НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ПІВДЕННИХ МОРІВ ІМ. О.О. КОВАЛЕВСЬКОГО

ШАХМАТОВА

Ольга Олександрівна

УДК 577.1:574.(262.5)

Активність антиоксидантної системи деяких чорноморських гідробіонтів у
прибережній акваторії севастополя

03.00.17 – гідробіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Севастополь – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біології південних морів

ім. О.О. Ковалевського НАН України, м. Севастополь

Науковий керівник: кандидат біологічних наук,

старший науковий
співробітник

Тренкеншу Рудольф Павлович,

Інститут біології південних морів НАН України,

завідувач відділу

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,
професор

Сіренко Лідія Якимівна

Інститут гідробіології НАН України,

головний науковий співробітник

кандидат
біологічних наук,

старший науковий співробітник

Сілкін Юрій Олександрович

Карадазький природний заповідник НАН України

Провідна установа: Одеський Національний університет ім. І. І.
Мечникова Міністерства освіти і науки України, кафедра гідробіології та
загальної екології

Захист дисертації відбудеться 07.07.2004 р. о 14 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 50.214.01 Інституту біології південних
морів ім. О.О. Ковалевського НАН України за адресою: 99011, м.
Севастополь, пр. Нахімова, 2.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту біології
південних морів, адреса: 99011, м. Севастополь, пр. Нахімова, 2.

Автореферат розісланий 04.06.2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої ради Д50.214.01

Доктор біологічних наук,

професор
Гаєвська А.В

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Антиоксидантна (АО) система в наш час розглядається
як ланка метаболізму, що відрізняється універсальним відгуком на
будь-який вплив, у тому числі, і токсичний. Відгук організмів включає
адаптивні зміни, пов’язані з активацією АО системи у відповідь на
збільшення концентрації токсичних метаболітів, що спричинюють порушення
окисно-відновного потенціалу клітин і тканин, а також деструктивні
зміни білків, жирів, нуклеїнових кислот (Владимиров, Арчаков, 1972;
Менщикова, Зенков, 1993).

Потенційна можливість використання зв’язку між біохімічним відгуком
організмів на оксидативний стрес, що виникає під час дії ушкоджуючого
чинника навколишнього середовища зі станом самого середовища, є ключовим
моментом екологічного моніторингу. На існування такої залежності
вказують багато авторів (Winstone, Di-Jiulio, 1991; Lafaurie et al.,
1992; Burgeot et al., 1996). Порівняльні дослідження відгуку тварин з
різних таксономічних груп на руйнівну дію вільних радикалів дозволили
виявити особливу роль морських організмів у механізмі екологічного
моніторингу (Di-Giulio, 1991).

Показники АО системи відрізняються швидкістю й адекватністю реакції на
збільшення концентрації токсичних речовин, що дає можливість оцінити
екологичний стан забруднення акваторій. З цієї причини у світовій
практиці АО широко використовується для контролю якості середовища
(Livingstone et al., 1990; Di-Giulio, 1993; Peters et al., 1994;
Foerlin et al., 1995; Вurgeot et al., 1996; Nesci et al., 1998). Разом
с тим видомо, що визначення величини окремих полютантів у морському
середовищі не завжди об’єктивно характеризує екологічну ситуацію,
поскількі вони, внаслідок трансформації у водному середовищі та
взаємодіі між собою та чинниками середовища, утворюють продукти
невідомої хімічної природі, а методи оцінки їх токсичності не
розроблені. Отже пошук та застосування чутливих і недорогих методів
морського екологічного моніторингу є вкрай актуальним.

Зв’язок з науковими програмами, планами, темами. Дослідження
виконувались у межах бюджету НАН України за темами “Метаболічні
основи існування масових видів безхребетних і риб в умовах мінливого
режиму Чорного моря” (1996 — 1998 р.р), № держ. реєстрації 0196U022102
і “Структурно-функціональні основи продукційних процесів у
гідробіонтів” (1999 — 2000 р.р.), № держ. реєстрації 0199U001389, а
також міжнародного гранту “Bioenergetic activity of the marine organisms
as an integral index of enviromental water quality” INTAS-OPEN-96-1961,
де автор був виконавцем розділу.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було виявлення комплексу
параметрів АО системи гідробіонтів, придатних для оцінки екологічного
стану прибережних вод Чорного моря. Відповідно до мети дослідження
вирішувались наступні задачі:

— виявити зміни активності каталази у морських організмів різних
таксономічних груп для використання їх як організмів-індикаторів у
моніторингових дослідженнях, а також оцінити рівень реагування
відповідних організмів-індикаторів на забруднення;

— визначити інтервали активності каталази і перекисне окислення ліпідів
(ПОЛ) зелених і червоних водоростей-макрофітів та личинок ряду видів
риб, що відповідають нормі та патології функціонування;

— встановити поріг чутливості активності каталази зелених і червоних
водоростей-макрофітів у польових умовах для нітратів і нітритів;

— вивчити вплив міді і нітратів на зміну активності каталази личинок A.
hepsetus в експерименті;

— провести ранжування Українських прибережних районів Чорного моря
(на прикладі Севастопольської бухти) за рівнем активності
антиоксидантної системи гідробіонтів відповідно до рівня забруднення
акваторії.

Об’єктом дослідження є АО система 12 відів чорноморських гідробіонтів і
зв’язок її активності з рівнем забруднення середовища.

Предмет дослідження — екологічний стан прибережних вод Чорного моря і
його оцінка за рівнем активності АО системи гідробіонтів-індикаторів.

Методи дослідження. У роботі використовували біохімічні методи
визначення активності ферментів АО комплексу й концентрацій
низькомолекулярних антиоксидантів, а також стандартні гідрологічні й
гідрохімічні методи визначення параметрів середовища.

Наукова новизна отриманих результатів. У роботі вперше запропонований
комплекс біологічних параметрів АО системи для кількісної оцінки стану
гідробіонтів і середовища їхнього існування. Раніше відомі результати
вивчення АО системи чорноморських організмів, що використовували для
характеристики еволюційного рівня і відової приналежности гідробіонтів.
Вперше виявлено роль каталази в процесі адаптації гідробіонтів до
забруднення.

