів і природних антитіл у
нокаутних мишей трьох типів: у яких бракувало ?4, ?7 або ?2 субодиниць
нАХР. Як показано на рис.13, всі три типи досліджених нокаутів містили
суттєво менше сироваткових імуноглобулінів класу G, ніж миші дикого
типу. На відміну, кількість імуноглобулінів класу М у цих мишей суттєво
не відрізнялась від такої у вихідної лінії C57Bl/6. В селезінці ?2
нокаутів також містилось менше клітин, які продукували IgG, ніж у мишей
дикого типу. Ми визначили в сироватці крові контрольних і ??-нокаутних
мишей кількість антитіл проти антигенів, які звичайно вважають мішенями
так званих „природних” антитіл: актину, міозину, тубуліну і цитохрому с.
Кров нокаутних мишей містила менше IgG антитіл проти актину і міозину,
ніж кров мишей дикого типу, але однакову кількість антитіл проти
тубуліну і цитохрому с. Таким чином, відсутність нАХР не впливала на
базові рівні IgM та клітин, що їх продукують, але змінювала кількість
клітин, які переключилися з синтезу і секреції IgM на IgG. За нормальних
умов таке переключення відбувається у відповідь на антигени оточення,
здебільшого бактеріальні полісахариди. Кількість клітин, що продукують
IgG, у таких тварин фактично відповідає до-імунному репертуару
В-лімфоцитів. Отримані дані підтвердили зроблене вище припущення, що
відсутність нАХР в процесі розвитку В-лімфоцитів призводить до звуження
їх антиген-специфічного репертуару.

Роль нАХР в процесах активації В-лімфоцитів і імунній відповіді. Низькі
рівні сироваткових IgG та природних антитіл, знайдені у нокаутних мишей,
давали підставу очікувати, що такі миші будуть також слабше відповідати
на імунізацію білковим антигеном. Однак, на наш подив, миші, яким
бракувало ???або ?? субодиниці нАХР, продукували більше IgG антитіл
проти цитохрому с, ніж миші дикого типу (рис.14).

Для того, щоб пояснити протилежні до- і пост-імунні ефекти відсутності
нАХР, ми взяли до уваги той факт, що на відміну від переважно
Т-незалежної імунної відповіді на бактеріальні антигени оточення,
відповідь на білковий антиген, введений в суміші з ад’ювантом, є
Т-залежним процесом і потребує сигналу через костимуляторну молекулу
В-лімфоцитів CD40. Тому наступним кроком було вивчено активацію
В-лімфоцитів мишей дикого типу і нокаутних мишей під дією антитіл проти
CD40.

Як показано на рис. 15, В-лімфоцити мишей, нокаутних за геном
??-субодиниці, відповідали на стимуляцію краще, ніж клітини мишей дикого
типу. В протоковій цитофлуориметрії IgM+B220+ спленоцити як ??-, так і
??-нокаутів зв’язували більше антитіл проти CD40, ніж клітини мишей
дикого типу (на 11,4% і 8,4%, відповідно). За інтенсивністю
флуоресценції зв’язаних анти-IgМ антитіл, В-лімфоцити селезінки
нокаутних мишей експресували приблизно на 5% більше IgM, ніж клітини
мишей дикого типу. Таким чином, відсутність нАХР впливала на активацію
В-лімфоцитів і, як наслідок, на гуморальну імунну відповідь шляхом
підвищення експресії (і, можливо, сигналингу) головних активаційних
молекул В-лімфоцитів: антиген-специфічного рецептора і CD40. Як видно із
представлених даних, різниця між мишами дикого типу і нокаутними за
генами нАХР була невеликою: 5-10% в рівні експресії активаційних
молекул, 30 — 60% в проліферації і 50 -150% в продукції антитіл. Це
означало, що сигнал, який поступає в В-лімфоцити через нАХР, не є
драматичним, а скоріше виконує роль тонкого модулятора їх імунних
функцій. Такий висновок добре збігався з обговореною вище регуляторною
роллю ?????і???-вмісних нАХР в нейронах мозку і автономних гангліїв.

