.

Афінно-хроматографічний аналіз шаперонінів у нормі та під впливом іонів кадмію (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
2 3202
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна

МАРЧЕНКО НАТАЛІЯ ЮРІЇВНА

УДК 577.112

Афінно-хроматографічний аналіз шаперонінів у нормі та під впливом іонів
кадмію

03.00.04 ( біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті

ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України

та в Інституті білка Російської академії наук.

Науковий керівник ( доктор біологічних наук, професор

КАЛІМАН Павло Авксентійович,

професор кафедри біохімії

Харківського національного університету

ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

ЛІТОШЕНКО Олександр Якович,

керівник лабораторії молекулярної генетики

Інституту геронтології АМН України;

кандидат біологічних наук,

старший науковий співробітник

ВЕРЬОВКА Сергій Вікторович,

завідувач лабораторії біохімії

Інституту отоларингології ім. О.С. Коломійченка

АМН України.

Провідна установа ( Інститут молекулярної біології і генетики

Національної академії наук України, відділ білкової

інженерії та біоінформатики, м. Київ

Захист відбудеться 21 травня 2007 року о 14 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії

ім. О.В. Палладіна Національної академії наук України

(01601, Київ, вул. Леонтовича, 9)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії
ім. О.В. Палладіна (Київ, вул. Леонтовича, 9)

Автореферат дисертації розісланий 12 квітня 2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук КІРСЕНКО О.В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Білок теплового шоку GroEL клітин Escherіchіa colі є
представником молекулярних шаперонів – великої групи різноманітних
білків, що забезпечують згортання білків (синтезованих de novo чи
денатурованих внаслідок різних клітинних стресів), а також
трансмембранний транспорт білків і деградацію короткоживучих білків
цитозолю [Lindquist S., Craig E.A., 1988; Gething M.J., Sambrook J.,
1992]. Термін “шапероніни” вживають по відношенню до шаперонів родини
Hsp60 (60-kDa heat-shock proteins). Шапероніни є олігомерами, мають
вигляд двох кілець, покладених одне на одне, здатні міцно зв’язувати
різноманітні денатуровані білкові молекули і виявляють слабку АТФазну
активність [Hemmingsen S.M. et al, 1988; Braig K. et al, 1994; Roseman
A.M. et al, 1996]. Шапероніни виявлено в мітохондріях, хлоропластах і в
еубактеріальному цитозолі [Hemmingsen S.M. et al, 1988; Cheng M.Y. et
al, 1989]. Кількість шаперонінів значно зростає не тільки за теплового
шоку, але й за інших стресів та захворювань [Lindquist S., Craig E.A.,
1988; Schlesinger M.J., 1990; Ranford J.C., Henderson B., 2002].
Бактеріальні шапероніни є сильними імуногенами і можуть викликати різні
патології тканин. Шапероніни (як бактеріальні, так і шапероніни ссавців)
залучені в процеси, що відбуваються при інфекційних і автоімунних
захворюваннях, при амілоїдозах, а також при багатофакторних
захворюваннях, таких як артрити й атеросклероз, і захворюваннях неясного
походження [Ranford J.C., Henderson B., 2002; Maguire M. et al, 2002].
Тому молекулярні шапероніни (і, зокрема, GroEL) належать до
найважливіших об’єктів сучасних досліджень у галузі молекулярної
біології, біотехнології та біомедицини.

При вивченні фізико-хімічних властивостей шаперонінів дослідники
стикаються з низкою проблем, серед яких можна виділити такі:

1) проблема очищення від численних поліпептидних домішок, що міцно
зв’язані з шаперонінами (існуючі методи очищення є ефективними, але
складними) [Murai N. et al, 1996; Clark A.C. et al, 1998; Todd M.J.,
Lorimer G.H., 1998];

2) проблема вивчення взаємодії шаперонінів з денатурованими білками
(такі білки або ренатурують у присутності шапероніну, або схильні до
неспецифічної агрегації, що ускладнює дослідження їх взаємодії з
шаперонінами) [Rozema D., Gellman S.H., 1996; Марченков В.В. и др,
2004];

3) проблема швидкого аналізу вмісту шаперонінів у клітинах різних
організмів, у тому числі шаперонінів, що накопичуються при стресах і
захворюваннях (приготування антитіл – складний і тривалий процес, а
наявний у продажі набір антитіл обмежений) [Pauwels K. et al, 2005;
Joyner-Matos J. et al, 2006].