Вперше виявлені і визначені інтервали активності каталази
гідробіонтів-індикаторів, які відповідають умовно нормальному
функціонуванню організмів. Вперше визначено норму реакції процесу
перекисного окислення ліпідів в організмах-індикаторах. Вперше виявлені
діапазони зміни параметрів середовища (температурний режим, щільність,
концентрація кисню, фосфатів, нітратів і нітритів), які відповідають
умовно нормальному функціонуванню личинок A. hepsetus, а також двох
видів водоростей-макрофітів — Enteromorpha intestinalis (L.) Nees і
Ceramium rubrum (Huds.) Ag.

Практичне значення отриманих результатів. Комплекс біологічних маркерів
і відповідних організмів-індикаторів, запропонований авторкою, дозволяє
без великих фінансових витрат (простота відбору проб, економічність і
швидкість виконання аналізів) регулярно здійснювати контроль за станом
чорноморських акваторій, а також проводити ранжування прибережних
районів Чорного моря у відповідності до рівня забруднення акваторії.
Найчутливіші модифікації методу визначення активності каталази можуть
бути застосовані при визначенні оптимальних умов для культивування
личинок при штучному розведенні морських риб.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є оригінальним науковим
дослідженням автора. Відбір проб, підготовка матеріалу для аналізу,
визначення показників АО комплексу, статистична обробка, аналіз і
узагальнення отриманих результатів виконані автором самостійно. Зі
статей, опублікованих у співавторстві, в дисертації використані дані,
отримані автором особисто; частка участі здобувача складає 80 –85 %.
Права співавторів публікацій не порушені.

Апробація роботи. Основні положення роботи доповідались на 11-му з’їзді
Українського ботанічного товариства (Харків, 2000), на 6-ій міжнародній
конференції “Біоантиоксидант” (Москва, 2001), на 10-ій ювілейній
конференції «Нові інформаційні технології в медицині та екології”
(Гурзуф, 2002).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 8 праць, з них 5 статей у
журналах, затверджених ВАК України, 3 — у матеріалах і тезах
національних і міжнародних конференцій, дві — опубліковані в
співавторстві.

Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 109 сторінках
машинопису, складається зі вступу, огляду літератури, 3-х розділів,
висновків і списку використаної літератури, який включає 232 джерела (у
тому числі іноземних — 126). Текст ілюстрований 9 таблицями і 22
рисунками.

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Розглянуто роль вільних радикалів і процесу перекисного окислення
ліпідів у розвитку неспецифічного синдрому стресу, проаналізовані
загальні механізми дії високомолекулярних і низькомолекулярних
антиоксидантів взагалі, в гідробіонтів зокрема. Можливість використання
АО системи гідробіонтів як біомаркерів у моніторингу прибережних
морських акваторій згадувалася у ряді іноземних публикацій. У
вітчизняній фаховій літературі дані що до цієї важливої проблеми
нечисленні і фрагментарні, а по чорноморському регіону — практично
відсутні.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАЙОНІВ, ОБ’ЄКТІВ І МЕТОДІВ ДОСЛІДЖЕНЬ Дослідження
проводили в 1998-2000 р.р. у двох районах, що відрізняються рівнем
забруднення і водообміну — Севастопольська бухта (станції 2, 3, 5, 5А, 6
і 7) і відкрита частина її зовнішнього рейду (бухти Омега і Козача —
ст. 9 і 12) (рис.1). Окремі райони Севастопольської бухти відрізняються
рівнем евтрофування. Вершина бухти (ст. 2) найбільш забруднена, що
обумовлено надходженням з р. Чорна опріснених вод, пересичених
біогенними елементамі, а також находженням нафтогавані (Овсяный, Кемп и
др., 2000). Так, у гирлі ріки концнтрація біогенних речовин вища в 2-10
разів,

Рис.1. Стандартна сітка відбору проб у Севастопольській бухті й
прилеглих районах

ніж у районі виходу з бухти (ст.7). Особливо забруднена ст. 6, де
дислокується флот. За вмістом у ґрунтах важких металів (міді, цинку,
кадмію і хрому)видрізняються ст. 6 і 5 (район Пам’ятника затопленим
кораблям і 5А (бухта Старопівнічна), де знаходились стоянки кораблів
(Овсяный, Игнатьева и др., 2003). Теплове забруднення на ст.3 обумовлено
скиданнями гарячої води з прилеглої ГРЕС. На пидставі одержаних даних,
було проведено ранжування станцій за рівнем забруднення біогенними
речовинами: 6>2>3>5,5A>7. У прибережних водах зовнішнього рейду бухти
Севастопольської рівень біогенів нижчий в 10-100 разів, ніж у водах
самої бухти (Овсяный, Кемп, 2000). Ці райони віднесені до розряду
відносно чистих.

Концентрації біогенних речовин у воді й важких металів у ґрунті
визначали співробітники Морського гідрофізичного інституту НАН України
паралельно з нашими дослідженнями (Овсяный, Кемп и др., 2000; Игнатьева,
Овсяный, 2002). Об’єктами дослідження були водорості-макрофіти з різних
районів Севастопольської бухти. Досліджено 6 видів водоростей: —
Cystoseira barbata C.Ag.; Scytosyphon simplicissimus (Clemente)
Cremades = S. lomentaria (Lyngb.) Link., Cladophora albida (Nees) Kutz,
Ulva rigida C.Ag., Enteromorpha intestinalis (L.) Nees, Ceramium rubrum
(Huds.) Ag.; ікра, личинки і молодь чорноморських риб — Proterorhinus
marmoratus (Pallas), Lepadogaster lepadogaster lepadogaster
(Bonnaterre), Atherina hepsetus L. різного віку. Зазначені гідробіонти є
масовими в прибережних водах Чорного моря, що дозволяє вважати їх
зручним матеріалом для моніторингових досліджень. Крім того,
досліджували показники АО системи у печінці, зябрах, гонадах і гемолімфі
чорноморської мідії Mytilus galloprovincialis Lam., а також в чистої
культурі чорноморського гідроїда Obelia loveni (Allman).

