АКАДЕМІЯ медичних НАУК УКРАЇНИ

НАУКОВИЙ ЦЕНТР РАДІАЦІЙНОЇ МЕДИЦИНИ

Ільєнко Ірина Миколаївна

УДК 576.32/.36:57.016:612.119:616.832:616-001.28

Апоптоз, імунофенотип та функціональна активність елементів гемопоезу у
хворих на мієлодиспластичний синдром у віддалений період після
опромінення

03.00.01 – радіобіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті клінічної радіології

Наукового центру радіаційної медицини АМН України.

Науковий керівник

доктор медичних наук, професор

Базика Димитрій Анатолійович,

Інститут клінічної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН
України,

завідувач відділу клінічної імунології.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук

Мінченко Жанна Миколаївна,

Інститут клінічної радіології Наукового центру радіаційної медицини АМН
України,

завідувач лабораторії імуногенетики відділу гематології і
трансплантології;

доктор медичних наук, професор

Видиборець Станіслав Володимирович,

Національна медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ
України,

професор кафедри гематології і трансфузіології.

Захист дисертації відбудеться 13.11.2007 р. о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.562.01 Наукового центру радіаційної
медицини АМН України, 03115, м. Київ, просп. Перемоги, 119/121.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Наукового центру
радіаційної медицини АМН України, 04050, м. Київ, вул. Мельникова, 53.

Автореферат розісланий 12.10.2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук _______________________ Л. О. Ляшенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В результаті аварії на ЧАЕС безпрецедентні за
розміром групи населення зазнали багатофакторного впливу, у т.ч.
зовнішнього та внутрішнього опромінення. Визнаним на сьогоднішній день є
розвиток стохастичних ефектів опромінення – серед яких виникнення та
прогресування різних форм онкогематологічних захворювань [И.М. Богданов
и др., 2005; J. Edward et al., 2002]. Моніторинг системи кровотворення в
учасників ліквідації наслідків аварії на Чорнобильській атомній
електростанції (УЛНА на ЧАЕС) показав, що серед порушень функціонування
кровотворної системи одне з провідних місць займають якісні та
кількісні зміни гемопоезу – лейкопенії, анемії, моноцитоз та
лімфоаденопатії, що є прогностично несприятливими щодо розвитку
злоякісних захворювань системи крові [А.Е. Романенко и др., 2005].
Особливу увагу привертає мієлодиспластичний синдром (МДС), що включає
групу захворювань, яка характеризується клональними порушеннями
кровотворення. На сьогоднішній день МДС віднесено до захворювань, що
можуть бути індуковані іонізуючою радіацією. Відомими є морфологічні
особливості гемопоетичних клітин (ГК) кісткового мозку (КМ) та
периферичної крові (ПК) при МДС у постраждалих внаслідок Чорнобильської
катастрофи [І.В. Белінська, 2002; М.А. Френкель и др., 2001]. Описані
характерні цитогенетичні та молекулярно біологічні зміни [Д.Ф. Глузман и
др., 2003; В. Павлова и др., 1995]. Однак, відносно невелика кількість
робіт присвячена вивченню імунологічного фенотипу клітин ПК та КМ при
МДС. Між тим, функціонування та загибель клітин чітко контролюються
мембранними рецепторами та їх лігандами, які активують як процеси
проліферації, так і апоптозу, порушення яких встановлено при дії
іонізуючого опромінення [Darroudi et al., 2005]. Тому перспективним
напрямком досліджень для розуміння природи МДС, як віддаленого ефекту
опромінення, є визначення як кількісних характеристик експресії
рецепторного апарату, так і наявності/відсутності тих чи інших
антигенів, що визначають стадію диференціювання та лінійну належність
[H.D. Cualing, 2000; T. Horsburgh et al., 2000]. Характерним для МДС є
невідповідність високої проліферативної активності клітин гемопоезу
цитопенічному синдрому, що дозволило сформулювати теорію „неефективного
гемопоезу”. Більшість дослідників схильні вважати, що основним
механізмом цього феномену у хворих на МДС є активація апоптозу [А.Ф.
Романова и др., 2006; A. Raza et al., 1997; S.D. Mundle et al., 1999].
Тому дослідження ролі, специфіки, зв’язків про- та антиапоптотичних
молекул у складному каскаді запрограмованої клітинної загибелі є
пріоритетним напрямком дослідження патогенезу МДС. З іншого боку,
актуальність вивчення апоптозу при даній патології обумовлена
особливостями експресії клітинних рецепторів та маркерів апоптозу у
хворих, які зазнали впливу дії іонізуючого випромінювання, що є одним з
канцерогенних чинників. Співвідношення проліферації та апоптозу є
важливим параметром реакції на активуючі фактори, оскільки визначає її
результативність з точки зору імунної відповіді або формування
імунологічної толерантності [О.А. Рукавицын и др., 2004]. Окреслені
питання, обумовили напрямок проведеного дослідження, яке спрямовано на
з’ясування особливостей клітинних реакцій, що лежать в основі патогенезу
МДС.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є
самостійним завершеним комплексним науковим дослідженням. Дисертаційну
роботу виконано у структурі науково-дослідних робіт (НДР) відділу
клінічної імунології Інституту клінічної радіології (ІКР) Наукового
центру радіаційної медицини (НЦРМ) АМН України. Дисертант був
співвиконавцем наступних НДР:

1. 1998-2000 рр. НДР: „Вивчити клітинно-молекулярні механізми взаємодії
мікрооточення та імунної системи при дизгемопоетичних змінах
кровотворної системи у післяаварійний період” на замовлення АМН України
(№ держреєстрації 0198U004901).

2. 1999-2001 рр. НДР: „Вивчення закономірностей виникнення, механізмів
розвитку та особливостей перебігу найбільш розповсюджених захворювань у
постраждалих, що віднесені до критичних груп. Розробка системи
лікувально-реабілітаційних заходів, первинної та вторинної профілактики
патологічних станів” на замовлення Міністерства України з питань
надзвичайних ситуацій у справах захисту населення від наслідків
Чорнобильської катастрофи, договір № 17/11-Н-99.03 (№ держреєстрації
0199U003595).

3. 2001-2003 рр. НДР: „Вивчити механізми трансформації
мієлодиспластичного синдрому в лейкемію в осіб, які постраждали
внаслідок аварії на ЧАЕС, у віддалений період” на замовлення АМН України
(№ держреєстрації 0101U001450).

4. 2004-2006 рр. НДР: „Розробка нових програм терапії гострих лейкемій
та мієлодиспластичного синдрому у хворих, які постраждали внаслідок
аварії на ЧАЕС, з урахуванням молекулярно-генетичних аспектів цих
захворювань та множинної медикаментозної резистентності” на замовлення
АМН України (№ держреєстрації 0104U003631).

Мета дослідження. Визначити особливості клітинних реакцій:
диференціації, активації та апоптозу в елементах гемопоезу у хворих на
мієлодиспластичний синдром у віддалений період після опромінення, для
удосконалення діагностичних та прогностичних критеріїв
радіаційно-обумовлених імунологічних та гематологічних станів.

Завдання дослідження.

1. Встановити особливості імунологічного фенотипу елементів гемопоезу ПК
та КМ хворих на МДС у віддаленому періоді після дії іонізуючої радіації.

2. Дослідити особливості експресії рецепторного апарату на етапах
диференціювання лімфоцитів та можливу залежність їх від дози опромінення
при різних варіантах МДС.

3. Провести дослідження якісних та кількісних параметрів запрограмованої
клітинної загибелі в елементах ПК та КМ при різних варіантах МДС у
віддалений період після опромінення.

4. Провести порівняльний аналіз рівнів спонтанного та
верапаміл-індукованого апоптозу імунокомпетентних та гемопоетичних
клітин ПК та КМ у хворих на МДС в залежності від експресії
протеїнів-регуляторів апоптозу.

5. Вивчити особливості спонтанної та мітоген-індукованої експресії
активаційних антигенів лімфоцитів в групах УЛНА на ЧАЕС 1986 р., хворих
на МДС та опромінених осіб, які не мали гематологічної патології.

6. Встановити in vitro особливості спонтанної та мітоген-індукованої
проліферативної активності імунокомпетентних клітин ПК хворих на МДС за
розподілом по фазах клітинного циклу у віддаленому періоді після
опромінення.

Об’єкт дослідження. Периферична кров та кістковий мозок УЛНА на ЧАЕС
1986 р., опромінених в діапазоні доз від 0,04 до 0,92 Зв, хворих на МДС.

Предмет дослідження. Процеси апоптозу, активації та диференціювання в
імунній та кровотворній системах в УЛНА на ЧАЕС та хворих на МДС у
віддалений період після опромінення.

