Застосування фізико-хімічних методів для аналізу якості фенолвміщуючих лікарських засобів (автореферат)

АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ

ЄВТУШЕНКО ОЛЬГА ОЛЕКСАНДРІВНА

УДК 615.213: 615.015.4: 615.015.2

Фармакологічний аналіз центральних нейромедіаторних механізмів дії
протисудомних препаратів

14.03.05-фармакологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ-2005

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фармакології та токсикології АМН України

Науковий керівник доктор медичних наук, професор,

заслужений діяч науки та техніки України,

Громов Леонід Олександрович,

Інститут фармакології та токсикології АМН України,

завідувач відділу нейрофармакології

Офіційні опоненти доктор біологічних наук

Кокшарева Наталія Володимирівна,

Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя

МОЗ України, завідувач відділу нейротоксикології

доктор медичних наук, професор

Кульчицький Олег Костянтинович,

Інститут геронтології АМН України,

завідувач лабораторії регуляції метаболізму

Провідна установа Одеський державний медичний університет, кафедра
загальної та клінічної фармакології МОЗ України, м. Одеса

Захист відбудеться „ 20 ” квітня 2005 р. о 1300 годині на
засіданні спеціалізованої

вченої ради Д 26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН
України за адресою:

03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та
токсикології

АМН України за адресою: 03057, м. Київ, вул. Ежена Потьє, 14

Автореферат розіслано „ 18 ” березня 2005 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук
І.В. Данова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Однією з проблем епілептології є так звана
рефрактерна або резистентна до монотерапії форма епілепсії, яка
становить 25 – 30 % усіх випадків захворювання (Л.Р. Зенков, 2002; P.N.
Patsalos et al., 2002).

Згідно сучасної класифікації експертів Міжнародної протиепілептичної
ліги, нараховується до 50 різновидів клінічних форм епілепсії, кожна з
яких має свої патогенетичні особливості (Г.С. Бурд, 1995). Ось чому для
ефективного лікування конкретного хворого надзвичайно важливою умовою є
збіг патогенезу даної клінічної форми епілепсії з механізмом дії
антиепілептичних засобів, що призначаються.

Механізм розвитку судомного нападу головним чином пов’язаний з
порушенням обміну та функцій нейромедіаторних систем синаптичної
передачі (А.И. Болдырев, 1990; B. S. Meldrum, 1995; P.S. Jobe, 1999;
R.H. Levy, 2002). Тому знання нейромедіаторних механізмів дії
протиепілептичних засобів важливо не тільки з теоретичної, але й
практичної точки зору – для цілеспрямованого підбору протисудомних
препаратів у кожному конкретному клінічному випадку.

Тактика лікування епілепсії полягає у виборі монотерапії базовими
препаратами – фенобарбіталом, карбамазепіном, депакіном (В.А. Карлов,
1990; Д. Шмидт, 1996; J.A. French, S. Schachter, 2002). У випадку
неефективності монотерапії призначають комбіновану терапію – додають
протисудомні засоби нового покоління – ламотриджин, топірамат, фелбамат
(А.Е. Дубенко, 1998; Л.Р. Зенков, 2002; P.N. Patsalos, 2002; S. M.
Sander, 2004).

Існує чимало даних про дію протиепілептичних препаратів як на
електрогенез епілептизованих нейронів, так і на обмін нейроактивних
медіаторних амінокислот – гамма-аміномасляної кислоти (ГАМК), гліцину,
глутамату (J.M. Rho, R. Sankar, 1999; I. Bohme, H. Luddens, 2001;
P.Kwan, G.Sills, M.Brodie, 2001; H. Ashton, H. Young, 2003). Однак,
приймаючи до уваги, що у патогенезі судомного синдрому беруть участь й
інші нейромедіаторні системи, актуальним є вивчення впливу протисудомних
засобів на функціональний стан цих систем, а також виявлення домінантної
міжпівкульової дії препаратів на моноамінергічні системи. Досі
залишається не з’ясованою роль молекулярної взаємодії протиепілептичних
препаратів з ключовими амінокислотами білка ГАМКА рецептора (провідною
гальмівною системою нейронів головного мозку) у протисудомній активності
цих препаратів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано
в плані наукової тематики Інституту фармакології та токсикології, теми
№2 АМН України (2000-2003, шифр АМН.02.01, номер держреєстрації
0101U000441) „Дослідження механізмів протисудомної дії та нешкідливості
при тривалому застосуванні нового антиепілептичного засобу Етобровал”.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було встановлення
нейромедіаторного профілю механізму дії протиепілептичних препаратів
першої лінії (фенобарбітал, депакін, карбамазепін) та антиепілептичних
ліків нового покоління (ламотриджин, топірамат, фелбамат) для
оптимізації їх індивідуального підбору при лікуванні епілепсії.

Для досягнення цієї мети були визначені такі завдання:

Визначити дію досліджуваних протисудомних засобів на функціонування
ГАМК-, гліцин-, глутамат-, адрен-, дофамін-, серотонін- та холінергічної
нейромедіаторних систем.

Дослідити вплив протиепілептичних препаратів на рівень моноамінів у
мозку тварин та виявити домінантність їхньої дії на ліву та праву
півкулі головного мозку.

Підібрати комбінації протисудомних засобів з взаємодоповнюючим
нейромедіаторним профілем дії та оцінити їх протисудомну ефективність.

Провести квантовохімічний аналіз взаємодії досліджуваних
протиепілептичних препаратів з ключовими послідовностями амінокислот
білків ГАМКА рецептора.

Об’єкт дослідження: білі нелінійні щури та миші з експериментальною
моделлю судомного стану, головний мозок білих щурів.

Предмет дослідження: нейромедіаторний профіль механізму дії
протиепілептичних препаратів першого покоління (фенобарбіталу,
карбамазепіну, депакіну) та нової генерації (ламотриджину, топірамату,
фелбамату).

