МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім.О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

ВОЙЦЕХОВСЬКИЙ ВАЛЕРІЙ ГРИГОРОВИЧ

УДК 576.5:579.852.1:579.24

Агрегація клітин в онтогенезі спороутворюючих мікроорганізмів

03.00.07 – мікробіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

Київ – 2004

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному медичному університеті
ім.О.О.Богомольця МОЗ України

Науковий консультант доктор медичних наук, професор,

академік НАН України, член-кореспондент АМН України,

заслужений діяч науки і техніки України

Широбоков Володимир
Павлович,

Національний медичний
університет ім.О.О.Богомольця,

завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології

Офіційні опоненти

доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України

Коваленко Надія Костянтинівна, Інститут мікробіології і вірусології

ім.Д.К.Заболотного НАН України, провідний науковий співробітник

відділу фізіології промислових мікроорганізмів

доктор медичних наук, професор

Кременчуцький Геннадій Миколайович, Дніпропетровська державна

медична академія, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та
імунології

доктор медичних наук, професор Клімнюк Сергій Іванович

Тернопільська державна медична академія ім. І.Я. Горбачевського,

завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології

Провідна установа

Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика,

кафедра мікробіології та епідеміології, МОЗ України, м. Київ

Захист відбудеться 26.04. 2004 року о 13-30 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.01 Національного
медичного університету ім. О.О. Богомольця за адресою : 03057,
м.Київ-57,

пр. Перемоги, 34, санітарно-гігієнічний корпус, аудиторія № 2.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного
медичного

університету ім. О.О. Богомольця за адресою: 03057, м.Київ-57, вул.
Зоологічна, 1.

Автореферат розісланий 25.03.2004 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради
Анісімов Є.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження глибинних механізмів міжклітинної
взаємодії у еукаріот і прокаріот є однією з актуальних проблем сучасної
медицини і біології. Міжклітинні зв’язки відіграють важливу роль на всіх
рівнях організації живих систем, а їх дослідження має важливе значення в
розв’язанні таких фундаментальних проблем біології, мікробіології,
імунології та онкології, як розвиток клітин, їх диференціація,
міжклітинна кооперація, злоякісна трансформація тощо.

Процеси міжклітинної взаємодії всебічно вивчаються серед еукаріотичних і
прокаріотичних клітин. До теперішнього часу залишаються не розв’язаними
проблеми міжклітинної взаємодії при різноманітній патології, мало
вивчені питання взаємодії бактеріальних клітин з клітинами організму
людини під час інфекційного процесу (Олескин А.В. и др., 1999; Воронов
О.О. із співавт., 1999; Hartshorn K.L. et al., 2002; Sheikh J. et al.,
2002; Mellata M. et al., 2003).

За останні роки став помітним суттєвий прогрес у підходах до вивчення
процесів міжклітинної взаємодії та механізмів її регулювання. Одним із
можливих підходів до розв’язання вказаних загальнобіологічних проблем є
використання мікробіологічної моделі дослідження механізмів міжклітинної
взаємодії, зокрема аеробних спороутворюючих бактерій (Дорошенко Е.В. и
др., 2000; Lazazzera B.A. et al., 2001; Chary V.K., Piggot P.J., 2003;
Eichenberger P. еt al., 2003). Представники роду Bacillus на певних
стадіях свого розвитку різко відрізняються між собою за морфологічними
ознаками, мають характерну клітинну диференціацію та унікальні
властивості спорових форм.

Аеробні спороутворюючі бактерії відносять до умовно патогенних
мікроорганізмів, які здатні викликати в організмі людини ряд
патологічних процесів: харчові отруєння, септицемії, ендокардити,
ревматоїдні артрити, менінгіти, енцефаліти, пневмонії, нефрити тощо. Їх
дія на організм обумовлена такими факторами патогенності, як
ентеротоксини (Fletcher P. et al., 1999; Granum G. et al., 1999),
ендотоксини (Mahler H. et al., 1997), гемолізини (Okstad O. et al.,
1999; Kuse M. et al., 2000), ферменти патогенності: фосфоліпаза С,
беталактамаза, протеаза, коллагеназа тощо (Bach H. et al., 1999; Nund T.
et al., 1999; Kurakahe M. et al., 2000; Hosaka T. et al., 1999). Поява
факторів патогенності спороутворюючих бактерій тісно пов’язана з певними
фазами їх росту та розвитку. Окремі представники роду Bacillus, зокрема
B.megaterium H, мають перехресно-реагуючі антигени з тканинами
злоякісних пухлин (Затула Д.Г., 1982). Невірулентні штами бацил широко
використовують для одержання пробіотиків (Кременчуцкий Г.Н. и др.,
2003). Тому дослідження процесів розвитку цих мікроорганізмів має
важливе значення як для розв’язання питань, пов’язаних з різноманітною
інфекційною патологією, так і для пошуку та отримання корисних
біологічно активних речовин, в тому числі, протипухлинної дії.

Вивчення міжклітинної взаємодії у бактерій – це важлива проблема не
тільки медичної мікробіології, але й загальнобіологічна.
Мікробіологічний аспект її полягає в тому, що, не зважаючи на численні
дослідження, ще й досі залишаються недостатньо вивчені фази розвитку
періодичної культури мікроорганізмів, роль ауторегуляторних факторів у
процесах розвитку, зміни хімічного складу бактеріальних клітин під час
росту та розмноження, значення окремих елементів та біополімерів у
процесах диференціації, в реалізації механізмів анабіозу. Важливими та
нерозв’язаними залишаються питання, пов’язані із структурними та
функціональними особливостями бактеріальних клітин на різних стадіях
розвитку, механізмами регуляції розвитком та диференціацією, можливістю
управління цими процесами у мікроорганізмів.

Однією з головних перешкод в дослідженні невирішених питань було те, що
до недавнього часу не існувало сучасних технічних засобів, які дозволяли
б експериментаторам вивчати розвиток бактеріальних клітин на прикладі
однієї чи кількох особин протягом тривалого часу культивування. Слід
також зауважити, що отримані експериментальні дані та висновки про
розвиток спороутворюючих бактерій базувалися на аналізі окремих зразків,
що отримані із глибинної культури (макрокультури). Вивченню розвитку
окремих клітин та формування мікропопуляції мікроорганізмів з
використанням прямих методів спостереження присвячені лише одиничні
роботи.

Попередніми дослідженнями нами встановлений феномен агрегації клітин під
час розвитку періодичної культури одного штаму бактерій – B.cereus 504
(Войцеховский В.Г., 1982). Залишилося нез’ясованим можливість агрегації
серед інших видів та штамів спороутворюючих бактерій. Не досліджені
особливості міжклітинної взаємодії під час агрегації, ультраструктура
агрегатів, фактори, які впливають на процес агрегації, зміни хімічного
складу клітин та синтезу біополімерів на різних фазах розвитку
бактеріальної популяції, можливі механізми агрегації та її роль в
онтогенезі мікроорганізмів.

У зв’язку з вище викладеним слід вважати актуальною проблему вивчення
міжклітинної взаємодії у процесі розвитку та диференціації
спороутворюючих бактерій.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана у межах проекту Державного фонду фундаментальних
досліджень Комітету з науково-технічного прогресу при Кабінеті Міністрів
України під назвою: “Явище агрегації клітин в онтогенезі
мікроорганізмів” (№5/385) та науково-дослідної роботи кафедри
мікробіології, вірусології та імунології Національного медичного
університету ім.О.О.Богомольця за темою: “Розробити тверді поживні
середовища на основі синтетичних та природніх гелів для культивування та
ідентифікації мікроорганізмів (№ держреєстрації 01.87.0011067).

Мета та задачі дослідження. Мета: встановити закономірність феномену
агрегації клітин у різних видів спороутворюючих бактерій роду Bacillus
та визначити його значення в онтогенезі мікроорганізмів.

Для досягнення вказаної мети були поставлені наступні задачі:

Дослідити умови та етапи формування агрегатів клітин у процесі розвитку
періодичних культур різних видів спороутворюючих бактерій з
використанням методів фазово-контрастної та електронної мікроскопії.

Вивчити динаміку розвитку та міцність міжклітинних зв’язків у процесі
агрегації та дезагрегації клітин періодичної культури бактерій.

Здійснити біохімічний та електрофоретичні дослідження біополімерів
поверхневих шарів клітинної стінки та розчинних полімерів культуральної
рідини на різних фазах розвитку періодичної культури спороутворюючих
бактерій.

Встановити особливості мінерального обміну бактеріальних клітин на
різних етапах розвитку з комплексним використанням растрової електронної
мікроскопії та рентгеноспектрального мікроаналізу.

Дослідити властивості бактеріальних спор після багаторічного зберігання
в лабораторних умовах, а саме, проростання, утворення вегетативних форм
та їх здатність до агрегації.

Визначити можливості управління розвитком бацил у межах мікроциклічного
та макроциклічного розвитку.

Об’єкт дослідження: феномен агрегації клітин умовно патогенних аеробних
спороутворюючих бактерій.

Предмет дослідження: штами мікроорганізмів, періодичні культури
бактерій, мікрокультури бактерій, біополімери клітинних стінок та
розчинні полімери культуральної рідини, мінеральний склад бактерій на
різних фазах розвитку.

Методи дослідження. Для вивчення особливостей міжклітинної
взаємодії аеробних спороутворюючих бактерій використовували комплекс
мікроскопічних, бактеріологічних, фізіко-хімічних,
електронно-мікроскопічних методів досліджень із застосуванням растрового
електронного мікроскопа та рентгенівського мікроаналізатора, методи
мікрокультивування мікроорганізмів у камерах, які дозволяють здійснювати
багатодобове спостереження за розвитком окремих бактеріальних клітин.

Наукова новизна одержаних результатів. В результаті проведених
досліджень вперше встановлено, що в процесі розвитку періодичних культур
різних видів умовно патогенних спороутворюючих бактерій роду Bacillus,
вегетативні клітини після завершення експоненціальної фази розвитку
об’єднуються в багатоклітинні агрегати. Процес формування агрегатів
характеризувався спочатку зростанням сил міжклітинної взаємодії,
досягненням їх максимуму, потім зменшенням і повним зникненням.
Диференціація клітин від вегетативних до форм у стані спокою
відбувалася в агрегатах, а після повного дозрівання спор наступала
дезагрегація клітин. Таким чином, доведено, що в оптимальних умовах цикл
розвитку глибинної культури досліджуваних мікроорганізмів
супроводжується агрегацією клітин і завершується не лізисом та загибеллю
популяції, а, навпаки, 100 % спороутворенням.

Електронно-мікроскопічними дослідженнями встановлено, що агрегація
вегетативних клітин виникає в результаті щільного контакту їх боковими
поверхнями з наступним злиттям поверхневих шарів клітинних стінок. Після
завершення спороутворення в клітинах агрегату та лізису параспоральних
частин спорангіїв втрачалися попередні зв’язки між бактеріями і
відбувався розпад агрегатів.

В результаті електрофоретичних досліджень встановлено, що на початкових
етапах агрегації клітини здатні синтезувати специфічні розчинні
біополімери, а культура саме в цій фазі розвитку індукує спорогенез у
інших вегетативних клітин. Виявлені біополімери мають глікопротеїдну
природу з молекулярною масою 41,0 і 33,5 кДа. Крім того, під час
формування агрегатів бактеріальні клітини утворюють специфічні для цієї
фази розвитку білки поверхневих шарів клітинної стінки (ММ 70,0–72,0
кДа), яким, можливо, і належить роль агрегуючих білків.