Методи дослідження. Цитофлуориметричний аналіз – визначення
субпопуляційного складу імунокомпетентних клітин (ІКК), експресії
поверхневого фенотипу ГК та експресії активаційних маркерів у прямому
імунофлуоресцентному тесті. Аналіз запрограмованої клітинної загибелі
та розподілу лімфоцитів за фазами клітинного циклу. Культуральні –
формування короткочасових культур клітин для оцінки активаційної та
проліферативної відповіді лімфоцитів на стимуляцію мітогеном –
конканаваліном А (Кон А); вплив верапамілу, як індуктора апоптозу на ГК
та ІКК ПК та КМ in vitro. Статистичні – дисперсійний аналіз та
регресійно-кореляційний аналіз за параметричними критеріями [А. Бююль,
2002; С. Гланц,1999].

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше визначено особливості
процесів запрограмованої клітинної загибелі елементів гемопоезу на
різних стадіях їх диференціювання у хворих із радіаційно-асоційованим
МДС: на підставі дослідження молекулярних перебудов цитоплазматичної
мембрани, вперше встановлено залежність рівня апоптозу у хворих на МДС
від дозових навантажень у діапазоні від 0,04 до 0,92 Зв; встановлено
порушення „апоптозної програми” нейтрофілів у хворих на МДС, що
проявляється у зниженні чутливості до дії індуктору апоптозу та
супроводжується відповідними змінами експресії поверхневих антигенів;
вперше серед УЛНА на ЧАЕС 1986 р. встановлена позитивна кореляційна
залежність між рівнем CD95 та дозою опромінення; зафіксований стан
підвищеної активності у структурно-функціональній системі феномену
запрограмованої клітинної загибелі у віддалений період після
опромінення.

Вперше отримано нові дані про особливості експресії лінійних,
диференційних та активаційних антигенів ІКК та ГК ПК та КМ хворих на МДС
у віддалений період після опромінення. Встановлено особливості
імунофенотипу популяції бластних клітин, яка характеризується експресією
CD34+, CD71+, CD117+, CD34+117+.

Вперше визначена роль імунологічних порушень у формуванні неопластичних
змін гемопоезу. Визначена доцільність використання у
клініко-діагностичній практиці оцінки імунологічної реактивності ІКК у
віддалений період після опромінення.

Практичне значення отриманих результатів. Теоретично обґрунтована
необхідність внесення змін до стратегії діагностики МДС, у т.ч. серед
постраждалого контингенту. Методично визначена інформативність
імунофенотипових параметрів ГК для діагностики та прогнозування перебігу
МДС. Запропоновано використання показників експресії CD71 та
коекспресії CD117, CD34 антигенів ранніх ГК-попередників в якості
діагностичного маркеру МДС. Розроблено новий спосіб діагностики та
прогнозування перебігу МДС: заявка на пат. № u 200706774, який базується
на використанні індексу апоптозу в якості діагностичного та
прогностичного маркеру.

Розроблені в дисертаційній роботі підходи щодо діагностики МДС з
урахуванням радіаційної компоненти, впроваджені у практику роботи
відділу клінічної імунології та відділення радіаційної гематології
дорослих ІКР НЦРМ АМН України.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено аналіз наукових
літературних даних та визначення ступеня вирішеності наукового завдання
в межах теми, обґрунтована актуальність і необхідність дослідження, його
мета і задачі, сформовано групи обстеження. Особисто розроблено алгоритм
дослідження, обґрунтовано і відібрано методи дослідження, розроблено
протокол для систематизації та фіксації результатів, структуру бази
даних. Самостійно визначений імунофенотип ГК та ІКК у групах обстеження,
встановлено особливості спонтанної та мітоген-залежної активації
лімфоцитів. Автором проведений диференційний аналіз рівня спонтанного та
індукованого апоптозу і надана оцінка розподілу лімфоцитів за фазами
клітинного циклу. Особисто проведено експериментальні дослідження in
vitro із формуванням короткочасових культур клітин. Заповнена база даних
з подальшою статистичною обробкою та аналізом отриманих результатів.
Особисто виконано написання всіх розділів дисертаційної роботи,
створення ілюстративного матеріалу та формування висновків і практичних
рекомендацій.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені
та обговорені на національних та міжнародних науково-практичних
конференціях та конгресах: IV з’їзді гематологів та трансфузіологів
України (Київ, 2001); Міжнародній конференції “П’ятнадцять років
Чорнобильської катастрофи. Досвід подолання” (Київ, 2001); 3-ей
Международной конференции “Медицинские последствия Чернобыльской
катастрофы: итоги 15-летних исследований” (Киев, 2001);
Научно-практической конференции, посвященной 70-летию Российскому НИИ
гематологии и трансфузиологии “Актуальные вопросы гематологии и
трансфузиологии” (Санкт-Петербург, 2002); The 8th Annual Meeting of EHA
Assotiation (Lion, France, 2003); Науково-практичній конференції
“Гематологія і трансфузіологія: фундаментальні та прикладні питання”
(Київ, 2005); 5th Parnas Conference (2005); 3th International Symposium:
Chronic Radiation Exposure: Biological and Heаlth Effects (Chelyabinsk,
2005); X Congress European Hematology Association (Stockholm, 2005);
Міжнародній конференції “Двадцять років Чорнобильської катастрофи.
Погляд у майбутнє” (Київ, 2006); Ювілейній науково-практичній
конференції до 20-річчя гематологічного відділення ІКР НЦРМ АМН України
“Радіаційна гематологія: етапи становлення, основні досягнення та
перспективи розвитку” (Київ, 2007); Conference “Death, Danger and
Immunity” Institut Pasteur (Paris, France, 2007); The Ninth
International Symposium on Myelodysplastic Syndromes (Florence, Italy,
2007); The 12th Congress of the European Hematology Association (Vienna,
Austria, 2007).

Публікації. За результатами досліджень опубліковано 20 наукових праць;
із них: 5 статей у фахових виданнях, 1 заявка на патент, 14 тез
доповідей (у т.ч. 7 – за кордоном).

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, 6
розділів основної частини (аналітичний огляд літератури, матеріал та
методи, три розділи результатів власних досліджень, аналіз та
узагальнення результатів дослідження) висновків, практичних рекомендацій
та списку використаних джерел. Робота ілюстрована 31 таблицею і 34
рисунками. Повний обсяг дисертації – 176 сторінок, із них 149 сторінок
складає основна частина. Список літератури викладений на 27 сторінках та
містить 258 джерел (83 кирилицею, 175 латиницею).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи дослідження. В роботі проаналізовано та узагальнено
результати досліджень у 130 осіб. Основну групу обстеження склали
пацієнти, які перебували на лікуванні у клінічних відділеннях НЦРМ АМН
України з діагнозом МДС. Клінічний діагноз та підтип МДС встановлено у
відділенні радіаційної гематології дорослих ІКР НЦРМ АМН України за
критеріями ФАБ-класифікації [H. Muller-Berndoff et al., 2006; J.M.
Bennet et al., 1982]. Загальна кількість осіб, які склали дану групу
становила 55 осіб. Відповідно до модифікованої ФАБ-класифікації, яка в
останні роки була доповнена некласифікованим варіантом МДС, обстежені
хворі були розподілені за встановленим діагнозом наступним чином:
рефрактерна анемія (РА); рефрактерна анемія із надлишком бластів (РАНБ);
рефрактерна анемія із надлишком бластів у стадії трансформації (РАНБ-Т);
некласифікований варіант МДС (МДС-Н). Для проведення аналізу підтипи МДС
були об’єднані за ступенем злоякісності та відсотком бластних клітин у
дві підгрупи:

I підгрупа – РА, МДС-Н. Вік обстежених складав 54,6±17,20 (M±SD);

II підгрупа – РАНБ, РАНБ-Т. Вік обстежених складав 56,4±13,08 (M±SD);

Серед осіб основної групи дослідження виділена група хворих на МДС, які
були УЛНА на ЧАЕС 1986 р. та зазнали впливу низьких доз іонізуючого
випромінення (від 0,04 до 0,92 Зв). Ця підгрупа склала 17 осіб. Частина
хворих обстежувалась повторно на різних етапах мієлопроліферативного
процесу. Групу порівняння склали 55 УЛНА на ЧАЕС, які перебували в 30-ти
кілометровій зоні ЧАЕС у 1986 р., опромінені в діапазоні доз від 0,01 до
0,95 Зв. Вік обстежених складав 50,0±8,86 (M±SD). В анамнезі не
встановлено інших шкідливих факторів та захворювань, які б мали вплив на
кровотворну або імунну системи. Контрольну групу склали 20 практично
здорових осіб, гематологічні та імунологічні показники яких коливались в
межах вікових норм. Середній вік складав 52,5±5,41 (M±SD). Всі особи
контрольної групи не зазнавали впливу іонізуючого випромінювання, яке б
перевищувало рівень природного радіаційного фону.

