Національна академія наук України

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного

ВАЩЕНКО ЛЮДМИЛА МИКОЛАЇВНА

УДК 579.841.11:577.114

Антимутагенна і протипухлинна активність pseudomonas syringae pv.
atrofaciens i pseudomonas syringae pv. coronafaciens

03.00.07 – мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ – 2004

Дисертацією є рукопис

Дисертаційна робота виконана у відділі фітопатогенних бактерій Інституту
мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Гвоздяк Ростислав Ілліч,

Інститут мікробіології і вірусології

ім. Д. К. Заболотного НАН України,

завідувач відділу фітопатогенних бактерій

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,

член-кор. НАН України

Мацелюх Богдан Павлович,

Інститут мікробіології і вірусології

ім. Д. К. Заболотного НАН України,

завідувач відділу генетики мікроорганізмів

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

Сарнацька Вереса Василівна,

Інститут фізіології рослин та генетики

НАН України, провідний науковий співробітник

відділу фізіології росту і розвитку рослин

Провідна установа: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України

Захист відбудеться “21“ квітня 2004 р. о 1200 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських
дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д. К.
Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного,
154.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д. К.Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ,
вул. Заболотного, 154.

Автореферат дисертації розіслано “18” березня 2004 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук
Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Бактеріальні захворювання рослин завдають значної
шкоди сільському господарству. Саме цим обумовлюється актуальність
вивчення бактерій, які здатні уражувати рослини. Але не менш важливо
дослідити екологічне значення фітопатогенних бактерій, які є постійними
супутниками рослин і знаходяться не лише на уражених, але й на здорових
рослинах (епіфітна та ендофітна фази). Разом із рослинами фітопатогенні
бактерії або продукти їхньої життєдіяльності можуть потрапляти в
організм людини і негативно впливати на неї. Відомо, що патогенні для
людини бактерії мають мутагенний вплив на макроорганізм-хазяїна,
спричиняючи збільшення кількості точкових мутацій, аберацій та зміни
кількості хромосом у клітинах (Ильинских и др., 1984). Сапрофітні
бактерії також можуть виявляти мутагенні властивості (Линдер и др.,
2000). З іншого боку, бактеріям, які є постійними супутниками людини
(молочнокислі, пропіоновокислі, біфідобактерії), притаманні
антимутагенні властивості (Воробьева, Абилев, 2002). Що стосується
фітопатогенних бактерій, то їхню здатність впливати на геном інших
організмів і досі не з’ясовано.

Зернові культури займають важливе місце в щоденному раціоні людей.
Зважаючи на широке розповсюдження фітопатогенних бактерій, які уражують
зернові культури, та можливість надходження їх і продуктів їхньої
життєдіяльності до організму людей, вивчення геномоделювальних
властивостей збудників бактеріозів зернових є актуальним.

Не менш важливим є вивчення впливу фітопатогенних бактерій на процеси
пухлиноутворення. Особливо це стосується ліпополісахаридів (ЛПС)
фітопатогенних бактерій, яким властивий широкий спектр біологічної
активності. Відомо, що ЛПС грамнегативних бактерій можуть
використовуватися в імунотерапії онкологічних хворих. Однак стосовно
фітопатогенних бактерій дані літератури суперечливі і свідчать як про
позитивний, так і негативний вплив ЛПС на пухлиноутворення (Варбанец и
др., 1995, Zdorovenko et al., 1997). Отже, вивчення дії фітопатогенних
бактерій Pseudomonas syringae van Hall 1902 та їхніх ЛПС на
пухлиноутворення є перспективним напрямом досліджень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано
в межах НДР відділу фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України за темами: «Дослідження
взаємовідносин між фітопатогенними, ендофітними та епіфітними бактеріями
з метою виявлення їх ролі в стійкості рослин до хвороб» (номер державної
реєстрації 0197U012033), «Дослідження фітопатогенних бактерій фітоценозу
та їх генопротекторних, мутагенних та протипухлинних властивостей»
(номер державної реєстрації 0101U009312).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було вивчення мутагенної та
антимутагенної активності і впливу на пухлиноутворення двох патоварів P.
syringae та їхніх ліпополісахаридів.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

вивчити біологічні властивості штамів P. syringae;

одержати та вивчити хімічний склад ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281
і ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030;

дослідити вплив на частоту спонтанних та індукованих мутації у
Salmonella typhimurium культуральної рідини та ліпополісахаридів P.
syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030;

вивчити антимутагенну активність спиртового екстракту та соку із
пшениці, інфікованої P. syringae pv. atrofaciens 8281;

підібрати штами Agrobacterium tumefaciens, які зумовлюють інтенсивне
пухлиноутворення на експлантатах картоплі;

вивчити вплив культуральної рідини, клітин та ліпополісахаридів P.
syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 на
пухлиноутворення, спричинене A. tumefaciens на експлантатах картоплі.

Об’єкти дослідження: фітопатогенні бактерії P. syringae pv. atrofaciens
8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 та їхні ліпополісахариди.

Предметом дослідження були мутагенна, антимутагенна та протипухлинна
активність фітопатогенних бактерій P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P.
syringae pv. coronafaciens 9030 та їхніх ліпополісахаридів.

Матеріали та методи дослідження. Для вивчення властивостей досліджуваних
штамів використано загальноприйняті мікробіологічні, біохімічні та
серологічні методи. Ліпополісахариди екстрагували 0,85% розчином хлориду
натрію, хімічний склад одержаних препаратів визначали за допомогою
відомих біохімічних методів. Антимутагенні властивості вивчали із
використанням бактеріальної тест-системи з ауксотрофними за гістидином
штамами S. typhimurium, протипухлинні властивості – на моделі
пухлиноутворення, спричиненого A. tumefaciens на експлантатах картоплі.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше для фітопатогенних бактерій встановлено, що за культивування на
картопляному бульйоні P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv.
coronafaciens 9030 не утворюють метаболітів із мутагенною активністю.

Виявлено, що ліпополісахаридам P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P.
syringae pv. coronafaciens 9030 притаманні антимутагенні властивості.
Вони здатні зменшувати частоту спонтанних і індукованих біхроматом калію
мутацій у тест-штамів S. typhimurium. Антимутагенна активність
ліпополісахаридів є найвищою за одночасного внесення їх та біхромату
калію до суспензії клітин тест-штамів і може бути зумовлена зв’язуванням
мутагену.

Показано, що інфікування пшениці у фазі сходів P. syringae pv.
atrofaciens 8281 не впливає на антимутагенну активність соку з листків
цієї рослини.

Встановлено здатність культуральної рідини та зруйнованих ультразвуком
клітин P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens
9030 зменшувати пухлиноутворення, спричинене A. tumefaciens на
експлантатах картоплі.

Показано, що ліпополісахариди P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P.
syringae pv. coronafaciens 9030 запобігають утворенню пухлин, зумовлених
A. tumefaciens на експлантатах картоплі, та зменшують інтенсивність
їхнього розвитку.

Практичне значення одержаних результатів. Результати роботи можуть бути
використані при здійсненні скринінгу речовин мікробного походження з
антимутагенними і протипухлинними властивостями, розробленні методів
боротьби з хворобами рослин, спричиненими A. tumefaciens, у сільському
господарстві, а також в лекційному курсі для студентів вищих навчальних
закладів.