У дисертаційній роботі розроблено метод афінної хроматографії GroEL на
базі денатурованих білків, ковалентно іммобілізованих на нейтральному
носії (агароза), що значно спрощує вирішення ряду задач в області
досліджень GroEL та інших шаперонінів, а саме:

1) афінна хроматографія дозволяє в одну стадію з мінімальними втратами
одержувати високоочищений GroEL із освітленого клітинного лізату;

2) ковалентно іммобілізовані на хроматографічному носії денатуровані
білки не агрегують, що дає можливість у широких діапазонах зовнішніх
умов (рН, іонної сили, концентрацій лігандів, тощо) досліджувати
взаємодію шаперонінів з білками, які мають різні фізико-хімічні
властивості;

3) міцна взаємодія шаперонінів з афінним сорбентом та їх мінімальні
втрати на стадії очищення уможливлюють створення методів експрес-аналізу
вмісту GroEL та інших шаперонінів у клітинах різних організмів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконана в рамках науково-дослідної роботи кафедри біохімії
Харківського національного університету імені В. Н. Каразіна за темою
“Клітинні та молекулярні механізми адаптації метаболізму при
оксидативному стресі” (№ державної реєстрації 0197 И008188).

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи є розробка
методу афінної хроматографії шаперонінів клітин різних організмів (на
прикладі клітин Escherіchіa colі дикого типу і суперпродуценту GroEL, а
також клітин печінки щурів у нормі та при оксидативному стресі).

Досягнення поставленої мети передбачало вирішення таких завдань:

1) дослідження фізико-хімічних властивостей (структури, заряду і
гідрофобності) ряду денатурованих білків, що можуть бути використані для
створення афінних сорбентів;

2) дослідження умов взаємодії GroEL з різними денатурованими білками в
розчині;

3) виготовлення афінних сорбентів на основі різних денатурованих білків
шляхом їх ковалентного приєднання до нейтрального хроматографічного
носія;

4) дослідження умов взаємодії GroEL з афінними сорбентами на базі
апоцитохрому с, в-казеїну, пепсину, б-лактальбуміну, лізоциму і
рибонуклеази А;

5) розробка методики ефективного очищення GroEL на афінних сорбентах;

6) застосування розробленого методу на прикладі аналізу вмісту
шаперонінів у клітинах печінки щурів у нормі та при оксидативному
стресі.

Об’єкт дослідження – вміст і властивості шаперонінів.

Предмет дослідження – метод афінної хроматографії на основі
іммобілізованих денатурованих білків для аналізу вмісту шаперонінів у
печінці щурів при оксидативному стресі, для вивчення взаємодії GroEL з
різноманітними денатурованими білками, а також для очищення GroEL.

Методи дослідження. Аналіз елюції шаперонінів з афінних сорбентів, а
також перевірку чистоти та нативності білків проводили методами
спектрофотометрії, електрофорезу, флуоресцентної спектроскопії та
визначенням АТФазної активності; виділення та очищення білків виконували
за допомогою методів гель-фільтрації, іонообмінної і зворотнофазової
хроматографії; концентрацію білків та активність гемоксигенази визначали
за допомогою методу спектрофотометрії; вимірювання гідрофобності
денатурованих білків та вивчення взаємодії GroEL з денатурованими
білками у розчині виконували методами флуоресцентної спектроскопії та
гель-фільтрації; освітлення клітинного лізату, зразків білків та
одержання субклітинних фракцій печінки виконували за допомогою
диференційного центрифугування.

Наукова новизна дисертаційної роботи

Вперше запропоновано універсальний, простий і швидкий метод аналізу
вмісту шаперонінів у різних організмах за допомогою афінної
хроматографії на базі денатурованого лізоциму.

Вперше докладно досліджено умови взаємодії GroEL з різними
денатурованими білками, які не здатні прийняти нативну конформацію.

Вперше застосовано метод афінної хроматографії на базі денатурованого
пепсину для виділення та очищення GroEL із освітленого центрифугуванням
клітинного лізату.