Обстеженим особам з встановленим діагнозом МДС проведено
імунофенотипування клітин ПК та КМ методом лазерної проточної
цитофлуориметрії. Субпопуляційний склад лейкоцитів та експресію
поверхневих антигенів визначали у прямому імунофлуоресцентному тесті за
допомогою панелі моноклональних антитіл (МКАТ) серії Leu фірми Becton
Dickinson (BD) методом дво- та трьохкольорового аналізу. Антитіла, були
мічені флуорусцеїнізоцианатом (FITC) та фікоеритрином (PE). За
специфічністю використані МКАТ розподілялись наступним чином: CD45/CD14
– диференціювання лімфоцитів, моноцитів та гранулоцитів; CD34, CD117,
CD71, CD10 – антигени клітин-попередників; CD33, CD13 – лінійні
мієлоїдні антигени, які експресуються на клітинах мієлоїдного походження
різного ступеня дозрівання; CD3/CD22, CD5/CD20, CD7, CD19 – визначення
загальної кількості Т- та В-клітин; CD4/CD8 – оцінка імунорегуляторних
субпопуляцій Т–лімфоцитів; HLA-DR/CD56 – оцінка цитотоксичних
Т-лімфоцитів та природних кілерів. Контролем були мікросфери “CaliBRITE”
(BD), помічені відповідно FITC чи РЕ, та МКАТ до імуноглобулінів миші
IgG1 – FITC / IgG2a – PE.

Зразки готували за рекомендаціями по використанню набору Acute Leukemia
Phenotyping Kit (BD, США). За стандартним протоколом аналізу даних
проточної цитометрії пряме (FSC) та бокове (SSC) світлорозсіювання було
використано для виділення трьохчасткового диференціювання популяцій
клітин. Визначення інтенсивності флуоресценції (ІФ) у зеленому спектрі
(FITC) – перший канал флуоресценції (FL1) та у червоному спектрі (PE) –
другий канал флуоресценції (FL2) проводили у логарифмічному режимі.
Коефіцієнти електронної компенсації спектрів флуоресценції складали 0,7%
для FL1 та 18% для FL2. Аналіз проводили на лазерному проточному
цитофлуориметрі FACScan (BD, США). Для збудження використовували
аргоновий лазер потужністю 25мВт (довжина хвилі 488 нм). Первинний
аналіз проводили з використанням програми збору та обробки даних Lysis
II.

Проліферативний потенціал ІКК досліджували в короткочасовій 24-годинній
культурі. Використовували мітоген конканавалін А (Кон A) у концентрації
5 мкг/мл. Суспензію клітин готували у концентрації 5Ч106 клітин/мл в
повному живильному середовищі на основі RPMI-1640 („SIGMA”, США),
L-глутаміну – 300 мкл/мл, гентаміцину – 60 мкг/мл („PHARMACHIM”,
Болгарія), HEPES („SIGMA”, США). В об’ємі 200 мкл 96-лункового
плоскодонного планшету суспензію клітин інкубували з Кон A при
температурі 37°С та зволоженій атмосфері з 5% СО2. Після інкубації
суспензію клітин переносили до пластикових пробірок для цитометричного
аналізу та проводили лізис еритроцитів з використанням Lysing Solution
(BD, США).

Активаційну відповідь оцінювали за кількістю клітин, які експресують на
своїй мембрані маркери активації (МА), а саме: аnti-CD25, аnti-CD71,
аnti-HLA-DR, anti-CD38. Оцінка здатності лімфоцитів відповідати на
мітоген проводилась за коефіцієнтом активації, який обчислювали окремо
для кожного МА, як відношення відсотку клітин, які експресують МА після
інкубації з мітогеном, до відсотку клітин, що експресують МА спонтанно.

Для оцінки проліферативної активності лімфоцитів використовували метод
розподілення клітин за фазами клітинного циклу. Після культивування
проводили пермабілізацію клітинних мембран лімфоцитів за допомогою
Permeabilizing Solution (BD, США). Як наслідок – інтеркалюючий барвник
пропідію йодид (PI) вільно проникає у клітини і зв’язується з ДНК.
Суспензію клітин з PI у концентрації 5 мкг/мл інкубували 20 хв. у
темряві. Аналіз проводили за допомогою проточної цитофлуориметрії шляхом
оцінки червоного спектру флуоресценції (FL2) PI для 10000 клітин.
Визначали процент гіподиплоїдних клітин (апоптотичні клітини),
диплоїдних клітин (фази G0/G1) та відсоток тетраплоїдних клітин у S/G2
фазах клітинного циклу.

Визначення спонтанного та верапаміл-індукованого апоптозу проводили за
допомогою системи для визначення деформацій (перебудов) клітинних
мембран, що супроводжують запрограмовану клітинну загибель – Annexin
V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD, США). Забарвлення проводили
згідно з протоколом рекомендованого фірмою-виробником. Апоптоз також
оцінювали шляхом підрахунку індексу апоптозу, який обчислювали як
співвідношення анексин-V+PI- клітин до загальної кількості клітин в
регіоні [Qi-Zhen Cao et al., 2005].

Для активації апоптотичних процесів використовували блокатор кальцієвих
каналів верапаміл у концентрації 100 мМоль/л. Клітини ПК інкубували в
загальному об’ємі 200 мкл у 96-лунковому планшеті протягом 5 годин при
температурі 370С та зволоженій атмосфері з 5 % СО2. До комплексу
досліджень спонтанного апоптозу входило визначення відсотку маркеру
запрограмованої клітинної загибелі – CD95 (Fas-рецептор) (BD, США).
Паралельно проводили внутрішньоклітинне визначення антиапоптогенних
молекул Bcl-2 (BD, США). Підготовку зразків проводили за стандартною
методикою для прямого імунофлуоресцентного тесту.

Первинні дані були отримані з використанням програми WinMDI 2.8.
Статистичний аналіз та презентацію отриманих результатів проводили у
форматі пакету для статистичної обробки даних SPSS 15.0.

Аналіз і узагальнення результатів досліджень. Проведено аналіз
популяційного складу лейкоцитів ПК хворих на МДС, з використанням МКАТ
до диференційних антигенів CD14 та CD45. Рівень експресії CD45 антигену
знижений на клітинах гранулоцитарного ряду при всіх підтипах МДС, що в
зв’язку з участю CD45 у процесах активації клітин та утворення клітин
пам’яті, може розцінюватись, як прояв імунологічної недостатності.
Незміненим залишається цей показник серед клітин лімфоїдного регіону. В
клітинах моноцитарного ряду встановлено підвищення відсоткового вмісту
CD45–14+ клітин, особливо у підгрупі хворих на РАНБ, РАНБ-Т, порівняно з
контролем. Порівняльний аналіз популяційного складу ПК та КМ хворих на
МДС показав при всіх варіантах значне зниження експресії CD45 антигену
на клітинах лімфоїдного ряду КМ. Гранулоцити КМ у підгрупі хворих на РА,
МДС-Н були представлені домінуючою популяцією з високою експресією CD45,
що можна розцінювати як прояв процесів дисгранулоцитопоезу. Характерною
особливістю КМ у підгрупі, яка об’єднує хворих на РАНБ, РАНБ-Т, є
підвищення відсоткового вмісту CD45+14– бластних клітин порівняно із ПК,
що корелює із критеріями FAB-класифікації МДС [J.M. Bennet et al.,
1982]. Проведений аналіз популяційного складу ПК та КМ за показниками
бокового світлорозсіяння – SSC. Зафіксована наявність популяцій
гранулоцитів із зниженою гранулярністю за рахунок мієлобластів у ПК та
КМ хворих на МДС. Гіпогранулярність в регіоні гранулоцитів КМ має більш
виражений характер порівняно з ПК.