Підвищений рівень IgM та CD40 на клітинах нокаутних мишей також
пояснював вплив нАХР на виживання попередників В-лімфоцитів в кістковому
мозку. Рішення негативного відбору: знищити або зберегти клітину, —
приймається на основі авідності взаємодії її попередника з антигенами
оточення. Підвищена експресія антиген-специфічного рецептору і
костимуляторної молекули очевидно посилює авідність взаємодії і реакцію
на неї, що сприяє відбракуванню клітин як потенційно автореактивних. Як
наслідок, ми спостерігаємо підвищений рівень апоптозу серед клітин
нокаутних мишей і звуження їх до-імунного репертуару. Відповідно, у
мишей дикого типу сигнал від нАХР сприяє утворенню нормального
антиген-специфічного репертуару, але стримує силу імунної відповіді в
зрілому стані. Вживання нікотину, яке підвищувало кількість
В-лімфоцитів в кістковому мозку, згідно із обговореними даними, повинно
розширювати до-імунний репертуар, але знижувати імунну відповідь. Таке
твердження добре узгоджуються із визначеною імуносупресивною роллю
нікотину. Зменшений тиск негативного відбору автоматично підвищує ризик
імунної відповіді на власні антигени, що відповідає описаній в
літературі підвищеній вірогідності автоімунних захворювань у людей, що
палять тютюн.

Загалом, одержані результати демонструють важливу роль ацетилхоліну в
регуляції розвитку і активації лімфоцитів. Утворення до-імунного
антиген-специфічного репертуару очевидно регулюється холінергічними
сигналами від нервової системи. На периферії регуляторну роль відіграє
ацетилхолін не-нейронального походження. Згідно до літературних даних,
лімфоцити експресують також рецептори до ацетилхоліну мускаринового
типу, причому їх активація потребує значно менших доз ацетилхоліну і
призводить до протилежних наслідків, ніж активація нАХР (Richman and
Arnason, 1979). У світлі отриманих нами даних можна уявити, що малі дози
ацетилхоліну сприяють імунним реакціям, діючи на мускаринові рецептори,
а підвищені – гальмують імунну відповідь через нікотинові рецептори.
Більше того, різні субтипи нАХР відіграють різні ролі в процесах
розвитку і активації В лімфоцитів. Оскільки потужним джерелом
ацетилхоліну є активовані Т-лімфоцити, то його продукція є очевидним
фактором зворотного зв’язку в імунних реакціях. Відповідно, ацетилхолін
можна вважати додатковим медіатором спілкування між Т- і В-лімфоцитами.

Вивчення ролі нАХР в процесах кровотворення. Оскільки кістковий мозок є
головним центром кровотворення у мишей, цікаво також було з’ясувати, чи
впливають сигнали від нАХР на утворення і диференціювання інших клітин
крові. Ми провели морфологічний аналіз відбитків кісткового мозку,
селезінки і мазків крові мишей дикого типу, тих, що вживали нікотин, і
нокаутних за генами нАХР. За отриманими даними, відсутність ??-вмісних
нАХР знижувала частку нормоцитів, не впливаючи на ранні еритроїдні
попередники, тобто сприяла трансформації нормоцитів в ретикулоцити. При
цьому підвищувалась частка ранніх мієлоїдних попередників і юних форм
нейтрофілів (рис. 16).

Із літератури відомо, що нормоцити стримують утворення ранніх мієлоїдних
попередників, тож відсутність ?? субодиниці, прискорюючи диференціювання
нормоцитів, опосередковано сприяла утворенню юних нейтрофілів. На
відміну, відсутність ??-субодиниці нАХР уповільнювала утворення як
нейтрофілів, так і ранніх еритроїдних попередників. При цьому
автоматично зростала частка лімфоцитів (рис. 17).

Дія нікотину нагадувала ефект відсутності ??-субодиниці нАХР,
вірогідно, завдяки десенситизації цього типу рецептора, і, на додаток,
сприяла збереженню зрілих нейтрофілів. Сумарні клітини кісткового мозку
містили сайти зв’язування радіоактивних епібатидину і ?-бунгаротоксину,
вказуючи на присутність гетеромерних і ?7-вмісних нАХР. Методом
протокової цитофлуориметрії ми розділили клітини кісткового мозку на
субпопуляції різних рядів і стадій диференціювання і прямо показали, що
як мієлоїдні, так і еритроїдні попередники експресують обидва субтипи
нАХР, причому, подібно до лімфоцитів, ???? нАХР присутні переважно на
ранніх стадіях диференціювання, в той час, як ??-вмісні рецептори
визначаються як на попередниках, так і на зрілих клітинах. Отримані дані
свідчили, що нікотинові рецептори приймають участь в регуляції
кровотворення в кістковому мозку, тобто фактично, визначали молекулярну
основу холінергічної регуляції цього процесу, описану раніше.