Вивчення впливу цинку на активність АО ферментів проводили в
лабораторних умовах на синьозеленій водорості Spirulina рlatensis
(Nordst) Geitl.

Загальна кількість браного й опрацьованого матеріалу наведена в
таблиці 1.

Таблиця 1

Характеристика матеріалу досліджень

Показник АО комплексу Досліджуваний вид Кількість вимірів, n

1 2 3

Активність каталази, мгН2О2/(г тканини(хв) Scytosyphon simplicissimus
(Clemente) Cremades = S. lomentaria (Lyngb.) Link

Cystoseira barbata C.Ag.

Ulva rigida C.Ag.

Cladophora albida (Nees) Kutz

Enteromorpha intestinalis (L.) Nees

Ceramium rubrum (Huds.) Ag.

Lepadogaster lepadogaster lepadogaster (Bonnaterre)

Proterorhinus marmoratus

Atherina hepsetus L.

Spirulina platensis (Nordst) Geitl. 16

12

14

14

264

264

92

92

384

54

Перекисне окислення ліпідів, n МДА/ г тканини C. rubrum

E. intestinalis

A. hepsetus 72

72

72

Активність супероксиддисмутази, mМ NADH/(г тканини(хв)

A. hepsetus

S. platensis

72

54

Активність Se-залежної глутатіон- пероксидази, у.о.акт./(г тканини(хв)
A. hepsetus 72

Каротиноїди, мг/100 г тканини Mytilus galloprovincialis Lam IV — V
стадії зрілості гонад 124

Загальні і вільні SH-групи, М/л(105г білка,

М/ 100 г тканини

M. galloprovincialis, III — IV стадії зрілості гонад 386

Активність пероксидази, мкМ індигокарміну/(л(хв) M. galloprovincialis,
III — IV стадії зрілості гонад 206

Активність АТФ-ази, мкг Р/(мг білка(хв) Оbelia loveni (Allman) 72

Активність кислої фосфатази, мкг Р/(мг білка(хв) О. loveni 72

Активність лужної фосфа-тази, мкг Р/(мг білка(хв) О. loveni 72

Білок, мг/мл супернатанту О. Loveni

M. galloprovincialis, III — IV стадії

Зрілості гонад 216

386

Загальна кількість вимірів 3100

Визначення величини показників АО комплексу здійснювали за допомогою
загальноприйнятих методик, адаптованих для гідробіонтів.

Інтенсивність перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) — (концентрацію
ТБК-активних продуктів) визначали за рівнем нагромадження кінцевого
продукту — малонового диальдегиду (МДА) за допомогою тіобарбітурової
кислоти (ТБК) (Ohkawa, 1978). Активність каталази визначали за кількістю
перекису водню, що розклався, (метод запропонований Бахом і Зубковою
(Березов, 1976). Активність супероксиддисмутази (СОД) – за мірою
пригнічення відновлення нітросинього тетразолієвого в присутності NАDН
(нікотинамідадениндинуклеотиду відновленого) і феназинметасульфату
(Nishikimi, 1972); активність глутатіонпероксидази (ГП) — за
нагромадженням окисленого глутатіону (Переслегина, 1989), пероксидази —
по нагромадженню продукту окислення індигокарміну пероксидом водню
(Попов, Нейковская, 1970); активність АТФ-ази визначали за швидкістю
гідролізу АТФ, (Мыслович, 1975), а кислої й лужної фосфатаз — за
кількістю фосфору, утвореного внаслідок гідролізу (-гліцерофосфату
натрію (Боданский, 1968). Визначення каротиноїдів здійснювали методом
спектрофотометрії ацетонових екстрактів, запропонованим В.Н.Карнауховим
(1982). Визначення вільних і зв’язаних з білком сульфгідрильних груп
проводили методом Седлака (Буркацкая, 1978). Гідрологічні і
гідрохімічні параметри морського середовища (температура, рН, солоність,
концентрація кисню, нітритів, нітратів, фосфатів і силікатів) визначали
стандартними методами. (Методи…, 1978). Ці матеріали люб’язно надав
старший науковий співробітник Морського гідрофізичного інституту НАН
України О.С. Романов.

Результати оброблені статистично. Розраховували середнє значення,
стандартне відхилення і довірчі інтервали вибірок параметрів АО
комплексу гідробіонтів. Порівняння параметрів вибірок проводили
стандартними методами Фішера і Ст’юдента (Урбах, 1964).

АКТИВНІСТЬ АНТИОКСИДАНТНОЇ СИСТЕМИ ГІДРОБІОНТІВ І ПЕРЕКИСНЕ
ОКИСНЕННЯ ЛІПІДІВ У ПРИРОДНОМУ СЕРЕДОВИЩІ

Активність каталази водоростей-макрофітів і контроль якості води. На
підставі зміни активності каталази у шести видів чорноморських
водоростей дійшли висновку про переважне використання як
організмів-індикаторів Enteromorpha intestinalis і Ceramium rubrum.

Дані про активність каталази цих двох видів водоростей на станціях
Севастопольської бухти, які наведені на рис.2, дозволили розрахувати
95%-й довірчий інтервал середніх значень активності каталази, що
пропонується вважати нормою реакції для досліджуваних видів. Довірчий
інтервал норми для E. intestinalis, за результатами вибірки від травня
до грудня (n=24), становив 0,034(0,009 мг Н2О2/(г тканини(хв); для C.
rubrum за період від червня до вересня (n=12) він дорівнював
0,057(0,012 мг Н2О2/(г тканини(хв). На рис.2 видно, що на ст. 6
активність каталази обох видів водоростей значно вища, ніж на станціях
3, 5 і 7. Це свідчить про високе забруднення ст. 6 у 1998 р. Рис. 3
також ілюструє факт збільшення забруднення у вересні-жовтні 1998 р.,
оскільки активність каталази E. intestinalis у цю пору року зростає в
19 разів, а для C. rubrum — в 15 разів, у порівнянні з нормальними
значеннями. Гідрохімічні показники зазначеного району в цей час свідчать
про значне збільшення концентрації біогенних речовин: нітратів від 1
до 100 мкМ/л, нітритів — від 0,1 до 1 мкМ/л, фосфатів — від 0,05 до 0,
15 мкМ/л.