Особистий внесок здобувача. Основна частина експериментального
матеріалу, викладеного в дисертації, одержана автором особисто. Автором
проведено визначення хімічного складу препаратів ЛПС, вивчення
геномоделювальної активності культуральної рідини, ЛПС, спиртових
екстрактів і соку із листків пшениці, а також впливу культуральної
рідини, клітин та ЛПС досліджуваних патоварів P. syringae на
пухлиноутворення, спричинене A. tumefaciens. Аналіз
результатів, їхнє узагальнення, інтерпретацію та формулювання основних
положень і висновків, підготовку до друку наукових статей
проведено особисто за консультації наукового керівника
дисертаційної роботи д.б.н., проф. Р.І. Гвоздяка.

Вивчення культуральних, біохімічних та патогенних властивостей P.
syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 та
одержання їхніх ліпополісахаридів здійснювали спільно з к.б.н. Л.А.
Пасічник, яка є співавтором публікацій дисертанта.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були
представлені на: Міжнародній науково-практичній школі для молодих учених
і спеціалістів “Природні екосистеми Карпат в умовах посиленого
антропогенного впливу” (Ужгород, 2001); конкурсі експериментальних робіт
молодих дослідників Інституту мікробіології і вірусології НАН України
(Київ, 2001, 2003); Міжнародній конференції “Мікробіологія і
біотехнологія XXI століття” (Мінськ, Бєларусь, 2002); 6-й Міжнародній
конференції по патоварах Pseudomonas syringae і близьких патогенах
(Маратеа, Італія, 2002); VIII Українському біохімічному з’їзді
(Чернівці, 2002); 7-й Пущинській школі-конференції молодих учених
“Біологія наука XXI століття” (Пущино, Росія, 2003); І Конгресі
європейських мікробіологів (Любляна, Словенія, 2003); конференції
молодих науковців, аспірантів та студентів з молекулярної біології і
генетики, присвяченій золотому ювілею подвійної спіралі ДНК та 30-річчю
заснування Інституту молекулярної біології і генетики (Київ, 2003);
Міжнародній науково-теоретичній конференції молодих учених “Молодь і
досягнення науки у вирішенні проблем сучасності” (Чернівці, 2003).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковано в 4 статтях у фахових
наукових журналах та 6 матеріалах і тезах конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 166
сторінках машинописного тексту. Вона складається із вступу, огляду
літератури, опису матеріалів і методів досліджень, 5 розділів
експериментальної частини, обговорення результатів, висновків, списку
використаних джерел літератури, який містить 193 посилання, в т.ч. 106
іноземних авторів. Дисертаційна робота містить 29 таблиць і 26 рисунків.

Основний зміст роботи

Розділ 1. Огляд літератури

В огляді літератури, який складається з 6 підрозділів, висвітлено
біологічні властивості збудників захворювань зернових культур, описано
явище полібіотрофії фітопатогенних бактерій, наведено дані щодо
хімічного складу і будови ліпополісахаридів Pseudomonas syringae та
їхньої біологічної активності, розглянуто сучасний стан проблеми
мутагенезу і пошуку речовин з антимутагенною активністю, наведено
класифікацію антимутагенів та уявлення щодо механізму їхньої дії,
охарактеризовано антимутагенні властивості мікроорганізмів, викладена
інформація щодо явища пухлиноутворення, спричиненого Agrobacterium
tumefaciens, та можливості використання його в якості моделі під час
пошуку речовин із протипухлинною активністю.

Розділ 2. Матеріали і методи досліджень

Об’єктом дослідження були два штами фітопатогенних бактерій, які
належать до двох патоварів: штам 8281 Pseudomonas syringae pv.
atrofaciens (McCulloch 1920) Young, Dye & Wilkie 1978, ізольований з
ураженого жита сорту Харківське 60, і штам 9030 Pseudomonas syringae pv.
coronafaciens (Elliott 1920) Young, Dye & Wilkie 1978, ізольований з
ураженого вівса сорту Грач.

Культуральні, фізіологічні та серологічні властивості цих бактерій
вивчали загальноприйнятими методами (Бельтюкова и др., 1968; Klement et
al., 1990). Для дослідження геномоделювальної і протипухлинної
активності використовували культуральну рідину, яку одержували
культивуванням бактерій на картопляному бульйоні при 28?С на качалках
(240 об/хв). В зруйнованих ультразвуком клітинах P. syringae, після
видалення залишків клітинних стінок, досліджували протипухлинну
активність.

ЛПС екстрагували 0,85% -м водним розчином NaCl (Здоровенко и др., 1982)
та очищали діалізом і ультрацентрифугуванням. Вміст білка визначали
методом O. Lowry et al. (1951), вуглеводів – за реакцією з фенолом та
сірчаною кислотою, 2-кето-3-дезоксиоктонової кислоти – за реакцією з
тіобарбітуровою кислотою (Захарова, Косенко, 1982), нуклеїнових кислот
спектрофотометричним методом А. С. Спирина (1958), жирних кислот –
методом газорідинної хроматографії метилових ефірів жирних кислот
(Brian, Gardner, 1967; Жеребило, Вишталюк, 1987).

Взаємодію між штамами P. syringae та тест-штамами A. tumefaciens і
S. typhimurium вивчали методом відстроченого антагонізму
(Егоров, 1965). Для з’ясування впливу ЛПС P. syringae на тест-культури
A. tumefaciens і S. typhimurium їх вносили до поживних середовищ, на
яких культивували бактерії.

Протипухлинну активність тестували за допомогою експлантатів бульб
картоплі. Для індукції пухлиноутворення використовували суспензію клітин
A. tumefaciens титром 109 кл/мл. На поверхню кожного
експлантату наносили по 0,1 мл досліджуваного розчину та суспензії
клітин A. tumefaciens (Гвоздяк та ін., 1998). Для вивчення впливу
досліджуваних речовин на процеси прикріплення A. tumefaciens до
рослинних клітин експлантати картоплі обробляли в різні строки до та
після інокуляції їх суспензією клітин A. tumefaciens. Через три тижні
інкубації експлантатів при температурі 20?С підраховували кількість та
інтенсивність розвитку на них пухлин. Якщо на експлантаті утворилося до
10 горбиків пухлин розвиток пухлин вважали слабким, від 10 до 30 (
середнім, 30 і більше ( сильним (Гвоздяк та ін., 1998).

Для визначення антимутагенної активності використовували тест-систему з
ауксотрофними за гістидином штамами Salmonella typhimurium таких
генотипів: S. typhimurium ТА100 ( his G46, ?uvr B, rfa, рКМ101; S.
typhimurium ТА98 ( his D3052, ?uvr B, rfa, рКМ101 (McCann et al., 1975).

