.

Вплив температури та складу середовища на фетальний гемоглобін і гемоглобін донорської крові (автореферат)

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
134 2760
Скачать документ

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Тимченко Наталія Миколаївна

УДК 612.014.46.111.11:57.043

Вплив температури та складу середовища на фетальний гемоглобін і
гемоглобін донорської крові

03. 00. 19 – кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2004

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини

Національної академії наук України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Моісеєв Віктор
Олексійович,

Інститут проблем кріобіології і
кріомедицини Національної

академії наук України, головний
науковий співробітник

відділу кріобіофізики.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Жегунов Геннадій
Федорович,

Харківська державна зооветеринарна
академія Міністерства

аграрної політики України, завідувач
кафедри хімії і біохімії;

кандидат біологічних наук, доцент
Гаташ Сергій Васильович,

Харківський національний університет
МОН України,

доцент кафедри біологічної і
медичної фізики.

Провідна установа: Харківський державний медичний університет
Міністерства охорони

здоров’я України, кафедра біохімії,
м. Харків.

Захист відбудеться 22.06. 2004 р. о 15 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології
і кріомедицини НАН України, 61015, м. Харків 15, вул. Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІПКіК НАН України за

адресою: 61015, м. Харків 15, вул. Переяславська, 23.

Автореферат розісланий 21.05. 2004 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

Член-кореспондент НАН України
Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Результати кріобіологічних досліджень мають
величезне значення для практичного застосування в різних галузях
народного господарства. Дані експериментів в області кріобіології
дозволили визначити, зокрема, роль білків в кріопошкодженні біологічних
систем різного рівня організації. Тепер ще залишаються актуальними
питання консервації клітин кордової крові – еритроцитів. Основним білком
еритроцитів є гемоглобін. Широке застосування методів
низькотемпературного зберігання біологічних об’єктів потребує більш
глибокого вивчення механізмів впливу факторів низькотемпературного
консервування на молекулярному рівні.

Будова молекули гемоглобіну змінюється у процесі онтогенеза, але,
незалежно від типу і періоду синтезу, більшість молекул гемоглобіну
мають по два однакових поліпептидних ланцюга. Ембріональні гемоглобіни
присутні на протязі перших двох місяців гестації. В останній
ембріональний період життя після двох місяців гестації відбувається
переважно синтез (-ланцюгів, внаслідок чого переважає фетальний
гемоглобін (гемоглобін F) (Карлсон Б., 1983). Структурно-функціональні
особливості фетального гемоглобіну не так широко вивчені, як гемоглобіну
А. Особливістю фетального гемоглобіну є те, що він в порівнянні з
гемоглобіном А в фізіологічних умовах володіє підвищеною спорідненістю
до кисню. Успішні результати застосування фетальних еритроцитів і
розчинів фетального гемоглобіну завдяки вираженому антигипоксичному
ефекту в експериментальних дослідженнях (Антоненко В.Т., 1979, 1980)
обумовили необхідність тривалого зберігання гемоглобінів кордової крові.

Раніше досліджувалось пошкодження білків при заморожуванні (Білоус А.М.,
Луговий В.І., Лемешко В.В., 1976) і в теперішній час ця тема залишається
актульною (Koseki T., 1990; Anchordoquy T.J., Carpenter J.F., 1996; Cao
E., Foster P.R., 2003). Також були досліджені механізми кріопошкоджень
білків, які мають четвертичну структуру. Визначено, що в результаті
заморожування-відтавання відбувається дисоціація молекул білків і
подальша рекомбінація. Гіперконцентрація електролітів, яка виникає у
розчині при виморожуванні води, є основною причиною структурної
перебудови молекули. При заморожуванні діє пошкоджуючий білки фактор –
дегидратація поліпептидних ланцюгів, порушується конформаційний стан
білка, зростає ступінь міжмолекулярних контактів, при цьому створюються
умови для швидкого окислення SH-груп і створення S-S зв’язків, внаслідок
чого втрачаються специфічні властивості білка. При застосуванні
кріопротекторів можна запобігти процесу утрати властивостей
біомакромолекул при охолодженні. Разом з тим не вивчені механізми
пошкодження фетального гемоглобіну при заморожуванні-відтаванні. Саме
тому дослідження структурно-функціональних властивостей фетального
гемоглобіну при впливі пошкоджуючих факторів в процесі
заморожування–відтавання, при взаємодії його з кріопротекторами,
являються на даний час актуальними. Значимість невирішених проблем
обумовила вибір теми, її актуальність й цільову спрямованість
дисертаційного дослідження.