Методи дослідження: фармакологічні, нейрохімічні, квантовохімічні,
статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Встановлено індивідуальний
нейромедіаторний профіль дії фенобарбіталу, карбамазепіну, депакіну,
ламотриджину, топірамату, фелбамату на ГАМК-, гліцин-, глутамат-,
адрен-, дофамін-, серотонін-, холінергічну нейромедіаторні системи.
Виявлено, що механізм протисудомної дії фенобарбіталу пов’язаний з його
впливом на всі досліджувані нейромедіаторні системи, що і визначає його
виражену протисудомну активність.

Показано, що по відношенню до моноамінів мозку всі досліджувані
протиепілептичні препарати, окрім фенобарбіталу, домінантно впливають на
праву гемісферу. При цьому всі досліджувані препарати згладжують
міжпівкульову асиметрію співвідношення норадреналін/дофамін.

За допомогою квантовохімічних розрахунків виявлена лінійна залежність
між антисудомною активністю досліджуваних протиепілептичних препаратів
та енергією їх взаємодії з активною ділянкою альфа-субодиниці ГАМКА
рецептора, яка відіграє важливу роль у провідності хлорного каналу цього
рецептору.

Практичне значення одержаних результатів. На основі встановлення
індивідуального впливу протиепілептичних препаратів на функціонування
нейромедіаторних систем та вміст моноамінів в тканинах мозку підібрані
оптимальні комбінації протисудомних засобів, а саме: депакін +
ламотриджин, карбамазепін + топірамат, які виявляють найбільшу
ефективність при епілептичній хворобі, пов’язаній з порушенням
метаболізму ГАМК.

Знайдена лінійна кореляція між енергією взаємодії досліджуваних
протиепілептичних препаратів із ключовими амінокислотними
послідовностями ГАМКА рецептора та протисудомною активністю цих
антиконвульсантів дозволяє вести цілеспрямований пошук нових
протиепілептичних препаратів, критерієм вибору яких можуть бути енергія
їх взаємодії з активними ділянками ГАМКА рецептора.

Наукові результати, отримані в ході виконання дисертаційної роботи,
впроваджено в лекційний курс по темі „Антиепілептичні засоби” на
кафедрах фармакології Вінницького державного медичного університету ім.
М.І. Пирогова, Буковинської державної медичної академії, Луганського
державного медичного університету, кафедрі фармакології та клінічної
фармакології Дніпропетровської державної медичної академії.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто проведено
патентно-інформаційний пошук, аналіз даних літератури за темою
дисертації, експериментальні дослідження, статистична обробка одержаних
даних та оформлення їх у вигляді таблиць та графіків, проаналізовано
результати досліджень, сформульовано основні положення та висновки
роботи. Аналіз квантовохімічних розрахунків проведений разом з к.
ф.-м.н. Куцем В.С. (Інститут сорбцій та проблем ендоекологій НАН
України).

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались на
III Міжнародній науково-практичній конференції „Наука і соціальні
проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія” (Харків, 2003),
V молодіжній науковій конференції СО РАМН „Фундаментальні та прикладні
проблеми сучасної медицини” (Новосибірськ, Росія, 2004), конференції
Британської асоціації психофармакології (Summer Meeting of the British
Assoсiation of Psychopharmacology) (Харрогат, Велика Британія, 2004),
науково-практичній конференції молодих вчених „Вчені майбутнього”
(Одеса, 2004).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 наукових праць, з
них: 5 статей у наукових фахових журналах, рекомендованих ВАК України,
та 4 – в збірниках матеріалів конференцій, у тому числі із міжнародною
участю.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із
вступу, огляду літератури, розділу „Матеріали і методи досліджень”,
власних експериментальних досліджень, обговорення отриманих результатів
та висновків. Робота викладена на 182 сторінках машинописного тексту,
ілюстрована 19 рисунками та 53 таблицями. Список літератури має 263
найменування, з яких 108 вітчизняних та 155 іноземних джерел.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень. Експериментальні дослідження проведені на
260 статевозрілих нелінійних білих щурах масою 160-220 г та на 680
нелінійних білих мишах масою 18-28 г обох статей, які були розведені у
віварії Інституту фармакології та токсикології АМН України. Тварин
утримували на стандартному водно-харчовому раціоні при вільному доступі
до води та їжі. З метою проведення біохімічних досліджень щурів
декапітували, евтаназія інших тварин здійснювалась передозуванням
ефірного наркозу (Ю.М. Кожем’якін та співавт., 2002), згідно вимогам
етичної комісії Інституту, щодо досліджень на лабораторних тваринах.

Дослідження нейромедіаторних механізмів дії досліджуваних протисудомних
препаратів (фенобарбіталу, карбамазепіну, вальпроєвої кислоти,
ламотриджину, фелбамату, топірамату) проведено за допомогою аналізаторів
функціонування ГАМК-, гліцин-, глутамат-, адрен-, дофамін-, серотонін-
та холінергічної нейромедіаторних систем (табл. 1).

Усі досліджувані протиепілептичні препарати уводили інтрагастрально
(і/г) в умовно-терапевтичній дозі (1/10 від ЛД50) за 1 год. до
фармакологічних аналізаторів синаптичної передачі.

Таблиця 1

Характеристика використаних в роботі фармакологічних аналізаторів

Система Назва речовини Фармакологічна дія Використана

доза, мг/кг Шлях уведення

ГАМКергічна Бікукулін Блокатор ГАМКА рецептора 20 і/п

-//- Коразол Блокатор ГАМКА рецептора 90 і/п

-//- Тіосемікарбазид Блокатор синтезу ГАМК 20 і/п

Гліцинергічна Стрихнін Блокатор рецепторів гліцину 1,5 і/п

Глутаматергічна Каїнова кислота Блокатор рецепторів глутамату 30 і/п

Дофамінергічна Апоморфін Агоніст рецепторів 10 і/п

-//- Галоперидол Антагоніст рецепторів 1 і/п

Адренергічна Сиднокарб Агоніст рецепторів 20 і/г

Холінергічна Нікотин Агоніст Н-холінорецепторів 0,75 і/п

-//- Ареколін Агоніст М-холінорецепторів 17,5 і/п

-//- Езерин Блокатор холінестерази 0,35 і/п

Серотонінергічна Резерпін Блокатор транспорту серотоніну із цитоплазми
у синаптичні везикули 15 і/п

Фенобарбітал використовували в дозі 15 мг/кг для мишей та 40 мг/кг для
щурів; карбамазепін – відповідно – 125 мг/кг та 200 мг/кг; депакін –
155 мг/кг та 150 мг/кг; ламотриджин – 30 мг/кг та 20 мг/кг; топірамат –
304 мг/кг та 300 мг/кг; фелбамат – 500 мг/кг для мишей та щурів.