Експресія нАХР лейкоцитами периферичної крові людей та її зміни у хворих
на хворобу Альцгеймера. За нашими даними, нАХР лімфоцитів виявились
подібними до відповідних рецепторів мозку. У зв’язку з цим виникло
питання, чи пов’язані між собою експресія нАХР в мозку і в клітинах
крові. Зручною моделлю для таких досліджень є нейродегенеративні
захворювання, наприклад, хвороба Альцгемера, за якої кількість нАХР в
мозку достовірно знижується. В результаті наших експериментів було
з’ясовано, що у деякої частини хворих дійсно спостерігається зниження
кількості нАХР на поверхні лейкоцитів у порівнянні з контролями (рис.
18), причому кількість нАХР може залежати від присутності автоантитіл до
цього рецептору в плазмі крові.

Отримані дані демонструють потенційний зв’язок між експресією нАХР в
мозку і в лейкоцитах і вперше вказують на те, що автоімунна реакція на
нАХР може бути однією з причин патологічних змін за хвороби Альцгеймера.
Відповідно, зниження кількості нАХР на лейкоцитах периферичної крові
може бути додатковим діагностичним критерієм цього захворювання.

ВИСНОВКИ

Імунна і нервова системи організму є різними за будовою, призначенням та
принципами функціонування, однак використовують багато спільних
медіаторів і рецепторів до них. В результаті проведених досліджень
показано, що В-лімфоцити експресують нікотинові ацетилхолінові рецептори
(нАХР), подібні за будовою і механізмом дії до рецепторів нейронів, які
є важливим фактором розвитку і активації цих клітин.

Отримано антитіла до пептидних фрагментів ?3, ?4, ?????7, ?2 і ??
субодиниць нАХР, які блокують активацію рецептору шляхом конкуренції за
сайт зв’язування ацетилхоліну; це дало можливість розрізнити субтипи
нАХР, складені із різних субодиниць.

Фрагмент нативного рецептору, проти якого отримані антитіла, має
витягнуту просторову будову; в ??-вмісних нАХР він містить центр
зв’язування специфічного антагоністу метиллікаконітину.

Функціональна активність антитіл проти ?? і??? субодиниць нАХР свідчить
про те, що ці структурні субодиниці відіграють важливу роль у відкритті
іонного каналу.

Головним субтипом нікотинових рецепторів в верхньому шийному та
інтракардіальному гангліях щура і в нижньому брижовому ганглії та
підслизовому сплетінні морської свинки. є ????????, а за представленістю
??- і ??-вмісних субтипів нейрони сильно відрізняються як в межах одного
ганглію, так і між гангліями різної локалізації, що відображає їх
функціональну різноманітність і джерело походження.

В-лімфоцити і клітинні лінії В-лімфоцитарного походження експресують два
субтипи нікотинових рецепторів: ???????? і ???????), — і механізм їх
функціонування подібний до такого в нервових клітинах.

Субтип ???????? переважно представлено на незрілих В- і Т-лімфоцитах
первинних лімфоїдних органів, що інервуються холінергічними нервами, а
кількість ??-вмісного субтипу збільшується в міру дозрівання лімфоцитів
і виходу їх із зони холінергічної інервації.

Активація нікотинових рецепторів сприяє проліфераціі і виживанню
В-лімфоцитів в процесі диференціювання в кістковому мозку і таким чином
розширює їх антиген-специфічний репертуар. В зрілих В-лімфоцитах
нікотинові рецептори, напроти, стримують активацію в процесі імунної
відповіді. Механізм дії нАХР на ці процеси опосередкований впливом на
антигенний рецептор В-лімфоцитів і костимуляторну молекулу CD40.

Активація нікотинових рецепторів, представлених на клітинах кісткового
мозку, регулює також загальні процеси кровотворення, зокрема генерацію і
виживання клітин мієлоїдного ряду і еритрону.

У частини пацієнтів з хворобою Альцгеймера кількість нікотинових
рецепторів на лейкоцитах крові знижена, що обумовлено наявністю
автоантитіл проти нАХР. Визначення кількості нАХР на лейкоцитах крові,
може бути додатковим діагностичним критерієм хвороби Альцгеймера.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Скок М.В. Основи імунології. Курс лекцій: Підручник. – К.:
Фітосоціоцентр, 2002. – 152 с.