Зв‘язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
у відділі кріобіофізики в рамках планових тем НДР ІПКіК НАН України: №
69 “Дослідження впливу температури на структурний стан мембрани і
цитозолю, а також на проникненість для електролітів і неелектролітів
еритроцитів людини на різних стадіях розвитку і при деяких патологіях”,
шифр – 2.2.6.69, № держреєстрації 0201U005152; № 99 “Дослідження впливу
низьких температур і складу середовища на деякі елементи
фетоплацентарного комплексу людини (клітини і плазма кордової крові,
тканини плаценти та їх екстракти)”, шифр – 2.2.6.99, № держреєстраії
0100U003482.

Мета і задачі дослідження. Мета дослідження – визначити, як впливає
заморожування–відтавання і склад середовища на конформаційний і
функціональний стан гемоглобінів А і F людини.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі задачі:

Провести вивчення впливу заморожування–відтавання на конформаційний стан
гемоглобінів A і F.

Дослідити вплив заморожування-відтавання на функціональний стан
гемоглобінів А і F.

Визначити характер впливу розчинів NaCl і KCl концентраціями 0,5-3,5М на
конформаційний стан фетального гемоглобіну.

З‘ясувати, чи впливають кріопротектори гліцерин і 1,2-пропандіол в
області концентрацій 10-40% на конформацію гемоглобіну А і фетального
гемоглобіну при заморожуванні-відтаванні.

Об‘єкт дослідження. Конформаційний і функціональний стан гемоглобінів А
і F людини.

Предмет дослідження. Структурно-функціональні зміни гемоглобінів A і F,
викликані заморожуванням–відтаванням та впливом на них складу середовища
(сольових розчинів і кріопротекторів).

Методи дослідження. Методами ультрафіолетової диференціальної
спектрофотометрії, гель-хроматографії, сольвентно-пертурбаційної
диференціальної спектрофотометрії, температурно-пертурбаційної
диференціальної спектрофотометрії в діапазоні температур +10(+380С
досліджувався конформаційний стан гемоглобіну A і фетального
гемоглобіну. Ультрафіолетовою диференціальною спектрофотометрією
вивчався характер впливу заморожування-відтавання і складу розчинника,
методом гель-хроматографії досліджувався вплив складу розчинника,
сольвентно-пертурбаційною диференціальною спектрофотометрією вивчався
вплив заморожування–відтавання і кріопротекторів на конформаційний стан
гемоглобіну А і фетального гемоглобіну. Температурно-пертурбаційною
диференціальною спектрофотометрією в діапазоні температур +10(+380С
досліджувався конформаційний стан гемоглобіну A і фетального гемоглобіну
до і після заморожування–відтавання. Диференціальною скануючою
калориметрією визначали температури денатурації білків.
Спектрофотометрією вивчали зв’язування гемоглобінами А і F органічного
барвника бромтимолового синього. Спектрофотометрично кількісно визначали
наявність окси-, дезокси- і метформ гемоглобінів А і F.

Наукова новизна одержаних результатів полягає в тому, що вперше
експериментально встановлено, що після заморожування–відтавання
спостерігається збільшення вмісту метгемоглобінів у розчинах
гемоглобінів A і F. Показано, що для молекули фетального гемоглобіну
розпад на дімери відбувається при менших концентраціях натрію хлориду і
калію хлориду, ніж для гемоглобіну А. Визначено, що фетальний гемоглобін
функціонально менш стійкий, ніж гемоглобін А, до дії розчинів натрію
хлориду і калію хлориду концентраціями 0,5-3,5М і подальшого
заморожування–відтавання в присутності цих концентрацій солей. Вперше
встановлено, що 1,2-пропандіол змінює конформацію фетального гемоглобіну
після заморожування-відтавання, тоді як у випадку гемоглобіну А такого
впливу не виявлено. Показано, що фетальний гемоглобін менше агрегує в
присутності поліетиленгліколя-1500 в порівнянні з гемоглобіном А.
Визначені числові значення параметрів зв’язування фетальним гемоглобіном
органічного барвника бромтимолового синього, які вказують на те, що у
фетального гемоглобіну в порівнянні з гемоглобіном А менше доступних
гідрофобних областей на поверхні молекули.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані в роботі дані будуть
використані при вивченні механізму дії заморожування–відтавання на
конформаційний і функціональний стан гемоглобіну F. Вони також можуть
враховуватися при розробці методів збереження розчинів гемоглобінів
кордової крові, скоректованих з врахуванням особливостей фетального
гемоглобіну в тому, що його стійкість до дії пошкоджуючих факторів при
заморожуванні-відтаванні менше, ніж у гемоглобіну А.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно проаналізував дані
літератури за темою дослідження. Автором разом з науковим керівником
були визначені мета та завдання роботи, сформульовані остаточні
висновки. Автором особисто одержані результати експериментальних
досліджень та проведено їх статистичну обробку, зроблено попередні
висновки. В статтях, опублікованих спільно з Розановою К.Д. та іншими
співавторами, були використані результати, самостійно отримані
здобувачем. У роботі, опублікованій сумісно з Онищенко О.В., автор
готував зразки для експериментів, обробляв та аналізував одержані
результати.