Для вивчення впливу на спонтанний мутагенез 0,1 мл досліджуваної
речовини (культуральної рідини, розчину ЛПС, спиртового екстракту або
соку із листків пшениці) вносили до розплавленого напіврідкого агару
одночасно із 0,1 мл суспензії клітин тест-штаму. Для вивчення впливу на
індукований мутагенез до напіврідкого агару разом з суспензією
тест-штаму та досліджуваною речовиною вносили 0,1 мл розчину мутагену –
біхромату калію (концентрація 2 мг/мл). Напіврідкий агар виливали на шар
мінімального агару без гістидину. Через 48 год культивування при
температурі 37?С здійснювали облік кількості колоній His+ ревертантів.
Антимутагенну дію стосовно спонтанного мутагенезу виражали у відсотках
зменшення кількості ревертантів порівняно зі спонтанним фоном мутацій
тест-штаму S. typhimurium. У разі вивчення впливу на індукований
мутагенез ( у відсотках зменшенням кількості ревертантів, індукованих
біхроматом калію за присутності досліджуваної речовини, порівняно з
кількістю ревертантів, індукованих лише біхроматом калію. Статистичну
оцінку даних проводили за t-критерієм Стьюдента (р < 0,05). Штучне зараження пшениці у фазі сходів проводили в теплиці інокуляцією листків уколом крізь краплину бактеріальної суспензії. Після розвитку видимих ознак ураження, збирали листки рослин з ознаками ураження (дослід) і здорових рослин (контроль). Для одержання спиртового екстракту до подрібнених листків додавали 40%-й розчин етилового спирту у співвідношенні 1:10. Екстракцію проводили на киплячій водяній бані протягом 5 хв. Для одержання стерильного соку подрібнені листки розтирали до повного руйнування тканин, сік віджимали центрифугуванням (30 хв, 2000 об/хв) і фільтрували крізь азбестові фільтри. Розділ 3. Біологічні властивості Pseudomonas syringae pv. atrofaciens i Pseudomonas syringae pv. coronafaciens Основними збудниками бактеріальних захворювань жита в Україні є P. syringae pv. atrofaciens, вівса – P. syringae pv. coronafaciens. Штами цих патоварів було обрано об’єктами нашого дослідження. Оскільки ці штами тривалий час зберігали в лабораторних умовах, ми вважали необхідним вивчити їхні основні фізіолого-біохімічні властивості порівняно з типовим штамом P. syringae pv. syringae 8511 (NCPPB 281, ATCC 19310, УКМ B-1027). P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 є грамнегативними оксидазонегативними рухливими паличками. На лакмусовій сироватці обидва штами утворюють луг, не утворюють індол та сірководень, не редукують нітрати. Досліджувані штами відрізняються за здатністю розріджувати желатину. На картопляному агарі P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 утворюють круглі сірі напівпрозорі блискучі колонії із хвилястим краєм. Подібно до типового штаму P. syringae pv. syringae 8511 досліджувані штами використовують як єдине джерело вуглецевого живлення глюкозу, арабінозу, галактозу, ксилозу, фруктозу, інозитол, манітол, сахарозу, манозу, сорбітол, гліцерол і не утилізують лактозу, саліцин, мальтозу, рамнозу, целобіозу, інулін, дульцитол. На відміну від типового штаму, вони не використовують рафінозу. P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 належать до серогрупи I відомої схеми серогрупування бактерій P. syringae (Пастушенко, Симонович, 1979). Обидва штами виявляють патогенні властивості та індукують реакцію надчутливості на листках тютюну. У складі клітинних ліпідів P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 було виявлено характерні для бактерій виду P. syringae насичені, ненасичені та оксизаміщені жирні кислоти. Таким чином, за фізіологічними, біохімічними, серологічними і патогенними властивостями досліджувані штами P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 не відрізнялися від типового штаму P. syringae pv. syringae 8511, що свідчить про умовний їхній поділ на патовари. Розділ 4. Ліпополісахариди патоварів Pseudomonas syringae Вихід ЛПС досліджуваних бактерій за екстракції 0,85%-м розчином хлориду натрію становить 5,4% від сухої маси бактерій для P. syringae pv. atrofaciens 8281 і 6,0% – для P. syringae pv. coronafaciens 9030 (табл. 1). ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 містить 32,6% вуглеводів, ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 – 42,0%. В ЛПС обох штамів міститься значна кількість білка: 22,0 і 17,4% відповідно (табл. 1). В одержаних препаратах білок не відокремлюється від ЛПС за осадження з 3%-го розчину ультрацентрифугуванням. Це свідчить про те, що білок і ЛПС утворюють комплекс. Таблиця 1 Хімічний склад ліпополісахаридів патоварів P. syringae Патовар, штам Вихід ЛПС, % від сухої маси бактерій % від сухої маси ЛПС Вуглеводи Білок Нуклеїнові кислоти КДО P. syringae pv. atrofaciens 8281 5,4 32,6 22,0 8,7 0,56 P. syringae pv. coronafaciens 9030 6,0 42,0 17,4 5,4 0,87 Примітка. КДО – 2-кето-3-дезоксиоктонова кислота ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 містять нуклеїнові кислоти і КДО (табл. 1). В жирнокислотному складі досліджуваних ЛПС виявлено насичені (додеканова, тетрадеканова, пентадеканова, гексадеканова, октадеканова), ненасичені (гексадеценова, октадеценова) та оксизаміщені (3-оксидеканова, 2-оксидодеканова, 3-оксидодеканова) жирні кислоти. Наявність 3-оксидеканової, 2-оксидодеканової і 3-оксидодеканової кислот є характерною ознакою для патоварів P. syringae (Stead, 1992). Раніше E.L. Zdorovenko et al. (2001) встановлено структуру О-специфічних полісахаридів (О-ПС) ЛПС цих патоварів P. syringae. В О-ПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 основними повторюваними одиницями є лінійні трисахарид і тетрасахарид (-L-рамнози. В мінорній кількості виявлено також розгалужений пентасахарид з основним ланцюгом, який утворено (-L-рамнозою і бічним моносахаридом 3-ацетамідо-3,6-дидезокси-D-галактозою (D-фукозою). В О-ПС ланцюзі P. syringae pv. atrofaciens 8281 повторювані одиниці є розгалуженими тетра- та двома пентасахаридами, які відрізняються за розташуванням бічної D-фукози. Розділ 5. Мутагенна і антимутагенна активність екзометаболітів та ліпополісахаридів патоварів Pseudomonas syringae Здатність фітопатогенних бактерій утворювати речовини з мутагенною активністю практично і досі залишається поза увагою дослідників, хоча вони можуть потрапляти в продукти харчування і впливати на здоров’я людей. P. syringae pv. coronafaciens 9030 і P. syringae pv. atrofaciens 8281 не мають антагоністичного, а їхні ЛПС – токсичного або стимулювального впливу на тест-штами S. typhimurium, що є передумовою вивчення їхньої геномоделювальної активності. Фільтрат культуральної рідини P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 не виявляє мутагенної активності в експериментах з обома тест-штамами S. typhimurium (рис. 1, 2). Примітки: КБ – картопляний бульйон, СФМ – спонтанний фон мутацій, ФКР – фільтрат культуральної рідини. ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 в концентраціях від 0,1 до 1000,0 мгк/чашка не виявляють мутагенної активності стосовно S. typhimurium. Водночас у концентрації 1000,0 мкг/чашку ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 вірогідно зменшує частоту спонтанних мутацій тест-штаму S. typhimurium ТА100 на 16%, а тест-штаму S. typhimurium ТА98 – на 31%. Після термічного оброблення (2 год, 100?С) антимутагенна активність ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 майже не змінюється порівняно з нативним ЛПС цього штаму. ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 у концентраціях 1000,0 та 100,0 мкг/чашку вірогідно знижує спонтанний фон мутацій тест-штаму S. typhimurium ТА100 на 23 та 19% відповідно. ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 не зменшує спонтанний фон мутацій тест-штаму S. typhimurium ТА98. ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 зменшує показники мутагенезу, індукованого біхроматом калію, у обох тест-штамів S. typhimurium. Як і стосовно спонтанного мутагенезу, ЛПС виявився активнішим в експериментах із S.typhimurium ТА98 (табл. 2). Таблиця 2 Вплив ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 на індукований мутагенез у S. typhimurium ЛПС, мкг/чашка Біхромат калію, мкг/чашка S. typhimurium ТА98 S. typhimurium ТА100 Кількість ревертантів на чашку Інгібування мутагенезу, % Кількість ревертантів на чашку Інгібування мутагенезу, % 1000,0 200 35,0 ( 0,2 78 295,3 ( 5,7 49 100,0 200 41,7 ( 0,2 74 363,3 ( 6,5 37 10,0 200 53,3 ( 0,3 67 339,3 ( 31,2 41 1,0 200 55,7 ( 0,1 65 333,3 ( 34,6 42 0,1 200 68,7 ( 0,1 57 493,3 ( 13,1 14 0 200 161,7 ( 0,3 0 576,3 ( 3,6 0 Спонтанний фон мутацій 33,3 ( 0,04 93,0 ( 2,9 ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 також зменшує кількість індукованих біхроматом калію His+ ревертантів у обох тест-штамів S. typhimurium (табл. 3). В експериментах із тест-штамом S. typhimurium ТА98 спостерігається незначне зниження антимутагенної активності досліджуваних ЛПС зі зменшенням їхньої концентрації, тоді як у дослідах із S. typhimurium ТА100 антимутагенна активність ЛПС істотно залежить від їхньої концентрації, але ця залежність не є лінійною. Отже, нами вперше встановлено наявність антимутагенних властивостей у ліпополісахаридів фітопатогенних бактерій на прикладі ЛПС P. syringae. Досліджувані ліпополісахариди здатні зменшувати показники як спонтанного, так і індукованого мутагенезу у S. typhimurium. Для з’ясування можливого механізму антимутагенної дії нами було проведено експерименти за схемою, наведеною на рисунку 3. Таблиця 3 Вплив ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 на індукований мутагенез у S. typhimurium ЛПС, мкг/чашка Біхромат калію, мкг/чашка S. typhimurium ТА98 S. typhimurium ТА100 Кількість ревертантів на чашку Інгібування мутагенезу, % Кількість ревертантів на чашку Інгібування мутагенезу, % 1000,0 200 87,7 ( 0,1 46 410,7 ( 80,5 51 100,0 200 88,3 ( 0,5 45 532,0 ( 73,4 37 10,0 200 90,7 ( 0,1 44 605,0 ( 12,8 28 1,0 200 91,5 ( 0,1 43 683,3 ( 14,2 19 0,1 200 95,6 ( 0,1 41 738,6 ( 10,0 12 0 200 161,7 ( 0,3 0 840,0 ( 13,9 0 Спонтанний фон мутацій 33,3 ( 0,4 58,7 ( 0,9 Результати вивчення антимутагенної активності ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 залежно від послідовності оброблення клітин тест-штаму S. typhimurium мутагеном і ЛПС наведено в таблиці 4. У разі інкубації клітин S. typhimurium ТА100 з біхроматом калію впродовж 30хв кількість реверсій становить 260,0 ( 40,8 (табл. 4, варіант 2.1). Після внесення ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 до клітин цього тест-штаму, попередньо оброблених протягом 30 хв біхроматом калію, кількість His+ ревертантів становить 150,0 ( 5,6 на чашку (табл. 4, варіант 2.2). За оброблення клітин S. typhimurium ТА100 одночасно мутагеном і ЛПС утворюється ще менша кількість ревертантів – 130,0 ( 29,9 (табл. 4, варіант 4.1). Отже, ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 захищає клітини S. typhimurium ТА100 від мутагенної дії біхромату калію за одночасного внесення мутагену і ЛПС до клітин тест-штаму і значно слабше за внесення ЛПС після дії мутагену. Попереднє оброблення клітин S. typhimurium ТА100 цим ЛПС не збільшує їхню стійкість до дії мутагену (табл. 4, варіанти 3.2 і 1.2). Можна припустити, що механізм антимутагенної дії ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 стосовно S. typhimurium ТА100 пов’язаний з перешкоджанням проникненню мутагенів у клітини, а також, ймовірно, із впливом на репараційні системи клітин, що дозволяє усувати попередньо утворені пошкодження ДНК. На відміну від штаму S. typhimurium ТА100, у дослідах із S. typhimurium ТА98 внесення ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 до попередньо оброблених біхроматом калію клітин тест-штаму не приводить до зменшення кількості ревертантів (табл. 4, варіант 2.2). Однак за одночасного внесення ЛПС і біхромату калію до клітин тест-штаму ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 виявляє антимутагенну активність. Попереднє оброблення ЛПС цього штаму клітин S. typhimurium ТА98 вірогідно не підвищує їхньої стійкості до дії мутагену. Рис. 3. Схема досліду Примітка. МС – мінімальне середовище. Таблиця 4 Антимутагенна активність ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 за різних умов інкубації тест-штамів S. typhimurium із біхроматом калію Варіант досліду (рис. 3) Порядок оброблення клітин тест-штаму Кількість колоній ревертантів S. typhimurium ТА98 S. typhimurium ТА100 1.1 Спонтанний фон мутацій 31,3 ( 8,1 100,0 ( 10,8 1.2 Клітини + біхромат калію 960,0 ( 59,8 1700,0 ( 299,4 2.1 Клітини, попередньо оброблені біхроматом калію (30 хв) 53,3 ( 8,6 260,0 ( 40,8 2.2 Клітини, попередньо оброблені біхроматом калію (30 хв) + ЛПС 66,3 ( 18,1 150,0 ( 5,6 3.1 Клітини, попередньо оброблені ЛПС (30 хв) 24,7 ( 1,6 88,6 ( 5,8 3.2 Клітини, попередньо оброблені ЛПС (30 хв) + біхромат калію 866,0 ( 65,3 1300,0 ( 299,4 4.1 Клітини, попередньо оброблені біхроматом калію та ЛПС (30 хв) 47,0 ( 9,3 130,0 ( 29,9 Результати вивчення антимутагенної активності ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 на моделі S. typhimurium ТА98 залежно від послідовності оброблення мутагеном та ЛПС наведено в таблиці 5. Таблиця 5 Антимутагенна активність ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 за різних умов інкубації тест-штаму S. typhimurium ТА98 з біхроматом калію Варіант досліду (рис. 3) Порядок оброблення клітин тест-штаму Кількість колоній ревертантів . 0 \ , 0 \ b ? ue th „`„ \ th & & & $ ????? ???????? @ @ @ @ ?? ?? ? ? ??¦?¬?®???A?O?ii5iii?kdss ? ? ? ? »&»,»F»L»N»V»iiii5i?kdY ? ? ? ? ? ? ? ? ?? ?? ?? ?? ? ? ???? ? ? ???? h? ? ???? h? ? ???? ? ? ???? ? ? ? ? ?? ?? 