Skok M.V., Grailhe R., Agenes F., Changeux J.-P. The role of nicotinic
acetylcholine receptors in lymphocyte development // J. Neuroimmunol. –
2006. – Vol. 171, № 1-2. – С. 86-98. (Дисертантом особисто сформульовано
завдання роботи, виконано цитофлуориметричний аналіз клітин химерних і
нокаутних тварин, написано статтю).

Скок М.В., Звєркова А.С., Комісаренко С.В. Роль нікотинових
ацетилхолінових рецепторів в регуляції процесів кровотворення //
Доповіді НАН України. – 2005, № 10. – С. 180-184. (Дисертантом особисто
сформульовано завдання роботи, підготовлено препарати для аналізу,
написано статтю).

Skok M.V., Grailhe R., Changeux J.-P. Nicotinic receptors regulate B
lymphocyte activation and immune response // Eur. J. Pharmacol. – 2005.
– Vol. 517, № 3. – P. 246-251. (Дисертантом особисто сформульовано
завдання роботи, проведено всі експерименти, написано статтю).

Л.М.Коваль, С.І.Романюк, Д.В.Колибо, М.В.Скок, С.В.Комісаренко. Роль
нікотину в регуляції проліферативних процесів В-лімфоцитах // Укр.
біохім. журн. – 2005. — т.77, №2. — C.104-110. (Дисертантом особисто
сформульовано завдання роботи, сплановано експерименти, зроблено внесок
в написання статті).

Skok M.V., Koval L.M., Petrova Y.I., Lykhmus O.Y., Kolibo D.V., Romanyuk
S.I., Yevdokimova N.Y., Komissarenko S.V. The effect of simulated
microgravity on hybridoma cells // Acta Astronautica. – 2005. – Vol. 56,
№ 8. – P. 721-728. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи,
сплановано експерименти, написано статтю).

Грігоров О.О., Скок М.В., Скок В.І. Альфа-субодиничний склад нікотинових
холінорецепторів підслизового сплетення тонкого кишечника морської
свинки // Фізіол. журн. – 2004. — т.50, №3. — C. 73-78. (Дисертантом
отримано антитіла для проведення досліджень, проаналізовано результати,
зроблено внесок в написання статті).

Purnyn H.E., Rikhalsky O.V., Skok M.V., Skok V.I. Functional nicotinic
acetylcholine receptors in the neurons of rat intracardiac ganglia //

Фізіол. журн. – 2004. – т. 50, № 4. – C. 79-84. (Дисертантом отримано
антитіла для проведення досліджень, проаналізовано результати, зроблено
внесок в написання статті).

Koval O.M., Voitenko L.P., Skok M.V., Lykhmus E.Y., Tsetlin V.I., Zhmak
M.N. and Skok V.I. The (-subunit composition of nicotinic acetylcholine
receptors in the neurons of the guinea pig inferior mesenteric ganglion
// Neurosci. Lett. – 2004. — Vol.365, № 2. — P. 143-146. (Дисертантом
отримано антитіла для проведення досліджень, проаналізовано результати,
зроблено внесок в написання статті).

Скок М.В. Нікотинові рецептори нейронного типу: будова і функції у
клітинах різного походження (огляд) // Укр. біохім. журн. – 2004. —
т.76, № 3. — С. 5-15.

Glushakov A.V., Voytenko L.P., Skok M.V., Skok V.I. Distribution of
neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing different
alpha-subunits in the submucosal plexus of the guinea-pig // Autonomic
Neuroscience: Basic and Clinical. – 2004. — Vol. 110, № 1. — P. 19-26.
(Дисертантом отримано антитіла для проведення досліджень, проаналізовано
результати, зроблено внесок в написання статті).

Skok M.V., Kalashnik E.N., Koval L.N., Tsetlin V.I., Utkin Y.N.,
Changeux J.-P., Grailhe R. Functional nicotinic acetylcholine receptors
are expressed in B lymphocyte-derived cell lines // Mol. Pharmacol. –
2003. – Vol. 64, №. 4. – P.885-889. (Дисертантом особисто сформульовано
завдання роботи, проведено експерименти зі зв’язуванням радіоактивних
лігандів, написано статтю).

Скок М.В., Коваль Л.Н., Бачинская Н.Ю., Комиссаренко С.В.Никотиновые
ацетилхолиновые рецепторы на лимфоцитах периферической крови при болезни
Альцгеймера // Доповіді НАН України. – 2003, № 9. — C.194-198.
(Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, сплановано
експерименти, написано статтю).