Показано:

– GroEL надійно з’єднується з денатурованими білками, що мають різний
ступінь структурованості, гідрофобності та різний заряд;

– GroEL надійно зв’язується з афінними сорбентами на базі різних
денатурованих білків, що дає можливість для його ефективного виділення
та очищення;

– при низьких і середніх іонних силах (до 100 мМ) і pН 7.5 присутність
двовалентних катіонів (магнію чи кальцію) необхідна для зв’язування
GroEL з негативно зарядженими денатурованими білковими мішенями, однак
при високих іонних силах (~600 мМ) GroEL утворює міцний комплекс із
негативно зарядженими денатурованими білками і за відсутності
двовалентних катіонів; присутність двовалентних катіонів чи високої
іонної сили не впливає на зв’язок молекулярного шаперону GroEL з
позитивно зарядженими денатурованими білками;

– ліганди GroEL (Mg-АДФ, Mg-АТФ і кошаперонін GroES) послаблюють зв’язок
GroEL з денатурованими білковими мішенями, причому це ослаблення
залежить як від природи ліганда в ряді Mg-АДФ ? ® ° 1/4 - ? e ? a ?? ?? @Б + 20 мМ Mg-АДФ + Б + 600 мМ NaCl (KCl, NH4Cl) Б + 20 мМ Mg-АДФ + (-лакталь-бумін -7 Б + 5 мМ ЕДТА ( (GroEL у вільному об'ємі) ( Б + 10 мМ MgCl2 (CaCl2) Б + 5 мМ ЕДТА + Б + 5 мМ ЕДТА, 600 мМ NaCl (KCl, NH4Cl) Б + 5 мМ ЕДТА + (-казеїн -8 А + 5 мМ ЕДТА ( (GroEL у вільному об'ємі) ( А + 10 мМ MgCl2 (CaCl2) А + 5 мМ ЕДТА + А + 5 мМ ЕДТА, 600 мМ NaCl (KCl, NH4Cl) А + 5 мМ ЕДТА + пепсин -32 А + 5 мМ ЕДТА ( (GroEL у вільному об'ємі) ( А + 10 мМ MgCl2 (CaCl2) А + 5 мМ ЕДТА + А + 5 мМ ЕДТА, 600 мМ NaCl (KCl, NH4Cl) А + 5 мМ ЕДТА + *Якщо більш ніж 90% шаперону, що було нанесено на афінний сорбент, зв'язувалося з сорбентом, вважали, що комплекс GroEL з ненативним білком наявний; якщо менш ніж 10% шаперону, що було нанесено на афінний сорбент, зв'язувалось, комплекс вважали відсутнім. А ( 20 мМ Tris-HCl, рН 7.5; Б ( 20 мМ Tris-HCl, 20 мМ ДТТ, рН 7.5. Видно, що при низькій іонній силі розчину (20 мМ Trіs-HCl, рН 7.5) і за відсутності двовалентних катіонів (іонів Mg2+ і Ca2+) GroEL не зв'язується з негативно зарядженими при рН 7.5 денатурованими білками (пепсин, в-казеїн і б-лактальбумін), але зв'язується з позитивно зарядженими денатурованими білками (апоцитохром с, рибонуклеаза і лізоцим). Таким чином, при низьких іонних силах наявного ступеня денатурованості негативно заряджених білкових мішеней недостатньо для утворення міцного комплексу з GroEL. Загальний заряд GroEL при рН 7.5 (розрахований з його амінокислотній послідовності) негативний (-266). Можна припустити, що гідрофобне притягнення GroEL і денатурованого білка при низькій іонній силі розчину цілком компенсується електростатичним відштовхуванням їх негативно заряджених молекул. На користь цього свідчить той факт, що підвищення іонної сили розчину до 600 мМ NaCl забезпечує утворення міцного комплексу GroEL з негативно зарядженими денатурованими білками навіть за відсутності двовалентних катіонів (таблиця 3). Крім того, при низькій іонній силі розчину високу спорідненість GroEL до негативно заряджених денатурованих білків можуть забезпечити порівняно невеликі концентрації (~10 мМ) двовалентних катіонів (іонів Mg2+ і Ca2+, таблиця 3) (див. також [Pack C.G. et al, 1999]). Відомо, що іони Mg2+ значно підвищують стійкість GroEL до дії температури [Surin A.K. et al, 1997] і сечовини [Azem A. et al, 1994]. Можливо, це підвищення стабільності забезпечується зв'язуванням іонів Mg2+ з ділянками, розташованими на поверхні GroEL. Таке зв'язування може також приводити до значного зменшення локального негативного заряду на частині його поверхні, можливо, в зоні безпосереднього контакту з денатурованим білком, зменшуючи електростатичне відштовхування. Таким