Застосування широкої панелі МКАТ дозволило провести дослідження
експресії лінійних та диференційних антигенів у групах обстеження. При
аналізі даних імунофлуоресценції визначали відсоток позитивних клітин та
інтенсивність експресії досліджуваних антигенів. Проведений аналіз
показав наявність порушень експресії лінійних, диференційних та
активаційних антигенів клітин кровотворної системи у хворих на МДС.
Вміст клітин з експресією диференційних антигенів Т-лімфоцитів, а саме
CD5+, CD3+, CD7+, був стабільним. Поряд з цим показники ІФ Т-клітинних
диференційних антигенів лімфоцитів були достовірно знижені. Зміни
рецепторного апарату Т-клітин у хворих на МДС свідчать про функціональну
недостатність цієї ланки лімфоїдного ряду і можуть бути відображенням
переходу до мієлодиспластичного стану. Субпопуляційний склад ІКК
характеризувався достатнім рівнем зрілих CD4+ та CD8+ лімфоцитів. Однак,
спостерігається тенденція до зростання популяції CD8+ клітин у поєднанні
із зниженням вмісту CD4+ клітин. Відмічено зростання CD56+ клітин у
підгрупі хворих на РАНБ, РАНБ-Т та CD56+DR+ при всіх варіантах МДС.
Активація гомофільної молекули міжклітинної адгезії CD56+ не виключає
реципрокну депресивну дію на елементи гемопоезу шляхом зміни продукції
розчинних ростових факторів. Зазначений дефект може відображати
спільність механізмів дисгемопоезу, який спостерігається при МДС, а
також процесів диференціювання ІКК. Поряд з цим зафіксоване зниження ІФ
CD56 антигену, що пов’язано з відповідними порушеннями функціональної
активності натуральних кілерів (CD56+) при всіх варіантах МДС та має
особливе значення у формуванні непластичних змін гемопоезу. Однак, не
можна виключити, що порушення в імунній системі – лише наслідок хвороби.
З метою встановлення внеску радіаційного чинника у формування
патологічних станів імунної системи у хворих на МДС, проведено аналіз
субпопуляційного складу ІКК у трьох групах обстеження: групі
нозологічного контролю (неопромінені хворі на МДС); хворих на МДС-УЛНА
на ЧАЕС 1986 р.; УЛНА на ЧАЕС 1986 р. без гематологічних патологій. У
групі нозологічного контролю спостерігали зростання кількості CD4–8+
клітин на фоні зниження CD4+8– клітин. Протилежний характер змін
зафіксовано серед УЛНА на ЧАЕС та хворих на МДС з дозовим навантаженням.
Виявлено негативну кореляцію між дозою опромінення та відносною
кількістю Т-супресорів серед цієї категорії осіб (r = –0,634; р<0,01) і позитивний кореляційний зв'язок між дозою опромінення та вмістом Т-хелперів (r = 0,622; р<0,13). Результати проілюстровано на рис 1. Б. Рис. 1. Діаграма розсіяння із регресійною прямою дози опромінення та експресії CD4 (А), CD8 (Б) антигенів лімфоцитарної популяції ПК у хворих на МДС-УЛНА на ЧАЕС 1986 р. Проведений аналіз В-клітинних диференційних антигенів ПК при МДС. Субпопуляційний аналіз В-клітин змінювався за рахунок збільшення числа ранніх CD19+10+ клітин. Доказом прихованого дефекту В-клітинної ланки імунітету є різноспрямовані порушення показників ІФ, які характерні для всіх варіантів МДС. Виявлені зміни непрямо вказують на наявність порушень імунної відповіді, які можуть проявлятися на етапах рецепції антигену та відображати складні зміни клітинної взаємодії. Для перевірки останнього припущення було проведене дослідження експресії основних антигенів гранулоцитів, які є своєрідними елементами мікрооточення для ІКК. Також гранулоцитарна популяція викликає особливу зацікавленість, оскільки однією з гіпотез патогенезу МДС є ураження раннього мієлоїдного попередника [W.R. Gerritsen et al., 1992; W.M. Todd et al., 2002]. При вивченні гранулоцитарних лейкоцитів ПК встановлено, зокрема, зменшення експресії антигенів CD10, CD33, CD13, які є специфічними маркерами даної популяції клітин. Нами отримані дані, які є непрямим доказом порушень клітинного диференціювання, а саме: зростання рівня коекспресії HLA-DR та CD13 антигенів, що не властиво даній популяції, а також наявність лімфоїдного антигену CD19 та зростання рівня експресії ранніх В-клітинних маркерів – CD10+19+ на клітинах гранулоцитарного ряду. Оцінка лінійних антигенів гранулоцитарної популяції показала зниження експресії CD33 антигену в групі хворих на МДС, які були УЛНА на ЧАЕС 1986 р. Подібний напрямок змін відмічено серед HLA-DR–13+ клітин. Такі відхилення, порівняно з контрольною групою, мають місце серед УЛНА на ЧАЕС 1986 р., які не мали гематологічних змін у ПК та хворих на МДС-УЛНА на ЧАЕС 1986 р. Мінімальні значення CD13 антигену, який презентований на гранулоцитах ПК, мають групи з дозовим навантаженням. Відносні показники HLA-DR+13+ клітин, які максимально відрізняються від нормативних значень, також зафіксовано серед груп з дозою опромінення до 1 Зв. Такі зміни імовірно є відображенням дисгранулопоезу у віддалений період після опромінення. Результати представлено на рис. 2. Б. Рис. 2. Зміни експресії CD13 (А) та коекспресії CD13/HLA-DR (Б) антигенів на гранулоцитах ПК осіб, хворих на МДС в залежності від дози опромінення. Проліферація бластних клітин є прогностичним фактором трансформації МДС у гостру лейкемію [В.А. Бышук и др., 2002]. З огляду на це, нами проведена порівняльна імунофенотипова характеристика популяцій клітин мієлоїдного походження та бластних клітин у ПК та КМ хворих на МДС. У дослідженій фракції гранулоцитарних клітин серед хворих на РАНБ, РАНБ-Т відсоток CD34+ клітин був достовірно підвищений, що дає нам змогу припустити наявність клітин з різним ступенем диференціювання. Встановлено зниження рівня CD38+ клітин, що є характерною ознакою обмеженої диференційної здатності. Із зростанням експресії CD34 антигену корелює значне збільшення кількості CD117+ клітин, р<0,01. При всіх варіантах МДС значно підвищений рівень HLA-DR у КМ порівняно з ПК, що не є властивим для даної популяції в нормі. Спостерігається зростання CD71+ клітин на мембрані КМ хворих на МДС. На думку деяких дослідників цей антиген є дискримінуючим маркером бластних клітин [M. Maynadie et al., 2002]. Зростання функціональної активності ранніх клітин мієлоїдного ряду виявлено через підвищення показників ІФ деяких антигенних детермінант. За цим показником нами відмічено односпрямовані зміни у КМ при всіх варіантах МДС антигенів CD117, CD33, CD34, CD71, порівняно з ПК. Лише рівень середніх показників ІФ для популяції CD38+ клітин відрізняє досліджені підгрупи. При РА, МДС-Н цей показник у КМ не відрізняється від середньогрупових значень у ПК, натомість серед хворих на РАНБ, РАНБ-Т рівень ІФ CD38 антигену достовірно зростає, р<0,01. Популяція бластів КМ хворих на МДС представлена CD34+, CD71+, CD117+, CD117+34+ клітинами (табл.1). Таблиця 1 Порівняльна характеристика експресії антигенів гемопоетичних клітин периферичної крові та кісткового мозку хворих на МДС Показники, (%) I підгрупа РА/МДС-Н (n=31) M±SD IІ підгрупа РАНБ/РАНБ-Т (n=24) M±SD ПК КМ ПК КМ CD34+ 0,4±0,30 1,1±0,13* 1,1±0,29 68,0±7,08* CD71+ 12,2±2,06 24,4±3,06* 5,6±2,44 23,0±3,61* CD117+ 0,8±0,21 5,2±0,12* 1,8±0,51 11,8±3,01* CD117+34+ 0,4±0,04 1,3±0,04* 1,0±0,02 65,0±11,20* Примітка.*– вірогідність розбіжностей показників ПК та КМ р<0,01. Імунофенотипічна картина КМ при РАНБ, РАНБ-Т насамперед характеризувалася високим рівнем експресії CD34 антигену – 68,0±7,08 (M±SD). Натомість, відсутня кореляція між кількістю бластів та CD34+ клітин, що дає змогу припустити наявність аномальної персистенції експресії цього антигену на клітинах, що дозрівають. Поряд з цим для бластних клітин характерна коекспресія CD117 та CD34 антигенів. Наявність CD71 антигену свідчить про порушення в еритроїдному паростку кровотворення. Високий рівень експресії CD71, CD117 та коекспресії CD117, CD34 антигенів, на нашу думку, може мати діагностичне значення. Оскільки при імунофенотипічному аналізі КМ у досліджених підгрупах визначалися бластні клітини, які презентували схожий набір антигенних детермінант порівняно з популяцією гіпогранулярних нейтрофілів, нами запропоноване припущення про мієлоїдне походження бластів. 8 , . 