Вперше одержані дані про зміну вмісту хімічних елементів на різних фазах
розвитку мікробної клітини. При вивчені мінерального складу у бактерій
роду Bacillus встановлено, що вміст калію, натрію, кальцію, хлору,
сірки, фосфору та кисню суттєво змінюється в клітинах на різних фазах
розвитку періодичної культури. Проростаючі спори значною мірою втрачають
більшість елементів, вегетативні форми бактерій під час агрегації
накопичують калій, хлор, сірку та фосфор, що характеризує збільшення
синтетичних та енергетичних процесів в клітинах. Таким чином, всебічне
дослідження встановленого нами феномену агрегації клітин показало, що це
закономірний процес, який має важливе значення в розвитку та
диференціації клітин мікробної популяції.

На підставі одержаних результатів розроблена мікробіологічна модель, яка
дозволяє вивчати онтогенез окремих бактеріальних клітин при постійному
спостереженні за ними, діяти на них регуляторними факторами різного
походження та змінювати стадії розвитку клітин в певному напрямку і,
таким чином, досліджувати механізми диференціації та міжклітинної
взаємодії.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлені закономірності
розвитку умовно патогенних спороутворюючих бактерій мають значення при
використанні їх у мікробіологічній промисловості для одержання
діагностичних, лікувальних та профілактичних препаратів, біологічно
активних речовин, біомаси спорових форм мікроорганізмів. Запропоновані
методи мікрокультивування бактерій можуть бути використані для вивчення
їх біологічних властивостей, дослідження механізмів дії антимікробних
речовин. Одержані результати роботи можна використовувати при пошуку та
створені препаратів – регуляторів поділу та диференціації клітин, які
необхідні для застосування в різних галузях медицини.

Впровадження в практику. Розроблені камери для мікрокультивування
бактерій використовуються в Інституті епідеміології та інфекційних
хвороб ім. Л.В.Громашевського АМН України для дослідження антимікробної
дії хімічних сполук. Одержані результати використовуються у
педагогічному процесі на кафедрах мікробіології, вірусології та
імунології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця,
Буковинської державної медичної академії, Дніпропетровської державної
медичної академії.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. У
дисертації викладені результати теоретичних та експериментальних
досліджень, проведених переважно особисто. Фрагменти планових та
грантованих НДР виконані здобувачем як виконавцем та відповідальним
виконавцем вищеназваних наукових тем. Особисто автор провів аналіз
літератури, мікроскопічні та мікробіологічні дослідження.
Електронно-мікроскопічні та масспектральні дослідження проведені спільно
з інженером-технологом вищої категорії Філімоненком О.П. та інженером 1
категорії Федоровим В.М. на базі лабораторії електронної мікроскопії та
масспектрального аналізу НПО “Мікропроцесор” Київського НДІ
Мікроприладів Центру фізіко-хімічних досліджень і високоточних
вимірювань. Біохімічні та електрофоретичні дослідження проведені спільно
з к.б.н., доцентом Михальським Л.О. та к.б.н, м.н.с Фуртат І.М. на базі
кафедри мікробіології та прикладної імунології Київського національного
університету імені Тараса Шевченко. *

Всі положення та висновки дисертаційної роботи належать автору. Автор
самостійно написав та проаналізував усі друковані роботи.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що викладені в
дисертаційній роботі були представлені на: VI Всесоюзній конференції по
клінічні біохімії, морфології та імунології інфекційних захворювань
“Новые возможности исследования состояния иммунитета при кишечных
инфекциях” (Рига, 18-20 жовтня, 1983 р.); IX Всесоюзній конференції
“Гигиени-ческое изучение биологического загрязнения окружающей среды”
(Москва, 1983 р.); IV з’їзді Українського мікробіологічного товариства
(Донецьк, 1984 р.); VII Мечніковській конференції “Современные вопросы
вирусологии, микробиологии и иммунологии” (Одеса, 12-14 вересня 1984
р.); семінарі Всесоюзного мікробіологічного товариства “Физиология и
генетика энтомопатоген-

___________________________________

* Автор висловлює щиру подяку вищеназваним співробітникам за надану
консультативну та практичну допомогу при виконанні окремих фрагментів
роботи.

ных бацилл — продуцентов средств защиты растений” (Оболєнск, 27-29
лютого 1984 р.); VII Всесоюзному з’їзді мікробіологічного товариства
(Алма-Ата, 1985 р.); ХІ Українському республіканському з’їзді
мікробіологів, епідеміологів та паразитологів (Одеса, 9-11 жовтня, 1985
р.); Всесоюзному семінарі “Вопросы антибактериальной терапии
инфекционных осложнений в неинфекционной клинике” (Москва, 17-18
листопада, 1987 р.); І міській науково-практичній конференції
винахідників та раціоналізаторів “Изобретательство и рационализаторство
на современном этапе развития медицины” (Київ, 27-29 жовтня, 1988); XII
Українському з’їзді мікробіологів, епідеміологів та паразитологів
(Харків, 25-27 вересня, 1991 р.); Міжнародній науковій конференції “Идеи
И.И.Мечникова в развитии современного естествознания” (Харків, 28-30
жовтня, 1995 р.); Міжнародній науково-практичній конференції “Актуальні
питання епідеміології на рубежі ХХІ століття” (Харків, 21-22 вересня,
2000 р.); Міжнародній конференції “Стратегия и тактика применения
антисептиков в медицине” (Вінниця, 3-4 жовтня, 2000 р.);
Науково-практичній конференції з міжнародною участю “Проблемні питання
лікування дітей” (Київ, 17-18 травня, 2001 р.); Науково-практичній
конференції “Медикаментозна та немедика-ментозна профілактика та
відновне лікування в клінічній практиці” (Київ, 14-15 червня, 2001 р.).

Публікації. За результатами роботи опубліковано 50 наукових праць, з
яких 24 статті у фахових виданнях, визначених ВАК України, 2 авторських
свідоцтва, 5 патентів, 19 робіт у матеріалах з’їздів, конференцій.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду
літератури, опису матеріалів і методів дослідження, 5 розділів власних
досліджень, обговорення результатів дослідження, висновків, практичних
рекомендацій, додатку. Роботу викладено на стор. основного
тексту, ілюстровано таблицями і рисунками. Бібліографія
складається з джерел, серед яких україно- та
російськомовних і іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Головним об’єктом дослідження був
феномен агрегації клітин періодичних культур умовно патогенних
спороутворюючих бактерій роду Bacillus. У дослідженнях використовували
еталонні штами аеробних спороутворюючих мікроорганізмів, які були
отримані із ДНДІСК ім. Л.О.Тарасевича (РФ, м.Москва). Це такі штами:
B.mesentericus 66, B.mesentericus 1027 typе “E”, B.mesentericus 1026
typе “E”, B.mesentericus 1026 typе “D”, B.cereus ССM, B.cereus 2527,
B.cereus 4/43, B.cereus 8035, B.cereus 24, B.megaterium 654,
B.megaterium 2550, B.megaterium 89, B.subtilis 83, B.subtilis 7241. Крім
того вивчалась культура оригінального штаму мікроорганізмів –
B.megaterium H, який був виділений із грунту чл.-кор. НАН України
Д.Г.Затулою. Відмінною особливістю даного штаму є те, що його спорова і
вегетативна форма мають перехресно-реагуючі антигени з тканинами
злоякісних пухлин (Д.Г.Затула, 1982). Також вивчалась культура
B.mesentericus AB-56, яка мала антагоністичні властивості відносно штаму
B.megaterium H. Обидва штами отримані із музею живих культур Інституту
мікробіології та вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України. Також
використовували штами Bacillus spр., Streptococcus pyogenes, Penicillium
notatum 997 отримані на кафедрі епідеміології Національного медичного
університету ім. акад. О.О.Богомольця.

Поживні середовища. Для культивування мікроорганізмів, одержання чистих
культур, накопичення їх біомаси використовували такі поживні середовища:
м’ясо-пептонний бульйон, перевар по Хоттінгеру, МПА, кров’яний МПА.
Основні експерименти проведені в рідкому середовищі “ВВГ”, яке
лімітоване за вмістом пептонів і за своїм хімічним складом сприяло
повноцінному циклу розвитку досліджуваних мікроорганізмів, тобто 100 %
спороутворенню. Для мікрокультивування бактерій використовували
розроблену нами із співавторами (Гашинський В.В., Широбоков В.П.,
Крайнюкова Т.І., Марченко М.М. та ін.) і запатентовану синтетичну основу
для твердого поживного середовища – поліакріламідний гель.

Накопичення біомаси спор. Спорову біомасу отримували за допомогою
методів, розроблених нами у попередній роботі (Войцеховський В.Г.,1982),
використовуючи для цього культивування мікроорганізмів в рідкому
середовищі, а також на твердих поживних середовищах із поліакриламідною
основою. З 1975 року були отримані біомаси спор різних видів бацил (в
об’ємі в середньому по 100 мл з концентрацією спор до 10 млрд/мл). Спори
отримали для проведення експериментів, а також були закладені для
довготривалого досліду, мета якого – з’ясувати життєздатність спор в
процесі їх зберігання в лабораторних умовах.

Одержання культуральної рідини спороутворюючих бактерій. Культуральну
рідину спороутворюючих бактерій одержували з метою визначення зміни
білкових та вуглеводних компонентів в її складі на різних фазах розвитку
періодичної культури бактерій. Процес накопичення культуральної рідини
здійснювали за наступною модифікацією. Мікроорганізми культивували у
колбах об’ємом 3 л в 500 мл поживного середовища “ВВГ” (див. п.2.2.1)
при температурі 30? С. Через певні проміжки часу, які відповідали
послідовним фазам розвитку періодичної культури відбирали піпетками Мора
зразки проб і переносили їх у пробірки.

Для одержання культуральної рідини проби центрифугували в режимі 1000
об/хв протягом 20 хвилин. Надосадову рідину зливали в пробірки та
закривали резиновими корками.

Камери для вивчення розвитку бактерій в мікрокультурах. Дослідження
розвитку спороутворюючих бактерій в мікрокультурах здійснювали в
спеціальних камерах, розроблених і запатентованих спільно з Гашинським
В.В. Камери для мікрокультивування бактерій складалися із предметного
скла, блоків із поліакріламідного гелю, покровного скла, герметизуючої
замазки. На блоки із поліакріламідного гелю, розміщені на предметному
склі, засівали спеціальними мікропіпетками від однієї до кількох
десятків бактеріальних клітин. Саме така методика дозволяла досліджувати
процеси розвитку окремих бактеріальних клітин, та виявляти особливості
міжклітинних взаємодій, в тому числі агрегацію бактерій.

Електронно-мікроскопічне дослідження агрегатів клітин спороутворюючих
бактерій у процесі розвитку періодичної культури.
Електронно-мікроскопічні дослідження здійснювали в растровому
електронному мікроскопі (РЕМ), де можна було побачити реальну структуру
досліджуваних об’єктів та топографію їх поверхні. Для цього
використовували РЕМ фірми Hitachi типу S-806. Зовнішній вигляд
досліджуваних об’єктів, що представлений на мікрофотографіях РЕМ,
отриманий в режимі вторинної електронної емісії. Параметри приладу
(струм зонду, прискорювана напруга, робоча відстань, діафрагма та інші)
добиралися, виходячи з умов отримання найкращого зображення.