Апробація результатів дисертації. Основні матеріали дисертаційної роботи
доповідались і обговорювались на конференції молодих вчених ІПКіК НАН
України (м. Харків, 2001); Всеукраїнській науковій конференції “Успіхи і
перспективи розвитку кріобіології і кріомедицини” (м. Харків, 2001); V
з’їзді білоруського суспільного об’єднання фотобіологів і біофізиків
„Молекулярні, мембранні і клітинні основи функціонування біосистем (м.
Мінськ, 2002); 14-й зустрічі European Association for Red Cell Research
(м. Роскофф, Франція, 2003).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті в провідних
фахових наукових журналах і 4 тез доповідей на міжнародних і
національних наукових конференціях.

Обсяг і структура дисертації. Матеріали викладені на 114 сторінках
друкованого тексту і містять: введення, огляд літератури (1 розділ),
матеріали, методи і методика досліджень (2 розділ), результати
досліджень і їх обговорення (3-6 розділ), заключення, висновки.
Матеріали дисертації проілюстровані 30 рисунками й 7 таблицями. Список
літератури складається з 136 джерел і викладений на 15 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження

Дослідження проводились в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини
НАН України. Використовували оксигемоглобін А людини (НbА), виділений з
свіжої донорської крові і очищений методом гель-хроматографії; фетальний
гемоглобін (HbF), виділений з кордової крові за допомогою денатурації
гемоглобіну А і осадження його сульфатом амонію, і очищення методом
гель-хроматографії. Метгемоглобіни А і F одержували шляхом окислення
оксигемоглобінів А і F надміром 1М ферецианіду калію і очищення
одержаних розчинів на хроматографічній колонці.

30*10-6М.

Сольвентно-пертурбаційна диференціальна спектрофотометрія в
ультрафіолетовій області застосовувалась для дослідження конформаційного
стану молекул гемоглобіну А і фетального гемоглобіну при взаємодії цих
білків з розчинами кріопротекторів.

Температурно-пертурбаційною диференціальною спектрофотометрією в
ультрафіолетовій області оцінювали конформацію білків при дослідженні
впливу температури в інтервалі +10(+38(С на фетальний гемоглобін і
гемоглобін А до і після заморожування-відтавання.

Метод гель-хроматографії застосовувався для оцінки агрегатного стану
білків в розчинах солей концентраціями 0,5-3,5М. Для характеристики
конформаційного стану білка використовували перші похідні спектрів
поглинання гемоглобінів А і F в ультрафіолетовій області.
Спектрофотометрично кількісно визначали вміст окси-, дезокси- і метформ
гемоглобінів А і F.

Диференціальною скануючою калориметрією визначали температуру
денатурації білків за величиною температури у максимумі термограм, що
реєструються. Кінетичні залежності процесів зв’язування окси- і
метгемоглобінів А і F з ліпосомами одержували, реєструючи зміну оптичної
щільності білок-ліпідних сумішів у максимумі смуги Соре. Результати
експериментів оброблені статистично з врахуванням коефіцієнтів Стьюдента
для n(5 при довірливій імовірності Р=0,95.