З листопада 1998 р. ситуація помітно поліпшилась: відбулося зменшення
концентрації нітратів до 0,08мкМ/л, нітритів — до 0,007 мкМ/л, фосфатів
— до 0,002 мкМ/л. Внаслідок зменшення рівня трофності активність
каталази помітно знизилась. Рис. 3 також підтверджує висновок про
можливість використання активності каталази як біомаркера в моніторингу
морських акваторій.

Порівняння рисунків 2а і 2б свідчить, що середнє значення активності
каталази, а також її варіабельність у E. intestinalis помітно нижча, ніж
у C. rubrum. Це можна пояснити тим, що червона водорість має більш
чутливий механізм відгуку на ідентичний градієнт забруднення. На
підставі результатів дворічних спостережень було виявлено залежність
активності каталази E. intestinalis і C. rubrum від концентрації
нітратів і нітритів у морському середовищі (рис. 4 і 5). Було
встановлено, що поріг чутливості для нітратів у ентероморфи і цераміума
складає 2 мкМ/л, а для нітритів у ентероморфи – 0,2 мкМ/л, у цераміума
– 0,1 мкМ/л. Таким чином, поріг чутливості активності каталази для
нітратів на порядок вищий, ніж нітритів. Це, можливо, можна пояснити
тим, що нітратний азот є одним з елементів живлення водоростей, у той
час як нітритна форма азоту під дією будь-якого акцептора електронів
легко перетворюється у радикал (NО2, який спричинює вільнорадикальні
процеси.

Горизонтальні ділянки кривих на рис. 4 і 5 розташовані на рівні 0,035
мг Н2О2/(г тканини(хв) для ентероморфи і 0,05 – 0,08 мг Н2О2/(г
тканини(хв) для цераміума. Ці величини потрапили в довірчий інтервал
норми відгуку, розрахований на підставі рис. 2а і 2б. Отримані довірчі
інтервали значень активності каталази ентероморфи і цераміума
відповідають їх нормальному функціонуванню.

З метою підтвердження знайденої в природному середовищі залежності
активності каталази водоростей від концентрації нітратів і нітритів був
проведений контрольний експеримент на морській воді з 10-мильової зони,
умовно вільній від біогенних речовин. Активність каталази під впливом
концентрації нітратів 100 мкМ/л протягом 48 год. для E. intestinalis,
порівняно з контролем; зростала на 250%, а для C. rubrum – на 260%.
Значення активності каталази у контролі були близькі до величин, що
відповідають їх нормальному функціонуванню.

На рис. 3 показано, що діапазон коливань активності каталази після
жовтня-листопада 1998 р., тобто після припинення дії забруднюючого
чинника, становить 0,02-0,12 мг Н2О2/(г тканини(хв) для цераміума і
0,02-0,10 мг Н2О2/(г тканини(хв) для ентероморфи. Ці величини активності
каталази знаходяться в межах значень довірчого інтервалу норми
відгуку, тобто відповідають нормальному функціонуванню водоростей.

Перекисне окиснення ліпідів водоростей-макрофітів. Норму для процесу
перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ) знаходили, користуючись вибіркою
значень рівня ПОЛ (концентрації ТБК-активних продуктів) від березня до
серпня включно (рис. 6). Довірчий інтервал середнього значення ПОЛ для
E. intestinalis дорівнює 21,39(6,13 нМ МДА/г тканини (n=12), для С.
rubrum — 85,56(25,81 нМ МДА/г тканини (n=12) (Р=0,95). Таким чином,
середнє значення рівня ПОЛ, а також його варіабельність в Е.
intestinalis значно нижчі, ніж у С. rubrum (рис. 6). Те саме явище ми
спостерігали і для каталази, рівень активності якої був також вищим в
С. rubrum і відрізнявся значно більшою варіабельністю, ніж в Е.
intestinalis. Це можна пояснити більш активним метаболізмом C. rubrum,
а також наявністю чутливіших механізмів відгуку на той же самий
градієнт забруднення.

Виявлено, що рівень ПОЛ в тканинах макрофітів з більш забруднених
станцій (5 і 6) значно вищий, ніж на станціях 3 і 7. Якщо рівень
коливань значень ПОЛ на умовно чистих станціях становив 12,193 — 40, 01
нм МДА/ г тканини і 32,7 — 159,67

нМ МДА/г тканини для Е. intestinalis і С. rubrum, відповідно, то на
більш забруднених станціях він досягав значень 21,3 — 105,86 нМ МДА/ г
тканини для Е. intestinalis і 35,42 — 220,99 нМ МДА/ г тканини для С.
rubrum. Це дозволяє використовувати показник рівня перекисного окиснення
ліпідів в організмах-індикаторах — зеленій водорості E. intestinalis і
червоній C. rubrum як біологічний маркер забруднення морських
акваторій.

`

?

?

?

?

 

c

¤

¦

I

I

ue

th

j ? O O V

„J

y^„7`„J

?????????????????

???????

???????

e

e

e

e

e

e

e

e

e

e

e

e

e

e

?????

0ньому рейді (ст.9, умовно чистий район) АК ікри виявилася вдвічі
меншою. Було встановлено, що значення АК личинок досліджуваних видів
були вищі, ніж ікри. Зі збільшенням рівня забруднення середовища
відзначалось зростання відносини АК личинок / АК ікри. В умовно чистому
районі АК личинок була вища , ніж АК ікри, в 1,81 рази, у
забрудненому — у 4,53 рази. И.И. Руднєва-Тітова (1994) також відзначає,
що АК в ікрі чорноморського бичка-кругляка нижча, ніж АК в личинках.
Вищий рівень каталазної активності дорослих особин, у порівнянні з АК
ікри, при умовах стресового впливу, відзначено також і у інших
гідробіонтів, наприклад, у поліхет (Abele-Oeschger, Oeschger, 1995).