Уведення бікукуліну, коразолу, тіосемікарбазиду, стрихніну, каїнової
кислоти, нікотину супроводжувалося розвитком судомного синдрому, який
оцінювали за 5-ти бальною шкалою (Г.Н. Крижановський, А.А. Шандра, Є.В.
Нікушкін, 1982): 0 – відсутність судомної активності; 1 – судомні
здригання, стрибки; 2 – клонічні судоми тіла; 3 – виражені
тоніко-клонічні судоми з падінням тварини на бік, присутня чітка фаза
тонічної екстензії (опістотонус); 4 – загибель тварини.

Відповідно до досліджуваних систем оцінювали здатність препаратів
запобігати розвитку:

тремору та гіперсалівації, які виникали при уведенні ареколіну;

блювотного рефлексу, викликаного апоморфіном;

тремору, викликаного уведенням езерину;

каталепсії (К.С. Раевский, 1975), яка виникала при уведенні
галоперидолу;

гіпотермії, пози „горб” та пілоерекції, викликаної уведенням резерпіну;

гіпертермії та рухової гіперактивності (Я. Буреш, О. Бурешова, Дж.
Хьюстон, 1991), які виникали при уведенні сиднокарбу.

Концентрацію норадреналіну, дофаміну, серотоніну й триптофану в півкулях
мозку щурів визначали методом високоефективної рідинної хроматографії із
флюориметричним детектором (W.A. Hunt, T.K. Dalton, 1983). Тварин
декапітували під ефірним наркозом через 1 год. після уведення
досліджуваного протисудомного препарату, препарували головний мозок з
метою виділення півкуль. Вміст моноамінів визначали в нг/мг сирої
тканини.

Розрахунок електронної будови досліджуваних протиепілептичних
препаратів, конвульсантів, “ключових” амінокислотних послідовностей та
їх взаємодії проведений квантовохімічним напівемпіричним методом
самоузгодженого поля АМ1 (пакет комп’ютерних програм HyperChem7 –
http:// HYPERLINK «http://www.hyper.com» www.hyper.com ).

Статистичну обробку результатів здійснювали загальноприйнятими методами
варіаційної статистики з використанням комп’ютерної програми StatSoft
Statistica 6.0 (однофакторний дисперсійний аналіз ANOVA, t-критерій
Ст’юдента), а також непараметричним ранговим критерієм Уайта.

Результати досліджень та їх обговорення. 1. Вплив протисудомних засобів
на функціонування нейромедіаторних систем головного мозку. При
проведенні фармакологічних досліджень з використанням аналізаторів
функціонування нейромедіаторних систем було виявлено, що механізм
протисудомної дії як базових препаратів (фенобарбіталу, карбамазепіну,
депакіну), так і препаратів нової генерації (ламотриджину, фелбамату і
топірамату) має поліфункціональний нейромедіаторний профіль (рис 1 — 6).

Так, фенобарбітал має найбільш різноманітний нейромедіаторний профіль
дії (рис.1). Цей препарат має виражений вплив на систему ГАМК,
активізує гліцинергічну передачу і проявляє холінергічну дію. Крім
цього, фенобарбітал знижує активність глутамат- і норадренергічної
систем і підвищує активність серотонінергічної системи. Така
різноманітність нейромедіаторних ефектів фенобарбіталу з одного боку
може пояснювати його потужний протисудомний вплив, а з іншого – може
бути причиною чисельних побічних і токсичних проявів при клінічному
застосуванні.

У механізмі дії карбамазепіну насамперед виступає його агоністична дія
на ГАМКА рецептори і активація гальмівної гліцинергічної системи (рис.
2).

Депакін проявляє властивості агоніста ГАМКА рецепторів та виразно
потенціює антихолінестеразну дію езерину. Одночасно з цим депакін
активізує гальмівну серотонінергічну систему, має певну адренергічну та
холінолітичну дії (рис. 3).

Ламотриджин має виражений вплив на ГАМК-, гліцин- та дофамінергічну
системи (рис.4).

В механізмі дії фелбамату (рис.5) домінує вплив на систему ГАМК та
адренергічна дія. Певний вплив фелбамат має і на функціонування дофамін-
і холінергічної систем.

Домінуючим в механізмі дії топірамату є його вплив ГАМКергічну систему
(рис. 6) та потенціювання антихолінестеразної дії езерину. Крім цього,
топірамат змінює функціонування адрен- і дофамінергічної систем.

2. Домінанатна міжпівкульова дія протисудомних засобів на рівень
моноамінів в головному мозку. Існують дані про різну ефективність
антиконвульсантів при лікуванні хворих із правим і лівим профілями
функціональної асиметрії. Так, відомо, що ефект антиконвульсантів більше
виражений у хворих із правим і знижується у хворих з лівим профілем
функціональної асиметрії (Т.І. Тетеркіна та співавт., 1993).

Ми провели нейрохімічне дослідження з визначення вмісту моноамінів у
півкулях мозку під дією досліджуваних протиепілептичних препаратів за
допомогою методу високоефективної рідинної хроматографії, результати
якого наведені в таблицях 2 і 3.

Проведений аналіз співвідношення рівнів норадреналін / дофамін (НА/ДА) у
тканинах лівої і правої півкуль як маркерів функціональної активності
міжпівкульового балансу (А.В. Качура, 1997) показав наявність
міжпівкульової асиметрії: в правій півкулі – це відношення складало 1:4
(0,272 нг/мг норадреналіну / 0,965 нг/мг дофаміну), тоді як в лівій
півкулі – 1:2 (0,360 нг/мг норадреналіну / 0,732 нг/мг дофаміну).