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив заморожування–відтавання на розчини гемоглобіну A і фетального
гемоглобіну. Вивчення вмісту різних форм гемоглобіну у розчинах білків
показали, що після заморожування–відтавання спостерігається збільшення
вмісту метгемоглобіну. Одержані результати свідчать про те, що в процесі
заморожування–відтавання утворюються умови, які сприяють окисленню
заліза в білках. Оскільки в розчині присутній тільки NaCl, можливо, такі
умови утворюються при концентруванні солі в процесі вимерзання води.
Проведені дослідження в розчинах NaCl концентраціями 0,5-3,5М
підтверджують наші припущення.

Заморожування–відтавання розчинів гемоглобіну А і фетального гемоглобіну
приводить до конформаційних змін в молекулах цих білків. Після
заморожування-відтавання білків відбувається зміщення максимуму спектра
поглинання розчинів гемоглобіну А і фетального гемоглобіну в
короткохвильову область. Це свідчить про збільшення доступності
розчиннику поглинаючих хромофорів, в даному випадку, тирозинових
амінокислотних залишків, так як зміни в формі першої похідної спектрів
поглинання (ІПСП) відбуваються в області 277 нм, яка відповідає
поглинанню тирозинових амінокислотних залишків, що розташовуються в
полярних областях. Таким чином, заморожування-відтавання розчинів
гемоглобіну А і фетального гемоглобіну приводить до конформаційних змін,
які торкаються переважно полярних областей білкових глобул.

Досліджено вплив температури в діапазоні +100С(+380С на гемоглобін А і
фетальний гемоглобін до і після заморожування-відтавання. При цьому
використовували методи температурно-пертурбаційної спектрофотометрії і
аналізу ІПСП. Залежність інтенсивності в максимумі
температурно-пертурбаційних диференціальних спектрів при 286 нм
(температура порівняння +100С), пронормованої на інтенсивність спектра
поглинання при +100С, від температури для розчинів гемоглобіну А і
фетального гемоглобіну має S-образний вид. На цій залежності для
гемоглобіну А існують злами: перший в області температур +250С(+270С і
другий в області температур +330С(+350С. Для фетального гемоглобіну
подібні злами спостерігаються при менших температурах: перший в області
температур +200С(+230С, другий в області температур +270С(+300С. Ця
S-образна залежність, можливо, зв’язана з наявністю конформаційних змін
в молекулі гемоглобіну А в області температур +250С(+350С, а фетального
гемоглобіну – в області температур +200С(+300С. Для розчинів гемоглобіну
А при +100С і +180С структури ІПСП схожі між собою, а при +100С і +360С
– відрізняються. Також для розчинів фетального гемоглобіну при +100С і
+180С структури ІПСП схожі між собою, а при +100С і +360С –
відрізяються. Це свідчить про те, що молекули гемоглобінів А і F мають
різний конформаційний стан при +100С і +360С. При дослідженні впливу
температур в області +100С(+380С на конформаційний стан гемоглобінів А
і F виявлено, що після заморожування-відтавання розчинів цих білків
відбувається згладжування зламів на залежностях інтенсивності в
максимумі температурно-пертурбаційних диференціальних спектрів при 286
нм (температура порівняння +100С), пронормованої на інтенсивність
спектра поглинання при +100С, від температури. Це свідчить про те, що
згладжуються, стають менше помітними за результатами експерименту
температурозалежні конформаційні зміни в білкових молекулах.

Методом диференціальної скануючої калориметрії була визначена
температура плавлення фетального гемоглобіну +620С. Це не суперечить
літературним даним про те, що HbF менш температуростійкий у порівнянні з
HbA.

Методом диференціальної скануючої калориметрії досліджено вплив
заморожування-відтавання на температуру денатурації гемоглобіну і за
максимумами термограм визначено, що температура денатурації HbF в
фізіологічному розчині зменшилась.

Таким чином, заморожування-відтавання розчину гемоглобіну F приводить
до невеликого зниження термостійкості і згладжування температурозалежних
конформаційних змін. Крім того, в процесі заморожування гемоглобіну А і
фетального гемоглобіну утворюються умови, які сприяють окисленню заліза
в гемоглобіні, котрі, можливо, викликані концентрованим сольовим
розчином. Тому для подальшого розкриття цих механізмів нами було вивчено
питання з’ясування характеру впливу сольових розчинів на білки, що
вивчаються.

Вплив розчинів солей концентраціями 0,5-3,5М і заморожування–відтавання
на стан гемоглобінів А і F. Наведені результати експериментального
дослідження впливу розчинів натрію хлориду і калію хлориду
концентраціями 0,5-3,5М, заморожування–відтавання на конформаційний і
функціональний стан гемоглобінів А і F за допомогою методів
ультрафіолетової диференціальної спектрофотометрії, гель-хроматографії
та кількісного визначення окси-, дезокси- і метформ гемоглобінів.