Таблиця 2

Активність каталази ікри і личинок видів Proterorhinus marmoratus і
Lepadogaster lepadogaster на станціях з різним рівнем забруднення.

Активність каталази, мг Н2О2/(г тканини ( хв), Х((, п=184.

Станція 9 Станція 2 Станція 5

Ікра

Личинки

Ікра

Личинки

Ікра

Личинки

0.254

(0,11 0.43

(0.051 0.463

(0.04 1.953

(0.695 0.166

(0.046 0.439

(0.071

Ст. 9 і 2 — Proterorhinus marmoratus; ст. 5 — Lepadogaster
lepadogaster.

Значне збільшення АК личиночних стадій, порівняно з ікрою, при
посиленні забруднюючого чинника, імовірно, пов’язано з наявністю в ікрі
захисної оболонки, яка охороняє ембріон від шкідливих впливів, у той
час як личинки і молодь риб зазнають безпосереднього впливу токсиканта.
З огляду на це, застосування ікри як біоіндикатора, на нашу думку, менш
доцільне, через те в подальших дослідженнях ми використовували личинок
масового прибережного виду A. hepsetus.

При визначенні каталазної активності личинок A. hepsetus було виявлено,
що найбільшим рівнем АК відрізнялися личинки, виловлені на більш
забруднених станціях (рис. 7).

Рис. 7. Активність каталази личинок Atherina hepsetus на станціях з
різним рівнем забруднення.

Мінімальну активність каталази виявлено на ст. 9, максимальну — на ст.
2. Оскільки величина активності каталази чітко відповідала рівню
забруднення станцій біогенними речовинами, ми вважали можливим провести
ранжування інтенсивності забруднення досліджуваних станцій за рівнем
активності каталази: 2>3,5А>9. Також від рівня забруднення акваторій
спостерігалась залежність активності каталази печінки камбали і
личинок сардин, що живуть у Північному морі (Peters et al., 1994;
Livingstone et al, 1992).

Визначення активності СОД, ГП і концентрації ТБК-активних продуктів
проводили у личинок A. hepsetus, відібраних на станціях 3, 5А, 6 і 9. У
чистому районі (ст. 9) активність СОД складала 14,05(2,07 m NADH/(г
тканини( хв ( рис.8).

Вірогідне збільшення активності СОД порівняно зі ст. 9 відзначено при
наявності теплового (ст. 3) і антропогенного (ст. 6) забруднення — до
значень 17,62(1,02 mМ NADH/(г тканини((хв) і 16,34(1,43 mМ NADH/(г
тканини((хв) (Р=0,95). Це свідчить про стрес, який зазнають личинки у
зазначених районах, внаслідок якого зростає кількість вільних
радикалів, що стимулюють роботу СОД. Збільшення активності СОД в
еритроцитах коропа Cyprinus carpio L. при підвищенні температури
середовища встановив А. Реді (Rady, 1993). Активність ГП личинок A.
hepsetus знижувалася зі збільшенням рівня забруднення станцій. Найвищою
вона була на ст. 9, найчистішій з усіх, і складала 9,13(3,02 опт. од.
акт./(г тканини(хв). На ст. 3 знайшли зниження активності ГП до
6,07(1,12 опт. од. акт./(г тканини(хв), на ст. 5 – до 5,08(1,52 опт. од.
акт./(г тканини( хв) (Р=0,95). На ст. 6, одній з найзабрудніших,
активність ГП зменшувалася в 10 разів порівняно з умовно чистим
районом і складала 0,95(0,08 опт. од. акт./(г тканини(хв). Імовірно, це
пов’язано з посиленням процесів трансформації продуктів
вільнорадикального окиснення при умовах токсичного стресу,
нагромадженням високих концентрацій перекису водню, що блокує активність
ГП, і включенням у роботу каталази. ГП функціонує при низьких
концентраціях пероксиду, каталаза — при високих.

При дослідженні ПОЛ у личинок атерини відмічено посилення цього процесу
в забруднених районах (рис.10). Особливо істотно це проявилося при
наявності теплового забруднення на ст. 3, де
інтенсивність перекисних процесів

збільшилась в 6 разів порівняно з чистим районом і склала 167,6(47,9 нM
MДA/г тканини і 27,8(1,3 нM MДA/г тканини відповідно. На цій станції
найбільш високою була активність СОД. Це дає можливість припустити, що
активність СОД і ПОЛ більшою мірою реагують на теплове забруднення, в
той час як активність ГП і каталази – на токсичне. Відомий факт
активації процесу ПОЛ в зябрах і мембранах повітряних мішків
прісноводного морського кота Heteropneuster fossilis при підвищенні
температури води до 32-37°С (Parihar, Dubey, 1995). Зі збільшенням
температури зростала також і активність СОД в еритроцитах коропа
Cyprinus carpio (Rady, 1993), що підтверджує захисну роль СОД у процесі
ушкодження ліпідів. Посилення процесів ПОЛ на станціях 5А і 6 також було
вірогідним (Р=0,95) – 117,6(34,2 нM MДA/г тканини і 89,2(2,5 нM MДA/г
тканини. Посилення процесу пероксидації ліпідів у забруднених районах,
зокрема, на станції 6, виявлено також і у чорноморських водоростей.