Коваль О.М., Скок М.В., Скок В.І. ?-субодиничний склад нікотинових
холінорецепторів нейронів нижнього брижового ганглія морської свинки:
електрофізіологічне дослідження // Нейрофізіологія. – 2003. – т. 35, №
1. – C. 9-19. (Дисертантом отримано антитіла для проведення досліджень,
проаналізовано результати, зроблено внесок в написання статті).

Коваль О.М., Войтенко Л.П., Скок М.В., Скок В.І. ?-субодиничний склад
нікотинових холінорецепторів нейронів нижнього брижового ганглія
морської свинки: імуногістохімічне дослідження // Нейрофізіологія. –
2003. – т. 35, № 2. – С. 99-107. (Дисертантом отримано антитіла для
проведення досліджень, проаналізовано результати, зроблено внесок в
написання статті).

Skok M.V., Lykhmus O.Yu., Bobrovnik S.O., Solodova O.V., Tzartos S.J.,
Tsouloufis T., Vanderesse R. and Marraud M. Production of antibodies to
?(181-192) peptides of neuronal nicotinic acetylcholine receptor coupled
to protein carriers in different orientations // Укр. біохім. журн. –
2002. – т. 74, №4. – С.54-60. (Дисертантом особисто сформульовано
завдання роботи, проведено аналіз виділених антитіл, написано статтю).

Skok M., Lykhmus E., Bobrovnik S., Tzartos S., Tsouloufis T., Vanderesse
R., Coutrot F., Thong Cung M., Marraud M., Krikorian D.,
Sakarellos-Daitsiotis M. Structure of epitopes recognized by the
antibodies to ?(181-192) peptides of neuronal nicotinic acetylcholine
receptors: extrapolation to the structure of acetylcholine-binding
domain // J. Neuroimmunol. – 2001. — Vol.121, № 1-2. — P.59-66.
(Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, отримано
моноклональні антитіла, проаналізовано результати, написано статтю).

Voitenko L.P., Voitenko S.V., Skok M.V., Purnyn H.E., Skok V.I..
Nicotinic acetylcholine receptor subtypes in rat superior cervical
ganglion neurons as studied by sequential application of two
?-subunit-specific antibodies // Neuroscience Letters. – 2001. — Vol.
303, № 1. — P. 37-40. (Дисертантом отримано антитіла для проведення
досліджень, сплановано експеримент, проаналізовано результати, написано
статтю).

Лихмус О.Ю., Скок М.В., Мірошниченко О.С., Комісаренко С.В. Вуглеводний
компонент нікотинових ацетилхолінових рецепторів, присутніх на нервових
та імунних клітинах // Доповіді НАН України. – 2001. — № 10. — C.
185-189. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, сплановано
експерименти, написано статтю)

Калашник О.М., Лихмус О.Ю., Скок М.В. та Комісаренко С.В. Експресія та
можливі функції нікотинових ацетилхолінових рецепторів В-лімфоцитах //
Доповіді НАН України. – 2000. — № 4. — C.171-175. (Дисертантом особисто
сформульовано завдання роботи, проведено експерименти з протокової
цитофлуориметрії, написано статтю).

Skok M.V., Voitenko L.P., Voitenko S.V., Lykhmus E.Y., Kalashnik E.N.,
Litvin T. I., Tzartos S.J. and Skok V.I. Study of ? subunit composition
of nicotinic acetylcholine receptor in the neurons of autonomic ganglia
of the rat with subunit-specific anti-?(181-192) peptide antibodies //
Neuroscience. – 1999. — Vol. 93, № 4. — P. 1437-1446). (Дисертантом
особисто сформульовано завдання роботи, отримано антитіла для проведення
досліджень, проаналізовано результати, написано статтю).

M.V.Skok, S.V.Komissarenko. Immune response to cytochrome c in BALB/c
mice is delayed due to inability of non-specific antigen-presenting
cells to provide its immunodominant epitope // Immunology Letters. –
1995. — Vol. 47. — P. 87-92. (Дисертантом особисто сформульовано
завдання роботи, проведено всі експерименти, написано статтю).

Э.М.Кавун, М.В.Скок. Динамика антителообразования, изотипы и
специфичность антител в иммунном ответе мышей BALB/c на цитохром с //
Биохимия (Москва). – 1994. — т.59, № 6. — C. 881-888. (Дисертантом
особисто сформульовано завдання роботи, проведено дослідження динаміки
імунної відповіді і ізотопів антитіл, зроблено внесок в написання
статті).