0 2 4 6 8 : < T V ‚ „ e 8 : T V ‚ „ P t ? ? ° ? i ’ ” ae ae e '? ” ae ae e e i 6 8 : Z – - \ ae.Ae1ooo»?????????????? ?? ?? ?? ?? ?? ?? WNNBBB ітин у поєднанні із зниженням вираженості апоптозу у гранулоцитах хворих на МДС, що може бути пов’язаним із негативним прогнозом, первинною резистентністю до хіміотерапії і відповідно скороченням тривалості життя. Проведена порівняльна характеристика рівнів експресії CD95 та Bcl-2 у ПК та КМ хворих на МДС. Картина, яка спостерігалася у КМ в обстежених підгрупах, мала протилежний характер, ніж у ПК. Різноспрямованість процесів у ПК та КМ знайшла відображення як у зниженні відсоткового вмісту Bcl-2, так і зростанні експресії CD95-рецептора. У підгрупі хворих на РАНБ, РАНБ-Т підвищення рівня експресії CD95 на ГК КМ корелює з рівнем експресії CD34-рецептора. Враховуючи важливу роль Fas-рецептора у реалізації запрограмованої клітинної загибелі, такий зв’язок може стати відображенням аномальної програми гемопоезу при мієлодисплазіях. Наступний етап у напрямку вивчення особливої ролі апоптозу у патогенезі МДС пов’язаний із специфічними структурно-молекулярними перебудовами, які характерні для клітини у стані запрограмованої клітинної загибелі [А.А. Болдырев и др., 2005]. Проведене нами дослідження було побудоване на визначенні сформованих молекул фосфатидилсерину шляхом взаємодії з анексином-V (рис. 3). Кількість анексин-V+PI– клітин гранулоцитарного ряду ПК підвищена за рахунок клітин на пізніх стадіях апоптозу. Відсоток анексин-V+PI– та анексин-V+PI+ серед клітин лімфоїдного ряду КМ був вищий ніж у ПК при всіх підтипах МДС. Рівень апоптотичних клітин у гранулоцитарній популяції КМ також зростав, однак у підгрупі, яка об’єднує хворих на РАНБ, РАНБ-Т цей показник був знижений, порівняно з підгрупою хворих на РА, МДС-Н. Знижений рівень апоптозу може пояснити більш високий ступінь трансформації в ГЛ. Найвищий ступінь апоптозу у нашому дослідженні був зафіксований у бластних клітинах КМ, що підтверджується високими середньогруповими значеннями індексу апоптозу, який був підрахований згідно з рекомендаціями Qi-Zhen Cao et al., 2005. Низький апоптотичний індекс встановлений для підгрупи хворих на РАНБ, РАНБ-Т імовірно пов’язаний з негативним прогнозом даних варіантів МДС. Б. Рис. 3. Дискримінаційний аналіз стадій запрограмованої клітинної загибелі в нормі (А) та МДС (Б). 1-й квадрат – клітини мічені тільки PI (початкова стадія некрозу); 2-й квадрат – клітини, які мічені як PI, так і анексином-V-FITC (пізні стадії апоптозу); 3-й квадрат – клітини, які не мічені ні PI, ні анексином-V-FITC (живі клітини); 4–й квадрат – клітини мічені тільки анексином-V-FITC (ранні стадії апоптозу). Відомий зв’язок між ростом популяції пухлинних клітин та своєчасним запуском запрограмованої клітинної загибелі [В.И. Петухов, 2000; A. Parcharidou et al., 1999]. Тим важливішим є вибір способів індукції апоптозу. У нашому дослідженні верапаміл був використаний як індуктор апоптозу у клітинах ПК та КМ in vitro в групах дослідження та проведена оцінка особливостей відповіді ІКК при МДС. Серед отриманих результатів слід звернути увагу на ті, що продемонстрували нечутливість до дії індукторів апоптозу гранулоцитарної популяції ПК, що може свідчити про запрограмованість на інший шлях розвитку, який не передбачає елімінації пухлинного клону клітин шляхом апоптозу, і як наслідок може бути пов’язаний з високим ризиком трансформації у ГЛ. Клітини КМ мієлоїдного ряду у нормі не запрограмовані на загибель шляхом апоптозу [Н.А. Маянский, 2001], однак з отриманих нами результатів саме цей паросток кровотворення мав максимальну відповідь на індуктор апоптозу, що свідчить про порушення рецепторного апарату та диференціювання серед ГК КМ. Серед питань, які були розглянуті, особливий інтерес представляють реакції запрограмованої клітинної загибелі серед хворих на МДС, у віддалений період після опромінення. З часом збільшується доля патологічних процесів, що базуються на підсиленні апоптозу, яке викликане дією зовнішніх апоптогенних факторів. На першому місці серед них знаходиться іонізуюча радіація. Є свідчення про підвищення при дії іонізуючої радіації в низьких дозах ключових регуляторів апоптозу [D.E. Fisher et al., 1994; M.E. Peter et al., 1998], що знайшло відображення у нашому дослідженні. У групі УЛНА на ЧАЕС спостерігається підвищена готовність лімфоцитів до Fas-опосередкованого апоптозу. Показники відсоткового рівня Fas-позитивних клітин у хворих на МДС з радіаційним навантаженням були найвищими порівняно з контрольною групою та групою УЛНА на ЧАЕС. В умовах виявленої низької експресії антиапоптотичних систем, представником яких є Bcl-2, можуть спрацьовувати сигнали до розвитку апоптозу особливо при радіаційному ураженні лімфоцитів. Апоптоз в даному випадку є захисним механізмом у процесі формування канцерогенних ефектів. Підтвердженням такого припущення є позитивна кореляційна залежність, яка встановлена між рівнем CD95+ клітин та дозою опромінення в групі УЛНА на ЧАЕС (r = 0,63; р<0,05). Поряд із зростанням рівня експресії CD95 антигену та Bcl-2+ клітин ПК в групах УЛНА на ЧАЕС та хворих на МДС, які були ліквідаторами 1986 р., інтенсивність їх флуоресценції доволі знижена. Тобто, незважаючи на готовність лімфоцитів до вступу в апоптоз, внутрішньоклітинні сигнали, які формуються в результаті імовірних дефектів генетичного матеріалу внаслідок радіаційного впливу, можуть блокувати пусковий механізм запрограмованої клітинної загибелі. Існують сучасні повідомлення щодо змін ліпідно-білкового взаєморозташування у мембранах лейкоцитів УЛНА на ЧАЕС [А.Н. Коваленко и др., 2004; V.P. Chirnishov et al., 2000]. Структурні перебудови клітинних мембран супроводжуються порушеннями їх функцій та мембран-залежних процесів, що може змінювати трансмембранний іонний транспорт, міжклітинну взаємодію, стимулювати апоптоз. Нами проведене визначення сформованих молекул фосфатидилсерину шляхом взаємодії з анексином-V. Відсоток як анексин-V+PI–, так і анексин-V+PI+ клітин в групі УЛНА на ЧАЕС 1986 р. не змінювався, на відміну від групи хворих на МДС з дозовим навантаженням, в якій зростання цих показників, імовірно пов’язано зі специфікою хвороби. ІФ анексин-V+PI– клітин в групах УЛНА на ЧАЕС та хворих на МДС, які були ліквідаторами 1986 р., характеризувалась значно підвищеними значеннями, порівняно з контролем. Зазначимо, що in vitro відповідь лімфоцитів на індукцію апоптозу верапамілом була значно інтенсивнішою, як в групі УЛНА на ЧАЕС, так і серед хворих на МДС, які були УЛНА на ЧАЕС 1986 р. (рис. 4). Така реакція свідчить про стан підвищеної активності у структурно-функціональній системі феномену запрограмованої клітинної загибелі у віддалений період після опромінення. Відомо, що апоптоз поряд з процесом проліферації є формою відповіді лімфоцитів на активаційні стимули [М.Ф. Никонова и др., 1999]. З огляду на це, нами проведений аналіз активаційних процесів ІКК в групах контролю, УЛНА на ЧАЕС та хворих на МДС у віддалений період після опромінення. Рис. 4. Характеристика експресії анексин-V+PI– клітин у лімфоцитах периферичної крові УЛНА на ЧАЕС та хворих на МДС з дозовим навантаженням після інкубації з верапамілом. Першим етапом у вирішенні поставленої задачі був розгляд активаційних процесів, які оцінювали за даними спонтанної та мітоген-залежної експресії активаційних маркерів, таких як HLA-DR, CD25, CD71, CD25, CD38. Серед хворих на МДС, які не мали радіаційної компоненти в анамнезі хвороби, встановлено значне зростання рівня спонтанної експресії HLA-DR та коекспресії HLA-DR і CD38 антигенів. Така тенденція характерна і для опромінених осіб. Поряд із зростанням відносної кількості HLA-DR+ клітин, показники ІФ даного маркеру активації значно знижені серед хворих на МДС. Лише серед УЛНА на ЧАЕС 1986 р. цей показник залишається в межах контрольних значень. Подібна картина змін щільності розташування спостерігається для рецептору до ІЛ-2. Однак такі зміни ІФ відбуваються на фоні зниження спонтанної експресії рецепторів до ІЛ-2, які характерні лише для груп з дозовим навантаженням, що дає змогу пов’язати такі зміни з радіаційною складовою. Середні значення вмісту активованих Т-хелперів з коекспресією CD25 антигену достовірно знижені лише у групі хворих на МДС, які були УЛНА на ЧАЕС 1986 р. (доза опромінення від 0,04 до 0,92 Зв). Отримано різноспрямовані дані спонтанної експресії рецепторів до трансферину (CD71). У групі хворих на МДС встановлено підвищений рівень CD71+ клітин (р<0,01), тоді як серед опромінених осіб з мієлодисплазією середньогрупові значення даного показника мали тенденцію до зниження. Аналогічний напрямок змін спостерігається серед показників ІФ. У групі УЛНА на ЧАЕС на фоні зниження показників відносної кількості CD71+ клітин подібним чином змінюються показники ІФ. Вважається, що мітогенна стимуляція лімфоцитів in vitro досить близько відтворює активацію специфічними антигенами. За даними аналізу мітоген-залежної активації, після стимуляції Кон А у здорових осіб спостерігали зростання відносного рівня CD38+ та HLA-DR+ CD38+ клітин. Подібний напрямок змін, однак, лише для CD38 антигену, відмічався у групах хворих на МДС, як з дозовим навантаженням, так і за відсутності такого. Зазначимо, що для групи УЛНА на ЧАЕС 1986 р. експресія даних рецепторів не змінювалась порівняно з вихідними показниками. Показники ІФ HLA-DR зростають у відповідь на мітогенну стимуляцію у всіх групах обстеження, за виключенням групи хворих на МДС УЛНА на ЧАЕС 1986 р. Після стимуляції Кон А спостерігається збільшення вмісту та рівня ІФ CD4–25+ та CD4+25+ клітин з високим ступенем вірогідності (р<0,01) серед всіх груп обстеження, що імовірно пов’язано із збільшенням виходу цитокінів, у т.