Таблиця 2

Вплив протиепілептичних препаратів депакіну, фенобарбіталу,
карбамазепіну, ламотриджину, топірамату, фелбамату на вміст
нейромедіаторів норадреналіну та дофаміну в мозку щурів (M ± m, n=6)

Препарат Вміст норадреналіну, нг/мг

Вміст дофаміну, нг/мг

Права півкуля

Ліва півкуля

Права півкуля

Ліва півкуля

Контроль 0,272 ± 0,045 0,360 ± 0,061 0,965 ± 0,056 0,732 ± 0,107

Депакін, 150 мг/кг 0,409 ± 0,061 0,363 ± 0,051 1,367 ± 0,088 * 0,788 ±
0,549

Фенобарбітал, 40 мг/кг 0,415 ± 0,060 0,535 ± 0,026 * 1,017 ± 0,055 1,363
± 0,131 *

Карбамазепін, 200 мг/кг 0,518 ± 0,023 * 0,486 ± 0,039 1,253 ± 0,143
1,022 ± 0,211

Ламотриджин, 20 мг/кг 0,512 ± 0,049 * 0,350 ± 0,044 1,197 ± 0,125 0,967
± 0,147

Топірамат, 300 мг/кг 0,461 ± 0,028 * 0,388 ± 0,045 1,420 ± 0,089 * 0,922
± 0,077

Фелбамат 500 мг/кг 0,388 ± 0,043 0,387 ± 0,065 1,117 ± 0,059 1,065 ±
0,188

Примітка. В цій та в табл. 3 * p<0,05 у порівнянні з контролем. Таблиця 3 Вплив протиепілептичних препаратів депакіну, фенобарбіталу, карбамазепіну, ламотриджину, топірамату, фелбамату на вміст нейромедіаторів серотоніну та триптофану в мозку щурів (M ± m, n=6) Препарат Вміст серотоніну, нг/мг Вміст триптофану, нг/мг Права півкуля Ліва півкуля Права півкуля Ліва півкуля Контроль 0,358 ± 0,029 0,386 ± 0,023 4,016 ± 0,334 4,011 ± 0,410 Депакін, 150 мг/кг 0,739 ± 0,083 * 0,492 ± 0,043 5,572 ± 0,520 4,520 ± 0,284 Фенобарбітал, 40 мг/кг 0,476 ± 0,021 0,475 ± 0,044 6,136 ± 0,310 * 6,187 ± 0,368 * Карбамазепін, 200 мг/кг 0,489 ± 0,070 0,456 ± 0,063 5,282 ± 1,079 4,848 ± 0,669 Ламотриджин, 20 мг/кг 0,495 ± 0,104 0,433 ± 0,062 4,595 ± 0,351 3,988 ± 0,482 Топірамат, 300 мг/кг 0,741 ± 0,055 * 0,497 ± 0,066 5,647 ± 0,280 * 4,405 ± 0,612 Фелбамат 500 мг/кг 0,458 ± 0,047 0,442 ± 0,054 4,489 ± 0,470 4,307 ± 0,323 Отримані дані (табл. 2 - 3) свідчать про те, що найбільш активними щодо змін рівнів моноамінів мозку є фенобарбітал, депакін та топірамат. Так, фенобарбітал підвищував рівень норадреналіну і дофаміну в лівій півкулі та вірогідно підвищував рівень триптофану у лівій і правій півкулях, що є передумовою підсилення біосинтезу серотоніну. Депакін домінантно підвищував вміст дофаміну та серотоніну в правій півкулі.. Топірамат вірогідно підвищував рівень усіх досліджуваних моноамінів в правій півкулі мозку. Карбамазепін та ламотриджин проявляли домінантну дію щодо вмісту норадреналіну у правій півкулі. Фелбамат не приводив до статистично значимих змін рівнів досліджуваних моноамінів. Всі досліджувані прелати згладжували міжпівкульову асиметрію співвідношення НА/ДА. Встановлена виражена латералізація дії протиепілептичних препаратів на вміст моноамінів у мозку дає змогу цілеспрямовано корегувати порушення нейромедіаторного балансу в залежності від локалізації епілептичного вогнища в лівій або правій півкулі та індивідуального домінування півкуль за сенсорними і руховими показниками у хворих епілепсією. 3. Дослідження ефективності цілеспрямованої комбінації протисудомних засобів. У випадках рефрактерної епілепсії клініцисти звертаються до комбінованої терапії – призначають два, або три протисудомних засоби. Але підбір комбінації протисудомних препаратів в таких випадках здійснюється, переважно, клініко-емпіричним шляхом. Отримані результати дають підстави вважати, що у випадках рефрактерної епілепсії, найімовірніше, не відбувається збіг нейромедіаторного профілю патогенезу конкретної клінічної форми захворювання з нейромедіаторними профілями механізмів дії антиепілептичних засобів. Виходячи з цього, можна вважати, що експериментально обґрунтованими оптимальними комбінаціями протисудомних засобів будуть ті препарати, які взаємно поповнюють бракуючі нейромедіаторні профілі дії кожного з них. Аналіз отриманих результатів вказує, що такими комбінаціями можуть бути депакін з ламотриджином та карбамазепін з топіраматом. Вказані комбінації складаються з протиепілептичних препаратів першої лінії і протисудомних препаратів нового покоління. Це підтверджує і клінічна практика. Для дослідження протисудомної дії таких комбінацій були проведені судомні тести з використанням бікукуліну, коразолу, тіосемікарбазиду та стрихніну. Вказані препарати уводилися внутрішньошлунково в дозах у 2 рази менших (1/20 від ЛД50), ніж умовно-терапевтичні (тобто 1/10 від ЛД50). Така постановка дослідів щодо підбору доз була обумовлена необхідністю виявити можливість взаємопідсилюючої дії комбінацій депакін + ламотриджин і карбамазепін + топірамат. Було встановлено, що запропоновані комбінації мають сильну протисудомну дію в досліді з тіосемікарбазидом (табл. 4). Можна вважати, що ці комбінації будуть найбільш ефективними в тих випадках фармакотерапії епілепсії, де провідною ланкою патогенезу є порушення біосинтезу, метаболізму і функції ГАМК. Таблиця 4 Вплив комбінацій депакіну та ламотриджину, карбамазепіну та топірамату на судомну дію тіосемікарбазиду Препарат, дози (мг/кг) Кількість тварин з клонічними судомами Кількість тварин з тонічними судомами Летальність Загальна сума балів судомного синдрому Тіосемікарбазид (20) ¤ ¦ E b ? N R v ¦ e O $ O $ O l-0!o#?&1$a$ N P R v ¦ e O O O ae ae O ae ae lін (77) за 1 год. до тіосемікарбазиду (20) 6/6 6/6 6/6 4,0 Ламотриджин (15) за 1 год. до тіосемікарбазиду (20) 6/6 4/6 2/6 * 3,0 Депакін (77) + ламотриджин (15) за 1 год. до тіосемікарбазиду (20) 2/6 * 2/6 * 2/6 * 1,7 * Карбамазепін (63) за 1 год. до тіосемікарбазиду (20) 6/6 6/6 6/6 4,0 Топірамат (152) за 1 год. до тіосемікарбазиду (20) 3/6 2/6 * 0/6 * 1,7 * Карбамазепін (63) + топірамат (152) за 1 год. до тіосемікарбазиду (20) 0/6 * 0/6* 0/6 * 0 * Примітки: 1. # - у чисельнику – кількість тварин з фармакологічним ефектом тіосемікарбазиду, у знаменнику – кількість тварин у досліді. 2. * - p<0,05. 4. Квантовохімічне дослідження взаємодії протиепілептичних препаратів з ключовими амінокислотами ГАМКА рецептора. З наших дослідів виявлено, що всі досліджувані протиепілептичні препарати опосередкують свою дію через систему ГАМК. Тому є важливим дослідження взаємозв’язку між протиепілептичною дією препаратів, їх електроною будовою та енергетичними характеристиками їх взаємодії з “ключовими” амінокислотами ГАМКА рецептора. В роботі були встановлені ряди протисудомної активності досліджуваних препаратів на основі їх здатності зменшувати прояви судомних нападів, викликаних бікукуліном і коразолом: - з бікукуліном: Фелбамат ~ Фенобарбітал > Карбамазепін > Ламотриджин > Депакін ~
Топірамат;