За допомогою методу ультрафіолетової спектрофотометрії одержані ІПСП,
які характеризують конформаційний стан гемоглобінів А і F в
фізіологічному розчині і з різними концентраціями натрію хлориду. На
ІПСП гемоглобіну F максимум в області 277 нм (відповідний поглинанню
тирозинових залишків білків) є більш виражений в порівнянні з
гемоглобіном А. Це підтверджує відомий факт про більший вміст тирозину в
фетальному гемоглобіні в порівнянні з гемоглобіном А. Форми ІПСП HbA і
HbF, починаючи з 0,5М натрію хлориду, практично не змінюються до певних
концентрацій натрію хлориду, після яких в області 277 нм приймають інший
вигляд, теж в свою чергу незмінний при подальшому збільшенні
концентрації солі. Концентрації натрію хлориду, після яких відбуваються
зміни в формі ІПСП в області 277 нм для гемоглобіну А – 2(2,5М, для
гемоглобіну F – 1,5(2М натрію хлориду.

Методом ультрафіолетової диференціальної спектрофотометрії одержані
залежності (Е/Е від концентрації натрію хлориду в розчині для
гемоглобіну А і фетального гемоглобіну (рис. 1). Злам на цих залежностях
пов’язаний з розпадом тетрамерів гемоглобінів А і F на димери. Як видно
з рис. 1, дисоціація фетального гемоглобіну відбувається при більш
низьких концентраціях натрію хлориду.

Рис. 1. Залежність інтенсивності в максимумі диференціальних спектрів
при 277 нм гемоглобіну А і фетального гемоглобіну в присутності розчинів
NaCl концентраціями 0,5-3,5М (порівняння з поглинанням відповідного
білка в фізіологічному розчині), пронормованої на інтенсивність спектра
поглинання відповідного білка в фізіологічному розчині, від концентрації
NaCl.

Одержано розподіл гемоглобінів А і F за молекулярними масами в розчинах
з різною концентрацією натрію хлориду методом гель-хроматографії.
Встановлено, що положення максимумів на кривих фракціонування розчинів
як гемоглобіну А, так і гемоглобіну F в 1,5М натрію хлориду відповідає
одній і тій же фракції з молекулярною масою 64 кД. При фракціонуванні
розчинів гемоглобіну А і F в 1,9М натрію хлориду положення максимумів
для гемоглобіну А не змінюється, в той час як для гемоглобіну F
зсувається й відповідає фракції з молекулярною масою 36 кД (рис.2).

Рис. 2. Криві фракціонування розчинів гемоглобіну А і фетального
гемоглобіну в присутності 1,5M и 1,9M натрію хлориду. (Е577 –
інтенсивність спектра поглинання при 577 нм розчинів гемоглобінів).

Таким чином, можемо зробити висновки, що фетальний гемоглобін є менш
стійкий до дії розчинів натрію хлориду і калію хлориду концентраціями
0,5-3,5М, оскільки для нього відбуваються зміни конформації, а також
з‘являються фракції зі значно меншою молекулярною масою – при менших
концентраціях солі. Можливо, це пов’язано з відомим фактом меншого
вмісту двох реактивних SH-груп в фетальному гемоглобіні (в порівнянні з
гемоглобіном А), які підтримують четвертичну структуру цих білків.

ae

ae

P„H

?

ae

ae

?H

????????????$??

?????

?????

???

h? Відповідальний за випуск Г.О. Бабійчук Підписано до друку 6.05.2004. Формат 60х90/16. Тираж 100 прим. Ум. друк. арк. 0,9. Надруковано в ТОВ „Спайк”, м. Харків, вул. Сумська, 11 Тел.: 14-29-61 PAGE 17 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 (Е/Е HbA HbF концентрація NaCl, M 0 5 10 15 20 25 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 64 kD 1,5M NaCl HbA HbF E 577 номер фракції 0 5 10 15 20 25 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 64 kD 36 kD 1,9M NaCl HbA HbF E 577 номер фракції 0 10 20 30 40 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 2 1 ????/Е ? Концентрація 1,2-ПД, % 0 10 20 30 40 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 2 1 ????/Е ? Концентрацiя 1,2-ПД, %

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020