M. Skok, L. Voitenko, S. Voitenko, E. Lykhmus, E. Kalashnik, V. Skok, S.
Tzartos, Monoclonal antibodies, which bind and selectively block
different nicotinic acetylcholine receptor subtypes: studies with
lymphocytes // Abstracts 17th Summer Meeting on Molecular Biology
“Immuno-Neuro-Endocrine Interactions”. — Penn State (USA). – 1998. —
P.81.

M.V.Skok, L.P.Voitenko, S.V.Voitenko, E.Yu.Lykhmus, E.N.Kalashnik, S.J.
Tzartos and V.I.Skok Study of nicotinic acetylcholine receptor
expression with???subunit-specific anti-?(180-191) peptide antibodies //
Abstracts 5th IUBMB Conference on the Biochemistry of Health and
Diseases. – Jerusalem (Israel). – 1998. — P. 69.

M. Skok, Е. Kalashnik, E. Lykhmus. Neuronal nicotinic acetylcholine
receptors in lymphocytes // Abstracts “Neuronal Nicotinic Receptors:
From Structure to Therapeutics “. — Venice (Italy). – 1999. — P. 77.

M.V.Skok, E.Y.Lykhmus, E.N.Kalashnik. Mouse lymphocytes express two
subtypes of neuronal nicotinic acetylcholine receptor, which appear at
different stages of B lymphocyte development // Abstracts of the Fifth
John Humphrey Advanced Summer Programme and Lecture Series in Immunology
“Immunology in Health and Disease”. – Pushchino (Russia). – 2000. — P.
91-92.

M.V.Skok, E.Y.Lykhmus, N.Y.Bachinskaya. Nicotinic acetylcholine
receptors in lymphocytes: implications for Alzheimer disease //
Abstracts of the ESN Conference on “Advances in molecular mechanisms of
neurological disorders”. — Perugia (Italy). — 2001. — J. Neurochem. –
Vol. 77, Suppl. 1. — P.23.

M.V.Skok, O.Y.Lykhmus, L.M.Koval, D.V.Kolibo, S.I.Romanyuk. Structure
and role of nicotinic acetylcholine receptors in lymphocytes studied
with subunit-specific anti-peptide antibodies // Abstracts of the 4th
Parnas Conferenc. — Wroclaw (Poland). – 2002. — P. 23.

М.В.Скок, О.Ю.Лихмус, Л.М.Коваль, Д.В.Колібо, С.І.Романюк. Будова і
функції нікотинових ацетилхолінових рецепторів на клітинах імунної
системи // Тези 8-го Українського біохімічного з’їзду. – Чернівці
(Україна). – Укр. біохім. журн. – 2002. — т. 74, № 4б, додаток 2. — C.
12-13.

Koval L.M., Kalashnik O.M., Skok M.V. Structure and role of nicotinic
acetylcholine receptors in lymphocytes // Abstracts of the 6th John
Humphrey Advanced Summer Programme and Lecture Series in Immunology
“Molecular Basis of the Immune Response”. – Pushchino (Russia). – 2002.
— P. 63.

Скок М.В., Петрова Ю.І., Колибо Д.В., Лихмус О.Ю., Коваль Л.М., Романюк
С.І., Комісаренко С.В. Вплив імітованої мікрогравітації на клітини, що
продукують антитіла // Сборник тезисов Третьей Украинской конференции
по перспективным космическим исследованиям. — Кацивели (Крым). — 2003. —
C. 89.

Koval L., Romanyuk S., Komisarenko S., Skok M. Structure and functions
of nicotinic acetylcholine receptors in transformed B lymphocytes //
Abstracts of the First (Inagural) Ukrainian Congress for Cell Biology. –
Lviv (Ukraine). – 2004. — P. 285.

Komisarenko S.V., Koval L.M., Skok M.V. Structure and functions of
nicotinic acetylcholine receptors expressed in B lymphocyte-derived cell
lines // Abstracts of 29th FEBS Meeting. — Warsaw (Poland). – 2004. –
Eur. J. Biochem. – Vol. 271, Suppl. 1. — P. 123.

Koval L.M., Romanyuk S.I., Kolibo D.V., Komisarenko S.V. Skok M.V.,
Nicotinic acetylcholine receptors regulate proliferation of B
lymphocytes // Abstracts of the 12th International Congress of
Immunology and 4th Annual Conference of FOCIS. — Montreal (Canada). —
Chemical and Investigative Medicine Journal Supplement. – 2004. — Vol.
27, № 4. — P.163C.