Вплив параметрів середовища (температура, щільність, концентрації кисню,
фосфору) на активність каталази личинок. У розділі викладено результати
польового експерименту з виявленням умовно нормальних значень активності
каталази личинок A. hepsetus у залежності від параметрів середовища
(температура, щільність, концентрація кисню і фосфору). Значення
параметрів середовища, при яких рівні активності каталази були
мінімальні й практично не змінювалися (0,25 — 0,75 мг Н2О2/(г
тканини(хв), становили: температурний діапазон 22,0 — 25,5(С; діапазон
щільності 10,0 — 11,5 у.о.щ; концентрація кисню 6,0 — 7,5 мл/л;
фосфору — не менше 0,05 мкМ/л. Оскільки збільшення активності каталази
свідчить про стрес, що зазнають личинки, то мінімальні значення
активності каталази, імовірно, відповідають їхньому нормальному
функціонуванню. Збіг цих значень з активністю каталази личинок із
незабрудненого району (бухта Омега, ст.9 – 0,263 ( 0,032) (рис.7) дає
нам можливість говорити про відносно нормальні значення активності
каталази, виявлені для личинок A. hepsetus у зазначених умовах. Для
підтвердження залежності активності каталази личинок A. hepsetus від
параметрів середовища був проведений контрольний лабораторний
експеримент з умовно вільною від біогеннів елементів морською водою.
Зростання активності каталази на 10-30% спостерігали при максимальних і
мінімальних значеннях вивчених параметрів середовища, відзначених нами в
природних умовах.

Низькомолекулярні антиоксиданти (каротиноїди, загальні й вільні тіолові
групи) у тканинах мідії Mytilus galloprovincialis. Було виявлено деяке
збільшення вмісту каротиноїдів у гонадах мідій відповідно до сезонного
зниження температури води. В осінньо-зимовий сезон молюски мають більшу
здатність поглинати полютанти з морського середовища, ніж влітку.
Зростання вмісту каротиноїдів у цьому випадку є захисним адаптаційним
механізмом, що дозволяє нейтралізувати дію токсикантів (Костылев, 1981).
Ніяких значних змін вмісту каротиноїдів у гонадах мідій, зібраних на
станціях з різним рівнем забруднення, не виявлено.

Концентрацію сульфгідрильних груп (SH-) визначали в печінці і зябрах
мідії Mytilus galloprovincialis з умовно чистого району — бухти Козачої
(ст. 12) і з

Севастопольської бухти ( ст. 5А і ст. 3).

Зміну вмісту загальних і вільних SH-груп у печінці мідій показано на
рис. 11 і 12. Відзначено вірогідне зниження вмісту загальних SH-груп в
печінці на станціях 3 і 5А, порівняно з відносно чистим районом —
ст.12. Найбільше зниження вмісту загальних SH-груп виявлено на станції
5А, що, імовірно, пов’язано з забрудненням її ґрунтів важкими
металами. Відомо, що при утворенні комплексів тіолів з важкими металами,
відбувається зниження вмісту загальних SH-груп білків (Торчинский,
1977). Крім того, вільні радикали, що виникають під час токсичного
стресу, взаємодіючи з тіоловими групами, можуть зменшувати їхню
кількість (Леус, Грубинко, 1998).

При визначенні небілкових SH-груп у печінці мідий виявили достовірне
зниження їх на станції 3, у порівнянні з чистим районом (ст. 12) (рис.
12), і деяке збільшення на станції 5А. Імовірно, це свідчить про
посилення перекисних процесів у молюсків із зазначеного району бухти, що
супроводжується активацією синтезу глутатіону – одного з основних
антиоксидантних тіолів небілкової природи — трипептиду, за рахунок
якого відбувалось збільшення концентрації вільних SH-груп (Коновалов,
1984).

АКТИВНІСТЬ АНТИОКСИДАНТНОЇ СИСТЕМИ ГІДРОБІОНТІВ В ЕКСПЕРИМЕНТІ

Вплив важких металів (Сu2+, Zn2+) і нітратів на антиоксидантну систему
гідробіонтів. Встановлено, що мідь (Cu2() у концентраціях 0,01; 0,1 і
5,0 мг/л, а також нітрати в концентраціях 8,82 і 25,64 мкМ/л при дії
протягом 2 і 12 год. спричинюють збільшення активності каталази
личинок атерини A. hepsetus (Р=0,95). Слід зазначити, що діапазон зміни
активності каталази контрольних личинок сягав 0,45-0,58 мг Н2О2/(г
тканини(хв) при експозиції 2 і 12 год. Це збігається з інтервалом
умовно нормальних значень активності каталази 0,25-0,75 мг Н2О2/(г
тканини(хв), встановленим для нормального функціонування личинок.

При визначенні активності пероксидази в гемолімфі чорноморської мідії M.
galloprovincialis під впливом граничних і токсичних концентрацій міді
протягом 1-6 діб (для токсичних концентрацій 0,1; 1,0; 5,0 мг/л) і в
тривалому експерименті (30 діб) для граничних ( 0,001; 0,005; 0,01
мг/л) було встановлено, що в досліджуваному діапазоні концентрацій
активність каталази вірогідно не змінювалась. Можливо, це пов’язано з
припиненням мідіями фільтрації, закриттям стулок і переходом на
анаеробний тип обміну в токсичних умовах.

Вивчення впливу міді в концентраціях 0,25; 1,25 і 2,5 мкг/л на вміст
загальних і вільних тіолових груп у печінці і зябрах M.
galloprovincialis у тривалих (10, 20 і 30 діб) експериментах показало
їхнє вірогідне зниження при концентрації 2,5 мкг/л, що відзначалося на
30-у добу експерименту. Зростання вмісту SH-груп у зябрах можна
інтерпретувати як адаптаційний механізм, що включається на першому етапі
стрес-реакції.

Вплив іонів цинку в концентраціях 0,09; 0,18; 0,45; 0,9 і 9 мг/л на
антиоксидантні ферменти синьозеленої водорості S. рlatensis проявився в
пригнічіванні активності супероксиддисмутази і каталази, починаючи з
мінімальної концентрації 0,09 мг/л. Збагачення спіруліни цинком було
максимальним при концентрації 9 мг/л і становило 253,5 мкг/г сухої ваги.
Цинк у концентраціях до 9 мг/л не впливав на ростові характеристики
спіруліни.