700,0 ( 11,3 2.1 Клітини, попередньо оброблені біхроматом калію (30 хв) 91,6 ( 4,0 2.2 Клітини, попередньо оброблені біхроматом калію (30 хв) + ЛПС 77,5 ( 1,2 3.1 Клітини, попередньо оброблені ЛПС (30 хв) 30,7 ( 0,7 3.2 Клітини, попередньо оброблені ЛПС (30 хв) + біхромат калію 750,0 ( 5,7 4.1 Клітини, попередньо оброблені біхроматом калію та ЛПС (30 хв) 34,7 ( 12,6 Якщо до попередньо оброблених біхроматом калію клітин S. typhimurium ТА98 додавати ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030, то кількість His+ ревертантів знижується до 77,5 ( 1,2 (табл. 5, варіант 2.2). Але інтенсивніше ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030, як і ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281, зменшує мутагенну дію біхромату калію за одночасного внесення їх до суспензії клітин S. typhimurium ТА98. Кількість ревертантів за таких умов експерименту становить 34,7 ( 12,57 (табл. 5, варіант 4.1). Отже, за одночасного оброблення клітин тест-штаму S. typhimurium ТА98 біхроматом калію і ЛПС P.syringae pv. coronafaciens 9030 останній майже повністю усуває мутагенну дію біхромату. Таким чином, ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 притаманні антимутагенні властивості. Вони зменшують як спонтанний, так і індукований біхроматом калію мутагенез у тест-штамів S. typhimurium. Розділ 6. Антимутагенна активність пшениці, ураженої Pseudomonas syringae Значна частина мутагенів належить до сполук, які нині не можуть бути виведені зі сфери життєдіяльності людини. Тому використання антимутагенів для захисту геному людей від шкідливого впливу мутагенів є одним з найперспективніших шляхів вирішення цієї проблеми. При здійсненні пошуку речовин з антимутагенними (генопротекторними) властивостями увагу дослідників досить часто привертають рослини. Антимутагенні властивості виявлені у соків, водних, ацетонових та спиртових екстрактів багатьох сільськогосподарських та лікарських рослин (Бариляк, Исаева, 1994). Проте зазвичай поза увагою залишається питання щодо впливу збудників захворювань на антимутагенну активність рослин. Вивчення антимутагенних властивостей уражених бактеріями рослин нами проведено на пшениці. Відомо, що комплексу речовин, які містяться в екстракті із її проростків, притаманні антимутагенні властивості (Задорожная и др., 1997). За нашими даними, спиртові екстракти із уражених P. syringae pv. atrofaciens 8281 листків пшениці у фазі сходів та неуражених листків не виявляють геномоделювальної активності. Сік із уражених P. syringae pv. atrofaciens 8281 листків пшениці і сік із неуражених листків не мають геномоделювальної активності в дослідах з тест-штамом S. typhimurium ТА98. В експериментах з тест-штамом S. typhimurium ТА100 сік із листків пшениці у фазі сходів виявив антимутагенну активність. При цьому соку із листків з ознаками ураження P. syringae pv. atrofaciens притаманна така сама активність, як і соку із здорових листків. Сік із уражених листків зменшує кількість спонтанних ревертантів на 21%, а сік із не інокульованих листків пшениці – на 22%. Сік із листків, інокульованих P. syringae pv. atrofaciens 8281, пригнічує мутагенну дію біхромату калію стосовно S. typhimurium ТА100 на 39%, а сік із здорових листків – на 38%. Тобто, антимутагенна активність соку із листків здорових і уражених бактеріями рослин є однаковою. Таким чином, нами встановлено, що соку із листків пшениці у фазі сходів притаманна антимутагенна активність стосовно тест-штаму S. typhimurium ТА100. При цьому за ураження пшениці P. syringae pv. atrofaciens 8281 антимутагенна активність її соку не змінюється. Розділ 7. Протипухлинна активність патоварів Pseudomonas syringae і їхніх ліпополісахаридів Відомо, що речовини, яким притаманні антимутагенні властивості, можуть виявляти також протипухлинну активність. Тому ми дослідили протипухлинну активність P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 та їхніх ЛПС, для яких нами встановлено антимутагенну активність. Для вивчення протипухлинних властивостей серед колекційних штамів було відібрано штами A. tumefaciens 9052 і A. tumefaciens 9054, які з високою інтенсивністю спричинювали утворення пухлин на експлантатах картоплі. P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P.syringae pv. coronafaciens 9030 не мають антагоністичного, а їхні ЛПС не виявляють токсичного впливу на тест-штами A. tumefaciens, що є необхідною умовою вивчення протипухлинної активності. Картопляний бульйон, на якому культивували P. syringae, не впливає на пухлиноутворення, зумовлене A. tumefaciens 9052 (табл. 6). Таблиця 6 Вплив фільтрату культуральної рідини P. syringae pv. atrofaciens 8281 на пухлиноутворення, зумовлене A. tumefaciens 9052 на експлантатах картоплі1 Досліджувана речовина Послідовність оброблення Кількість експлантатів без пухлин, % до загальної кількості Кількість пухлин на один експлантат Зменшення кількості пухлин, %3 Позитивний контроль2 0 12,34 ( 2,83 0 Картопляний бульйон за 15–20 хв до інокуляції A.tumefaciens 0 14,65 ( 2,06 0 через 15–20 хв після інокуляції A.tumefaciens 0 13,00 ( 2,38 0 Фільтрат культуральної рідини за 15–20 хв до інокуляції A.tumefaciens 17 4,16 ( 1,23 66 через 15–20 хв після інокуляції A.tumefaciens 11 6,38 ( 1,59 48 через 24 год після інокуляції A.tumefaciens 0 12,55 ( 2,78 0 Фільтрат культуральної рідини після термічного оброблення за 15–20 хв до інокуляції A.tumefaciens 0 14,96 ( 2,62 0 через 15–20 хв після інокуляції A.tumefaciens 0 12,54 ( 3,18 0 через 24 год після інокуляції A.tumefaciens 0 12,80 ( 3,02 0 Примітки: Тут і в табл.7, 8, 9, 10: 1 – на експлантатах, які не інокулювали A. tumefaciens, пухлини не утворюються, 2 – необроблені експлантати інокулювали культурою A. tumefaciens, 3 – відсоток зменшення кількості пухлин обчислювали за наявності статистично вірогідної різниці між дослідними варіантами та позитивним контролем. Фільтрат культуральної рідини (ФКР) P. syringae pv. atrofaciens 8281 виявив здатність інгібувати утворення пухлин за оброблення експлантатів до або через 15 – 20 хв після інокуляції A. tumefaciens 9052. Оброблення експлантатів ФКР P. syringae pv. atrofaciens 8281 через 24 год після інокуляції A. tumefaciens не впливає на пухлиноутворення. Після термічного оброблення (2 год, 100?