ч. ІЛ-2. Однак, підвищення експресії CD25+ антигену серед УЛНА на ЧАЕС 1986 р. відбувається за рахунок CD4+ клітин, тоді як для групи хворих на МДС експресія рецептору до ІЛ-2, стимульованих мітогеном, підвищена за рахунок Т-супресорів. Імовірно при впливі Кон А спрацьовують більш пізні ефекти активаційної відповіді під впливом ІЛ-2, джерелом якого є Т-хелпери. Особливий інтерес з точки зору активаційної відповіді представляє антиген CD71. Незважаючи на те, що вихідний рівень експресії рецептору до трансферину в групах хворих на МДС був високим, відповідь на мітоген не була такою значною, як серед здорових осіб. Поряд з цим ІФ даного антигену після стимуляції також різко знижена, що імовірно пов’язано з функціональними порушеннями цієї групи рецепторів та є результатом значних дисгемопоетичних змін, які відбуваються у КМ при даній патології. Протилежний характер змін ІФ CD71 рецептору спостерігається серед УЛНА на ЧАЕС, опромінених у діапазоні доз від 0,01 до 0,95 Зв. Після стимуляції Кон А ІФ рецептору до трансферину, також як інших маркерів активації (МА) значно зростає, що свідчить про високий активаційний потенціал лімфоцитів у даній групі обстеження. Порушення спонтанної та мітоген-залежної активації знаходять відображення у розрахованих КА для кожного з МА. Надмірна інтенсивність активаційної відповіді CD25 антигену відмічена в осіб хворих на МДС з дозовим навантаженням та УЛНА на ЧАЕС 1986 р., що свідчить про напруженість цієї ланки рецепторного апарату і, можливо, є наслідком дії низьких доз іонізуючого опромінення у віддалений період. Особливості проліферативної активності лімфоцитів у групах обстеження встановлено за даними аналізу клітинного циклу до та після стимуляції Кон А. Виявлено, що у здорових осіб співвідношення між процесами проліферації та апоптозу дорівнює близько 1. У групі хворих на МДС характерним є підвищений рівень клітин у стані програмованої клітинної загибелі, що відповідає особливостям патогенезу даного захворювання. За даними порівняльного аналізу показників клітинного циклу в осіб з дозою опромінення до 1 Зв, як з мієлодиспластичною патологією, так і в УЛНА на ЧАЕС 1986 р. без гематологічних відхилень, виявлено високий рівень гіподиплоїдних клітин. Відсоток лімфоцитів у S / G2 фазах серед груп з дозовим навантаженням достовірно не змінений. Дослідження перерозподілу лімфоцитів за фазами клітинного циклу після інкубації з Кон А вказує на зміни проліферативних потенцій в залежності від групи обстеження. Для осіб контрольної групи характерне рівномірне зростання двох альтернативних процесів: апоптозу та проліферації. В групах УЛНА на ЧАЕС 1986 р. та хворих на МДС з дозовим навантаженням вираженість апоптозу значно зростала порівняно з контролем. Однак, достовірне зростання проліферативної активності за рахунок переходу лімфоцитів до S / G2 фаз клітинного циклу відмічено лише серед УЛНА на ЧАЕС 1986 р., опромінених у діапазоні доз від 0,01 до 0,95 Зв. У хворих на МДС при відповіді на мітоген пріоритетним є перехід клітин до стану активаційного апоптозу, а не за рахунок клітин у S / G2 фазах (рис. 5). Б. Рис. 5. Гістограма розподілення лімфоцитів за вмістом ДНК після стимуляції Кон А у контрольній групі (А) та хворих на МДС-УЛНА на ЧАЕС 1986 р. (Б). М1–гіподиплоїдні клітини (апоптоз), М2 – G0, М3 – G1, М4 – G2/S фази клітинного циклу. Таке явище можна пояснити особливостями патогенезу цього захворювання, при якому ще на рівні КМ відбувається порушення проліферативної активності та зростання рівня апоптозу в клітинах попередниках гемопоезу. Очевидною є конкуренція двох форм реакції на мітоген у формуванні проліферативної відповіді у групах, які зазнали впливу низьких доз іонізуючого випромінювання у віддалений період після опромінення. На фоні інтенсивної активаційної відповіді та порогових значень компенсаторних реакцій серед осіб, які підлягали впливу низьких доз іонізуючого випромінювання, можна припустити виникнення фазових порушень імунологічної реактивності в умовах дезорганізації адаптивного регулювання. ВИСНОВКИ У дисертації теоретично обґрунтовано та експериментально підтверджено вирішення актуального науково-прикладного завдання радіобіології, що полягає у розкритті особливостей клітинно-молекулярних реакцій, які лежать в основі патогенезу МДС, а також значення опромінення в діапазоні низьких доз (від 0,04 до 0,92 Зв) у формуванні гемато- та імунопатологічних станів у віддалений період після опромінення. 1. У віддалений період після опромінення імунофенотипова характеристика ГК у хворих на МДС, свідчить про ознаки порушення клітинного диференціювання. Для клітин мієлоїдного ряду: встановлений знижений рівень експресії антигенів CD10, CD33, CD13 та аномальну коекспресію HLA-DR та CD13- антигенів на клітинах гранулоцитарної популяції хворих на РАНБ та РАНБ-Т. Для клітин лімфоїдного ряду: збільшення числа ранніх CD19+10+ клітин та різноспрямовані порушення показників ІФ, які характерні для всіх варіантів МДС. 2. Встановлено особливості імунофенотипу популяції бластних клітин у хворих на МДС, яка характеризується експресією CD34+, CD71+, CD117+, CD34+117+ антигенів та має мієлоїдне походження. Відсутність кореляції між кількістю бластів та вмістом CD34+ клітин дозволяє припустити наявність аномальної персистенції експресії даного антигену на клітинах, що дозрівають. 3. У віддалений період після опромінення у хворих на МДС визначені зміни рецепторного апарату Т-лімфоцитів: перерозподіл імунорегуляторних популяцій CD4+ та CD8+ клітин, зниження функціональної активності натуральних кілерів (CD56+). Визначено негативну кореляцію між дозою опромінення та кількістю CD8+ Т-лімфоцитів у групі хворих на МДС (РА), опромінених у діапазоні доз від 0,04 до 0,92 Зв. 4. Встановлено зміни ліпідно-білкового взаєморозташування у мембранах лейкоцитів УЛНА на ЧАЕС 1986 р., хворих на МДС, які виявлялись у зростанні відсотку анексин-V+PI– та анексин-V+PI+ клітин. Серед цієї групи встановлено: підвищений рівень експресії Fas-рецептору на фоні послаблення ІФ та позитивна кореляційна залежність між рівнем CD95 та дозою опромінення, що свідчить про порушення у структурно-функціональній системі феномену апоптозу у віддалений період після опромінення. 5. Виявлена негативна кореляційна залежність між рівнем CD95+ та Bcl-2+ клітин гранулоцитарного ряду ПК хворих на МДС відповідає характеру взаємодії досліджених складових у процесі Fas-опосередкованого апоптозу. Поряд з цим встановлена аномальна експресія CD95 антигену на фоні зниження експресії Bcl-2 білків на клітинах лімфоцитарного та гранулоцитарного рядів КМ, що є наслідком дисгемопоетичних процесів при мієлодисплазіях. 6. Зафіксований високий індекс апоптозу у популяції бластних клітин хворих на РАНБ та РАНБ-Т. Серед цієї категорії хворих втановлено позитивний кореляційний зв'язок між рівнем експресії CD95 та CD34 антигенів ГК КМ, що є відображенням аномальної програми гемопоезу при мієлодисплазіях та спричинювати первинну резистентність до хіміотерапії. 