Вивчення спектрів елементного складу мікробних об’єктів із використанням
рентгенівського мікроаналізатора (РМА). Для дослідження мікробних
зразків ми використовували комплекс РЕМ-РМА, в якому РЕМ – растровий ЕМ
фірми YEOL YSM 845, а РМА – система Link Analytical M 200. Першим етапом
досліджень було отримання зображення об’єкта на екрані мікроскопа. Для
порівняння різних об’єктів умови спостережень підтримувались одними і
тими ж прийомами. Нами використовувалося прискорена напруга U –10
КЕВ, струм зонду – 6х10 –10 А, робоча відстань – 48 мм, збільшення –
х12000. Спектри якісного хімічного складу мікробного об’єкту знімалися
двома способами: з окремої вибраної площі на зразку, яка містила велику
кількість бактерій і в місці розташування однієї бактеріальної клітини.

На основі отриманих спектрів робили висновок про наявність даного
хімічного елемента, а також про його кількість відносно кількості іншого
елемента. Таким чином, для порівняння зразків можна використовувати
відношення висоти піків окремих елементів.

Одержання поверхневих біополімерів бактеріальних клітин та визначення їх
фізико-хімічних характеристик. Для одержання препаратів поверхневих
біополімерів зразки клітинної біомаси відбирали на етапах культивування,
які відповідали всім фазам розвитку періодичної культури. Препарати
поверхневих біополімерів одержували екстракцією із інтактних клітин
відповідного віку. Бактерії осаджували із культурального середовища
центрифугуванням при 8 тис. об/хв протягом 15 хв. та відмивали тричі
стерильним ФР. Відмиті клітини ресуспендували у спеціальному буфері
екстракції такого складу: 1% DS-Na у ФР, pH 4,5 (Михальський Л.О. із
співавт., 2001). Екстракцію проводили при постійному перемішуванні на
магнітній мішалці протягом 2 год при кімнатній температурі. Екстракти
відділяли центрифугуванням (8 тис. об/хв, 20 хв) та піддавали подальшому
аналізу. Матеріалом для дослідження була також культуральна рідина після
осадження бактеріальних клітин. Контролем виступало стерильне поживне
середовище. Культуральну рідину у об’ємі приблизно 80 мл ліофілізували і
розчиняли в 1,5 мл дистильованої води для концентрування матеріалу.
Проводили діаліз проти 0,15 М розчину NaCl при 40 С протягом 18 год.
Після діалізу у зразках визначали кількість біополімерів.

Вивчення кількісного складу бiополiмерiв у препаратах. Вміст білків у
препаратах визначали за методом Лоурі (Lowri et al.,1951), а вміст
вуглеводів — антроновим методом (И.Я. Захарова, Л.В. Косенко, 1982 ).

Електрофорез у системі поліакриламідний гель-натрій додецилсульфат
(DS-Na-ПААГ). Електрофорез препаратів проводили у системі DS-Na- ПААГ за
Laemmli у модифікації (Laemmli, 1970) із застосуванням 14% гелей.
Електрофорез проводили у комерцiйному апаратi для вертикального
електрофорезу (“Хийу Каллур”, Естонія) при 90 В i 30 мА на гелеву
пластину протягом 2,5 год при 40 С. Для вiзуалiзації електрофореграм
використовували фарбування гелей кумасi блакитним R-250 та нейтральне
фарбування нiтратом срiбла (Позур и др.,1995). Для визначення
молекулярних мас (ММ) використовували набір маркерних білків LMW:
фосфорилаза В (97,4 кДа), альбумін (66,2 кДа), овальбумін (45,0 кДа),
карбонатангідраза (31,0 кДа), інгібітор трипсину (21,5 кДа), лізоцим
(14,4 кДа) виробництва “Pharmacia” (Швеція). Молекулярні маси
біополімерів розраховували за спеціальною комп’ютерною програмою
(Михальський Л.О. із співавт., 2001).

Методи статистичної обробки результатів. Усі отримамані кількісні
результати досліджень підлягали статистичній обробці загальноприйнятими
методами варіаційної і кореляційної статистики з використанням значень
середньої арифметичної (М), помилки середньої арифметичної (m), критерію
Стьдента (t), рівня значущості (р). Крім того, використовували
комп’ютерну програму “STATISTICA for Windows Release 5.1”.

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

Агрегація вегетатавних клітин у процесі розвитку періодичних
культур спороутворюючих бактерій. Дослідження періодичних культур
бактерій роду Bacillus здійснювали в таких умовах культивування, які
забезпечували повноцінний, тобто, еволюційно сформований цикл їх
розвитку, неодмінними етапами якого є проростання спор, утворення
вегетативних форм, їх розмноження з подальшим формуванням нових клітин в
стані спокою. Під час розвитку періодичної культури в рідкому поживному
середовищі через кожні 30 хвилин вимірювали оптичну густину,
досліджували зміну морфології мікробних клітин в камерах для
мікрокультивування бактерій. Це дало можливість одночасно та об’єктивно
здійснювати комплексну (графічну, морфологічну і фізіологічну) оцінку
змін, що відбувалися в популяції мікроорганізмів.

Після завершення експоненціальної фази розвитку клітини досліджуваних
мікроорганізмів втрачали рухливість, припиняли розмноження і поступово
починали зближуватись та об’єднуватись між собою, утворюючи, таким
чином, агрегати. Така закономірність виявилася характерною для різних
штамів і видів досліджуваних мікроорганізмів (B.mesentericus, B.
subtilis,

B. megaterium, B. cereus). Тривалість процесу агрегації вегетативних
клітин становила 5-7 годин. Спочатку бактеральні агрегати складалися з
2-3 клітин, пізніше кількість бактерій в агрегатах збільшувалася до
десятків, а надалі сотень та тисяч клітин (рис.1).

Рис. 1. Феномен агрегації клітин під час розвитку періодичної культури
спороутворюючих бактерій B. cereus 24.

1 – експоненціальна фаза; 2, 3 – фаза агрегації вегетативних клітин; 4
– 6 – фаза споруляції агрегованих клітин та розпаду агрегатів.
Фазово-контрастна мікроскопія, х 900.

Показники оптичної густини періодичної культури під час експоненціальної
фази розвитку збільшилися десятикратно (від 0,018 до 0,198), і, навпаки,
після об’єднання більшості клітин в агрегати, оптична густина культури
зменшувалася (від 0,198 до 0,155). Зменшення оптичної густини не було
пов’язано з частковим відмиранням клітин, як вважалося раніше, а
виникало в результаті того, що культура з агрегованими бактеріями мала
кращі світлопропускаючі властивості (рис. 2).

Рис. 2. Криві розвитку періодичних культур спороутворюючих бактерій у
циклі: спори – вегетативні клітини – розмноження – агрегація –
споруляція в агрегатах – розпад агрегатів – спори

1 – B.subtilis 7241; 2 – B.cereus CCM; 3 – B.mesentericus 66;
4 – B.megaterium 2550;

А – проростання спор; Б – еспоненціальна фаза; В – агрегація
вегетативних клітин; Г – споруляція агрегованих клітин; Д – розпад
агрегатів; Є – спори в стані спокою.

Отже, виявлена нами фаза агрегації вегетативних клітин як доказ
невипадковості існування феномену агрегації мікроорганізмів, могла б
бути ще названа фазою припинення поділу клітин і початку підготовки
культури до спороутворення. Це так звана “стаціонарна” фаза за загально
визнаною термінологією. В наших умовах експерименту використаний термін
“стаціонарна” не повністю і не зовсім точно, а лише частково
віддзеркалює уявлення про зміст стаціонарної фази, в якій раніше автори
бачили тільки рівновагу між розмноженням і відмиранням клітин. Здійснені
мікробіологічні дослідження із застосуванням нової, розробленої нами
експериментальної технології спостереження за долею клітин у процесі їх
розвитку, без сумніву показали, що в наших умовах експерименту це не
фаза рівноваги розмноження і відмирання клітин, тому що обидва ці
процеси в ній відсутні. Отже, стаціонарність в даному випадку слід
розуміти, як якісну стабілізацію без відмирання клітин. Абсолютно такий
же характер розвитку відбувався у різний термін спостережень, що
свідчить про невипадковий характер зазначених фаз і можливість
постійного відновлення цього етапу, навіть після тривалого часу
зберігання спор (протягом 25 років).

Після повного завершення агрегації бактерій періодичної культури її
подальший розвиток переходив у якісно нову фазу, характерною ознакою
якої була диференціація клітин. Аналіз морфології бактерій у зразках
засвідчував, що переважним і принциповим процесом на даному етапі
розвитку культури є спороутворення, яке здійснювалося в клітинах,
об’єднаних в агрегати. Процес спороутворення бактеріальних клітин був
динамічний: спочатку у складі агрегатів переважали передспори, потім
вони набували рефрактильності і протягом 2-3 годин в усіх клітинах
знаходилися дозріваючі спори (див. рис. 1). Зростання та коливання
оптичної густини культури на даному етапі розвитку було пов’язане із
зміною світлопоглинаючих властивостей клітин, що перебували на різних
стадіях спороутворення (див. рис. 2). Після повного дозрівання спор та
лізису параспоральних частин спорангіїв (20-24 години культивування)
агрегати, які складалися повністю із спорових форм, починали поступово
руйнуватися, а оптична густина періодичної культури досягала свого
максимуму. Завершення циклу розвитку культури характеризувалося повним
руйнуванням агрегатів, після чого культура складалася виключно із зрілих
розрізнених спор. Таким чином, встановлено, що розвиток періодичних
культур різних видів досліджуваних спороутворюючих бактерій в
лімітованому за вмістом пептонів поживному середовищі неодмінно
проходитиме фазу агрегації вегетативних клітин з наступною споруляцією
їх у складі агрегатів, розпадом агрегатів і переходом життєздатних
клітин у стан довготривалого анабіозу.

Динаміка формування агрегатів та розвиток сил міжклітинної взаємодії в
процесі агрегації бактерій. Агрегація вегетативних клітин займає
центральне місце серед встановлених нами особливостей розвитку
періодичних культур різних видів спороутворюючих бактерій. У зв’язку з
цим були проведені дослідження , задачею яких було з’ясувати: як швидко
і яка доля клітин бактеріальної популяції включається в процес
агрегації. Для цього кожні 30 хвилин відбирали зразки культури, що
розвивалася в рідкому поживному середовищі, починаючи з фази прискорення
темпів розмноження досліджуваних мікроорганізмів, та здійснювали
підрахунок клітин в камерах для мікрокультивування бактерій, а також їх
фотографування з метою оцінки послідовних змін у взаємному розташуванні
мікроорганізмів. Динаміка включення вегетативних клітин в агрегати, на
прикладі культури B.cereus 24, в залежності від часу культивування
представлена в табл. 1 і на рис.3.

Таблиця 1

Результати вивчення переходу вегетативних клітин в агрегати в залежності

від часу культивування періодичної макрокультури

проби Час від початку

0 100-100 +

Рис. 3. Динаміка включення вегетативних клітин спороутворюючих бактерій
в агрегати.

А – побудовано на підставі прямих підрахунків клітин в одному полі при
застосуванні імерсійної системи; Б – дані табл. 1 враховували загальну
кількість клітин в пробі; В – об’ємне зображення динаміки агрегації.

Таким чином, було встановлено, що агрегація вегетативних клітин
відбувається протягом досить короткого часу (5-7 годин, в залежності від
виду бактерій), якщо враховувати за її початок момент появи
морфологічних ознак агрегації, а завершенням вважати час 100 % переходу
клітин в агрегати і появи перших ознак споруляції в окремих клітинах. І
хоча агрегати ще певний час будуть існувати, проте це вже будуть інші за
змістом агрегати, в яких в результаті диференціації все менше
залишатиметься вегетативних клітин і переважатимуть їх спорові форми.