Skok M.V., Grailhe R., Agenes F., Changeux J.-P. Signaling through
nicotinic acetylcholine receptors regulates lymphocyte development and
activation // Abstracts of the 5th Parnas Conference. — Kiev (Ukraine).
— Ukr. Biochem. J. – 2005. — Vol. 77, №. 2. — P. 34.

Koval L.M., Lykhmus E.Yu., Romanyuk S.I., Kolibo D.V., Komisarenko S.V.,
Skok M.V. Nicotinic acetylcholine receptors mediate the effect of
nicotine on antibody-producing cells // Abstracts of the 5th Parnas
Conference. — Kiev (Ukraine). – Укр. біохім. журн. – 2005. — т. 77, №.
2. — С. 59.

Skok M, Zverkova A, Grailhe R, and Changeux JP. Haemostasis is regulated
through nicotinic acetylcholine receptors // Abstracts of the XXth
Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. —
Sydney (Australia). – J. Thromb. Haemost. – 2005. – Vol. 3, Suppl. 1. –
P0342.

Skok M.V. The role of nicotinic acetylcholine receptors in B lymphocyte
proliferation and survival // Abstracts of International Workshop “New
insights in cell proliferation, autophagy and apoptosis: fundamental and
medical aspects”. – Odessa (Ukraine). – 2005. — P. 9.

АНОТАЦІЯ

Скок М.В. Будова і функції нікотинових ацетилхолінових рецепторів
В-лімфоцитів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за
спеціальністю 03.00.04 – біохімія. – Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна
НАН України, Київ, 2006.

Дисертацію присвячено дослідженню нікотинових ацетилхолінових рецепторів
В-лімфоцитів у порівнянні з такими автономних гангліїв. Представлені
дані мають важливе теоретичне значення для розуміння загальних
механізмів функціонування та взаємодії імунної та нервової систем,
холінергічної регуляції процесів кровотворення та впливу нікотину на
імунні реакції. З’ясовано важливі структурні особливості нікотинових
рецепторів, ідентифіковано їх головні субтипи в В-лімфоцитах і
декількох автономних гангліях. Визначено, що вони регулюють формування
репертуару і активацію В-лімфоцитів, впливаючи на експресію
антиген-специфічних рецепторів та костимуляторних молекул CD40.
Показано, що нікотинові рецептори, експресовані в ранніх мієлоїдних і
еритроїдних попередниках клітин крові в кістковому мозку, регулюють
дозрівання цих клітин. Виявлено, що автоантитіла проти нікотинових
рецепторів можуть бути причиною зниження кількості цих рецепторів в
крові деяких пацієнтів з хворобою Альцгеймера, що складає основу для
розробки альтернативних методів діагностики цього захворювання.

Ключові слова: нікотиновий ацетилхоліновий рецептор, В-лімфоцити,
антитіла, автономні ганглії, хвороба Альцгеймера.

АННОТАЦИЯ

Скок М.В. Структура и функции никотиновых ацетилхолиновых рецепторов
В-лимфоцитов. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по
специальности 03.00.04 – биохимия. – Институт биохимии им. А.В.Палладина
НАН Украины, Киев, 2006.

Диссертация посвящена изучению никотиновых ацетилхолиновых рецепторов,
а именно, установлению их субъединичного состава и возможных функций в
В лимфоцитах сравнительно с нейронами вегетативных ганглиев.
Представленные данные имеют важное теоретическое значение для понимания
взаимодействия и общих механизмов функционирования иммунной и нервной
систем, холинергической регуляции процессов кроветворения и влияния
никотина на иммунные процессы.