7. Для нейтрофільної субпопуляції клітин ПК хворих на РАНБ та РАНБ-Т встановлена нечутливість до дії верапаміла, що свідчить про запрограмованість на інший шлях розвитку, який не передбачає елімінації пухлинного клону клітин шляхом апоптозу, і, як наслідок, може бути пов’язаний з високим ризиком трансформації у ГЛ (еритро-мієлоїдного або мієло-моноцитарного походження). Відповідь на індукцію апоптозу клітин гранулоцитарного ряду КМ характеризувалась значним зростанням відсотку клітин на ранніх стадіях апоптозу, що є доказом порушення рецепторного апарату та диференціювання ГК КМ. 8. У віддалений період після опромінення в групі УЛНА на ЧАЕС, хворих на МДС, виявлено поєднання високих рівнів спонтанної експресії рецепторів інтерлейкіну-2 та трансферину з низькою мітоген-залежною відповіддю. В групі УЛНА на ЧАЕС з дозами опромінення від 0,01 до 0,95 Зв без гематологічної патології на ранніх етапах активації встановлено значне підвищення презентації активаційних антигенів лімфоцитів. 9. Встановлено конкурентні відносини двох форм реакції на мітоген: проліферації та активаційного апоптозу в групах обстежених осіб, які зазнали дії низьких доз іонізуючого випромінювання у віддалений період. Підвищений вихід гіподиплоїдних клітин, зумовлений дією мітогену на популяцію лімфоцитів, характерний для осіб, хворих на МДС, опромінених у діапазоні доз від 0,04 до 0,92 Зв. Достовірне зростання проліферативної мітоген-індукованої активності за рахунок переходу лімфоцитів до S / G2 фаз клітинного циклу відмічене лише серед УЛНА на ЧАЕС 1986 р., опромінених у діапазоні доз 0,01 до 0,95 Зв. ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ 1. До комплексу обстежень хворих на МДС рекомендовано включати визначення імунофенотипу клітин ПК та КМ, що дозволяє отримати додаткову інформацію у диференційній діагностиці та формуванні прогностичних груп. 2. Ступінь ризику трансформації МДС у ГМЛ рекомендовано оцінювати за відносною кількістю бластів КМ, які експресують CD34, CD71, CD117 антигени. 3. Співвідношення показників проліферації та активаційного апоптозу рекомендовано використовувати в якості об’єкта направленого впливу імуномодулюючих засобів при мієлодисплазіях та імунопатологіях різного генезу, зокрема радіаційного. 4. Для вдосконалення діагностики та підвищення надійності прогнозування перебігу радіаційно-асоційованих МДС доцільно проводити визначення якісних та кількісних показників апоптозу за допомогою проточної цитометрії з використанням комбінації анексину-V (FITC) і PI (РЕ) та підрахунку індексу апоптозу. СПИСОК НАУКОВИХ РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ 1. Клінічна, морфологічна та імунологічна характеристика мієлодиспластичного синдрому у осіб, які постраждали внаслідок аврії на Чорнобильській АЕС, у віддалений період / Т.Ф. Любарець, С.В. Клименко, Д.А. Базика, І.В. Бєлінська, І.М. Ільєнко // Проблеми радіаційної медицини та радіобіології. – 2003.– вип. 9.– С. 57–60. 2. Базика Д.А., Любарець Т.Ф., Ільєнко І.М. Особливості апоптозу пацієнтів з мієлодиспластичним синдромом, які постраждали від наслідків Чорнобильської катастрофи // Проблеми радіаційної медицини та радіобіології. – 2004. – вип.10. – С.136–141. 3. Клінічні та імунологічні особливості мієлодиспластичного синдрому в осіб, які постраждали в результаті аварії на ЧАЕС, у віддаленому періоді / Д.А. Базика, В.І. Клименко, Т.Ф. Любарець, І.М. Ільєнко, Н.В. Бєляєва // Проблеми радіаційної медицини та радіобіології. – 2005. – вип. 11. – С. 50–54. 4. Експресія молекул апоптозу FAS та BCL–2 при радіаційно-асоційованих гострих мієлоїдних лейкеміях / В.Г. Бебешко, Д.А. Базика, С.В. Клименко, О.Л. Мазниченко, Н.А. Голярник, О.В. Лясковська, І.М. Ільєнко, Н.М. Третяк, О.О. Вдовцов, Т.М. Сербіненко, Т.Б. Зубрицька, В.Н. Зінченко // Український журнал гематології та трансфузіології. – №1. – 2005. – С. 28–33. 5. Детерминанты множественной медикаментозной резистентности при острой миелоидной лейкемии у лиц подвергшихся воздействию ионизирующей радиации вследствие аварии на Чернобыльской АЭС / С.В. Клименко, Д.А. Базыка, О.Л. Мазниченко, Н.А. Голярник, И.Н. Ильенко, В.Г. Бебешко // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2006. – Т. 46, №5. – С.555–562. 6. Спосіб діагностики та прогнозування перебігу мієлодиспластичного синдрому. Д.А. Базика, І.М. Ільєнко, С.В. Клименко, Т.Ф. Любарець. Заявка на патент № u 200706774 (дата одержання 16.06.2007). 7. Ильенко И.Н. Иммунофенотипические характеристики клеток при миелодиспластическом синдроме // Междунар. журн. радиационной медицины. – 2001. – №1–2. – С. 200. 8. Ильенко И.Н. Значение онкогенов и опухолевых супрессоров в патогенезе миелодиспластических состояний // Гематологія і переливання крові. IV з’їзд гематологів та трансфузіологів України: Зб. наук. пр. (16–18 травня, 2001 р.). – Київ: Нора-прінт, 2001. – С. 54. 9. Базыка Д.А., Ильенко И.Н. Иммунофенотипическая характеристика клеток у пациентов с миелодиспластическим синдромом, пострадавших вследствие аварии на ЧАЭС // Укр. журн. гематол. та трансфузіол. – 2002. – №5. – С.14. 10. Морфологическая и иммунологическая характеристика пациентов с миелодиспластическим синдромом, пострадавших вследствие аварии на ЧАЭС / В.И. Клименко, Д.А. Базыка, Т.Ф. Любарец, И.Н. Ильенко, И.В. Белинская // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: Науч.-практ. конф., посвященная 70-летию Российского НИИ гематологии и трансфузиологии (18-20 июня 2002 г.). – Санкт-Петербург, 2002. – С. 118-119. 11. Ильенко И.Н., Базыка Д.А. Иммунофенотипирование субпопуляций лейкоцитов при миелодиспластическом синдроме // Гематологія і трансфузіологія: фундаментальні та прикладні питання: Мат. наук.-практ. конф. (13–14 жовтня 2005 р.). – Київ, 2005. – №5. – С. 43–44. 12. Особливості імунологічних змін при цитопенічних станах кровотворення у пацієнтів, постраждалих внаслідок Чорнобильської катастрофи / Д.А. Базика, Т.Ф. Любарець, Н.В. Беляєва, І.М. Ільєнко // Гематологія і трансфузіологія: фундаментальні та прикладні питання: Мат. наук.-практ. конф. (13–14 жовтня 2005 р.). – Київ. – 2005. – С. 97–98. 13. Ильенко И.Н., Базыка Д.А., Любарец Т.Ф. Исследование экспрессии поверхностных антигенов субпопуляций лейкоцитов и CD95 рецептора при миелодиспластическом синдроме // Двадцять років Чорнобильської катастрофи. Погляд у майбутнє: Зб. тез Міжнар. конф. (24–26 квітня 2006 р.). – Київ, 2006. – С. 105–106. 14. Apoptosis-related proteins expression in radiation-associated acute myeloid leukemia / V.I. Klymenko, D.A. Bazyka, O.L. Maznichenko, N.A. Golarnik, O.V. Ljaskovska, I.M. Ilyenko, N.M. Tretyak, O.O. Vdovtsov, T.M. Serbinenko, T.B. Zubricka, V.N. Zinchenko, V.G. Bebeshko // Український біохімічний журнал: 5th Parnas Conference. – 2005. – Т. 77, №2 – С. 116. 15. Drug Transporters And Apoptosis-Related Proteins Expression Analysis In Acute Myeloid Leukemia Patients Exposed To Ionizing Radiation Due To The Chernobyl Accident / V.G. Bebeshko, D.A. Bazyka, S.V. Klymenko, O.L. Maznichenko, N.A. Golarnik, O.V. Ljaskivska, I.M. Iljenko // Haematologica: X Congress European hematology Association Stockholm (June 2-5, 2005). – Stockholm. – 2005. – V. 90, Suppl. 2. – Р. 379. 16. Bcl-2, Fas And P-Glycoprotein Expression Analysis In Acute Myeloid Leukemia Patients Exposed To Ionizing Radiation Due To The Chornobyl Accident / V.G. Bebeshko, D.A. Bazyka, S.V. Klymenko, О.L. Maznichenko, N.А. Golyarnik, O.V. Ljaskivska, I.M. Iljenko // В кн: 3rd International Symposium: Chronic Radiation Exposure: Biological and Health Effects (October 24-2, 2005). – Chelyabinsk. – 2005. – С. 61–62. 17. Immunophenotypic analysis of secondary myelodysplasia in patients exposed to low-dose irradiation after Chernobyl accident / D.A. Bazyka, V.I. Klymenko, T.F. Lubarets, N.V. Belyaeva, I.S. Dyagil, I.N. Ilyenko // The Hematology J. Abstr. of the 8th Annual Meeting of EHA Assotiation (12-15 June, 2003): Lion, France. – 2003. – V. 4, Suppl. 2. - № 0711. 18. Programmable cell death and immunity in patients with secondary myelodysplasia suffered after the Chernobyl accident / D. Bazyka, I. Ilyenko, N. Belyaeva, T. Lubarets // Abstract book of conference “Death, danger and immunity”, Institut Pasteur (March 8–9, 2007). – Paris, France, 2007. – P 34. 