У зв’язку з тим, що проміжки між клітинами в процесі агрегації поступово
зменшувались, виникло припущення про існування певних сил, які
забезпечують міжклітинні зв’язки. Так, у фазі інтенсивного розмноження
рухливі клітини після випадкового зіткнення одна з одною, не злипалися,
а досить швидко розходились, ніби відштовхуючись. Згодом такі зіткнення
призводили до того, що клітини залишались у контакті,
втрачаючи рухливість і об’єднуючись у все більші за розміром і різної
форми групи. За допомогою фазово-контрастної мікроскопії здійснювали
оцінку морфології міжклітинних зв’язків. При світовій мікроскопії та
збільшенні в 900 разів між клітинами, об’єднаними в малі агрегати,
помітним був певний простір, що могло свідчити про відсутність навіть
часткового склеювання в новоутворених з’єднаннях клітин. При досягненні
максимальних розмірів агрегатів з поглинанням вільних клітин
розмежувальний простір був помітний тільки на периферії агрегатів, де
клітини частіше контактували не полюсами, як при народженні, а своїми
тілами. В центральній частині агрегатів багатошарове переплетіння клітин
не дозволяло дослідити суть контактів, хоч і створювалось враження про
досить міцне склеювання клітин.

Для визначення сил міжклітинної взаємодії та динаміки їх розвитку був
застосований метод піпетування – руйнування агрегатів шляхом
багаторазового їх пропускання через вузький отвір спеціальної
мікропіпетки. Ефективність цього методу визначали за оптичною густиною
культури до і після такої дії.

Слід визнати, даючи оцінку частини дослідів по з`ясуванню наявності
певних сил, що обраний метод не достатньо характеризував процес появи і
розвитку міжклітинних контактів. На точність розрахунків суттєво впливав
приріст оптичної густини не тільки за рахунок руйнування агрегатів. Нас
зацікавили взаємини клітин в самих агрегатах.

Для з`ясування динаміки контактних зв`язків вегетативних клітин в
агрегатах різної зрілості довелось клітинну суспензію, в якій
формувались агрегати, розділити на фракції, маючи на меті відділити
агреговані клітини від вільних форм. Випробувавши кілька методів, ми
зупинили свій вибір на фракціонуванні шляхом центрифугування відповідних
зразків макрокультури. Агрегати клітин переходили в осад (при певній
кількості обертів) значно швидше вільних клітин, які залишались в
надосадовій рідині.

Пам`ятаючи про можливий вплив центрифугування на процес агрегації
клітин, в контрольних дослідах суспензію таких же клітин (рівнозначної
густини) фракціонували, але без ознак агрегації. Контроль за впливом
центрифугування на динаміку зв’язків здійснювали мікроскопією зразків.
Таким способом одержали кілька фракцій агрегатів з різною кількістю
агрегованих клітин, що відповідали різним стадіям процесу агрегації.
Кожну фракцію після декантації ресуспензували до повного руйнування
агрегатів в нативному поживному середовищі шляхом піпетування.
Виявилось, що кожна з фракцій диференціювалась за кількістю проходжень
через отвір піпетки (табл. 2).

Таблиця 2

Результати впливу фракціонування і піпетування агрегатів вегетативних
клітин

на міцність міжклітинних зв`язків

фрак-ції Кількість

клітин в агрегаті, % Кількість піпетувань: Довірчий

інтервал

m, %

1 10-12 12 1,791 0,513 0,404-3,176*

2 30-35 16 2,388 0,591 0,793-3,983*

3 50-57 48 7,146 0,998 4,470-9,858

4 70-74 58 8,653 1,083 5,735-11,569

5 80-85 120 17,910 1,481 13,918-21,908

6 90-94 340 50,746 1,931 45,533-55,959

7 97-100 670 100,000 0 0

8 100 500 74,626 1,615 70,316-79,036

9 100 100 14,925 1,375 11,213-18,637

10 100 10 1,492 0,469 0,226-2,758*

Конт-роль 0 4 0,597 0,298 -0,207-1,401

*-порівняно з контролем різниця не достовірна з вірогідністю в 99 % при
n = 670.

1,083 % від максимальної міцності агрегатів.

1,931 до 100%). Цей період характеризувався утворенням максимальних за
розмірами агрегатів, які включали від 90 до 100 % вегетативних клітин.

Співставлюючи дві криві (рис. 4), можна помітити, що агрегати
вегетативних клітин, досягши максимальних розмірів, продовжували
існувати протягом певного часу, зберігаючи стаціонарність. В той час
сили міжклітинних зв`язків почали втрачати свою інтенсивність (крива 2
після піку різко знижувалась). Це співпало із диференціацією
вегетативних клітин у спорову форму. Розміри агрегатів зберігались до
повного завершення споруляції, після чого вони спонтанно і раптово
розсипались. Повне руйнування (дезагрегація) агрегатів співпало з
втратою сил притягування, які змінились відштовхуванням.

Рис. 4. Співвідношення інтенсивності агрегації (1) і темпів росту
міжклітинних зв’язків в агрегатах (2). Графік побудовано за даними табл.
2.

Таким чином, вдалось з’ясувати, що в процесі розвитку спороутворюючих
бактерій міняються міжклітинні зв’язки, як за своїм характером, так і
силою: на початкових етапах розвитку, коли спори трансформувались у
первинні вегетативні клітини і коли останні інтенсивно розмножувались,
все більше заповнюючи простір в поживному середовищі, діяли
відштовхувальні сили. Зміни в характері сил зв’язку наступили в період
завершення експоненціальної фази розвитку. В цей час почало зростати
контактне гальмування між клітинами, яке переростало в притягальну силу,
об’єднуючи вегетативні клітини в міцні агрегати. Створювалось враження
про найвірогідніше призначення об’єднання клітин в агрегати як своєрідні
генетично обумовлені морфологічні структури, в яких здійснювався процес
спороутворення. На таку думку наводила і та обставина, що як тільки
завершилась фаза споруляції, змінився і характер міжклітинних зв’язків в
агрегатах. Повне і швидке руйнування агрегатів, суцільне 100 %
вивільнення спорових форм клітин із агрегатів, переконливо засвідчувало
про закінчення функції агрегатів, про відсутність потреби в них у
подальшій долі культури, а, отже, і в подальших затратах енергії на
підтримку міжклітинних сил взаємодії. Наведені факти переконливо
вказували на невипадковість явища агрегації клітин, як самостійного,
фізіологічного періоду розвитку бацил.

Виникло дуже важливе питання про природу міжклітинних зв`язків,
виявлених у процесі розвитку культури. Наведені нижче дані частково
дадуть можливість наблизитись до отримання відповіді на поставлене
питання.

Електрофоретичні дослідження поверхневих біополімерів клітинної стінки
та полімерів культуальної рідини в процесі агрегації бактерій. У процесі
агрегації бактерій виникають тісні міжклітинні контакти, міцність яких
має свою динаміку розвитку. Тому, мабуть, важливе значення у формуванні
агрегатів, а також і в їх розпаді можуть мати біополімери поверхневих
шарів клітинних стінок (КС). Крім того, не виключено, що певне значення
у цьому процесі відіграють розчинні полімери, які потрапляють у
культуральну рідину (КР) на різних фазах розвитку періодичної культури.
У зв’язку з цим була проведена серія експериментів з метою дослідження
поверхневих біополімерів клітинних стінок, а також розчинних полімерів
культуральної рідини на різних фазах розвитку періодичної культури.

Для характеристики та реєстрації змін, які відбуваються у складі
клітинних стінок бактерій під час періодичного культивування, поверхневі
біополімери КС одержували із інтактних клітин B.cereus 24 на різних
фазах розвитку. Водночас, матеріалом для дослідження була культуральна
рідина після осадження бактеріальних клітин. Вибраний нами час відбору
зразків клітинної біомаси та КР (0,5; 1,5; 2; 4; 5; 6,5; 8; 11; 14; 18
та 24 години культивування) репрезентував усі фази розвитку культури під
час проходження макроциклу. В результаті проведеного аналізу було
показано, що одержані зразки містили білкові та вуглеводні компоненти в
кількості, достатній для подальших електрофоретичних досліджень (табл.
3).

Таблиця 3

Вміст білкових та вуглеводних компонентів у препаратах поверхневих
біополімерів клітинних стінок (КС) і біополімерів культуральної рідини
(КР) B.cereus 24

Номер

зразка Вміст білків в 1 мл екстракта, мг/г Вміст вуглеводів в 1 мл
екстракта, мг/г Співвідношення білки/вуглеводи

КС КР КС КР КС КР

1 0,41 0,01 0,07 0,005 1:0,17 1:0,5

2 17,00 0,02 0,39 0,004 1:0,02 1:0,2

3 15, 88 0,02 0,25 0,004 1:0,02 1:0,2

4 20,88 0,01 0,24 0,003 1:0,01 1:0,3

5 3,87 0,03 0,16 0,004 1:0,04 1:0,13

6 3,87 0,01 0,16 0,005 1:0,04 1:0,5

7 5,13 0,01 0,19 0,005 1:0,04 1:0,5

8 1,24 0,01 0,08 0,005 1:0,06 1:0,5

9 0,15 0,05 0,05 0,004 1:0,33 1:0,08

10 0,15 0,02 0,05 0,003 1:0,33 1:0,15

11 0,15 0,03 0,05 0,004 1:0,33 1:0,13

?

?

1/4

3/4

?

i

?

?

&

AAAE`IooioaeoooaeOOOIIAE?OOOo

aiaaaUIUUUUUUUUUUUUUUUUU

oeoeoeoeoeoeoeoeoeoeoeoeoeoeoeniaeaeOIA

`„Aea$

4

X

|

|

~

?

?

®

°

?

?

Ae

AE

ae

e

O

E

?

O

TH

.

/

0

1

F

G

Z

j

hAEX?CJ EHue??? ?Т?Т???????????????Т?Т??

6

D

F

Q

U

s

?

Z

[

k

l

m

n

?

?

?

©

?

«

A

A

O

O

a

ae

c

e

y

th

?

°

3/4

A

E

I

i

u

y

3+

I

O

рів КС показали, що на стадії проростання спор у зразках практично
відсутні біополімери як білкової, так і змішаної природи. Виключення
становили декілька низькомолекулярних компонентів, які були
ідентифіковані у слідовій кількості при фарбуванні гелей нітратом
срібла, з ММ 20,0; 19,0; 17,0; 16,0; 15,5; 15,0; 14,4; 14,2; 13,0 12,5 і
12,2 кДа. Для стадії початку та завершення утворення вегетативних клітин
характерне поступове збільшення поверхневих компонентів, хоча більшість
із них виявляли в препаратах у незначній кількості.

У експоненціальній фазі розвитку B.сereus 24 відбувався активний синтез
поверхневих компонентів КС. Деякі з них під час росту бактерій
виділялися в культуральне середовище, хоча більша частина залишалася
асоційованою з клітинною стінкою. У препараті, який було одержано з
клітин цієї фази, при застосуванні обох способів фарбування
ідентифікували максимальну кількість біополімерів (> 50). При фарбуванні
гелів кумасі блакитним були ідентифіковані мінорні білки з ММ 85,0;
80,0; 75,0; 72,0; 65,0; 62,0; 60,0; 58,0; 46,0; 45,0; 44,0; 43,0; 40,0;
38,0; 35,0; 34,0; 33,0; 32,0; та 30,0 кДа та значна кількість
низькомолекулярних компонентів. Характерною особливістю цієї фази
розвитку є відсутність у зразках високомолекулярних білків з ММ 130,0;
122,0 і 110,0 кДа, а замість комплексу, утвореного мажорними білками
60,0 і 58,0 кДа, нами були ідентифіковані 3 мінорні компоненти з ММ
62,0; 60,0 і 58,0 кДа.