С) ФКР P. syringae pv. atrofaciens 8281 втрачає протипухлинну активність (табл. 6). Аналогічні результати одержано для ФКР P. syringae pv. coronafaciens 9030. ФКР цього штаму виявляє здатність запобігати пухлиноутворенню та зменшувати його інтенсивність, при цьому вища протипухлинна активність спостерігається у разі попереднього оброблення експлантатів порівняно з таким через 15 – 20 хв після інокуляції A. tumefaciens. За збільшення тривалості культивування протипухлинна активність культуральної рідини P. syringae pv. coronafaciens 9030 підвищується. Після термічного оброблення ФКР P. syringae pv. coronafaciens 9030 майже повністю втрачає протипухлинну активність. Таким чином, ФКР P. syringae pv. atrofaciens 8281 та P. syringae pv. coronafaciens 9030 можуть запобігати пухлиноутворенню, спричиненому A. tumefaciens на експлантатах картоплі. Протипухлинна дія ФКР досліджуваних штамів пов’язана з термолабільними речовинами, які накопичуються в середовищі в процесі їх культивування. Активніше порівняно з позаклітинними метаболітами на пухлиноутворення впливають зруйновані ультразвуком клітини обох патоварів P. syringae. При цьому протипухлинна активність зруйнованих клітин P. syringae pv. atrofaciens 8281 не залежить від періоду оброблення експлантатів (табл. 7). Розведення зруйнованих клітин призводить до зменшення їхньої протипухлинної активності. Таблиця 7 Вплив зруйнованих ультразвуком клітин P. syringae pv. atrofaciens 8281 на спричинене A. tumefaciens 9054 пухлиноутворення на експлантатах картоплі1 Послідовність оброблення експлантатів Кількість експлантатів без пухлин, % до загальної кількості Кількість пухлин на один експлантат Зменшення кількості пухлин, %3 Позитивний контроль2 8 10,00 ( 2,93 0 за 15–20 хв до інокуляції A. tumefaciens 67 1,28 ( 0,17 13 через 15–20 хв після інокуляції A. tumefaciens 64 1,33 ( 0,18 13 У разі оброблення експлантатів зруйнованими клітинами P. syringae pv. coronafaciens 9030 до інокуляції культурою A. tumefaciens 9052 пригнічення пухлиноутворення було інтенсивнішим порівняно з обробленням експлантатів після інокуляції A. tumefaciens (табл. 8). Таблиця 8 Вплив зруйнованих ультразвуком клітин P. syringae pv. coronafaciens 9030 на спричинене A. tumefaciens 9052 пухлиноутворення на експлантатах картоплі1 Послідовність оброблення експлантатів Кількість експлантатів без пухлин, % до загальної кількості Кількість пухлин на один експлантат Зменшення кількості пухлин, %3 Позитивний контроль2 0 26,70 ( 3,46 0 за 15–20 хв до інокуляції A. tumefaciens 100 0 100 через 15–20 хв після інокуляції A. tumefaciens 21 9,20 ( 2,56 66 Оброблення експлантатів розчином ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 в концентрації 10,0 мг/мл приводить до зменшення кількості пухлин на 87 %, при цьому на 31% експлантатів пухлини не утворюються взагалі. ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 в концентрації 1,0 мг/мл зменшує кількість пухлин на 67%, а в концентрації 0,1 мг/мл – на 37%. Після оброблення експлантатів розчином ЛПС в концентрації 1,0 мг/мл на 6% експлантатів пухлини не утворюються. Використання для оброблення розчину ЛПС в концентрації 0,1 мг/мл менш ефективне – на всіх експлантатах утворилися пухлини, але кількість їх менша порівняно з позитивним контролем. Таким чином, в концентраціях від 0,1 мг/мл до 10,0 мг/мл ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 виявляє здатність частково запобігати пухлиноутворенню на експлантатах картоплі і зменшувати інтенсивність розвитку пухлин. Досліджуваний ЛПС активніше впливає на пухлиноутворення, спричинене A. tumefaciens 9054. Після оброблення експлантатів ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 в концентрації 10,0 мг/мл на 57% експлантатів не відбувається утворення пухлин. На тих експлантатах, де пухлини утворюються, кількість їх зменшується на 90% порівняно з позитивним контролем. Протипухлинна активність ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 знижується зі зменшенням його концентрації. ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 також інгібує індуковане A. tumefaciens пухлиноутворення. Оброблення експлантатів розчином ЛПС в концентрації 10,0 мг/мл зменшує кількість пухлин, спричинених A. tumefaciens 9052, на 84% порівняно з позитивним контролем, а на 17% експлантатів пухлини взагалі не утворюються. Кількість пухлин, зумовлених A. tumefaciens 9054, таке оброблення зменшує на 74%, при цьому на 43% експлантатів пухлини не виникають. Отже, ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 і ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 запобігають індукції пухлиноутворення та/або зменшують інтенсивність розвитку пухлин на експлантатах картоплі. Протипухлинна дія залежить від концентрації застосованого для оброблення експлантатів розчину ЛПС та від штаму A. tumefaciens, використаного для індукції пухлиноутворення. Протипухлинна активність ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 після його термічного оброблення (2 год, 100?С) зменшується. Для дослідження можливого впливу ЛПС на процеси прикріплення клітин A. tumefaciens до клітин експлантатів картоплі проводили оброблення останніх розчинами ЛПС в різний термін – до або після інокуляції культурою A. tumefaciens. Оброблення експлантатів ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 за 20 хв до інокуляції A. tumefaciens та через 20 хв після неї інгібує пухлиноутворення майже однаково (табл. 9). Таблиця 9 Залежність впливу ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 на пухлиноутворення, спричинене A. tumefaciens 9052, від послідовності оброблення експлантатів1 Концентрація розчину ЛПС, мг/мл Послідовність оброблення експлантатів Кількість експлантатів без пухлин, % до загальної кількості Кількість пухлин на один експлантат Зменшення кількості пухлин, %3 Позитивний контроль2 0 20,36 ( 2,85 0 1,0 за 20 хв до інокуляції A.tumefaciens 23 13,40 ( 2,15 34 0,1 6 17,20 ( 2,38 16 1,0 через 20 хв після інокуляції A.tumefaciens 7 10,32 ( 1,57 49 0,1 0 14,27 ( 1,80 30 10,0 через 24 год після інокуляції A.tumefaciens 14 19,50 ( 2,36 5 1,0 7 21,03 ( 4,50 0 0,1 0 21,80 ( 1,56 0 У разі оброблення експлантатів ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 через добу після інокуляції A. tumefaciens пухлиноутворення на експлантатах інгібувалося в меньшій мірі порівняно з обробленням до інокуляції агробактеріями (табл. 9). При вивченні впливу ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 на пухлиноутворення залежно від періоду оброблення експлантатів було одержано аналогічні результати. Пригнічення пухлиноутворення відбувається в однаковій мірі за оброблення експлантатів ЛПС за 20 хв до та через 20 хв після інокуляції A. tumefaciens (табл. 10). Оброблення експлантатів через добу після інокуляції A. tumefaciens хоча і сприяє пригніченню пухлиноутворення, але в меншій мірі, ніж за оброблення до інокуляції бактеріями (табл. 10). Таким чином, досліджувані ЛПС виявляють протипухлинну активність у разі використання їх для оброблення експлантатів в період інокуляції A. tumefaciens. Оброблення експлантатів через добу після інокуляції бактеріями є менш ефективним. Однак, враховуючи те, що прикріплення бактерій до рослинних клітин відбувається переважно впродовж перших 15 хв їхнього контакту, значне зниження інтенсивності пухлиноутворення внаслідок оброблення експлантатів ЛПС через добу після зараження A.tumefaciens свідчить, що ЛПС впливає не лише на прикріплення, але й на перебіг інфекційного процесу. Таблиця 10 Залежність впливу ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 на пухлиноутворення, спричинене A. tumefaciens 9052, від періоду оброблення експлантатів1 Концентрація розчину ЛПС, мг/мл Послідовність оброблення експлантатів Кількість експлантатів без пухлин, % до загальної кількості Кількість пухлин на один експлантат Зменшення кількості пухлин, %3 Позитивний контроль2 0 16,90 ( 2,03 0 10,0 за 20 хв до інокуляції A.tumefaciens 33 7,09 ( 1,50 58 1,0 14 13,80 ( 2,28 18 0,1 6 14,50 ( 2,19 14 10,0 через 20 хв після інокуляції A.tumefaciens 33 5,04 ( 1,26 70 1,0 14 14,12 ( 2,34 16 0,1 3 11,90 ( 2,00 29 10,0 через 24 год після інокуляції A.tumefaciens 8 9,68 ( 1,72 43 1,0 5 10,70 ( 1,71 36 0,1 0 12,80 ( 2,04 24 Висновки Ліпополісахариди P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030, одержані екстракцією розчином хлориду натрію, мають хімічний склад, властивий бактеріям цього виду. Встановлено, що P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 за умов культивування на картопляному бульйоні не утворюють екзометаболітів із мутагенною або антимутагенною активністю. Вперше показано, що ліпополісахариди P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 виявляють антимутагенні властивості, зменшуючи частоту спонтанного та індукованого біхроматом калію мутагенезу у тест-штамів S. typhimurium. Антимутагенна активність ліпополісахаридів P. syringae залежить від їхньої концентрації. Термічне оброблення ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 не зменшує його антимутагенну активність. Антимутагенна активність ліпополісахаридів досліджуваних патоварів P. syringae є найвищою за умови одночасного внесення ЛПС і мутагену до суспензії клітини тест-штамів S. typhimurium. Виявлено, що сік із листків пшениці у фазі сходів має антимутагенні властивості. Вперше встановлено, що бактерії P. syringae pv. atrofaciens 8281 не впливають на антимутагенну активність пшениці за її інфікування. Фільтрати культуральних рідин P. syringae pv. coronafaciens 9030 і P. syringae pv. atrofaciens 8281 запобігають пухлиноутворенню, спричиненому A. tumefaciens на експлантатах картоплі, за оброблення експлантатів до інокуляції агробактеріями. Протипухлинну дію культуральних рідин патоварів P. syringae обумовлено термолабільними речовинами, які накопичуються в середовищі під час культивування бактерій. Порівняно з позаклітинними метаболітами на процес пухлиноутворення активніше впливають зруйновані ультразвуком клітини досліджуваних патоварів P. syringae. Встановлено, що ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 притаманна протипухлинна активність щодо пухлин, спричинених A. tumefaciens на експлантатах картоплі. Досліджувані ЛПС виявляють протипухлинну активність за використання їх у період інокуляції експлантатів суспензією клітин A. tumefaciens. Оброблення експлантатів через добу після інокуляції бактеріями є менш ефективним. список праць, опублікованих за темою дисертації Матеріали дисертаційної роботи опубліковано в 4 статтях у фахових журналах, 6 матеріалах і тезах конференцій: Ващенко Л.М., Гвоздяк Р.І., Пасічник Л.А. Антимутагенні властивості ліпополісахариду Pseudomonas syringae pv. coronafaciens 9030 // Науковий вісник УжНУ, серія: Біологія. – 2001. – №9. – С. 145 – 147 (Здобувачем особисто вивчено вплив ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 на виживання та на спонтанний фон мутацій тест-штамів S. typhimurium). Гвоздяк Р.І., Ващенко Л.М., Пасічник Л.А. Генопротекторна активність ліпополісахариду Pseudomonas syringae pv.coronafaciens 9030 // Доповіді НАНУ. – 2003. – № 4. – С. 159 – 162 (Здобувачем особисто вивчено здатність ЛПС P. syringae pv. coronafaciens 9030 зменшувати мутагенну дію біхромату калію на S.typhimurium). Гвоздяк Р.І., Пасічник Л.А., Ващенко Л.М. Вплив ліпополісахарид-білкового комплексу Pseudomonas syringae pv. atrofaciens на процес пухлиноутворення, спричинений Agrobacterium tumefaciens // Мікробіол. журн. – 2003. – 65, № 3. – С. 5 – 13. (Здобувачем особисто було підібрано штами A. tumefaciens для індукції пухлиноутворення, вивчено взаємодію між P. syringae pv. atrofaciens 8281 та штамами A. tumefaciens, вивчено хімічний склад ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281, вивчено вплив ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 на виживання A. tumefaciens та вплив на пухлиноутворення на експлантатах картоплі, спричинене A. tumefaciens). Ващенко Л.М., Пасічник Л.А., Гвоздяк Р.І. Антимутагенна активність пшениці, інфікованої P. syringae pv. atrofaciens // Науковий вісник Чернівецького університету: Збірник наук. праць. – 2004. – Вип. 194. – С. 42 – 47. (Здобувачем особисто вивчено вплив інфікування P. syringae pv. atrofaciens 8281 на антимутагенну активність спиртового екстракту та соку із листів пшениці у фазі сходів стосовно спонтанного та індукованого біхроматом калію мутагенезу у тест-штамів S. typhimurium). Гвоздяк Р.И., Пасичник Л.А., Ващенко Л.Н. Влияние липополисахарида Pseudomonas syringae pv.coronafaciens 9030 на частоту мутаций Salmonella typhimurium// Международная конференция "Микробиология и биотехнология XXI столетия" (Минск, 22 –24 мая, 2002): Материалы конференции. – Минск, 2002.– С. 128 – 129. Gvozdyak R.I., Vaschenko L.M., Pasichnyk L.A. Antimutagenic activity of Pseudomonas syringae pv. atrofaciens lipopolysaccharide and its influence on tumor formation // 6–th Intern. Conference on Pseudomonas syringae pathovars and related pathogens (Acquafredda di Maratea (PZ), Italy, September 15–19, 2002): Book of abstracts. – 2002. – P. 63. Пасічник Л.А., Ващенко Л.М., Гвоздяк Р.І Біологічна активність ліпополісахариду Pseudomonas syringae pv.coronafaciens 9030 // Укр. біохім. журн.– 2002.– 74, № 4б.– С.165. Ващенко Л. Н. Антимутагенные свойства P. syringae pv. atrofaciens в бактериальной тест–системе // 7–ая Пущинская школа–конференция молодых ученых “Биология наука XXI века” (Пущино, 14 – 18 апреля, 2003): Сборник тезисов. – Пущино, 2003. – С. 267. Vashchenko L. M., Gvozdyak R. I., Pasichnyk L. A. Influence of P. syringae pv. coronafaciens lipopolysaccharide on A. tumefaciens galls on potato discs // I FEMS Congress of European Microbiologist (Ljubljana, June 29 – July 3, 2003): Abstract book. – 2003. – P. 428. Vashchenko L. M. Gene modulation activity of P.syringae pv. atrofaciens UCM B-1013 // Conference for young scientists on molecular biology and genetics (Kyiv, September 25 – 27, 2003): Abstract book. – Kyiv, 2003. – P. 224. Анотація Ващенко Л.М. Антимутагенна і протипухлинна активність Pseudomonas syringae pv. atrofaciens i Pseudomonas syringae pv. coronafaciens. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України, Київ, 2004. Дисертація присвячена вивченню геномоделювальних та протипухлинних властивостей культуральної рідини, клітин та ліпополісахаридів (ЛПС) двох патоварів P. syringae. В роботі показано, що екстраговані 0,85%-м розчином хлориду натрію ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 i P. syringae pv. coronafaciens 9030 мають типовий для бактерій цього виду хімічний склад. В бактеріальній тест-системі з ауксотрофними за гістидином штамами Salmonella typhimurium встановлено, що P. syringae pv. atrofaciens 8281 i P. syringae pv. coronafaciens 9030 не утворюють сполук із мутагенною активністю у разі культивування на картопляному бульйоні. ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 і P. syringae pv. coronafaciens 9030 притаманна антимутагенна активність стосовно спонтанного та індукованого біхроматом калію мутагенезу у тест-штамів S. typhimurium. Антимутагенна активність обох досліджуваних ЛПС найбільшою мірою виявляється за одночасної дії їх з мутагеном на клітини тест-штамів. Це, ймовірно, пов’язано зі здатністю ЛПС адсорбувати біхромат калію. Сік із листків пшениці у фазі сходів з ознаками ураження P. syringae pv. atrofaciens 8281 та неуражених листків виявляє однакову антимутагенну активність. Отже, в уражених бактеріями рослинах пшениці не утворюються сполуки з мутагенною активністю. За допомогою моделі пухлиноутворення, спричиненого Agrobacterium tumefaciens на експлантатах картоплі, показано, що фільтрат культуральної рідини, зруйновані ультразвуком клітини та ЛПС патоварів P. syringae запобігають пухлиноутворенню та/або зменшують його інтенсивність. Ключові слова: P. syringae, ліпополісахарид, антимутагенна активність, протипухлинна активність. Аннотация Ващенко Л.Н. Антимутагенная и противоопухолевая активность Pseudomonas syringae pv. atrofaciens и Pseudomonas syringae pv. coronafaciens. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 – микробиология. – Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2004. Диссертация посвящена изучению геномоделирующих и противоопухолевых свойств двух патоваров Pseudomonas syringae и их липополисахаридов (ЛПС). ЛПС для проведения исследований получали экстракцией 0,85%-м раствором хлорида натрия. Полученные ЛПС имеют характерный для бактерий этого вида химический состав. В бактериальной тест-системе с ауксотрофными по гистидину штаммами Salmonella typhimurium установлено, что P. syringae pv. atrofaciens 8281 и P. syringae pv. coronafaciens 9030 не продуцируют веществ с мутагенной активностью при культивировании их в лабораторных условиях на картофельном бульоне. ЛПС P. syringae pv. atrofaciens 8281 и P. syringae pv. coronafaciens 9030 свойственна антимутагенную активность относительно спонтанного и индуцированного бихроматом калия мутагенеза у тест-штаммов S. typhimurium. Антимутагенная активность ЛПС патоваров P. syringae в наибольшей степени проявляется при одновременном внесении ЛПС и бихромата калия к клеткам тест-штаммов. В меньшей степени эти ЛПС вызывают уменьшение количества мутаций в клетках тест-штаммов, которые предварительно были инкубированы на протяжении 30 мин с бихроматом калия (10 мг/мл). При предварительной обработке клеток тест-штамов S. typhimurium исследуемые ЛПС не повышают их устойчивости к мутагенному действию бихромата калия. Антимутагенная активность сока из листьев пшеницы в фазе всходов с признаками поражения P. syringae pv. atrofaciens 8281 и непораженных листьев сохраняется на одном уровне – 21 и 22% соответственно для спонтанного мутагенеза и 39 и 38% для мутагенеза, вызванного действием бихромата калия. Исследование геномоделирующей активности P. syringae pv. atrofaciens 8281 и P. syringae pv.coronafaciens 9030, а также их ЛПС проводили на модели опухолеобразования, индуцируемого на эксплантатах картофеля Agrobacterium tumefaciens. Показано, что фильтрат культуральной жидкости, разрушенные ультразвуком клетки и липополисахариды P. syringae pv. atrofaciens 8281 и P. syringae pv.coronafaciens 9030 проявляют противоопухолевые свойства в этой тест-системе. Ключевые слова: P. syringae, липополисахарид, антимутагенные свойства, противоопухолевые свойства. Summary Vashchenko L. M. Antimutagenic and antitumor activity of Pseudomonas syringae pv. atrofaciens and Pseudomonas syringae pv. coronafaciens. – Manuscript. The thesis for a candidate’s degree by speciality 03.00.07 – microbiology. – Institute of microbiology and virology named D.K. Zabolotny of National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev,2004. The dissertation is focused to the investigation of gene modulation and antitumor properties of culture liquids, cells and lipopolysaccharides (LPS) of two P. syringae pathovars. It has been shown that LPS of P. syringae pv. atrofaciens 8281 and P. syringae pv. coronafaciens 9030 extracted by 0,85% solution of sodium chloride have typical for bacteria of this species chemical composition. Using bacterial test- system with histidine auxotrophic strains of Salmonella typhimurium it was established that P. syringae pv. atrofaciens 8281 and P. syringae pv. coronafaciens 9030 do not produce compounds with mutagenic activity. LPS of P. syringae pv. atrofaciens 8281 and P. syringae pv. coronafaciens 9030 have antimutagenic activity against spontaneous and induced by bichromate potassium mutagenesis in S. typhimurium test-strains. Antimutagenic activity of both researched LPS are the greatest if they have been added to cells of test-strains simultaneously with mutagen. It is probably that antimutagenic activity of LPS is connected with their ability to adsorb bichromate potassium. Juice from wheat leaves infected by P. syringae pv. atrofaciens 8281 and not infected wheat has identical antimutagenic activity. Using tumor formation induced by Agrobacterium tumefaciens on potato explants it was shown that culture liquids, cells disintegrated by ultrasonic sound and LPS of P. syringae pathovars reduce induction of tumors. Key words: P. syringae, lipopolysaccharide, antimutagenic activity, antitumor activity. PAGE 18 1. Культура S. typhimurium 2. Культура S. typhimurium + біхромат калію (10 мг/мл) 4. Культура S.typhimurium+ біхромат калію + ЛПС (10мг/мл) 3. Культура S. typhimurium + ЛПС (10 мг/мл) Культура S. typhimurium в експоненційній фазі росту Культивування 60 хв при температурі 37 0С Дворазове центрифугування (40 хв, 2000 об/хв) 1. Клітини S. typhimurium 2. Клітини S. typhimurium, попередньо оброблені біхроматом калію 4. Клітини S. typhimurium, попередньо оброблені біхроматом калію та ЛПС 3. Клітини S. typhimurium, попередньо оброблені ЛПС 1.1. Висів суспензії клітин на МС 1.2. Висів суспензії клітин на МС та біхроматом калію (200мкг/чашка) 3.1. Висів суспензії клітин на МС 3.2. Висів суспензії клітин на МС та біхроматом калію (200мкг/чашка) 4.1. Висів суспензії клітин на МС 2.1. Висів суспензії клітин на МС 2.2. Висів суспензії клітин на МС та ЛПС (100мкг/чашка) Культивування впродовж 48 год при температурі 37 0С

Похожие записи