— з коразолом:

Депакін > Фенобарбітал > Фелбамат > Карбамазепін > Топірамат >
Ламотриджин.

В табл. 5 приведені енергетичні характеристики граничних молекулярних
орбіталей ГАМК та досліджуваних протиепилептичних препаратів (ЕВЗМО –
енергія вищої заповненої молекулярної орбіталі та ЕНВМО – енергія нижчої
вільної молекулярної орбіталі), що відповідно характеризують
електронодонорні та електроноакцепторні властивості. Найкращі
електронодонорні властивості мають ламотриджин та карбамазепін, тоді як
електроноакцепторні – ламотриджин, топірамат та карбамазепін.

Аналіз рядів протисудомної активності препаратів та їх енергетичних
характеристик показав, що задовільного узгодження між цими
характеристиками не виявлено. Це дає підставу вважати, що
протиепілептичну активність препаратів не можна пояснити їх взаємодією з
молекулами антиконвульсантів. Вважаємо, що в таких системах протисудомна
дія препаратів обумовлена конкуренцією між препаратами і конвульсантами
за місця зв’язування з активними ділянками ГАМКА рецептора.

Таблиця 5

Квантовохімічні характеристики енергій молекул ГАМК, фенобарбіталу,
карбамазепіну, вальпроєвої кислоти, ламотриджину, фелбамату, топірамату.

Препарат ЕНВМО, еВ ЕВЗМО, еВ ЕНВМО — ЕВЗМО, еВ

ГАМК +0,97 -9,92 10,89

Фенобарбітал -0,19 -10,0 9,82

Карбамазепін -0,45 -8,60 8,14

Вальпроєва кислота * +1,11 -11,2 12,31

Ламотриджин -0,58 -8,32 7,73

Фелбамат 0,15 -9,8 9,89

Топірамат -0,38 -10,6 10,22

Примітка. * — для квантовохімічного розрахунку взяли молекулу
вальпроєвої кислоти, оскільки саме ця молекула є активним інгредієнтом
депакіну.

Згідно літературних даних (D.A.Wagner, C. Czajkowski, 2001, A.K. Mehta,
M.K. Ticku, 1999), ключовими амінокислотними послідовностями ГАМКА
рецептору є: Ser156-Tyr157-Gly158-Tyr159-Thr160-Thr161 (І) і
Thr201-Thr202-Gly203-Ala204-Tyr205-Pro206 (ІІ) ?2 субодиниці,
Val64-Phe65-Phe66-Arg67 (ІІІ), Thr255-Val256-Phe257 (ІV) і
Val262-Leu263-Thr264 (V) ?1 субодиниці, які згідно даних
цілеспрямованого мутагенезу відіграють важливу роль у провідності
каналів хлору ГАМКА рецептора.

Для визначення активних ділянок послідовностей (I-V) нами розраховані
локальні (за амінокислотами) функції густини стану (атоми С, N, O) у
кожній з амінокислот цих послідовностей. Встановлено, що кращими як
електронодонорними, так і електроноакцепторними властивостями в
амінокислотних послідовностях володіють: у (І) — Tyr157 і Tyr159; у (ІІ)
— Tyr205; у (ІІІ) — Phe65 і Phe66; у (ІV) — Phe257; у (V) — Thr264.
Одержані дані збігаються з експериментальними результатами
цілеспрямованого мутагенезу (D.A.Wagner, C. Czajkowski, 2001, A.K.
Mehta, M.K. Ticku, 1999), які свідчать, що участь саме цих амінокислот є
визначальною у зв’язуванні ГАМК та регуляції провідності хлорних каналів
ГАМКА рецептора. Аналіз локальних за атомами функцій густини станів
показує, що найбільший вміст у електронодонорні та електроноакцепторні
властивості активних ділянок амінокислотних послідовностей (I-V)
вносять: у (I) і (II) атоми С і O, у (III) та (IV) атоми С; у (V)
атоми С, N і О.

В роботі була розрахована енергія взаємодії досліджуваних препаратів з
амінокислотними послідовностями I-V.