чином, у формуванні міцного комплексу GroEL з негативно зарядженими денатурованими білками велике значення відіграє пригнічення їх електростатичного відштовхування, що і здійснюється у фізіологічних умовах підвищеною іонною силою (~150 мМ NaCl) і присутністю іонів Mg2+ чи Са2+. На наявність взаємодії GroEL з позитивно зарядженими денатурованими білками не впливає ні присутність двовалентних катіонів, ні підвищення іонної сили до 600 мМ (таблиця 3). Слід зазначити, що представлені результати узгоджуються з літературними даними про вплив двовалентних катіонів на спорідненість GroEL до денатурованих пепсину, б-лактальбуміну й апоцитохрому c [Pack C.G. et al, 1999], а також з даними, що були отримані нами щодо взаємодії GroEL з флуоресцентно-міченими пепсином, лізоцимом і б-лактальбуміном у розчині. В той же час, використання обраного нами методу (афінної хроматографії на базі агарозного гелю з ковалентно приєднаними білками-мішенями) дозволило розширити спектр білкових мішеней у порівнянні з відомими роботами [Aoki K. et al, 1997; Pack C.G. et al, 1999], завдяки чому можна стверджувати, що двовалентні катіони необхідні для взаємодії GroEL саме з негативно зарядженими денатурованими білковими мішенями при низьких іонних силах. Виділення та очищення GroEL методом афінної хроматографії Внаслідок неослабного інтересу до дослідження структури і функціонування молекулярних шаперонінів, вже давно постало питання про їх швидке та ефективне очищення. Існує ряд відомих методик виділення й очищення, що базуються на гель-фільтрації, іонообмінній і зворотнофазовій хроматографії і т.д. Ці методики досить трудомісткі і складаються з кількох послідовних стадій [Lissin N.M. et al, 1990; Clark A.C. et al, 1998; Motojima F. et al, 2000]. Істотною проблемою є також доочищення GroEL від домішок, що практично не виявляються методами електрофорезу, однак чітко визначаються методом флуоресцентної спектроскопії (амінокислотна послідовність GroEL не містить залишків триптофану [Hemmingsen S.M. et al, 1988], однак очищені зразки шаперону часто мають значну триптофанову флуоресценцію [Price N.C. et al, 1991]). Використання афінної хроматографії на базі денатурованого пепсину дозволяє досить просто звільнитися від такої домішки. На малюнку 4 представлені дані SDS-електрофорезу і флуоресцентної спектроскопії шапероніну GroEL, виділеного стандартним методом, до і після його додаткового очищення за допомогою афінної хроматографії. Рис. 4. SDS-електрофорез (А) і спектри флуоресценції (Б) зразків GroEL після стандартного очищення до нанесення на афінну колонку (1); домішка, що виходить у вільному об'ємі при нанесенні GroEL на афінний сорбент у 600 мМ NaCl (2); GroEL, елюйований з афінного сорбенту буфером 20 мМ Trіs-HCl, pН 7.5 (3). Спектри флуоресценції заміряно при довжинах хвиль збуджуючого світла 270 нм (––––) і 293 нм (– – –). Видно, що, незважаючи на те, що очищений стандартним способом [Lissin N.M. et al, 1990] GroEL виглядає електрофоретично як добре очищений (рис. 4А, слот 1), спектр його флуоресценції містить великий внесок триптофанової складової (лмакс ~350 нм (рис. 4Б, 1)). Нанесення цього препарату GroEL на афінний сорбент з негативно зарядженим денатурованим пепсином в умовах високої іонної сили (600 мМ) при відсутності двовалентних катіонів приводить до того, що GroEL зв'язується з сорбентом (рис. 4А, слот 2; див. також табл. 3), а домішка, що містить триптофан, виходить у вільному об'ємі (рис. 4Б, 2). Елюйований з афінного сорбенту GroEL (рис. 4А, слот 3) практично не має домішки, що містить триптофан, і його спектр флуоресценції має тільки тирозинову складову (рис. 4Б, 3), як і випливає з його амінокислотної