Починаючи із фази агрегації у B.cereus 24 зареєстровано суттєві зміни
складу поверхневих біополімерів. Якщо фазі експоненціального росту був
притаманний активний синтез практично всіх ідентифікованих поверхневих
компонентів, то фаза агрегації характеризувалась їх вибірковою
секрецією. Зокрема, у зразках виявляли мажорні компоненти з ММ 94,0;
60,0; 58,0 і 26,0 кДа, а також декілька біополімерів змішаної природи з
ММ 25,0; 23,0; 19,5; 18,5; 18,0; 17,5; і 15,5 кДа. Особливістю фази
агрегації була наявність у зразках мінорних білків з ММ 72,0 і 70,0 кДа,
синтез яких, очевидно, пов’язаний із агрегацією клітин, оскільки вони
найкраще представлені у препаратах цієї фази, насамперед, білок з ММ
70,0 кДа. Перехід B. cereus у стадію визрівання спор в агрегатах та
інтенсивного лізису параспоральних частин спорангіїв також
супроводжувався незначними змінами складу та ступеня вираження
поверхневих біополімерів.

Фаза зрілих спор, як і фаза проростання спор характеризувалась найменшою
кількістю біополімерів, які виявляли у досліджених зразках. У препараті,
одержаному із клітин цієї фази, у слідовій кількості із раніше
ідентифікованих були зареєстровані біополімери з ММ 48,0; 26,0; 18,5;
18,0 та 12,2 кДа, а також два нових мінорних компонента з розрахунковими
молекулярними масами 130,0 і 122,0 кДа.

Дослідження полімерів культуральної рідини (КР) дозволили встановити вже
на початкових фазах росту B. сereus 24 наявність у КР мінорних білків,
не асоційованих з клітиною, з ММ 97,0; 94,0; 82,0; 75,0; 62,0; 60,0;
58,0; 56,0; 55,0; 52,0; 50,0; 48,04 46,0; 35,0 та 27,0 кДа. Необхідно
підкреслити, що більшість із вказаних мінорів практично не виявляли у
зразках КР на більш пізніх фазах розвитку при фарбуванні гелів кумасі
блакитним. Крім того, у цих зразках ідентифікували компоненти змішаної
(глікопротеїдної) природи, специфічні для певних фаз розвитку.

Фаза початку та підсилення агрегації супроводжувалась появою в КР
мажорних компонентів з ММ 62,0; 58,0; 52,0; 48,0; 41,0 та 33,5 кДа. Слід
зауважити, що біополімери з ММ 62,0; 58,0, 52,0 та 48 кДа як мінорні
були виявлені також і в інших зразках КР, тому їх ми вважаємо
“супутніми” для фази агрегації. Особливістю даного періоду розвитку був
синтез глікопротеїдів з ММ 41,0 і 33,5 кДа, які, безумовно, можуть бути
віднесені до тих специфічних розчинних компонентів, що синтезуються
клітинами B. сereus саме у фазі агрегації.

За результатами аналізу зразків КР та наявності характерних біополімерів
макроциклічний розвиток B. cereus можна розділити на 4 періоди. Перший
період розвитку бацил пов’язаний з фазами проростання спор, набухання та
інтенсивного лізису параспоральної частини спорангію і утворення спор.
Він супроводжувався секрецією у культуральне середовище біополімерів,
здебільшого, змішаної природи з ММ 34,0; 33,0; 30,0; 27,0; 26,0; 23,0 і
21,5-19,5 кДа. Другий період агрегації бактерій включав фази початку,
підсилення та максимальної агрегації вегетативних клітин і
характеризувався наявністю двох специфічних біополімерів з ММ 41,0 і
33,5 кДа та супутніми компонентами (ММ 62,0; 58,0; 52,0; 48,0; 38,0 і
35,0 кДа). Третій період був “перехідним” між стадією агрегації
вегетативних клітин B. сereus та утворенням і визріванням спор в
агрегатах, оскільки містив біополімери спільні для вказаних стадій
макроциклу. Четвертий період спороутворення включав дві фази –
дезагрегації спор та зрілих спор поза агрегатами. Цей період розвитку
бацил характеризувався практично повною відсутністю специфічних
біополімерів.

Таким чином, аналіз зразків КР дозволив встановити у B. cereus існування
розчинних біополімерів, які приурочені до певних фаз розвитку. Для фази
агрегації специфічними були біополімери з ММ 41,0 і 33,5 кДа. Враховуючи
те, що після агрегації бактерії активно приступали до споруляції, можна
припустити, що вказані специфічні біополімери здатні відігравати роль
індукторів спорогенезу.

Електронно-мікросокпічні дослідження структури агрегатів клітин
спороутворюючих бактерій. Бактеріальні спори в растровому електронному
мікроскопі (РЕМ) мають вигляд світлих круглястих та злегка подовжених
утворень з гладенькою поверхнею та маленькими виростами, розташованими,
переважно на полюсах і добре помітних при збільшені в 60 000 разів.
Через півтори години культивування, після остаточного набухання,
оболонки спор розривались і з них виростали первинні вегетативні
клітини, які в РЕМ, на відміну від спор, мали вигляд подовжених темних
утворень. Оболонка спори у вигляді ковпачка іноді залишалася
прикріпленою до полюса первинної вегетативної клітини (рис. 5 ).

Рис.5. Розвиток періодичної культури В.subtillis 83

1 – спори в стані спокою; 2 – проростання спор; 3 – вегетативні клітини
(експоненціальна фаза); 4, 5, 6 – агрегати вегетативних клітин
(стаціонарна фаза); 7, 8, 9 – дезагрегація спор.

Растрова електронна мікроскопія, х10000.

Експоненціальна фаза росту періодичної культури починалася через 2,5-3,0
години й продовжувалася протягом 2-3 годин. В цей час культура
складалася майже на 100 % із вегетативних форм, розташованих переважно
поодинці, а іноді короткими ланцюжками. Через 5,5-6 годин культивування
в РЕМ було видно, що вегетативні клітини починали групуватися,
прилягаючи одна до одної по поздовжній осі. Спочатку такі групи, тобто
агрегати, складалися із 2–3–5 клітин, а незабаром їх кількість досягала
вже кількох десятків. На 10 годині агрегати набули своїх максимальних
розмірів, в них були об’єднані кілька сотень клітин. На поверхні
агрегатів було чітко видно, що окремі клітини не випадково наближалися
одна до одної, а вступали в міцний контакт, нібито зливаючись своїми
оболонками, переважно не залишаючи між собою вільного простору (рис. 6).
В стані агрегації досліджувані мікроорганізми знаходилися досить
тривалий час (15 годин), і цей період, безумовно, можна характеризувати
як стаціонарну фазу розвитку. Після дванадцятої години культивування
спочатку в окремих клітинах, а потім і в інших утворювалися світлі
ділянки. Ще через кілька годин в таких місцях можна було побачити чітко
оформлені спори. При цьому параспоральні частини клітин залишалися
темними. Поступово темні ділянки клітин зникали, а агрегати складалися
із суцільних спор, які ще міцно контактували між собою. Після завершення
дозрівання спор поступово почалося роз’єднання клітин агрегатів, тобто
наступив зворотній процес – дезагрегація мікроорганізмів (рис. 5).

Рис. 6. Агрегати вегетативних і спорових форм бактерій роду Bacillus.

Різні за розмірами агрегати вегетативних клітин В.cereus 8035 (1, 3, 4)
та В.subtilis 83 (2); агрегати спор та окремі спори B.mesentericus AB-56
(5, 6).

Растрова електронна мікроскопія, х3000–60000.

Підтвердженням цього було те, що досліджувані проби складалися майже на
100 % із форм клітин у стані спокою, розташованих на значній відстані
одна від одної. Таким чином, вивчення періодичних культур
спороутворюючих бактерій в РЕМ остаточно підтвердило, що вегетативні
клітини неодмінно і невипадково об’єднуються в агрегати, саме в
агрегованих клітинах відбувається спороутворення, а після його
завершення наступає дезагрегація спор.

Рентгеноспектральний аналіз іонного складу бактеріальних клітин у різні
фази розвитку періодичної культури. Дослідження вмісту окремих елементів
в клітинах спороутворюючих бактерій на різних фазах розвитку періодичної
культури здійснювали за допомогою рентгеноспектрального аналізатора в
комплексі РЕМ-РМА, де РЕМ – растровий електронний мікроскоп фірми YEOL
YSM 845, а РМА – система Link Analytical M-2000. Спектри

якісного хімічного складу об’єкта дослідження реєстрували в двох точках:
в скупченні однорідних клітин (метод “площі”) і в поодинокій клітині
(метод “точки”). Про вміст окремих елементів судили на основі порівняння
відношення висоти піків, які відповідають числу одиниць імпульсів,
генерованих пучком електронів, що попадають на детектор рентгенівського
випромінювання з даного зразка дослідження.

Встановлено, що в процесі періодичного культивування В. cereus 24,
B.mesentericus AB-56, B.megaterium H вміст хімічних елементів суттєво
змінювався в залежності від фази їх розвитку. Так, у фазі проростання
спор досліджуваних видів бактерій відбувалася значна втрата клітинами
катіонів кальцію (табл. 6, рис. 7), хлору, фосфору.

Таблиця 6

Зміна вмісту кальцію в окремих клітинах В. mesentericus АБ-56 у процесі
розвитку періодичної макрокультури від спори до спори через фазу
агрегації вегетативних клітин

Час, год. Метод “площі” Час, год. Метод “точки”

Кількість

імпульсів

М + m,%

I95

Інтервал

Кількість

імпульсів

М + m,%

I95

Iнтервал

0 28 100 + 0,2 0,4 99,6 – 100,4 0 21 100 + 0,2 0,4 99,6 – 100,4

1,5 19 67,8 + 3,2 6,4 61,4 – 74,2 1,5 17 80,9 + 2,7 5,4 66,7 – 78,7

4 14 50 + 3,4 6,8 43,2 – 56,8 4 9 42,8 + 3,4 6,8 36,0 – 49,6

8 13 46,4 + 3,4 6,8 39,6 – 53,2 8 12 57,1 + 3,4 6,8 50,3 – 63,9

12 6 21,4 + 2,8 5,6 15,8 – 27,0 12 14 66,7+ 3,2 6,4 60,3 – 73,1

18 15 53,6 + 3,4 6,8 46,8 – 60,4 18 12 57,1 + 3,4 6,8 50,3 – 63,9

22 11 39,3 + 3,3 6,6 32,7 – 45,9 22 8 38,1 + 3,3 6,6 31,5–44,7

28 15 53,6 + 3,4 6,8 46,8 – 60,4 28 14 66,7 + 3,2 6,4 60,3 – 73,1

40 25 89,3 + 2,1 4,2 85,1 – 93,5 40 25 119,4 + 3,2 6,4 112,7 – 125,5

В експоненціальній фазі розвитку В. cereus 24 відзначено зниження
показників вмісту натрію та інтенсивне поглинання бактеріальними
клітинами катіонів калію (рис.8) фосфору та кисню, які необхідні для
підтримання обмінних, окислювально-відновлювальних процесів та утворення
енергетичних сполук. Вказані тенденції змін спектрів вмісту даних
елементів в експоненціальній фазі розвитку спостерігали і при
дослідженні інших штамів спороутворюючих бактерій.