Вивчення впливу гіпоксії на ферменти фосфорного метаболізму в тканинах
гідроїда O. loveni показало, що крива залежності тканинної активності
АТФ-ази від віку колоній гідроїда в нормальних умовах має дзвониковидну
форму і досягає максимальних значень (25,01(1,24 мкг Р/(мг білка(хв) у
віці 2,5 місяці, що характеризується найвищою метаболічною активністю.
Мінімальні значення активності цього ферменту, які дорівнюють 4,42(0,2
мкг Р/(мг білка (хв), характерні для гідроїда на стадії редукції
колоній. В умовах гіпоксії тканинна активність АТФ-ази експоненційно
знижується зі зростанням віку колоній гідроїда. В умовах нестачі кисню
виявлено також зниження активності кислої й лужної фосфатаз у віці
популяції 45 доби.

ВИСНОВКИ

1. Запропоновано комплекс параметрів антиоксидантної
системи для ряду масових видів макрофитів Чорного моря для оцінки
екологічного стану прибережних акваторій.Перевагою методу визначення
активності каталази є його простота, економічність, швидка реакція на
дію токсиканта, практично без запізнювання.

Виявлено, що чорноморські водорості-макрофіти — Enteromorpha
intestinalis і Ceramium rubrum можуть бути використані як
види-індикатори трофності морських акваторій.

2. Вперше визначені інтервали активності каталази Enteromorpha
intestinalis і Ceramium rubrum, які відповідають нормальному
функціонуванню організмів, тобто рівні норми відгуку в досліджуваному
районі за певних умов відповідають 0,034(0,009 мг Н2О2/(г тканини(хв)
для ентероморфи і 0,057(0,012 мг Н2О2/(г тканини(хв) для цераміума.

3. Вперше виявлено залежність активності каталази Enteromorpha
intestinalis і Ceramium rubrum від концентрації нітратів і нітритів у
морській воді. Встановлено, що поріг чутливості активності каталази
водоростей для нітратів становить 2 мкМ/л, а для нітритів — у
ентероморфи — 0.2 мкМ/л, у цераміума — 0.1 мкМ/л.

4. Концентрація ТБК-активних продуктів у
водоростей-макрофітів Enteromorpha intestinalis і Ceramium rubrum може
бути рекомендована як біологічний маркер забруднення морських акваторій.
Вперше визначено норму реакції процесу перекисного окиснення ліпідів в
організмах-індикаторах, що складає 21,39(6,13 нМ МДА/ г тканини і
85,56(25,81 нМ МДА/г тканини для ентероморфи і цераміума відповідно.

5. Показано, що деякі види чорноморських гідробіонтів, такі
як Atherina hepsetus і Оbelia loveni, можуть бути застосовані як
види-індикатори забруднення морських акваторій.

6. Встановлено, що личинки Atherina hepsetus є більш
чутливими, порівняно з ікрою, до змін трофності морських вод.. Виявлено
комплекс параметрів середовища, які впливають на антиоксидантну систему
личинок A. hepsetus. Визначено деякі значення параметрів середовища, які
відповідають нормальному функціонуванню личинок: температурний оптимум
22,5 — 25(С, щільність морської води 10,0-11,5 у.о.щ., концентрація
кисню 6,0-7,5 мл/л, концентрація фосфатів 0,04 — 0,13 мкМ/л. Норма
активності каталази для личинок A. hepsetus сягаля 0,25 — 0,75мг Н2О2/(г
тканини(хв).

7. Проведено ранжування різних ділянок Севастопольської
бухти за рівнем активності антиоксидантної системи деяких
чорноморських гідробіонтів відповідно до рівня антропогенного
навантаження: станції 2 і 6 (поблизу гирла р.Чорної і Південна бухта)
-політрофні акваторії; станції 3, 5 і 5А (райони ГРЕС, поблизу
пам’ятника затопленим кораблям і бухта Старопівнічна) – акваторії
евтрофні; станція 7 (вихід з бухти) – мезотрофні води; станції 9, 12
(зовнішній рейд б.Севастопольської) – оліготрофні акваторії.

8. Виявлено зниження концентрації загальних тіолових груп у
печінці мідії Mytilus galloprovincialis у евтрофних районах. Мідь
(Cu2() у концентрації 2,5 мкг/л у хронічних експериментах до 30 діб
призводила до зниження вмісту загальних і вільних сульфгідрильних груп
у печінці і зябрах мідії M. galloprovincialis.

9. Виявлено зміну активності каталази личинок Atherina
hepsetus під впливом двовалентної міді в концентраціях 0,01; 0,1 і 5
мг/л і нітратів у концентраціях 8,82; 25,64 мкМ/л у лабораторних
умовах. Активність каталази, яка відповідає нормальному функціонуванню
личинок (0,25 — 0,75мг Н2О2/(г тканини(хв), була відзначена тільки для
контрольної групи тварин.

10. Проведено дослідження антиоксидантної системи чистих
культур Оbelia loveni і Spirulina рlatensis, вирощених в
експериментальних умовах. Встановлено інгібування активності
антиоксидантних ферментів супероксиддисмутази і каталази при дії
концентрацій двовалентного цинку 0,09 – 9 мг/л на S. рlatensis.
Збагачення спіруліни цинком було максимальним при концентрації 9 мг/л і
становило 253,5 мкг/г сухої ваги. В умовах гіпоксії активність тканинної
АТФ-ази гідроїда О. loveni зі збільшенням віку колоній експоненційно
знижується в діапазоні значень 9,01 – 5,71 мкг Р/(мг білка(хв).

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Шахматова О. А. Активность каталазы личинок рыб как показатель качества
морской среды // Экология моря. — 2000. — Вып. 51. — С. 52-54.

Шахматова О. А.. Парчевская Д. С. Активность каталазы и контроль
качества воды // Альгология. — 2000. — Т. 10, № 3. — С. 355-361. Доля
участия диссертанта 80%

Шахматова О. А. Влияние гипоксии на активность ферментов фосфорного
обмена гидроида Оbelia loveni // Экология моря. — 2001. — Вып. 56. — С.
68-71.

Шахматова О. А. Активность антиоксидантной системы личинок рыб как
показатель качества морской среды // Экология моря. — 2002. — Вып. 59.
— С. 48-50.