19. Early Progenitor Cells Antigens and Apoptosis in Patients with Secondary Myelodysplasia Exposed to Ionizing Radiation after Chernobyl Accident / I.. Ilyenko, D. Bazyka, S. Klymenko, T. Lubarets, N. Golyarnik // Leuk. Research. Abstr. of the 9th International symposium on myelodysplastic syndromes (May 16-19, 2007): Florence, Italy. – 2007. – V.31, Suppl. 1. – P 029. 20. Bazyka D., Ilyenko I., Lubarets T. Early progenitors and apoptosis in myelodysplasia after low-dose radiation exposure // Haematologica. Abstr. of the 12th Congress of the European Hematology Association. (June 7-10, 2007) Vienna, Austria. – 2007. – Suppl. 1. - № 0964. АНОТАЦІЯ Ільєнко І.М. Апоптоз, імунофенотип та функціональна активність елементів гемопоезу у хворих на мієлодиспластичний синдром у віддалений період після опромінення. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.01. – радіобіологія. - Науковий центр радіаційної медицини АМН України. Київ, 2007. Дисертація присвячена виключно актуальній медико-біологічній проблемі – дослідженню механізмів радіаційного впливу на кровотворення та лейкозогенез у віддалений період після опромінення. Актуальність цієї проблеми зумовлена масштабністю радіоекологічної катастрофи, яка відбулася на території України в зв’язку з аварією на ЧАЕС. Визначено особливості експресії лінійних, диференційних та активаційних антигенів ІКК та ГК у хворих на МДС. Вперше проведено дослідження специфіки апоптотичних процесів у хворих на МДС з урахуванням радіаційної компоненти. Встановлено порушення „апоптозної програми” нейтрофілів у хворих на МДС, що проявляється у зниженні чутливості до дії індукторів та супроводжується відповідними змінами експресії поверхневих антигенів та структурно-молекулярними перебудовами цитоплазматичної мембрани. Охарактеризовано кількісні та якісні показники апоптозу у співвідношенні з показниками проліферативної активності, що стало підставою для оцінки реактивності ІКК хворих на МДС, у віддалений період після опромінення. Отримані результати можуть бути використані для підвищення ефективності діагностики радіаційно-обумовлених імунологічних та гематологічних порушень та слугувати базою для наступної розробки оптимальної стратегії моніторингу та корекції в осіб, які постраждали внаслідок аварії на ЧАЕС 1986 р. Ключові слова: іонізуюче випромінювання, ЧАЕС, гемопоез, мієлодиспластичний синдром, апоптоз, поверхневий фенотип, ДНК-цитометрія. АННОТАЦИЯ Ильенко И.Н. Апоптоз, иммунофенотип и функциональная активность элементов гемопоэза у больных миелодиспластическим синдромом в отдаленный период после облучения. – Рукопись. Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.01. – радиобиология. - Научный центр радиационной медицины АМН Украины. Киев, 2007. В диссертации представлено теоретическое обобщение и экспериментальное подтверждение нового решения научной проблемы, которое заключается в раскрытии механизмов развития вторичных гематологических нарушений в отдалённый период после облучения. Приоритетным в работе является комплексное изучение особенностей патогенеза МДС: экспрессии линейных, дифференцировочных и активационных антигенов, особенностей запрограммированной клеточной гибели, пролиферативных потенций гемопоэтических, а также иммунокомпетентных клеток. В период с 2001–2006 гг. обследовано 130 человек; из них: 55 – пациенты, с установленным диагнозом – МДС (среди них 17 УЛПА на ЧАЭС 1986 г., облучённых в дозах до 1 Зв); 55 человек УЛПА на ЧАЭС 1986 г. без гематологических патологий в анамнезе; 20 практически здоровых доноров. Применяя современные иммунологические методы, установлены нарушения субпопуляционного состава иммунокомпетентных клеток пациентов с миелодисплазией: снижение иммунорегуляторного коэффициента, повышенный уровень CD56+ клеток в подгруппе больных РАИБ, РАИБ-Т и CD56+HLA-DR+ при всех вариантах МДС. Зафиксировано снижение функциональной активности природных киллеров, что играет значительную роль в формировании неопластических изменений гемопоэза. Субпопуляционный состав В-клеточного звена иммунитета изменен за счет увеличения количества ранних CD19+10+ клеток. Поскольку одним из важных показателей, который определяет риск трансформации МДС в острую лейкемию, является пролиферация бластных клеток, проведен иммунофенотипический анализ популяции бластов костного мозга, которая представлена CD34+, CD71+, CD117+, CD117+34+ клетками. Исследование специфики апоптотических процессов у больных МДС с учетом радиационной нагрузки позволило установить повышенную готовность лимфоцитов к Fas-опосредованному апоптозу. Выдвинуто предположение, что апоптоз в данном случае является защитным механизмом в процессе формирования канцерогенных эффектов. Проследили корреляционную взаимосвязь между уровнем CD95+ клеток и дозой облучения в группе УЛПА на ЧАЭС. Подтверждена концепция, постулирующая о наличии липидно-белковых перестроек в мембранах лейкоцитов среди УЛПА на ЧАЭС. Зафиксировано повышенное количество аннексин-V+PI- и аннексин-V+PI+ клеток в сочетании со снижением их функциональных потенций среди больных МДС, облученных в диапазоне доз от 0,04 до 0,92 Зв. Проведено исследование верапамил-индуцированного апоптоза в клетках ПК и КМ in vitro в группах обследования. Отмечено нарушение программы апоптоза среди гранулоцитарной популяции. Ответ лимфоцатарного звена был наиболее интенсивным среди УЛПА на ЧАЭС 1986 г., что говорит о повышенной активности в структурно-функциональной системе феномена запрограммированной клеточной гибели в отдаленный период после облучения. Изучены процессы активации и пролиферации в группах с дозовой нагрузкой. Нарушения спонтанной и митоген-зависимой активации проявились в чрезмерной интенсивности активационного ответа CD25 антигена. Формирование пролиферативного ответа в группе УЛПА на ЧАЭС 1986 г. (дозы облучения от 0,01 до 0,95 Зв) происходит за счет перехода лимфоцитов в S / G2 фазу клеточного цикла, тогда как среди больных МДС дозовой нагрузкой до 1 Зв изменения перераспределение клеток происходит за счет увеличения количества гиподиплоидных клеток. Выявленные особенности, экпериментально подтверждены и теоретически обоснованы, доказывают необходимость внесения изменений в стратегию диагностики миелодиспластических состояний, в том числе среди пострадавшего контингента вследствие аварии на ЧАЭС. Ключевые слова: ионизирующее излучение, ЧАЭС, гемопоэз, миелодиспластический синдром, апоптоз, поверхностный фенотип, ДНК-цитометрия. SUMMARY Ilyenko I.N. Apoptosis, immunophenotype and functional activity of haemopoiesis elements in myelodisplastic syndrome at the late period after radiation exposure. – Manuscript. Dissertation for the degree of Candidate of Biological Sciences, speciality 03.00.01 – Radiobiology. - Research Center for Radiation Medicine Academy of Medical Sciences of Ukraine. Kyiv, 2007. Dissertation is devoted to the research of the mechanisms of ionizing radiation influence on haemopoiesis and leucogenesis at the late period after exposure. Cellular-molecular changes of the expression of linear differentiation and activation antigens of immune and hematopoietic cells are revealed in patients with MDS. Research of apoptotic processes is first conducted in radiation exposed MDS patients. Deviations are shown in the „apoptosis program” of neutrofils in MDS that include the decline of sensitivity to the action of apoptosis inductors and accompanying changes of expression of surface antigens and structural molecular alterations of cytoplasmic membrane. The quantitative and high-quality indexes of apoptosis are described in correlation with the indexes of proliferation activity that became the basis for the estimation of reactivity of immune cells of patients on MDS, in a late period after an irradiation exposure. Obtained results can be used for the increase of efficiency of diagnostic assays of the radiation-induced immunological and haematological changes and to serve as a base for future development of optimal strategy for the follow-up and treatment of patients, which suffered after accident at the Chernobyl nuclear power plant in 1986. Keywords: ionizing radiation, Chernobyl NPP, haematopoiesis, myelodisplastic syndrome, apoptosis, surface phenotype, DNA-cytometry. PAGE 25

Похожие записи