Процес агрегації вегетативних клітин спороутворюючих бактерій В. cereus
24 супроводжувався підвищенням показників вмісту фосфору (рис.9) калію,
хлору, сірки, що беруть участь у синтетичних та енергетичних процесах
клітин. Такі закономірності змін спектрів вмісту названих елементів
спостерігали і при дослідженні періодичних культур В. megaterium H та
B.mesentericus AB-56. У фазі спороутворення періодичної культури
бактерій роду Bacillus відзначено зниження спектрів вмісту калію, сірки
та значного підвищення показників вмісту кальцію, натрію та хлору.
Тенденція інтенсивного накопичення катіонів кальцію на етапі
спороутворення простежувалася на прикладі всіх досліджених представників
бактерій із роду

Рис. 7. Динаміка вмісту кальцію в клітинах B.mesentericus AБ-56 за
даними рентгеноспектрального мікроаналізу в залежності від фази розвитку
макрокультури.

А – метод “площі”, Б – метод “точки”.

Рис. 8. Динаміка вмісту калію в клітинах B.cereus 24, визначеного
методом “площі” (А) і “точки” (Б).

Рис. 9. Динаміка вмісту фосфору в клітинах B.megateriun H в залежності
від тривалості культивування (в годинах) за результатами
рентгеноспектрального мікроаналізу.

А – метод “площі”, Б – метод “точки”.

Bacillus. Встановлений факт підтверджував важливе значення катіонів
кальцію у формуванні високої резистентності спорових форм бактерій та в
підтриманні стану анабіозу.

Таким чином, завдяки застосуванню сучасного високочутливого методу
рентгеноспектрального мікроаналізу вдалось встановити суттєві зміни
хімічного складу спороутворюючих бактерій на різних фазах розвитку
періодичної культури. Характерним було і те, що коливання рівнів певних
іонів для одних видів мали схожі показники, а для інших – індивідуальні.
Найбільше співпадання динаміки змін іонного складу було характерне для
фази агрегації бактеріальних клітин.

Управління розвитком спороутворюючих мікроорганізмів. У зв’язку з тим,
що після агрегації бактеріальні клітини періодичної культури приступають
до якісно нового етапу розвитку – спороутворення, важливим було, на наш
погляд, дослідити такі взаємовідношення між клітинами, які мають
регуляторні функції. Простіше кажучи, як впливають одні клітини на
інших, який результат цих впливів на подальший розвиток та диференціацію
клітин.

Для цього нами була розроблена мікробіологічна модель для дослідження
впливу одних клітин на інші, суть якої полягала в тому, що окремі
бактеріальні клітини, будучи певним чином іммобілізовані на блоках
камери для мікрокультивування бактерій, ізольовані від контакту з іншими
клітинами популяції, яка вводиться в міжблочний простір камери і, таким
чином знаходиться в їх безпосередньому оточенні. В такій системі
взаємодія між одиничними ізольова-ними бактеріями та гомологічною
культурою певної фази розвитку могла здійснюватись завдяки екзогенним
факторам, які виділяються клітинами культури в середовище.

Принципова схема цієї серії експериментів полягала в тому, що ізольовані
в камері спори пророщували в поживному середовищі, доводячи їх до різних
стадій розвитку клітин, – активації, ініціації, набухання, елонгації,
утворення первинної вегетативної клітини та її поділу. На різних стадіях
розвитку ізольованих клітин здійснювали заміну поживного середовища
(умовно – індуктор вегетації) в камері на гомологічну культуру (умовно
– індуктор споруляції), що знаходилася в фазі максимальної агрегації
клітин та переходу до споруляції.

В результаті, на різних видах бацил було встановлено (схематичне
зображення на рис.10), що гомологічна культура у фазі агрегації
(індуктор споруляції) зупиняє вегетацію ізольованих клітин і
підпорядковує їх диференціацію в такому напрямку, в якому відбувається
її розвиток, тобто в напрямку активної споруляції. Характер життєвого
циклу “від спори до спори” визначався конкретною стадією проростання
первинної спори, під час якої відбувалася заміна “сигнала” вегетації на
“сигнал” споруляції (див. рис. 4). Сприймаючи “сигнал” гомологічної
культури, досліджувані клітини, в залежності від стадії проростання, в
якій вони перебували на час введення індуктора споруляції, продовжували
свій розвиток або по типу мікроциклу (від спори до

Рис. 10. Схема управління розвитком спороутворюючих бактерій з
використанням дії індуктора споруляції на різних стадіях проростання
спори та утворення первинної вегетативної клітини.

ІВ – індуктор вегетації; ІС – індуктор споруляції; СС – спора в стані
спокою; А – активація; І – ініціація; Н – набухання; Е – елонгація; В –
виростання; ПВК – первинна вегетативна клітина; ПС – передспора; С –
спора; ЛСП – лізис пароспоральних частин спорангіїв.

спори, без поділу первинної вегетативної клітини), або за типом
макроциклу з різною інтенсивністю розмноження первинних вегетативних
клітин та їх подальшим спороутворенням.

Таким чином, в результаті досліджень на різних видах спороутворюючих
мікроорганізмів було встановлено, що бактеріальна культура у фазі
агрегації, підпорядковує диференціацію інших клітин саме в такому
напрямку, в якому відбувається її розвиток. Найбільше вірогідно, що
факторами регуляції розвитком в даному випадку виступають розчинні
полімери, а саме: специфічні (як було показано вище для цієї фази
глікопротеїди з ММ 41,0 та 33,5 кДа). В таких умовах напрямок розвитку
бактеріальної клітини та його результат буде залежати від того, на якій
стадії її онтогенезу подавати “сигнал” на диференціацію. Проведені
дослідження показали також і те, що в циклі розвитку бактеріальної
клітини існують певні стадії, коли її геном здатний чи не здатний
сприймати “сигнали” на вегетацію або на споруляцію. Такі стадії нами
були визначені, завдяки чому стало можливим управляти розвитком
бактеріальної клітини в тому чи іншому напрямку. І ще одна важлива, на
наш погляд, закономірність, яка стосується гетерогенності властивостей
бактеріальних клітин. Так, в умовах регулюємого розвитку характерним для
мікроорганізмів є синхронність у відповіді на регулюючі “сигнали”, а
значить і синхронність в подальшому розвитку. І навпаки, якщо популяція
мікроорганізмів залишається без зовнішніх втручань, то процеси розвитку
в ній характеризуються виключною асинхронністю та гетерогенністю.
Вершина гетерогенності властивостей бактерій щодо їх розвитку,
проявляється в тому, що процеси вегетації та спороутворення в
мікропопуляціях клітин, які знаходяться в абсолютно однакових умовах,
можуть здійснюватися одночасно.

ВИСНОВКИ

В роботі вирішено актуальну наукову проблему – визначені закономірності
розвитку спороутворюючих мікроорганізмів роду Bacillus, встановлена
здатність різних їх видів утворювати клітинні агрегати, в яких
відбувається диференціація бактерій, визначені фазові зміни властивостей
досліджуваних мікроорганізмів на клітинному та популяційному рівнях,
показане значення певних мікробних біополімерів у становленні та
формуванні міжклітинних зв’язків, з’ясовані періоди компетентності до
сприймання регуляторних факторів в онтогенезі бактеріальної клітини, що
дало можливість спрямовано впливати та змінювати стадії розвитку і
диференціації клітин у певному напрямку.

Встановлено, що в процесі розвитку різних видів бактерій роду Bacillus
вегетативні форми здатні об’єднуватися у багатоклітинні агрегати. В
оптимальних для споруляції умовах розвиток періодичної культури
спороутворюючих бактерій складається з наступних послідовних фаз:
проростання спор, утворення первинних вегетативних клітин,
експоненціального їх розмноження, початку агрегації, максимальної
агрегації, споруляції агрегованих клітин, дозрівання спор в агрегатах,
лізису параспоральних частин спорангіїв, дезагрегації спор, анабіозу
бактеріальної популяції.

Виявлена динаміка зміни сил міжклітинних взаємодій від початку агрегації
до її повного завершення та наступної дезагрегації клітин. Процес
формування агрегатів характеризується послідовною зміною сил
міжклітинної взаємодії: спочатку вони зростають, досягають максимуму,
потім зменшуються і повністю зникають. Існує зв’язок між зростанням сил
міжклітинної взаємодії та утворенням специфічних для цієї фази розвитку
білків поверхневих шарів клітинних стінок (молекулярна маса 70,0-72,0
кДа).

Визначена морфологія бактеріальних клітин та їх взаєморозташування на
всіх етапах агрегації. Електронно-мікроскопічними дослідженнями
встановлено, що агрегація вегетативних клітин виникає в результаті
щільного контакту їх боковими поверхнями (по поздовжній осі) з наступним
злиттям поверхневих шарів клітинних стінок. Між бактеріями по завершенні
спороутворення в складі агрегату та лізису параспоральних частин
спорангіїв втрачаються попередні зв’язки та наступає дезагрегація
клітин. Взаєморозташування бактеріальних клітин пов’язано з тим, що
після поділу між ними зберігаються або зникають міжклітинні зв’язки
поверхневими шарами клітинних стінок.

Показано важливе значення мікробних екзогенних біополімерів у розвитку
процесів клітинної диференціації. На початкових етапах агрегації
бактеріальні клітини синтезують специфічні для даної фази розчинні
біополімери, а культура саме у цій фазі розвитку індукує спорогенез у
інших вегетуючих клітин. На підставі біохімічних та електрофоретичних
досліджень встановлено, що вказані біополімери мають глікопротеїдну
природу з молекулярною масою 41,0 та 33,5 кДа.

Доведено, що агрегація бактеріальних клітин – закономірний процес, який
має важливе значення у розвитку бактеріальної популяції. Агрегація
бактеріальних клітин розглядається як найбільш ранній еволюційний
механізм формування міжклітинної взаємодії. Агрегація забезпечує
найкращу компетентність бактеріальних клітин для реалізації міжклітинних
взаємодій, їх захист в складі агрегатів від зовнішніх впливів і створює
умови для диференціації клітин та індукції спорогенезу.

Вперше одержані дані про зміну вмісту хімічних елементів на різних фазах
розвитку мікробної клітини. Методом рентгеноспектрального мікроаналізу
хімічного складу бактерій роду Bacillus встановлено, що вміст калію,
натрію, кальцію, хлору, сірки, фосфору та кисню суттєво змінюється в
окремих клітинах на різних фазах розвитку періодичної культури. Під час
проростання спор відбувається втрата клітинами більшості елементів,
утворення агрегатів вегетативних клітин супроводжується накопиченням
калію, хлору, сірки та фосфору, що беруть участь у синтетичних та
енергетичних процесах клітин.

Вперше експериментально встановлено, що бактеріальні спори при
зберіганні в лабораторних умовах протягом більше 25 років не втрачають
життєздатність та характерні для кожного виду мікроорганізмів
властивості. Клітини періодичної культури, що розвиваються із спор після
довготривалого зберігання, здатні до агрегації. В процесі довготривалого
анабіозу зростає асинхронність проростання спор та виростання первинних
вегетативних клітин. Час генерації при цьому не змінюється.

Вперше об’єктивно доведено, що в бактеріальних популяціях процеси
вегетації та споруляції можуть відбуватися одночасно. На всіх етапах
розвитку бактеріальної популяції встановлена гетерогенність властивостей
окремих її особин: спори проростають, а первинні вегетативні клітини
утворюються асинхронно, процеси вегетації та спороутворення відбуваються
одночасно в однакових умовах середовища, в популяції клітин в стані
спокою завжди існують поодинокі вегетативні форми, здатні до криптичного
росту. Гетерогенність розвитку, як еволюційно сформована і генетично
детермінована властивість, має важливе значення для виживання бактерій у
природних умовах існування.