В процессе выполнения исследований создан уникальный инструмент –
функционально активные антитела против фрагментов альфа и бета
субъединиц никотинового рецептора, которые фактически являются
селективными блокаторами разных его субтипов. Использование таких
антител позволило выяснить важные структурные особенности рецептора, в
частности, конформацию соответствующего антигенного фрагмента,
локализацию центра связывания метилликаконитина, характер
пост-трансляционных модификаций и роль структурных субъединиц в
функционировании рецептора. С помощью антител были идентифицированы
основные субтипы никотиновых рецепторов в нескольких вегетативных
ганглиях и показано, что их состав отражает функциональную
гетерогенность нейронов как внутри ганглия, так и между ганглиями разной
локализации. Методом связывания антител и радиоактивных лигандов
установлена экспрессия двух субтипов никотинового рецептора в
В-лимфоцитах и в предшественниках клеток крови. В функциональных тестах
in vitro показано, что эти рецепторы опосредуют стимулирующее действие
никотина на пролиферацию трансформированных В-лимфоцитов. На моделях
мышей, нокаутных по генам отдельных субъединиц никотинового рецептора, и
химерных мышей, которые содержали лишь часть клеток крови нокаутных
животных, установлено, что никотиновые рецепторы регулируют как развитие
лимфоцитов в первичных лимфоидных органах, так и их активацию в иммунном
ответе. В частности, показано, что активация никотиновых рецепторов
способствует выживанию предшественников В-лимфоцитов в ходе негативного
отбора и тем самым расширению до-иммунного репертуара их антигенных
специфичностей. В зрелых В-лимфоцитах никотиновые рецепторы сдерживают
активацию и гуморальный иммунный ответ. Молекулярный механизм такого
влияния связан с регуляцией экспрессии антиген-специфичного рецептора и
костимуляторной молекулы СD40. Установлено, что никотиновые рецепторы
двух субтипов: ?????????и ????????, — выполняют разные функции в
лимфоцитах и, возможно, отвечают на ацетилхолин разного происхождения.

Исследование роли никотиновых рецепторов в процессах кроветворения
показало, что лимфоциты – не единственные клетки, дифференцировка
которых регулируется через эти рецепторы. Экспрессия рецепторов двух
субтипов была найдена в клетках костного мозга, а отсутствие или
десенситизация этих рецепторов нарушала образование и созревание ранних
миелоидных и эритроидных предшественников клеток крови.

Никотиновые рецепторы были идентифицированы также на лейкоцитах
периферической крови людей. Зафиксировано их снижение у части больных
болезнью Альцгеймера, которая также сопровождается уменьшением
количества подобных рецепторов в мозге. Найдено, что причиной снижения
количества никотиновых рецепторов на клетках крови могут быть
аутоантитела. Таким образом, впервые показано, что одним из патогенных
факторов болезни Альцгеймера может быть аутоиммунная реакция.
Обнаружение связи между болезнью, снижением числа рецепторов на клетках
крови и наличием аутоантител создает возможность разработки
альтернативных методов диагностики этого заболевания.

Полученные данные устанавливают молекулярную основу холинергической
регуляции гемопоэза, иммунопоэза и активации лимфоцитов и
свидетельствуют о важной роли ацетилхолина не-нейронального
происхождения как медиатора при кооперации иммунокомпетентных клеток.

Ключевые слова: никотиновый ацетилхолиновый рецептор, В-лимфоциты,
антитела, вегетативные ганглии, болезнь Альцгеймера.

SUMMARY

Skok M.V. Structure and functions of nicotinic acetylcholine receptors
of B lymphocytes. – Manuscript.

Thesis for a doctor’s degree by specialty 03.00.04 – Biochemistry. –
Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of
Ukraine, Kyiv, 2006.

The thesis deals with the study of nicotinic acetylcholine receptors in
B lymphocytes compared to the neurons of autonomic ganglia. The
presented data helps to clarify the general mechanisms underlying
functioning and interaction of nerve and immune systems, as well as
cholinergic regulation of haemopoiesis and the effects of nicotine on
immune reactions. The subunit composition of nicotinic receptors
expressed in lymphocytes and in several autonomic ganglia has been
identified. These receptors were shown to influence the antigen-specific
repertoire of B lymphocytes and their activation during the immune
response through B cell receptor and co-stimulatory molecule CD40.
Nicotinic receptors expressed in the myeloid and erythroid blood cell
precursors in the bone marrow regulate their maturation. Nicotinic
receptors were found decreased in the blood leukocytes of some patients
with Alzheimer disease due to the presence of autoantibodies that forms
a basis for the development of alternative diagnostic tests of this
disease.

Key words: nicotinic acetylcholine receptor, В lymphocytes, antibodies,
autonomic ganglia, Alzheimer disease.

PAGE 1

ОГ490нм

Розведення мАт

Розведення Ат

Час, хв.

Амплітуда струму, рА

Час, хв.

Ат7 мАт 1D6 Відмив

Інтенсивність флуоресценції

А

ОГ490нм

ОГ490нм

ОГ490нм х 103

Субодиниці нАХР

Похожие записи