Нами встановлена лінійна залежність між енергією взаємодії (?Е)
препаратів, крім топірамату, з амінокислотною послідовністю ІІ та їх
активністю в дослідах з бікукуліном (табл.6).

?Е = -1,3 х F – 0,9; r = 0,974; n = 5.

n — кількість препаратів; r — коефіцієнт кореляції, F — критерій Фішера.

Таблиця 6

Квантовохімічні характеристики енергії взаємодії систем

“амінокислотна послідовність II + препарат, ГАМК”

ГАМК Фенобар-бітал Фелбамат Карбама-зепін Ламо-триджин Вальпроєва
кислота Топірамат

Thr201-Thr202-Gly203- Ala204-Tyr205-Pro206

?Е, ккал/моль — 19,31 — 14,91 — 14,63 — 9,21 — 3,23 — 2,24 -9,39

ЕВЗМО, еВ — 8,97 — 9,05 — 9,06 — 8,83 — 8,49 — 8,96 -8,44

ЕНСМО, еВ + 0,36 — 0,17 + 0,10 — 0,64 — 0,45 -0,36 -0,53

За даними літератури (D.A.Wagner, C. Czajkowski, 2001), саме
послідовність ІІ згадується як ділянка, відповідальна за зв’язування
ГАМК та її агоністів, і яка відіграє важливу роль у провідності іонів
Cl-.

Одержані результати можуть бути корисними для направленого пошуку
протиепілептичних препаратів з більш вираженими протисудомними
властивостями. Критерієм цього вибору може бути енергія взаємодії між
антиконвульсантами та структурними одиницями рецепторів
нейротрансмітерів, зокрема, з амінокислотною послідовністю
Thr201-Thr202-Gly203-Ala204-Tyr205-Pro206 ГАМКА рецептору.

ВИСНОВКИ

Отримані в роботі експериментальні дані щодо нейромедіаторного профілю
дії фенобарбіталу, карбамазепіну, депакіну, ламотриджину, топірамату та
фелбамату дають підстави для обґрунтованого індивідуального вибору
препаратів при лікуванні епілепсії, а також створення комбінацій
протиепілептичних препаратів на основі їх впливу на центральні
нейромедіаторні системи.

1. У механізмі дії фенобарбіталу приймають участь усі вивчені
нейромедіаторні системи, що, напевно, визначає його високу протисудомну
ефективність:

ГАМК- система – препарат знижує кількість тварин з тонічними судомами та
зменшує летальність на 57% у досліді з букукуліном, на 80% та 60%
зменшує відповідні показники у досліді з тіосемікарбазидом та попереджує
виникненню тонічних судом та летальності у досліді з коразолом (р<0,05); гліцинергічна система – у досліді зі стрихніном під впливом фенобарбіталу тонічні судоми та летальність зменшуються на 60%; глутаматергічна система – препарат зменшує летальність в 3 рази в досліді з каїновою кислотою; адренергічна система – повністю попереджує рухову гіперактивність та гіпертермію, викликану введенням сиднокарбу; серотонінергічна система – препарат повністю запобігає резерпіновій гіпотермії; холінергічна система – фенобарбітал попереджує розвиток судомного синдрому, викликаного нікотином (р<0,05). 2. У функціональному плані карбамазепін змінює активність ГАМК- і гліцинергічної систем (попереджаючи тонічні судоми і знижуючи летальність на 57% у досліді з бікукуліном, та знижуючи на 50% тонічні судоми і на 70% летальність у досліді зі стрихніном). 3. Депакін має властивості агоніста ГАМКА рецептора (попереджує тонічні судоми та летальність тварин при дії коразолу, р<0,05). Також препарат проявляє виражену антихолінестеразну дію (потенціює прояви, викликані езерином, р<0,05) та активізує гальмівну серотонінергічну систему (попереджує симптоми, викликані резерпіном). 4. Ламотриджин потенціює ГАМК та гліцинергічну системи (повністю попереджує тонічні судоми та знижує летальність на 60% в досліді з тіосемікарбазидом і на 60% знижує тонічні судоми та летальність у досліді зі стрихніном). Вплив препарату на дофамінергічну систему проявляється у збільшенні латентного періоду апоморфінової стереотипії у 2 рази та зменшенні тривалості стереотипії в 1,3 рази. 5. Фелбамат має виражений вплив на ГАМКергічну систему (попереджує тонічні судоми та летальність у досліді з бікукуліном (р<0,05), запобігає розвитку судомного синдрому в досліді з тіосемікарбазидом, попереджує розвиток тонічних судом (р<0,05) та на 50% знижує летальність у досліді з коразолом). Фелбамат попереджує рухову гіперактивність та гіпертермію, викликані введенням сиднокарбу (р<0,05). Препарат потенціює гальмівну дофамінергічну систему (знижує прояви каталепсії, викликані галоперидолом та потенціює стереотипію, викликану апоморфіном (р<0,05)). Також препарат знижує активність адренергічної системи, попереджуючи розвиток тонічних судом та летальності, викликаних нікотином (р<0,05). 6. Для топірамату характерне потенціювання ГАМКергічної системи (повністю запобігає розвитку судомного синдрому, викликаного тіосемікарбазидом). Топірамат потенціює антихолінестеразну активність, викликаючи гіперсалівацію у 80% тварин, та летальність у 50% тварин при введенні езерину. Також препарат має вплив на адренергічну систему (попереджує розвиток гіпертермії, викликаної введенням сиднокарбу, р<0,05). 7. Виявлена домінантність дії досліджуваних протисудомних засобів на вміст моноамінів в тканинах лівої та правої півкуль головного мозку. Карбамазепін та ламотриджин підвищують рівень норадреналіну у правій півкулі в 1,9 рази, топірамат – у 1,7 рази. Фенобарбітал підвищує рівень норадреналіну в лівій півкулі в 1,5 рази. Рівень дофаміну підвищується в правій півкулі під впливом депакіну у 1,4 рази, топірамату – у 1,5 рази, а в лівій – при дії фенобарбіталу (у 1,9 рази). Рівень серотоніну підвищується в правій півкулі під впливом депакіну та топірамату у 2,1 рази. Рівень триптофану збільшується в 1,5 рази під впливом фенобарбіталу у правій та лівій півкулях. Топірамат підвищує рівень триптофану у 1,4 рази у правій півкулі. 8. Встановлена міжпівкульова асиметрія співвідношення вмісту норадреналін / дофамін (права півкуля 1/4, ліва – 1/2). Виявлено, що всі досліджувані протиепілептичні препарати згладжують міжпівкульову асиметрію співвідношення норадреналін / дофамін. 9. Обґрунтовано оптимальні комбінації антиепілептичних препаратів, а саме – депакін з ламотриджином та карбамазепін з топіраматом. Показано, що ці комбінації є найбільш ефективними у випадках, коли судомний синдром розвивається на фоні порушення метаболізму ГАМК. 10. Встановлено, що найбільш активні електронодонорні та електроноакцепторні ділянки амінокислотних послідовностей субодиниць ГАМКА рецепторів при їх взаємодії з дослідженими антиконвульсантами є Phe65, Phe66, Tyr157, Tyr159, Tyr205, Phe257, Thr264. Одержані результати підтверджують літературні дані цілеспрямованого мутагенезу щодо активності цих амінокислотних субодиниць у регуляції провідності каналів іонів хлору ГАМКА рецепторів. 11. На підставі вивчення протисудомної дії фенобарбіталу, карбамазепіну, депакіну, ламотриджину та фелбамату у дослідах з бікукуліном та розрахунку квантовохімічним методом енергетичних характеристик взаємодії цих препаратів з амінокислотною послідовністю Thr201-Thr202-Gly203-Ala204-Tyr205-Pro206 ГАМКА рецептора, встановлена лінійна залежність між антисудомною активністю цих препаратів та їх енергією взаємодії ?Е з вказаною послідовністю, що дозволяє вести направлений пошук протисудомних засобів з більш вираженою антиконвульсантною активністю. СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ АВТОРОМ ПРАЦЬ Євтушенко О.О. Нейромедіаторні механізми дії деяких протисудомних засобів // Ліки. – 2003. - №5-6. – С. 74-78. Євтушенко О.О. Нейромедіаторний профіль дії протисудомних препаратів нового покоління Ламотриджину, Топірамату, Фелбамату // Клінічна фармація. – 2004. – Т.8, №2. – С. 47-50. Євтушенко О.О. Особливості взаємодії протиепілептичних препаратів з амінокислотною послідовністю Thr201 -Thr202 - Gly203 - Ala204 - Tyr205 - Pro206 ГАМКА рецептора // Ліки. – 2004. - №3-4. – С. 94-97. Євтушенко О.О. Асиметрична міжпівкульна дія протиепілептичних засобів на вміст моноамінів головного мозку // Журн. Акад. мед. наук України. – 2004. – Т.10, №3. – С.563-568. Громов Л.А., Евтушенко О.А., Куць В.С. Антиконвульсантная активность противоэпилептических препаратов и квантовохимическое моделирование их взаимодействия с рецептором ГАМКА // Укр. біохім. журнал. – 2004. – Т.76, №6. – С. 117-121. (Особистий внесок здобувача: проведення експериментів та комп’ютерних кванотовохімічних розрахунків, участь в аналізі та узагальненні отриманих даних). Євтушенко О.О. Нейромедіаторні механізми протисудомної дії антиепілептичених засобів нового покоління (Топірамат, Фелбамат, Ламотриджин) // Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія: Тез. доп. – Харків, 2003. – Т. 2. - С.74. Євтушенко О.О. Особенности взаимодействия противоэпилептических препаратов с “ключевыми” аминокислотами ГАМКA рецептора // Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины: Материалы 5 молодеж. науч. конф. СО РАМН – Новосибирск, 2004. - С. 66-67. Olga Yevtushenko, Leonid Gromov, Vladimyr Kouts. Quantum pharmacologic study of antiepileptic drugs and chemoconvulsants interaction with “key” amino acids of GABAA receptor // Journal of Psychopharmacology. – 2004. - Vol.18, №3, - P.A18. Євтушенко О.О. Вплив протиепілептичних препаратів на вміст серотоніну, дофаміну, триптофану, норадреналіну в мозку щурів // Вчені майбутнього: Тез. доп. – Одеса, 2004. – С. 31. АНОТАЦІЯ Євтушенко О.