Створена мікробіологічна модель для дослідження регуляторних механізмів
розвитку окремих бактеріальних клітин, використання якої дозволило
встановити наступні закономірності: явище агрегації клітин різних видів
умовно патогенних спороутворюючих бактерій; можливість спорогенезу під
впливом індукторів споруляції в умовах середовища, де без них
відбувається вегетація; визначені фази в онтогенезі бактеріальної
клітини, коли вона сприймає або не сприймає зовнішні регуляторні
сигнали, що дало можливість змінювати стадії її розвитку в певному
напрямку; одержані дані, що підтверджують гіпотезу існування у бактерій
материнської клітини.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

Встановлені закономірності розвитку спороутворюючих бактерій роду
Bacillus доцільно враховувати в мікробіологічній промисловості при
створенні лікувальних, діагностичних та профілактичних препаратів,
одержанні біологічно активних речовин, пробіотиків, біомаси спорових
форм мікроорганізмів.

Запропоновані методи мікрокультивування бактерій можуть бути застосовані
з діагностичною метою та прискореного визначення чутливості
мікроорганізмів до антимікробних препаратів.

СПИСОК ОСНОВНИХ РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Періодичні фахові видання, затверджені ВАК України (*-особистий внесок
здобувача)

Завальнюк А.К. Гашинский В.В., Войцеховский В.Г. Покой и активация как
самые ранние этапы превращения споры в вегетативную клетку // Актуальные
проблемы медицины и биологии. — Киев. -1986. — Т. 2. — С. 43-52. (*
вивчено особливості спорових форм різних видів бацил на ранніх етапах їх
проростання, підготовлено роботу до публікації).

Войцеховский В.Г., Завальнюк А.К. Морфология микробных клеток в
процессе спорообразования // Научно-технический прогресс в медицине и
биологии. — Киев. — 1987. — Т. II. — С. 188-195. (* вивчено особливості
морфології клітин різних видів аеробних спороутворюючих бактерій в
процесі спороутворення, підготовлено роботу до публікації).

Войцеховский В.Г., Завальнюк А.К. Инициация и вырастание спор как
завершающие процессы ранних этапов развития спорообразующей культуры //
Научно-технический прогресс в медицине и биологии. — Киев. — 1987. — Т.
II. — С. 218-227. (* вивчено особливості ініціації та виростання спор у
різних видів бацил, підготовлено роботу до публікації).

Войцеховский В.Г., Завальнюк А.К. Условия, определяющие спорообразование
бактерий // Научно-технический прогресс в медицине и биологии. — Киев. —
1987. — Т. II. — С. 228-232. (* вивчено умови культивування та їх вплив
на спороутворення, підготовлено роботу до публікації).

Войцеховский В.Г., Завальнюк А.К. Ауторегуляция спорогенеза //
Научно-технический прогресс в медицине и биологии. — Киев. – 1987. — Т.
II. — С. 233-238. (* вивчено вплив факторів мікробного походження на
спороутворення у різних видів бацил, оформлено роботу).

Широбоков В.П., Тишко О.Г., Войцеховський В.Г., Завальнюк А.К. Про деякі
умови відтворення агрегативного стану мікробних клітин в процесі росту і
розвитку мікроорганізмів // Актуальные проблемы медицины и биологии. —
Киев. — 1993. — Т. II. -С.3-10. (* досліджено умови, при яких
відбувається агрегація вегетативних клітин, підготовлено роботу до
публікації).

Широбоков В.П., Войцеховський В.Г., Завальнюк А.К., Тишко О.Г.
Закономірності агрегації бактерій // Мікробіол.журн. — 1994. — Т. 56, №
4. — С. 53. (* визначено закономірності агрегації вегетативних клітин
спороутворюючих бактерій, підготовлено роботу до публікації).

Войцеховський В.Г. Пошук оптимальних умов електронно-мікроскопічного
дослідження агрегації бактерій // Актуальные проблемы медицины и
биологии. — Киев. — 2000. — №1. — С. 246-254.

Войцеховський В.Г. Зміна міцності міжклітинних зв’язків у різних фазах
розвитку бактеріальної популяції // Ліки України. — 2000. — №5. —
С.57-58.

Войцеховський В.Г. Електронно-мікроскопічне дослідження агрегатів
бактерій // Бюл. Інституту сільськогосподарської мікробіології. —
Чернігів. — 2000. — №7. — С.60-62.

Войцеховський В.Г. Формування агрегатів клітин під час розвитку та
диференціації бактерій // Зб. наук. праць співробітників КМАПО ім. П.Л.
Шупика. — Київ. — 2000. — Вип.9, №2. — С. 780-786.

Войцеховський В.Г. Дослідження зміни рН середовища в процесі агрегації
та дезагрегації спороутворюючих бактерій // Вісник проблем біології і
медицини. — Харків. — 2001. — №2. — С.108-110.

Войцеховський В.Г. Дослідження ймовірності формування штучних агрегатів
бактерій в процесі виготовлення препаратів для растрової електронної
мікроскопії // Актуальные проблемы медицины и биологии. — Киев. — 2000.
— №2. — С. 109-125.

Войцеховський В.Г. Фази розвитку періодичної культури, обумовлені
агрегацією бактерій // Биополимеры и клетка. — 2000. — Т. 16, № 5. —
С.430-435.

Войцеховський В.Г. Агрегати бактерій періодичної культури та їх
стійкість до антимікробних речовин // Вісник Вінницького держ. мед.
університету. — 2000. — № 2. — С. 278-279.

Войцеховський В.Г. Рентген-спектральний аналіз складу бактеріальних
клітин на різних фазах розвитку періодичної культури // Ліки України. —
2001. — № 4. — С. 51-53.

Войцеховський В.Г. Агрегація вегетативних клітин в процесі розвитку
періодичної культури // Зб. наук. праць співробітників КМАПО ім. П.Л.
Шупика. — Київ. — 2001. — Вип.10, № 1. — С. 687-695.

Войцеховський В.Г. Споруляція в агрегатах вегетативних клітин, як
самостійний етап розвитку періодичної культури бактерій // Зб. наук.
праць співробітників КМАПО ім. П.Л.Шупика. — Київ. — 2001. — Вип.10, №
3. — С. 1230-1238.

Войцеховський В.Г. Розвиток спороутворюючих бактерій в залежності від
умов культивування //Актуальные проблемы медицины и биологии. — Киев. —
2001. — № 2. — С. 99-110.

Войцеховський В.Г. Управління розвитком мікрокультур спороутвоюючих
бактерій під впливом факторів агрегації //Актуальные проблемы медицины и
биологии. — Киев. — 2001. — №2. — С.157-172.

Широбоков В.П., Михальський Л.О., Фуртат І.М., Войцеховський В.Г.
Електрофоретичні дослідження біополімерів спороутворюючих бактерій на
різних стадіях їх розвитку // Актуальные проблемы медицины и биологии. —
Киев. — 2002. — № 1. — С.122-128. (* проведено культивування
мікроорганізмів, одержано зразки мікробних клітин і культуральної рідини
для біохімічних та електрофоретичних досліджень, підготовлено роботу до
публікації).

Войцеховський В.Г. Обмін кальцію та фосфору в клітинах спороутворюючих
бактерій в процесі розвитку періодичної культури // Актуальные проблемы
медицины и биологии. — Киев. — 2002. — №2. — С.338-344.

Войцеховський В.Г. Міжклітинні взаємодії у бактерій в процесі їх
розвитку // Гігієна населених міст. — Київ, 2003. — Вип. 42. — С.
506–509.

Широбоков В.П., Войцеховський В.Г. Агрегація бактерій як один із
механізмів міжклітинної взаємодії прокаріот // Журнал академії медичних
наук України. — 2003. — Т.9, № 3. — С. 542-548. (* проведено всі
дослідження та підготовлено роботу до публікації).

Патенти

Способ приготовления плотной питательной среды для культивирования
микроорганизмов. А.с. 1654332 СССР, МКИ С N 1/20 / В.В.Гашинский,
В.П.Широбоков, Н.Н.Марченко, В.Г.Войцеховский, Т.И.Крайнюкова,
В.В.Онищенко (СССР).- № 4182247/13; Заявлено 30.01.87; Опубл. 07.06.91,
Бюл. № 21. — 4 с. (*досліджено культуральні властивості бактерій при
рості на поживному середовищі, проаналізовано та описано результати).

Способ получения плотной питательной среды для культивирования
микроорганизмов. А.с. 1837059 СССР, МКИ С 08 F 220/56, C 12 N 1/00 /
В.В.Гашинский, В.П.Широбоков, Н.Н.Марченко, В.Г.Войцеховский,
Т.И.Крайнюкова, В.В.Онищенко (СССР). — № 4278310/05; Заявлено 25.06.87;
Опубл. 30.08.93, Бюл. № 32. — 6 с. (*досліджено культуральні властивості
бактерій при рості на поживному середовищі, проаналізовано та описано
результати).

Пат. 2007242 Испания, МКИ С 08 F 220/56, CI 2 N 1/100. Un metodo de
obtencion del medio nutritivo denso para el cultivo de microorganismos:
Пат. 2007242 Испания, МКИ С 08 F 220/56, CI 2 N 1/100. — N 8801978 /
V.V.Gashinsky, V.P.Shirobokov, N.N.Marchenko, V.G.Voitsekhovsky,
T.I.Krainjukova, V.V.Onischenko (СССР); Заявл.24.06.88; Опубл. 01.07.89.
— 10 с. (*досліджено культуральні властивості бактерій при рості на
поживному середовищі, проаналізовано та описано результати).

Пат. 239260 Аргентина, МКИ С12 N 1/00 . Un metodo de obtencion del medio
nutritivo denso para el cultivo de microorganismos: Пат. 239260
Аргентина, МКИ С12N 1/00 / V.V.Gashinsky, V.P.Shirobokov, N.N.Marchenko,
V.G.Voitsekhovsky, T.I.Krainjukova, V.V.Onischenko (СССР). — № 311446;
Заявл.18.07.88; Опубл. 31.07.89. — 8 с. (*досліджено культуральні
властивості бактерій при рості на поживному середовищі, проаналізовано
та описано результати).

Пат. 13063 Уругвай. Un metodo de obtencion del medio nutritivo denso
para el cultivo de microorganismos: Пат. 13063 Уругвай / V.V.Gashinsky,
V.P.Shirobokov, N.N.Marchenko, V.G.Voitsekhovsky, T.I.Krainjukova,
V.V.Onischenko (СССР); Опубл. 14.03.90. — 8 с. (*досліджено культуральні
властивості бактерій при рості на поживному середовищі, проаналізовано
та описано результати).

Пат. 4939150 США, МКИ С12N 1/20. Method for preparing dense nutrient
medium for culturing microorganisms: Пат. 4939150 США, МКИ С12N 1/20 /
V.V.Gashinsky, V.P.Shirobokov, N.N.Marchenko, V.G.Voitsekhovsky,
T.I.Krainjukova, V.V.Onischenko (СССР). — № 283950; Заявл.07.01.88;
Опубл. 03.07.90. — 6 с. (*досліджено культуральні властивості бактерій
при рості на поживному середовищі, проаналізовано та описано
результати).

Пат. 1295569 Канада, МКИ C08F-220/56; C08F-267/10; C12N-1/00. Method
for preparing dense nutrient medium for culturing microorganisms: Пат.
1295569 Канада, МКИ C08F-220/56; C08F-267/10; C12N-1/00 / V.V.Gashinsky,
V.P.Shirobokov, N.N.Marchenko, V.G.Voitsekhovsky, T.I.Krainjukova,
V.V.Onischenko (СССР). — № 569565; Заявл. 15.06.88; Опубл. 11.02.92.
(*досліджено культуральні властивості бактерій при рості на поживному
середовищі, проаналізовано та описано результати).