послідовності. Вірогідно, при високій іонній силі взаємодія GroEL із домішкою, що містить триптофан, послаблюється і вона не може утриматись на міцно зв'язаному з афінним сорбентом шапероні. Афінна хроматографія на базі денатурованих білків видається одним з перспективних підходів до розробки методів швидкого і високоефективного очищення GroEL і подібних йому шаперонінів безпосередньо з клітинного лізату [Evers M.E. et al, 1993]. Це, в свою чергу, становить інтерес як для біотехнологічних цілей (наприклад, для одержання шаперонінів з різних організмів з метою їх використання для реактивації рекомбінантних білків з “тілець включення”), так і для експрес-аналізу вмісту шаперонінів у клітинах різних організмів, що може бути корисним у біомедицині для розробки нових діагностичних систем. На малюнку 5 наведено результати афінної хроматографії (на сорбенті з денатурованим пепсином) клітинного лізату, освітленого центрифугуванням, після експресії в клітинах E. colі оперону groЕ. Рис. 5. Афінне очищення GroEL із освітленого центрифугуванням лізату клітин E. colі після експресії в них groE-оперону (А) та клітин E. colі дикого типу (Б). А, Б – SDS-електрофорез клітинного лізату до нанесення на афінну колонку (1) і фракцій GroEL з афінного сорбенту в області піка елюції (2-4); В – типовий профіль елюції GroEL з афінного сорбенту, зареєстрований за АТФазною активністю. На врізці наведено спектри флуоресценції GroEL після афінного очищення при довжині хвилі збудження 270 нм (––––) і 293 нм (– – –). Як видно з малюнка 5, очищений у такий спосіб GroEL не тільки електрофоретично чистий (рис. 5А) і нативний (тобто має АТФазну активність, див. рис. 5В), але й не має триптофанової складової власної флуоресценції (рис. 5В, врізка). Як випливає з малюнка 5Б, афінна хроматографія на базі денатурованого пепсину дозволяє одержати очищений GroEL на тільки з клітин E. colі, що є суперпродуцентом GroE, але й із клітин E. colі дикого типу, де кількість шапероніну значно менша. Отримані результати вказують на високу ефективність очищення GroEL на афінному сорбенті з ковалентно іммобілізованим денатурованим пепсином. Такий підхід дозволяє очищати GroEL із клітинного лізату практично в одну стадію, забезпечуючи високий ступінь чистоти GroEL, і не вимагає додаткових етапів діалізу і концентрування, що підвищує вихід GroEL, дозволяючи уникнути його втрат у порівнянні з багатоетапним очищенням. Міцна взаємодія GroEL з афінним сорбентом в описаних нами умовах і мінімальні втрати шаперону на стадії очищення надають можливість експрес-аналізу вмісту GroEL та інших шаперонінів у клітинах, тканинах і органах різних організмів як у нормі, так і в патології, у тому числі при впливі різних стресів. Експрес-аналіз вмісту шаперонінів печінки щурів при оксидативному стресі Для експрес-аналізу шаперонінів печінки щурів було обрано агарозний гель з ковалентно приєднаним лізоцимом. GroEL міцно взаємодіє з денатурованим (у присутності ДТТ) лізоцимом при будь-якій іонній силі розчину (див. таблицю 3). Для індукції оксидативного стресу щурам був уведений хлорид кадмію. Для оцінки розвитку оксидативного стресу в групи щурів, що були під впливом хлориду кадмію, визначали активність гемоксигенази у мікросомальній фракції клітин печінки щурів, оскільки підвищення гемоксигеназної активності належить до класичних ознак оксидативного стресу. Було отримано наступні дані: в групі контрольних щурів значення гемоксигеназної активності склали 2.7±0.3 нмоль білірубіну/год на 1 мг білка, а в групі стресованих щурів – 15.7±0.8 нмоль білірубіну/год на 1 мг білка. Середні значення достовірно різняться: p

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020