Шахматова О. А. Действие цинка на активность супероксиддисмутазы и
каталазы у Spirulinal platensis (Notdst) Geitl // Экология моря. — 2002.
— Вып. 60. — С. 44-47.

Шахматова О. А., Парчевская Д. С. Перекисное окисление липидов некоторых
видов черноморских водорослей и качество воды //Матерiали ХI з,iзду
Украiнського ботаничного товариства. – Харкiв. – 2001. – С. 431. Доля
участия диссертанта – 85%

Шахматова О. А. Активность антиоксидантной системы личинок рыб как
показатель качества морской среды //Тез. докл. VI Междунар. конф.
“Биоантиоксидант”. – Москва. – 2002. – С. 620-621.

8. Шахматова О. А. Активность антиоксидантных ферментов Spirulina
рlatensis при длительном хранении // Труды Х Юбилейной междунар. конф.
“Новые информ. технологии в медицине и экологии”. Украина, Крым,
Ялта-Гурзуф, 1-10 июня 2002 г. – С. 300–301.

АНОТАЦІЇ

Шахматова О.О. Активність антиоксидантної системи деяких чорноморських
гідробіонтів у прибережній акваторії Севастополя. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за
спеціальністю 03.00.17 – гідробіологія. – Інститут біології південних
морів НАН України, Севастополь, 2004.

У дисертації запропонований комплекс біомаркерів антиоксидантної
системи для кількісної оцінки стану гідробіонтів і середовища їх
існування в прибережній зоні Чорного моря. Вперше виявлено роль
каталази в процесі адаптації гідробіонтів до забруднення. Визначені
інтервали активності каталази у гідробіонтів-індикаторів, що
відповідають їх умовно нормальному функціонуванню в досліджуваному
районі Чорного моря. Визначено норму реакції процесу перекисного
окислення ліпідів у організмів-індикаторів. Вперше визначені діапазони
зміни параметрів середовища (температура, щільність, концентрація кисню,
фосфатів, нітратів і нітритів), що відповідають умовам нормального
функціонування личинок риб Atherina hepsetus L.,а також двох видів
водоростей-макрофитів — Enteromorpha intestinalis (L.) Link.і Ceramium
rubrum (Huds.) Ag. На підставі активності антиоксидантної системи
гідробіонтів виконане ранжування досліджених районів за рівнем
евтрофності. За результатами досліджень рекомендовано використання
антиоксидантної системи гідробіонтів при проведженні моніторингових
робіт у прибережній зоні Чорного моря. Запропонований автором комплекс
біомаркерів і відповідних організмів-індикаторів дозволяє без істотних
фінансових витрат регулярно здійснювати контроль стану чорноморського
прибережних акваторій.

Ключові слова: антиоксидантний комплекс, каталаза, супероксиддисмутаза,
Se- залежна глутатіонпероксидаза, перекисне окислення ліпідів, личинки
Atherina hepsetus, водорості-макрофіти Enteromorpha intestinalis,
Ceramium rubrum, забруднення.

Шахматова О.А. Активность антиоксидантной системы некоторых черноморских
гидробионтов в прибрежной акватории Севастополя. – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по
специальности 03. 00.17 – гидробиология. – Институт биологии южных морей
НАН Украины, Севастополь, 2004.

В диссертации предложен комплекс биомаркеров антиоксидантной системы
для количественной оценки состояния гидробионтов и среды их обитания в
прибрежной зоне Черного моря. Впервые выявлена роль каталазы в процессе
адаптации гидробионтов к загрязнению. Определены интервалы активности
каталазы у гидробионтов-индикаторов, соответствующие их условно
нормальному функционированию в исследуемом районе Черного моря.
Определена норма реакции процесса перекисного окисления липидов в
организмах-индикаторах. Впервые определены диапазоны изменения
параметров среды (температура, плотность, концентрация кислорода,
фосфатов, нитратов и нитритов), соответствующие условно нормальному
функционированию личинок рыб Atherina hepsetus L., а также двух видов
водорослей-макрофитов — Enteromorpha intestinalis (L.) Link. и Ceramium
rubrum (Huds.) Ag. На основании активности антиоксидантной системы
некоторых гидробионтов выполнено ранжирование исследованных районов по
степени эвтрофности. В результате исследований рекомендовано
использование антиоксидантной системы гидробионтов при проведениии
мониторинговых работ в прибрежной зоне Черного моря. Предложенный
автором комплекс биомаркеров и соответствующих организмов-индикаторов
позволяет без больших экономических затрат регулярно вести контроль
состояния черноморских прибрежных акваторий.

Shakhmatova O.A. Hydrobionts antioxidant system activity in Black Sea
littoral water. – Manuscript.

The dissertation work to obtain a degree of Candidate of Biological
Sciences on speciality 03.00.17 –hydrobiology. – Institute of Biology
of the Southern Seas, National Academy of Sciences of Ukraine,
Sevastopol, 2004.

The biomarker complex for the quantitive estimation of both marine
organism and environment is proposed on basis of field and laboratory
investigated. The role of catalase in adaptation of hydrobionts for
pollution was revealed for the first time. For the indicatore organisms
there were determinated the confidence intervals of the catalase
activity corresponding to normal conditionally normal functioning in
this region of Black Sea. The norm of lipid peroxidation reaction of
the indicators organism was determined. The range of changing of the
environmental parameters (temperature, density, oxygen, phosphorus,
nitrates and nitrites concentrations) was determined for the fist time
wich correspond to their conditionally normal functioning of the fish
larvae Atherina hepsetus and seaweeds Enteromorpha intestinalis and
Ceramium rubrum. The studied regions were ranged according to the level
of pollution.

Key words: antioxidant complex, antioxidant enzymes, catalase,
superoxide dismutase, Se-dep. glutathione peroxidase, lipid
peroxidation, fish larvae Atherina hepsetus, seaweeds Enteromorpha
intestinalis, Ceramium rubrum, pollution.

Рис. 8 Активность супероксиддисмутазы личинок Atherina hepsetus на
станциях с различной степенью загрязнения

Похожие записи