Інші наукові видання

Войцеховский В.Г. Особенности развития периодической культуры
спорообразующих микроорганизмов // Тез. докл. IV Респ. конференции
молодых ученых-медиков. – Донецк. — 1983. -С. 192-193.

Войцеховский В.Г, Завальнюк А.К., Гашинский В.В., Авдеева Л.В. Новые
возможности исследования состояния иммунитета при кишечных инфекциях //
Тез. докл. VI Всес. конф. по клинической биохимии, морфологии и
иммунологии инфекционных болезней. — Рига. — 1983. — С. 45.

Войцеховский В.Г. Развитие периодической культуры условно-патогенных
спорообразующих бактерий // Материалы IХ Всесоюзной. конф.
“Гигиеническое изучение биологического загрязнения окружающей среды”. —
Москва. — 1983. — С.32.

Войцеховский В.Г. Особенности развития спорообразующих бактерий в
микрокультурах // Материалы Х итог. научн. конф. молодых ученых и
специалистов Киевского медицинского института. — Киев. — 1984. — С.9.

Войцеховский В.Г., Гашинский В.В. Исследования развития микропопуляций
бактерий // Достижения микробиологии — практике: Тезисы VII Всес. съезда
микробиол. общества. — Алма-Ата: Наука. — 1985. — Т. 6. — С. 37.

Войцеховский В.Г. Применение сред с синтетическим отвердителем для
культивирования возбудителя пищевой токсикоинфекции Bacillus cereus //
Тез.докл. XI Укр. респ. съезда микробиол., эпидемиол. и паразитол. —
Киев. — 1985. — С. 124.

Войцеховский В.Г., Авдеева Л.В., Бернасовская Е.П., Лукач И.Г.
Ускоренное определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам в
камерах для микрокультивирования клеток // Всесоюз. семинар “Вопросы
антибактериальной терапии инфекционных осложнений в неинфекционной
клинике”. — Москва. — 1987. — С.23.

Широбоков В.П., Гашинский В.В., Войцеховский В.Г., Крайнюкова Т.И.,
Марченко Н.Н., Пимченко В.П. Пластагаровые питательные среды для
культивирования микроорганизмов и перспектива их использования // Tез.
конф. “Актуальные вопросы разработки препаратов медицинской
биотехнологии”. — Махачкала. — 1988. — С.48.

Гашинский В.В., Широбоков В.П., Войцеховский В.Г., Крайнюкова Т.И.,
Марченко Н.Н., Лукач И.Г., Авдеева Л.В., Пимченко В.П. Применение
пластагаровых питательных сред для диагностики заболеваний, вызванных
условно-патогенными микроорганизмами // Тез. докл. II Всесоюзн. конф.
“Акт. вопр. клинической микробиологии в неинфекционной клинике”. –
Барнаул. — 1988. — С.105-106.

Гашинский В.В., Войцеховский В.Г., Марченко Н.Н., Крайнюкова Т.И.
Применение пластагара в медицине // Tез. докл. I городской
научно-практич. конф. изобретателей и рационализаторов “Изобретательство
и рационализация на современном этапе развития медицины ”. — Киев. —
1988. — Ч.1. – С. 90.

Войцеховский В.Г. Применение метода микрокультивирования бактерий для
определения их чувствительности к фитонцидам // Tез. II областной
межинститутской конф. молодых ученых ”Микробиология, иммунология,
биотехнология – практике здравоохранения”. – Харьков. — 1989. — С.35.

Гашинский В.В., Войцеховский В.Г., Крайнюкова Т.И., Марченко Н.Н.,
Онищенко В.В. Использование пластагара для контроля качества питательных
субстратов // Тез. докл. VII съезда Укр. микробиол. общества. —
Киев-Черновцы. — 1989. — Ч.2. — С. 83.

Гашинский В.В., Войцеховский В.Г., Крайнюкова Т.И., Фаль М.М., Фурман
А.А., Марченко Н.Н. Применение синтетических наполнителей для
конструирования плотных питательных сред // Тез. докл. VII съезда Укр.
микробиол. общества. — Киев-Черновцы. — 1989. — Ч.2. — С.82-83.

Войцеховський В.Г. Агрегація бактерій в періодичній культурі // Тез.
доп. “XII Український з’їзд мікробіологів, епідеміологів і
паразитологів”. — Харків. — 1991 . — Т. 1. — С.112.

Гашинский В.В., Войцеховский В.Г., Лукач И.Г., Авдеева Л.В., Марченко
Н.Н., Костенко С.И., Долина В.Л. Ускоренное определение чувствительности
микроорганизмов к антибиотикам // Материалы межвед. симпоз. “Пластагар,
проблемы, перспективы использования в медицине и биологии”. — Киев. —
1992. — С.19-20.

Лукач И.Г., Авдеева Л.В., Войцеховский В.Г., Завальнюк А.К., Долина В.Л.
Метод контроля эффективности антибиотикотерапии // Междунар. конф. по
проблемам медицины катастроф. – Киев. — 1992. — Т. II. — С.181.

Широбоков В.П., Войцеховський В.Г. Дослідження механізму агрегації
бактерій // Материалы междунар. научн. конф., посв. 150-летию со дня
рожд. И.И. Мечникова “Идеи И.И.Мечникова и развитие современного
естествознания”. — Харьков. — 1995. — С.58-59.

Войцеховський В.Г. Динаміка формування агрегатів вегетативних клітин в
процесі розвитку макрокультури // Актуальні питання медичної
мікробіології та вірусології. — Київ. — 1998. — С.24-27.

Войцеховський В.Г. Нові фази розвитку культури, що проходить стадію
агрегації клітин // Актуальні питання медичної мікробіології та
вірусології. — Київ. — 1998. — С.27-32.

АНОТАЦІЯ

Войцеховський В.Г. Агрегація клітин в онтогенезі спороутворюючих
мікроорганізмів. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук за
спеціальністю 03.00.07 – мікробіологія. – Національний медичний
університет ім. О.О. Богомольця, Київ, 2004.

В дисертації представлені результати дослідження міжклітинних взаємодій
в процесі розвитку та диференціації спороутворюючих бактерій роду
Bacillus. Встановлено здатність різних видів бацил на певній фазі
розвитку періодичної культури утворювати багатоклітинні агрегати, в яких
відбувається диференціація клітин. Досліджено властивоті бактеріальних
клітин, що об’єднані в агрегати, а саме: електронно-мікроскопічна
структура, сили міжклітинної взаємодії, іонний склад, полімери
поверхневих шарів клітинних стінок, екзогенні розчинні полімери.

Встановлено, що агрегація бактерій – закономірний процес, який
забеспечує найкращу компетентність для реалізації міжклітинних взаємодій
і створює умови для диференціації мікроорганізмів та індукції
спорогенезу.

Ключові слова: агрегація, розвиток, диференціація, міжклітинні
взаємодії, бактерії, спори, спороутворення, періодична культура.

АННОТАЦИЯ

Войцеховский В.Г. Агрегация клеток в онтогенезе спорообразующих
микроорганизмов. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по
специальности 03.00.07 – микробиология. – Национальный медицинский
университет им. А.А. Богомольца, Киев, 2004.

В диссертации изложены результаты исследований межклеточных
взаимоотношений, которые возникают в процессе развития спорообразующих
бактерий рода Bacillus в периодической культуре. Установлена общая для
различных видов бацилл (B.cereus, B.subtilis, B.mesentericus,
B.megaterium) закономерность, заключающаяся в том, что на определенной
фазе их развития вегетативные формы образуют многоклеточные агрегаты, в
которых происходит дифференциация бактерий, завершающаяся образованием
покоящихся форм. Описаны условия, при которых проявляется феномен
агрегации, представлена характеристика динамики формирования и распада
клеточных агрегатов.

Показано, что в процессе образования агрегатов силы межклеточного
взаимодействия постепенно увеличиваются, достигают максимума, а затем
уменьшаются и полностью исчезают. Существует взаимосвязь между
увеличением силы межклеточного взаимодействия и образованием
специфических для фазы агрегации белков поверхностных слоев клеточных
стенок (молекулярная масса 70,0-72,0 кДа). Электронно-микроскопическими
исследованиями установлено, что агрегация вегетативных клеток возникает
в результате их плотного контакта боковыми поверхностями с последующим
слиянием поверхностных слоев клеточных стенок. После завершения
спорообразования и лизиса параспоральных частей спорангиев между
бактериями, находящимися в составе агрегатов, утрачиваются прежние связи
и наступает разрушение агрегатов. Показано также, что взаиморасположение
бактерий связано с тем, что после деления между ними могут сохраняться
или исчезать межклеточные связи, обусловленные поверхностными слоями
клеточных стенок.

В результате изучения бактериальных экзогенных биополимеров установлено,
что на начальных этапах агрегации клетки синтезируют специфические
растворимые биополимеры, а бактериальная культура именно в этой фазе
развития индуцирует спорогенез у вегетативных форм. На основании
биохимических и електрофоретических исследований показано, что эти
биополимеры имеют гликопротеидную природу с молекулярной массой 41,0 и
33,5 кДа и специфичны для фазы агрегации бактерий. Применение
бактериальной культуры в фазе агрегации в качестве фактора,
регулирующего развитие микробных клеток, дало возможность
экспериментально изменять стадии их онтогенеза в определенном
направлении.

При исследовании содержания химических элементов методом
рентгеноспектрального анализа у бактерий рода Bacillus установлено, что
содержание калия, натрия, кальция, хлора, серы, фосфора и кислорода
существенно изменяется на различных фазах развития периодической
культуры. Во время прорастания спор происходит потеря клетками
большинства элементов, а образование агрегатов вегетативных форм
сопровождается накоплением калия, хлора, серы и фосфора, которые
принимают участие в синтетических и энергетических процессах в клетках.

Всестороннее изучение феномена агрегации бактерий показало, что это
закономерный процесс, имеющий важное значение в развитии микробной
популяции. Агрегация у бактерий рассматривается как наиболее ранний
эволюционный механизм формирования межклеточных взаимодействий.
Агрегация обеспечивает наилучшую компетентность бактериальных клеток для
реализации межклеточных взаимодействий, их защиту в составе агрегатов от
внешних влияний и создает условия для дифференциации клеток и индукции
спорогенеза.

Ключевые слова: агрегация, развитие, дифференциация, межклеточные
взаимодействия, бактерии, споры, спорообразование, периодическая
культура.

SUMMARY

Voitsechovskiy V.G. Cells aggregation in the ontogenesis of sporeforming
of microorganisms . – The manuscript.

The dissertation for a doctor’s degree in medicine, speciality 03.00.07
– microbiology. – Bogomolets National medical university, Kyiv, 2004.

The disertation presens the results of research of extracellular
interactions in a proses of sporeform Bacillus development and
differentiation. There has been established the ability kinds of bacilli
to form multicellular aggregates on certain phase of periodical culture
development. There have been investigated such properties of forming
aggregates bacterial cells as: electron-microscopic structure,
intercellular interaction powers, ion composition, polymers and exogenic
solubile polymers.

The bacterial agregation has been established to be the natural process
which provides the best competence for cellular realizations realization
and makes the conditions for microorganisms differentiation and
sporogenesis induction.

Key wоrds: aggrigation, development, differentiation, intercellular
interactions, bacterias, spores, sporification, periodical culture.

Похожие записи