О. Фармакологічний аналіз центральних нейромедіаторних механізмів дії протисудомних препаратів. – Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.05 – фармакологія. – Інститут фармакології та токсикології АМН України, Київ, 2005. В роботі теоретично обґрунтовується можливість індивідуального підбору протиепілептичних препаратів з урахуванням їх нейромедіаторного профілю дії. Встановлений індивідуальний профіль нейромедіаторної дії протиепілептичних препаратів першої лінії (фенобарбітал, карбамазепін, депакін) та нового покоління (ламотриджин, топірамат, фелбамат) на функціонування центральних нейромедіаторних систем. Показано, що по відношенню до моноамінів мозку, всі досліджувані протиепілептичні препарати, окрім фенобарбіталу, мають домінантний вплив на праву гемісферу. При цьому всі препарати згладжують міжпівкульову асиметрію співвідношення вмісту норадреналін / дофамін. На основі аналізу нейромедіаторних профілів дії досліджуваних протисудомних засобів обгрунтовані найбільш оптимальні комбінації антиепілептичних препаратів – депакін з ламотриджином та карбамазепін з топіраматом. Показано, що ці комбінації є найбільш ефективними у випадках, коли судомний синдром розвивається на фоні порушення метаболізму гамма-аміномасляної кислоти. Методом квантової хімії виявлений зв’язок між антиконвульсантною активністю фенобарбіталу, карбамазепіну, депакіну, ламотриджину, фелбамату та енергетичними характеристиками взаємодії цих препаратів з амінокислотною послідовністю Thr201-Thr202-Gly203-Ala204-Tyr205-Pro206 ГАМКА рецептора. Ключові слова: протиепілептичні препарати, нейромедіатори, міжпівкульова асиметрія, комбінована терапія, ГАМКА рецептор, квантовохімічний аналіз. АННОТАЦИЯ Евтушенко О.А. Фармакологический анализ центральных нейромедиаторных механизмов действия противосудорожных препаратов. – Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.05 – фармакология. – Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, Киев, 2005. Диссертация посвящена актуальной в современной медицинской науке проблеме механизма действия противосудорожных средств, теоретическому обоснованию возможностей индивидуального подбора противосудорожных препаратов на основании их нейромедиаторного профиля действия. Согласно современным представлениям, в основе возникновения судорожного синдрома лежат нарушения процессов возбуждения и торможения нейронов, которые, в свою очередь, возникают в результате изменений баланса нейромедиаторных систем. Целенаправленное влияние на нарушенные звенья нейромедиаторных систем является важной задачей при лечении эпилепсии. Цель работы заключалась в исследовании нейромедиаторного профиля действия противоэпилептических препаратов первой линии (фенобарбитал, депакин, карбамазепин) и нового поколения (ламотриджин, топирамат, фелбамат) для оптимизации их индивидуального подбора при лечении эпилепсии. Для выполнения поставленных задач были применены фармакологические, нейрохимические и квантовохимические методы исследования. Работа выполнена на 260 нелинейных белых крысах и 680 белых мышах. С использованием анализаторов функционирования нейромедиаторных систем было изучено влияние исследуемых препаратов на функционирование ГАМК-, глицин-, глутамат-, адрен-, дофамин-, серотонин-, холинергической нейромедиаторных систем. Выявлено, что все антиконвульсанты имеют полифункциональный механизм нейромедиаторного действия. При этом наиболее широкий нейромедиаторный профиль действия выявлен у фенобарбитала. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии установлено доминантное действие исследуемых противосудорожных средств на содержание моноаминов в тканях левого и правого полушарий мозга. Показано, что карбамазепин и ламотриджин повышают уровень норадреналина в правом полушарии в 1,9 раза, топирамат – в 1,7 раза, а фенобарбитал – в левом – в 1,5 раза. Содержание дофамина увеличивается в правом полушарии под действием депакина в 1,4 раза, топирамата – в 1,5 раза, а в левом – под действием фенобарбитала – в 1,9 раза. Уровень серотонина повышается в правом полушарии под влиянием депакина и топирамата – в 2,1 раза. Уровень триптофана повышается в 1,5 раза под влиянием фенобарбитала в правом и левом полушариях мозга. Топирамат повышает уровень триптофана в 1,4 раза в правом полушарии. Выявлена межполушарная асимметрия соотношения содержания норадреналин / дофамин (правое полушарие 1/4, левое – 1/2 ). Все исследуемые противоэпилептические препараты сглаживали межполушарную асимметрию соотношения норадреналин/дофамин. На основе анализа нейромедиаторных профилей действия исследуемых препаратов обоснованы наиболее оптимальные комбинации – депакин с ламотриджином и карбамазепин с топираматом. Показано, что эти комбинации наиболее эффективны в случаях, когда возникновение судорожного синдрома происходит в результате нарушения метаболизма гамма-аминомасляной кислоты (при введении тиосемикарбазида комбинация карбамазепин и топирамат полностью предотвращала развитие судорожного синдрома, а комбинация депакин с ламотриджином снижала развитие судорог и летальности на 67%). Методом квантовой химии (программный пакет HyperChem7, полуэмпирическим метод самосогласованного поля АМ1) выявлены наиболее активные участки ключевых аминокислотных последовательностей ГАМКА рецептора. Обнаружена корреляция между противосудорожной активностью указанных препаратов в эксперименте in vivo с бикукуллином и энергией взаимодействия системы противоэпилептических препаратов с аминокислотной последовательностью Thr201-Thr202-Gly203- Ala204-Tyr205-Pro206. Уравнение выявленной зависимости имеет следующий вид: ?Е = -1,3 ? F – 0,9, при этом n=5, r=0,974, где n – количество препаратов, r – коэффициент корреляции, F – критерий Фишера. Полученные результаты могут быть использованы для направленного поиска противоэпилептических препаратов с более выраженными антиконвульсантными свойствами. Критерием выбора при этом может служить энергия взаимодействия между антиконвульсантами и структурными единицами рецептора ГАМКА, в частности, с аминокислотной последовательностью Thr201-Thr202-Gly203-Ala204-Tyr205-Pro206. Ключевые слова: противоэпилептические препараты, нейромедиаторы, межполушарная асимметрия, комбинированная терапия, ГАМКА рецептор, квантовохимический анализ. SUMMARY Yevtushenko O.O. Pharmacological analysis of the central neurotransmitter mechanisms of the antiepileptic drugs’ action. – Manuscript. The dissertation is submitted to a scientific degree for a candidate of medical sciences in speciality 14.03.05 – pharmacology. – Institute of pharmacology and toxicology AMS of Ukraine, Kyiv, 2005. In the dissertation the possibility of the individual approach in the antiepileptic drugs prescribing dependently on the neurotransmitters’ profile of their action is grounded. The individual neurotransmitter profile of phenobarbital’s, carbamazepine’s, depakine’s, lamotrigine’s, topiramate’s, felbamate’s action on the functioning of central neurotransmitter systems was found out. It was revealed that all antiepileptic drugs studied, besides phenobarbital, have dominated influence on the level of monoamines in the right hemisphere. All antiepileptic drugs examined smoothed over the ratio noradrenaline / dopamine. Taking into account neurotransmitter profiles of the mechanisms of the studied antiepileptic drugs’ actions, the optimum combinations – depakine and lamotrigine, carbamazepine and topiramate were grounded. These combinations appeared to be the most effective against seizures caused by GABA metabolism disturbances. With the use of quantum chemical method the correlation between antiseizure activity of phenobarbital, carbamazepine, depakine, lamotrigine, felbamate and the energy of the system’s interaction of these drugs with aminoacid residue Thr201-Thr202-Gly203- Ala204-Tyr205-Pro206 of GABAA receptor was found out. Key words: antiepileptic drugs, neurotransmitters, hemispheric asymmetry, combined drug therapy, receptor GABAA, quantum chemical analysis. PAGE \* Arabic 1

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *