Вплив низьких температур на деякі біофізичні та біохімічні характеристики фолікулярної рідини яєчника людини (автореферат)

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

ЯКОВЛЕВА Олена Олександрівна

УДК 612.592.014.4:611.651.15

Вплив низьких температур на деякі біофізичні та біохімічні
характеристики фолікулярної рідини яєчника людини

14.01.35 ? КРІОМЕДИЦИНА

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Харків ? 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН
України

Науковий керівник: академік НАН України, доктор медичних наук,

професор, лауреат Державних премій СРСР та України

Грищенко Валентин Іванович,

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України,

директор ІПКіК НАН України, м. Харків.

Офіційні опоненти:

Доктор медичних наук, професор Лазуренко Вікторія Валентинівна,

Харківський державний медичний університет МОЗ України, професор

кафедри акушерства та гінекології №1.

Доктор біологічних наук, професор Гордіенко Євген Олександрович,
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач
відділу низькотемпературного консервування, м. Харків.

Провідна установа:

Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, кафедра
педіатрії,

акушерства та гінекології факультету фундаментальної медицини,

Міністерство освіти і науки України

Захист відбудеться „__20_”_лютого__2007 року о 13-30_ годині на
засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем
кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м. Харків,
вул. Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІПКіК НАН України за
адресою: 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23.

Автореферат розісланий „19___”_січня________ 2007р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук, професор,

член-кореспондент НАН України
Гольцев А.М.

Актуальність теми. Фолікулярна рідина (ФР) – біологічно активне
середовище, яке відіграє важливу роль у фізіологічних процесах
фолікулогенезу, овуляції, дозріванні ооциту і взаємодії гамет. Вона
містить білки і вуглеводи, гормони і ферменти, інгібітори і активатори
росту клітин, нестероїдні оваріальні чинники. Властивості ФР не є
сталими, а залежать від ступеня зрілості фолікула та складу плазми
крові, оскільки вона лише приблизно на 30 % складається з секретів
фолікулів, а на 70 % ? з ексудата плазми крові. Однак ФР яєчника людини
до недавна була мало доступна для вивчення та використання у
біотехнологіях. Останнім часом у зв’язку з розвитком методів допоміжних
репродуктивних технологій стало можливим отримання ФР в кількості,
достатній для проведення досліджень по впливу різних фізико-хімічних
факторів, у тому числі спрямованих на довготривале збереження цього
біологічного об’єкту при низьких температурах у здатному до відновлення
функціональної активності стані.

Відомо, що фізико-хімічні властивості і біохімічний склад ФР можуть
впливати на стимуляцію суперовуляції (W.M. Enien, С. P. Harris, 1995 р.
та інші). У літературі є незначна кількість наукових робіт, присвячених
вивченню впливу низьких температур на ФР яєчника людини. Так, С.Huyser
із співавторами (1993 р.) довели, що заморожування до температури -70°С
майже не впливає на досліджені ними 23 біохімічні та біофізичні
параметри, що характеризують стан і біологічну активність фолікулярної
рідини. Г.Г. Геродес із співавторами (1998 р.) встановили, що рівень
основних стероїдних гормонів, перекисне окислення ліпідів і активність
ферментів антиоксидантної системи в фолікулярній рідині людини після
заморожування по двохетапній програмі незначно змінюються у порівнянні з
нативними зразками. Проте розробка простого та ефективного способу
кріоконсервування фолікулярної рідини, виділеної з фолікулів різного
діаметру, з метою подальшого використання в рамках допоміжних
репродуктивних технологій і фармакології є актуальною задачею
кріобіології.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана
в рамках відомчої НДР ІПКіК НАН України «Вивчення особливостей дії
низьких температур і гіпотермії на гамети, ембріони, ембріональні
клітини в залежності від етапу гамето- та ембріогенезу, розробка
середовищ зберігання, кріоконсервації та репарації нелетальних
кріопошкоджень цих біооб?єктів”, № 2.2.6.96, № ДР 0101U003480.

Метою роботи було вивчити особливості впливу заморожування-відігрівання
на біофізичні, біохімічні та молекулярні параметри фолікулярної рідини
яєчника людини з фолікулів різного розміру. На основі отриманих
результатів досліджень запропонувати технологічно простий та ефективний
метод кріоконсервування, який поширить галузь застосування фолікулярної
рідини.

Для досягнення цієї мети були вирішені наступні задачі:

порівняти вплив швидкого занурення у рідкий азот та двохетапного режиму
охолодження до температури -196°С і зберігання при цій температурі на
рівень стероїдних гормонів у фолікулярній рідині людини;

дослідити вплив кріоконсервування на біофізичні і біохімічні показники
фолікулярної рідини людини, вилученої з фолікулів різного розміру;

вивчити стан прооксидантно-антиоксидантного балансу ФР після її
зберігання протягом одного року при температурі -196°С і подальшого
гіпотермічного зберігання у розмороженому стані при 4°С;

модифікувати середовище для виділення найрухомішої фракції сперміїв
людини для інсемінації сперми чоловіка або донора;

вивчити ефективність виділення активнорухливої фракції сперміїв з
еякуляту в середовищі, що містить різну концентрацію кріоконсервованої
ФР;

визначити біологічну активність ФР до і після кріоконсервування в
середовищі для культивування клітин ембріональних фібробластів, клітин
гранульози і кумулюсу.

Об’єкт дослідження. Кріоконсервування фолікулярної рідини яєчника
людини, виділеної з фолікулів різного розміру.

Предмет дослідження. Рідина, що міститься у фолікулах яєчника людини,
спермії людини, культура ембріональних фібробластів людини і клітини
кумулюсу і гранульози.

Методи дослідження: біохімічні (перекисне окислення ліпідів, вміст
реактивних карбонілів у білках, активність глутатіонпероксидази,
глутатіон-s-трансферазна активність, глутатіонредуктазна активність,
сумарна кількість білків за допомогою метода електрофореза та
вимірювання їх спектрів флуоресценції; концентрація гормонів;
імуноферментний аналіз цитокінів), біофізичні (рН-метрія, вимірювання
щільності ареометром, визначення осмотичного тиску рідини кріоскопічним
методом, вимірювання в’язкості капілярним методом, визначення
діелектричної проникності рідини методом діелектрометрії; аналіз фацій,
отриманих методом клиновидної дегідратації).

Наукова новизна отриманих результатів. Отримані вперше комплексні дані
щодо фізичних, біофізичних і біохімічних властивостей кріоконсервованої
ФР. Встановлено, що загальна кількість білка, статевих гормонів і
гормона росту (соматотропін) не змінюється після
заморожування-відігрівання і що вміст цих речовин в малих фолікулах
достовірно перевищує вміст в більш зрілих, великих фолікулах. Вперше
доведено, що кріоконсервування з використанням швидкого охолодження не
впливає на значення рН ФР, але приводить до достовірного збільшення
(приблизно на 40%) її в’язкості незалежно від розмірів фолікулів, з яких
вона виділялася. Вперше проведено комплексне дослідження
структурно-функціональних характеристик ФР до і після кріоконсервування
і запропоновано технологічно простий і ефективний спосіб її
кріоконсервування, який забезпечує високе збереження біологічних
властивостей фолікулярної рідини протягом тривалого терміну зберігання.

Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень
спрямовані на розробку методів зберігання біологічних об?єктів при
низьких температурах, зокрема біологічно активних рідин організму
людини, відкривають нові перспективи в розвитку біології і медицини.
Отримані дані дозволили запропонувати одноетапний метод
кріоконсервування ФР, який є менш трудомістким, технологічно простим і
ефективним. Результати роботи можуть бути успішно використані в центрах
по лікуванню безпліддя в допоміжних репродуктивних технологіях при
додаванні кріоконсервованої ФР до складу середовищ інкубації сперміїв
для внутрішньоматкової інсемінації, екстракорпорального запліднення.
Крім того, запаси ФР в перспективі можуть використовуватись в
фармакологічній, біотехнологічній та лабораторній практиці як джерело
біологічно активних сполук.

Доведена доцільність застосування кріоконсервованої ФР у 10%-й
концентрації в середовищі виділення для підвищення кінетичних
властивостей сперміїв людини при азооспермії.

Вперше показано, що при зберіганні кріоконсервованої ФР при температурі
4°С протягом 12 год не відбувається достовірних змін рівня
вільнорадикального окислення ліпідів і білків, активності ферментів
антиоксидантного захисту. Кріоконсервована за запропонованим в
дисертаційній роботі способом ФР яєчника людини не втрачає біологічної
активності і може бути використана як ростовий чинник залежно від
ступеня зрілості фолікулів, у середовищі для культивування різних
клітин, зокрема ембріональних фібробластів, клітин кумулюсу та
гранульози, ооцитів та ембріонів.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійним дослідженням
здобувача. Автором разом з науковим керівником було визначено мету,
задачі роботи й способи їхнього рішення, виконано інтерпретацію
отриманих результатів і зроблено висновки. В опублікованих спільно із
співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:

у роботі [1] у виконанні експерименту, статистичній обробці даних щодо
впливу низькотемпературного консервування на стабільність вмісту
стероїдних гормонів, разом з співавтором інтерпретувала дані;

у роботі [2] у вивченні впливу нативної та кріоконсервованої
фолікулярної рідини на кінетичні властивості сперміїв людини;

у роботі [3] у проведенні кріоконсервування фолікулярної рідини та
подальшому зберіганні її у гіпотермічних умовах, визначенні показників
прооксидантно-антиоксидантного балансу в фолікулярній рідині;

у роботі [4] у проведенні кріоконсервування фолікулярної рідини,
вивченні та підборі способів виділення рухливої фракції сперміїв з
еякуляту людини;

у роботі [5] у вивченні деяких біофізичних параметрів фолікулярної
рідини яєчника людини до і після дії низьких температур.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідалися і
обговорювалися на щорічній конференції молодих вчених «Застосування
холоду в медицині і біології» в ІПКіК НАН України (Харків, 2004), І
з’їзді сексологів і андрологів України (Київ, 2004), Міжнародній
конференції “Актуальні проблеми і досягнення кріобіології і
кріомедицини” (Харків, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 робіт, в тому числі
3 статті у наукових фахових виданнях, 1 патент на корисну модель та 1
теза доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 151 сторінках
друкованого тексту, з яких 125 сторінок основного змісту. Дисертація
складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів
досліджень, результатів власних досліджень, аналізу і узагальнення
результатів досліджень, висновків і переліку використаної літератури
(269 джерел на 25 сторінках). Робота містить 28 рисунків і 13 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи досліджень

Фолікулярну рідину одержували у жінок, що проходили курс лікування з
приводу безплідності, при проведенні програми екстракорпорального
запліднення. Всі жінки знаходилися в репродуктивному віці (25-35 років),
не мали ендокринних порушень і були обстежені на відсутність
урогенітальної інфекції (СНІД, сифіліс, хламідіоз, уреаплазмоз,
гарднерельоз). Фолікули класифікували за розміром (малі – з діаметром
13-15 мм, великі – з діаметром 16-22 мм) і за морфологічною оцінкою
ооцит-кумулюсного комплексу. У деяких дослідженнях використовували
фолікулярну рідину, вилучену окремо з пулу малих або великих фолікулів.
Усього в роботі досліджено 200 зразків фолікулярної рідини.

Матеріали дисертаційної роботи розглядалися комітетом з біоетики ІПКіК
НАН України, виконані дослідження не суперечать етичним нормам і діючому
законодавству України.

Після виділення із фолікулів ооцитів ФР центрифугували при

1500 g протягом 15-20 хв з метою осадження клітин крові і кумулюсу.
Cупернатант в асептичних умовах фасували у стерильні пластикові
пробірки, а потім у термосі з льодом транспортували протягом 30-40 хв
для проведення лабораторних досліджень. Зразки ФР людини, що призначені
для інкубації сперміїв і культивування, були досліджені на наявність
патогенної мікрофлори.

Використовували два режими заморожування: швидке охолодження зі
швидкістю 300-400°С/хв, яке здійснювалося шляхом безпосереднього
занурення зразків у рідкий азот, і двохетапне охолодження, при якому
зразки витримували в парах рідкого азоту протягом 20 хв на відстані 15
см над дзеркалом азоту, а потім занурювали в рідкий азот. Зразки
фолікулярної рідини протягом одного року зберігали в сховищі
біопродуктів (ХБ-500) при температурі -196°С. Розморожування зразків ФР
здійснювали на водяній бані при температурі 37°С. При виконанні роботи
заморожено 324 ампули з ФР людини.

Стан прооксидантно-антиоксидантного балансу ФР людини визначали за
вмістом гідроперекису ліпідів методом Асакава в середовищі, що містить
0,2 М гліцинового буферу (рН 3,6?; 0,3 мМ FeCl3; 0,3 мМ іонолу).
Фарбування здійснювали 2-тіобарбітуровою кислотою. Кількість продуктів
реакції визначали методом вимірювання оптичної густини рідини в
діапазоні довжини хвиль 535-580 нм.

Визначення реактивних білкових карбонілів у ФР проводили за методом
Левіна у модифікації Міллера. Активність глутатіонпероксидази визначали
за окисленням NADPH у зв’язаній глутатіонредуктазній системі.
Глутатіонпероксидазну активність реєстрували при температурі 37°С за
допомогою двопроменевого спектрофотометра Specord UV VIS на довжині
хвилі 340 нм у середовищі, що містить 50 мМ калій-натрій фосфатного
буфера (рН 7,4), 1мМ ЕДТА, 0,15мМ NADPH, 1мМ GSH, 0,5 Е./мл дріжджової
глутатіонредуктази, 0,4мМ Н2О2 або 1,2 мМ гідроперекису кумолу.

Стан ферментативної системи антиоксидантного захисту оцінювали по зміні
активностей селензалежної і селеннезалежної глутатіонредуктази і
глутатіонтрансферази. Селензалежну глутатіонпероксидазну активність
визначали з субстратом Н2О2, а селеннезалежну – по різниці між загальною
глутатіонпероксидазною активністю (із субстратом гідроперекису кумолу) і
селензалежної активності. Глутатіон-s-трансферазну активність у ФР
людини визначали спектрофотометрично за утворенням продукту кон?югації у
середовищі, що містить 0,1 М калій-фосфатного буферу (рН 6,5), 5мМ GSH,
1 мМ ХДНБ, на довжині хвилі 340 нм. Глутатіонредуктазну активність
вимірювали за спадом вмісту NADPH у середовищі, яке містить 50 мМ
калій-фосфатного буферу (рН 7,4), 1мМ ЕДТА, 0,16 мМ NADPH, 1 мМ GSSG, за
допомогою спектрофотометра Specord UV VIS на довжині хвилі 340 нм при
температурі 37°С. Коефіцієнт мольної екстинкції приймали рівним 6,22·103
М-1см -1.

Розділення білків за молекулярною масою у 36 зразках ФР, які було
отримано з великих і малих фолікулів до і після низькотемпературного
консервування, здійснювали методом гель-хроматографії на колонці з
сефадексом G-200 (висота колонки 22 см, діаметр 2 см). Визначення
загального білка і концентрації білка в окремих фракціях визначали
спектрофотометричним методом. Фракційний склад білків у 12 зразках ФР
визначали за допомогою діагностичного набору для гель-електрофорезу,
який звичайно використовується для розділення білків сироватки крові і
денситометрії. Для електрофореза була використана система SE 2120 і
скануючий денситометр ДМ 2120 фірми SOLAR.

Спектри флуоресценції ФР реєстрували спектрофлуориметром Cary Eclipse
(“Varian”, Україна) з використанням флуоресцентного зонду КС 35
(синтезований в інституті “Монокристал”, Україна). Спектри збудження
зразків реєстрували при температурі 18-20°С в максимумі їх спектрів
флуоресценції (Остерман Л.А.,1984).

Рівень гормонів (естрадіол, прогестерон, тестостерон) у ФР досліджували
модифікованим методом твердофазного імуноферментного аналізу, який
використовують для визначення рівня гормонів у плазмі крові. Тест для
визначення гормону росту (GH) проводили за методом двохетапного
імуноферментного аналізу за допомогою набору GH EIA (“Хема-медика”,
Росія). Оптичну густину вимірювали на фотоелектричному імуноферментному
аналізаторі АІФ-М/340 (С.-Петербург, Росія) на довжині хвилі 450 нм.

Рівень інтерлейкину 1? (ІЛ-1?) і гранулоцит-колонієстимулюючого фактора
(Гр-КСФ) встановлювали за допомогою наборів ProCon IL-1? і ProCon G-GSF
(C.-Петербург, Росія), а рівень ?-фактора некрозу пухлини (?-ФНО) –
набору «альфа-ФНО-ИФА-БЕСТ» (Росія) твердофазним імуноферментним методом
з використанням автоматичної фотометрії для мікропланшетів
«STATFAX-2000» (Awareness Tecnol, USA) при довжині хвилі 450 нм.

Значення рН визначали при кімнатній температурі 18-20°С на цифровому
іонометрі «рН-301» (Німеччина) у 76 зразках ФР (у 2-х аліквотах) до та
після заморожування-відігрівання. Осмотичний тиск ФР визначали
кріоскопічним методом на осмометрі ОМКА-01 (Україна), густину зразків —
на ареометрі та пікнографі. У 18 зразках ФР з малих і великих фолікулів
після фільтрації через паперові фільтри (Д пор =5мкм) вимірювали
в?язкість за допомогою спеціального пристрою (О.Ф.Тодрін, 1998 р.) при
температурі 37±0,5?С до і після заморожування зразків.

Концентрацію і рухливість сперміїв визначали згідно з рекомендаціями
ВООЗ (2001 р.) за загальноприйнятою методикою в лічильній камері Makler
(Ізраїль) за допомогою оптичного мікроскопа PZO (Польща) при х240 або
х480. Рухлива фракція сперміїв виділялась з еякуляту методом
«спливання». Для досягнення більш високої біологічної повноцінності
сперміїв застосовували модифіковану нами методику. Еякулят змішували з
розчином Хенкса (РХ), що містить 10% нативної або кріоконсервованої ФР,
і центрифугували протягом 10 хв при 750 g. Супернатант видаляли, а на
осад обережно по стінці пробірки нашаровували 0,5-0,7 мл даного
середовища, потім зразки переносили на 40-50 хв у термостат при
температурі 37°С. Після цього знімали надосадкову рідину, яка містить
рухливі фракції сперміїв, для дослідження або проведення інсемінації.

Двадцяти пацієнткам, які проходили лікування безпліддя, була проведена
внутрішньоматкова інсемінація (ВМІ). Для стимуляції овуляції вводили
клостилбегід у дозі 50 — 150 мг (per os) з 5-у по 9-у добу
менструального циклу. На 10 добу здійснювали ультразвуковий моніторинг
яєчників для визначення величини і кількості визріваючих фолікулів. За
36-40 год до овуляції, коли діаметр фолікулів досягав 17-20 мм, вводили
людський хоріонічний гонадотропін або Profasi “Serono” (5000-10000 од).
Внутрішньоматкову інсемінацію проводили стерильним підключичним
катетером із зовнішнім діаметром 0,6-1,0 мм, проходячи крізь
цервікальний канал, а потім вводили суспензію із сперміями безпосередньо
в порожнину матки.

Моношарову культуру ембріональних фібробластів людини (ЕФЛ), отриманих з
мезенхімально-мезодермальної тканини ембріонів людини 7-9 тижнів
гестації, готували за загальноприйнятим методом (Д.Б. Голубев).
Інкубацію клітин проводили при температурі 37°С протягом 3-4 діб до
формування суцільного моношару. Потім із культурального флакона з
моношаром клітин ЕФЛ видаляли ростове середовище і додавали до нього
розчин Версена, який сприяв відкріпленню клітин від субстрату. Через
1–1,5 хв розчин Версена змінювали на розчин трипсину і вміщували в
термостат при температурі 37°С (для поліпшення ресуспендування клітин).
Ступінь дисоціації клітин контролювали під інвертованим мікроскопом
(х600). Трипсин видаляли через 5-10 хв, клітини змивали зі стінок
флакона РХ і переносили в центрифужні пробірки. Отриману таким чином
суспензію центрифугували 5 хв при 100g. Супернатант видаляли, а до осаду
додавали 1 мл РХ. Далі у камері Горяєва підраховували кількість клітин,
життєздатність яких визначали за допомогою суправітального фарбника –
трипанового синього. Концентрацію клітин РХ доводили до 450-500 тис в 1
мл. Потім суспензію клітин переносили в чашку Петрі і додавали ростове
середовище 199/ДМЕМ (1:1) (ДУП ІПВЕ ім. М.П. Чумакова РАМН), що містить
10% нативної або кріоконсервованої ФР, отриманої з преовуляторних
фолікулів. Контролем були клітини, культивовані в середовищі з
додаванням 10%-ї ембріональної телячої сироватки. Чашки Петрі поміщали в
СО2-інкубатор і культивували з 5% СО2 у повітрі при 37°С. Зростання
фібробластів в умовах культивування візуально контролювали щодня за
допомогою інвертованого мікроскопа. Стан і переживаємість культури
оцінювали протягом 14 діб.

Для приготування моношарової культури клітин гранульози і кумулюсу після
аспірації фолікулів ФР центрифугували при 750 g 10-15 хв. Супернатант
знімали стерильною пастерівською піпеткою. Осад обережно зливали в
стерильну чашку Петрі. Клітини культивували в 4-луночних планшетах,
лунки яких заповнювали одним із досліджуваних середовищ: Менезо В2,
РХ+10% кріоконсервованої ФР, РХ+10% ембріонального екстракту, РХ.
Планшет вміщували в СО2-інкубатор і культивували з 5% СО2 у повітрі при
температурі 37°С. Стан культури контролювали візуально на 3-, 6-, 9- і
12-ту добу.

Статистичну обробку отриманих результатів проводили за методом
Стьюдента-Фішера за допомогою програмного пакета Мiсrosoft Excel 2000.

Результати власних досліджень і їх обговорення

Проведено порівняльне вивчення впливу швидкого заморожування і
розробленого раніше двохетапного способу кріоконсервування на вміст у
деконсервованій ФР стероїдних гормонів. Контролем (група 1) були зразки
ФР, в яких вміст статевих гормонів визначали на протязі 4-6 год після її
одержання. До групи 2 входили зразки ФР, заморожені безпосередньо
зануренням ампул з ФР у рідкий азот. Фолікулярну рідину групи 3
кріоконсервували по двохетапному методу, ФР груп 4 і 5 заморожували за
двома вказаними способами, рівень стероїдних гормонів визначали через 12
місяців зберігання у рідкому азоті.

Встановлено, що при обох режимах заморожування довгострокове зберігання
ФР при температурі -196оС протягом 12 місяців не призводить до
статистично достовірної зміни вмісту естрадіолу, тестостерону і
прогестерону в порівнянні з нативними зразками (табл. 1).

Таблиця 1

Вміст загальної кількості статевих гормонів у нативних і деконсервованих
зразках за одноетапним і двохетапним методами.

Гормони

F

F

F

„U

]„9^„U

3/4

ae

¦ U ¦

E

»

1/4

3/4

> ¦ a V

¤

¦

I

„!

]„9^„!

]„9^„

$ярна

рідина

група 1 група 2 група 3 група 4 група 5

E, пг/мл 405,0(38,4 409,0(31,2 408,2 ( 35,6 406,9(23,1 404 ( 30,7

T, пг/мл 125,1(26,1 124,7(17,9 123,3 ( 21,3 125,2(15,2 125,0(18,7

P, мкг/мл 135,7(19,7 123,7 (12,5 129,1( 43,2 134,1(39,9 131,1( 34,4

Таким чином, з урахуванням результатів щодо вмісту стероїдних гормонів у
деконсервованій ФР надалі у дослідженнях ми використали технологічно
простий режим швидкого охолодження зі швидкістю 300-400°С/хв.

Результати проведених експериментів показують, що вміст загальної
кількості білків, гормону росту (соматотропін) та деяких цитокінів не
змінюється після заморожування-відігрівання даним способом. Разом з тим
вміст цих речовин у малих, менш зрілих фолікулах, достовірно перевищує
їх вміст у більш зрілих, великих фолікулах (табл. 2).

Таблиця 2

Біохімічний склад фолікулярної рідини, виділеної з великих

і малих фолікулів до і після кріоконсервування

Параметри Нативний зразок Кріоконсервований зразок

Малий

фолікул Великий

фолікул Малий

фолікул Великий

фолікул

Гормон

росту, нг/мл 15,95±4,3 13,25±2,9 17,43±3,9 12,95±3,8

Гр-КСФ,

пг/мл 18±2,6 15±1,3 14±1,6 10±2,4

? –?НO,

пг/мл 2,00±0,33 0,5±0,25 1,5±0,33 0,3±0,25

Загальний білок, мг/мл 64,6 ±5,5 61,0±6,0 63,3±5,7 59,9±5,2

АЛ 55,2±0,3 56,1±0,56 56,6±0,25 56,6±0,32

ГЛ ? 1 7,4±0,37 6,7±0,56 6,6±0,5 6,4±0,4

ГЛ ? 2 7,2±0,2 7,7±0,52 7,0±0,35 7,3±0,3

ГЛ ? 1 7,9±0,14 8,0±0,33 8,0±0,3 8,7±0,4

ГЛ ? 2 7,6±0,56* 6,5±0,34** 5,7±0,34* 4,9±0,84**

ГЛ ? 14,4±0,72 14,9±0,51 15,2±0,8 15,9±0,64

Примітка — * ? Р<0,05 Рівень вмісту у ФР в малих фолікулах Гр-КСФ та ?-ФНO незначно вище, що, можливо, необхідно для росту і розвітку ооциту. Про неоднаковість білкового складу ФР, виділеної з великих і малих фолікулів, свідчить відмінність спектрів власної флюоресценції 13- 15-ї фракцій фолікулярної рідини (рис. 1). Ці дані узгоджуються з результатами експериментів інших дослідників, за якими у ФР зрілих фолікулів міститься більше імуноглобулінів і протеогліканів у порівнянні з рідиною, виділеною з преовуляторних фолікулів. а б Рис. 1. Інтенсивність власної флуоресценції фракцій фолікулярної рідини людини з фолікулів: а - великих (?); б- малих (о). За допомогою метода гель-хроматографії було встановлено, що ФР малих фолікулів у нормі містить більшу кількість білкових фракцій з молекулярною масою вище 120 кД і меншу кількість низькомолекулярних білків у порівнянні з їх вмістом у ФР, одержаної з великих фолікулів, що не змінюється після кріоконсервування (рис. 2). а б Рис. 2. Гель-хроматограма фолікулярної рідини людини з фолікулів: великих (а), малих (б) до (?) і після (?) заморожування-відігрівання. У цілому отримані в цій частині роботи результати свідчать про те, що швидке заморожування до температури –196°С істотно не впливає на білковий склад ФР людини. В той же час досліджені показники статистично не достовірно розрізняються у ФР з малих і великих фолікулів, за винятком фракції ?-2 глобуліну, яка значно вища в ФР малих фолікулів. Як показали результати проведених досліджень, біофізичні показники ФР після кріоконсервування також змінюються незначно. Густина, рН ФР, виділеної як з великих, так і з малих фолікулів, після кріоконсервування практично не відрізняється від нативних значень. Значення осмолярності залежить від розміру фолікулів, але процес кріоконсервування на нього не впливає. (табл. 3) Таблиця 3 Біофізичні характеристики фолікулярної рідини, виділеної з великих і малих фолікулів, до і після кріоконсервування Досліджувані Параметри Нативний зразок Кріоконсервований зразок Малий фолікул Великий фолікул Малий фолікул Великий фолікул В?язкість, спз 2,31±0,29* 1,89±0,23* 3,3±0,38* 2,36±0,36* рН 8,071±0,02 8,182±0,05 8,156±0,04 8,269±0,08 Густина, кг/м 3 1021-1022 1021-1022 Осмолярність, Осмоль 278,5±7,7 293,7±7,2 270,5±5,5 283,7±7,1 Примітка * ? Р<0,05. Проте, слід зазначити, що рН фолікулярної рідини (приблизно 8,1) відрізняється від значень, відомих з літератури (рН=7,0) (R.G. Edwards, 1976 р.), мабуть, через те, що ФР була отримана у жінок, яким проводилась стимуляція суперовуляції. Динамічна в'язкість ФР – єдиний показник, який після кріоконсервування достовірно змінюється (збільшується приблизно на 40%) незалежно від розміру фолікулів. Як видно з приведених в табл. 3 даних, в'язкість ФР з малих фолікулів є більш високою, ніж в'язкість ФР, отриманої з великих фолікулів. Можливо, змінення в'язкості ФР пов'язане з конформацією білкових молекул і з їх невеликою агрегацією, про що свідчать тенденція до зниження осмотичного тиску ФР після кріоконсервування та позитивна кореляція з молекулярною масою білка і в'язкістю в рідині. Наявність в ФР, отриманої з малих фолікулів, більшого вмісту фракції білків з молекулярною масою вищою 600, ніж у ФР, виділеної з великих фолікулів, приводить до підвищення її в?язкості. Це узгоджується з раніше встановленим фактом, що збільшення вмісту фракції високомолекулярних білків у плазмі крові супроводжується підвищенням її в'язкості. Підтвердженням ефективності збереження функціональної повноцінності кріоконсервованої ФР є подані у табл. 4 дані про зміну в ній стану активності антиоксидантної системи і вмісту продуктів вільно-радикального пошкодження біомолекул. За отриманими результами можна зробити висновок, що зберігання кріоконсервованої ФР в рідкому азоті упродовж 12 місяців не приводить до достовірної зміни значень досліджених показників. Крім того, зберігання ФР у холодильнику при температурі 4°С протягом 12 годин після кріоконсервування також не приводить до накопичення ТБК-активних продуктів і модифікованих білків (табл. 4). Таблиця 4 Показники прооксидантно –антиоксидантного балансу у фолікулярній рідині до і після кріоконсервування Досліджені параметри Нативна фолікулярна рідина (контроль), нмоль/мл Деконсер-вована фолікулярна рідина, нмоль/л Гіпотермічне збері-гання розморожених зразків фолікулярної рідини, год. 12 24 48 ТБК- активні продукти ПОЛ, нмоль/мл 2,21 ±0,09 2,28 ±0,04 2,6 ±0,2 3,73 ±0,39* 4,61 ±0,8** Карбонільні похідні білка, нмоль/мг білка 2,17 ±0,17 2,13 ±0,12 2,23 ±0,12 2,56 ±0,12* 3,15 ±0,18* Загальна глутатіонпероксидазна активність, нмоль NADPH/ мл на хв 215,6 ±15,8 214,6 ±15,7 201 ±16,1 181,3 ±13,2* 144,7 ±4,3* Селензалежна глутатіонпероксидазна активність, нмоль /мл на хв 139,4 ±16,7 138,4 ±16,9 130,2 ±18,1 108 ±10,8* 86,9 ±5,7* Селеннезалежна глутатіонпероксидазна активність, нмоль NADPH/мл на хв 76,2 ±6,1 76,2 ±6,7 71,4 ±6,6 72,3 ±4,8 57,5 ±3,8* Глутатіон-s-трансферазна активність, нмоль ХДНБ/мл на хв 250,0 ±31,0 250,3 ±32,7 247,2 ±26,3 240,1 ±25,8 238,5 ±25,6 Глутатіонредуктазна активність, нмоль NADPH /мл на хв 24,02 ±4,05 23,88 ±3,76 23,65 ±3,67 24,16 ±3,96 23,58 ±3,79 Примітка * ? Р<0,05. Підсумовуючи отримані дані, можна стверджувати, що спосіб швидкого кріоконсервування ФР яєчника людини забезпечує тривале (протягом 12 місяців) збереження її складу і стану. З теоретичної точки зору, швидке охолодження розчинених у воді без кріозахистних середовищ макромолекул більш сприятливе, ніж повільне охолодження, тому що, мабуть, біохімічні реакції, зміна конформації і денатурація білків, розпад ферментів на субодиниці і денатурація білків є процесами активаційного типу. Для їх реалізації необхідно, щоб несприятливі чинники кріоконсервування діяли на макромолекули достатньо великий проміжок часу. При швидкому заморожуванні час дії пошкоджуючих чинників на біомакромолекули менше, ніж при повільному заморожуванні. Тому вірогідність необоротної зміни конформації біологічно активних молекул або їх інактивації зі збільшенням швидкості охолодження зменшується. Метою наступної серії експериментів було порівняльне вивчення впливу процентної концентрації кріоконсервованої ФР у середовищі інкубації на кінетичну активність сперміїв людини. Раніше для виділення найбільш активних сперміїв з еякуляту методом "спливання" пропонувалося додавати до нього 50% ФР людини (Г.Г. Геродес, 1997 р.). В той же, час за даними літератури ( Y.Q. Yao, 1998 p.), експозиція сперміїв у середовищі, що містить нативну ФР в концентрації більше 10%, протягом однієї години значно знижує здатність сперміїв до пенетрації. Враховуючи цей факт, а також те, що ФР є дефіцитним матеріалом, ми вивчили эфективність виділення рухливих сперміїв при додаванні в середовище інкубації РХ кріоконсервованої ФР у концентрації 10, 20 та 50%. Нативні показники при нормозооспермії: концентрація сперміїв - 57,7(5,8 млн/мл, рухливість - 53,8(4,9%; при астенозооспермії: концентрація - 45,6(3,4 млн/мл, рухливість - 37,2(3,3%. Контроль - РХ без додавання ФР (табл. 5) Таблиця 5 Ефективність виділення активнорухливої фракції сперміїв з еякуляту у середовищі, що містить декріоконсервовану фолікулярну рідину Параметри Рухливість сперми – фракції "а+в", % Показни-ки Кон- центрація млн/мл РХ без ФР РХ+10%ФР РХ+ 20% ФР РХ+50% ФР Нормозоо-спермія 27,7±5,8 65,8(3,5 74,5(4,11 87,4(6,21,2, 85,8(5,61,2 Астенозоо-спермія 23,2±3,3 36,1(3,2 61,8(5,31 78,2(6,11,2, 84,9(7,21,2 Примітки: 1 ? Р<0,05 по відношенню до РХ без ФР; 2 ? Р<0,05 по відношенню до РХ+10% ФР. У результаті проведених досліджень встановлено, що додавання до еякуляту 10% кріоконсервованої ФР достовірно підвищує поступову рухливість сперміїв, хоча і у меншій мірі, ніж при використанні більш високої концентрації ФР. Очевидно, що ФР, яка введена до складу середовища інкубації у концентрації 10%, достовірно поліпшує кінетичні властивості сперміїв людини. Для підтвердження цього висновку ми підготували до інсемінації 14 еякулятів з астенозооспермією за загальноприйнятою методикою при додаванні 10% кріоконсервованої ФР до середовища інкубації. В результаті після проведення внутрішньоматкової інсемінації була отримана вагітність у трьох випадках. Однак, за даними (S.L. Corson, 1984 р.), в результаті внутрішньоматкових інсемінацій вагітність при деяких формах патоспермії настає в 10-12 % пацієнток. При порівняльному вивченні середовищ культивування, які містять 10% нативної або кріоконсервованої ФР і ембріональної сироватки великої рогатої худоби (ЕСВРХ), не було виявлено суттєвих відмінностей у розвитку та проліферації ембріональних фібробластів людини (ЕФЛ) в моношаровій культурі. Адгезія клітин, які мали округлу форму, розпочиналась через 60-90 хв. Протягом культивування при розпластовуванні на твердій живильній підложці клітини набували характерну для фібробластів веретеноподібну форму. Перші ознаки деградації культури ЕФЛ (пінистість цитоплазми, гранулярність, пікноз ядер клітин) спостерігали на 7-8-у добу з початку культивування. На 14-у добу спостерігали ознаки старіння культури незалежно від середовища культивування. При культивуванні клітин гранульози та кумулюсу в різноманітних середовищах спостерігали адгезію та міграцію клітин: на 2-у добу ? в середовищі, яке містить 10% кріоконсервованої ФР у РХ, на 3-у добу – у середовищі Менезо В2. В РХ та в середовищі з 10%-м кріоконсервованим ембріональним екстрактом адгезії не відбувалося упродовж 7 діб. Очевидно, у даних середовищах відсутні фактори, від яких залежало прікріплення клітин до твердої живильної підложки. Таким чином, у дослідженнях було показано, що кріоконсервовану ФР, отриману з преовуляторних фолікулів, можна з успіхом використовувати для підвищення ефективності культивування ембріональних фібробластів, клітин кумулюсу та гранульози. У цілому отримані дані дозволяють стверджувати, що швидке охолодження ФР людини шляхом безпосереднього занурення зразків у рідкий азот забезпечує збереження біохімічних, біофізичних та молекулярних показників на рівні, достатньому для застосування в біотехнологіях, а також у центрах по лікуванню безпліддя з метою виділення рухливої фракції сперміїв. ВИСНОВКИ В дисертаційній роботі представлено теоретичне і експериментальне узагальнення наукової проблеми, спрямованої на вивчення біофізичних, і біохімічних властивостей, а також біологічної активності фолікулярної рідини яєчника людини, виділеної з фолікулів різного розміру при екстракорпоральному заплідненні до та після заморожування-відігрівання. Перспектива застосування біологічно активної фолікулярної рідини в експериментальних та клінічних дослідженнях визначила необхідність оптимізації метода її кріоконсервування. На основі отриманих даних розроблено технологічно простий, ефективний спосіб кріоконсервування фолікулярної рідини яєчника людини. Швидке заморожування-відігрівання фолікулярної рідини людини та її зберігання протягом одного року при температурі –196оС статистично достовірно не впливають на вміст стероїдних гормонів у ній і не змінюють її гормональний склад. Встановлено, що стан прооксидантно-антиоксидантного балансу фолікулярної рідини людини після швидкого заморожування та довгострокового зберігання (12 місяців) при температурі –196оС, а також при подальшому гіпотермічному зберіганні деконсервованих зразків протягом 12 годин при температурі 4оС істотно не змінюється. Показано, що розмір фолікулів, з яких виділяється фолікулярна рідина, достовірно впливає на вміст білків та деяких гормонів і цитокінів в цій рідині. Густина, рН і осмотичний тиск фолікулярної рідини людини після її заморожування-відігрівання при температурі -196оС статистично достовірно не змінюються, тоді як динамічна в'язкість кріоконсервованої ФР збільшується приблизно на 40%. Деконсервована ФР у концентрації 10% додана до складу середовища для інкубації сперміїв при використанні методу "спливання" достовірно підвищує кінетичні властивості спреміїв людини на 10-40%, залежно від нормо- або патоспермії та підвищує ефективність інсемінації при штучному заплідненні. Розморожена фолікулярна рідина у складі середовища культивування сприяє виживанню ембріональних фібробластів, клітин кумулюсу і гранульози in vitro. СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ Яковлева О.О., Геродес Г.Г. Вплив низькотемпературного зберігання на стабільність вмісту стероїдних гормонів у фолікулярній рідині яєчника людини // Проблеми кріобіології. - 2004. - №1. ? С.83-89. Яковлева О.О., Юрченко Г.Г., Крамар М.Й., Геродес Г.Г. Вплив кріоконсервованої фолікулярної рідини яєчника людини на кінетичну активність сперміїв // Проблеми кріобіології. - 2004. - №4.- С.51-56. Грищенко В.І., Яковлева ОО., Петренко О.Ю., Никітченко Ю.В. Стан вільнорадикального окислення фолікулярної рідини яєчника людини після довготривалого кріоконсервування // Міжнародний медичний журнал. -2005.- №1.- Т. 11.-С. 86-91. Пат. №11355 Україна, МПК А61К35/52. Спосіб виділення рухливої фракції сперміїв з еякуляту людини / В.І. Грищенко, О.О. Яковлева, Н.Н. Чуб, М.Й. Крамар (ІПКіК НАН України). №200506396; Заявл. 29.06.2005; Опубліковано 15.12.2005.- Бюл. №12. Яковлева О.О. Вивчення деяких біофізичних параметрів фолікулярної рідини яєчника людини до і після дії низьких температур // Проблеми кріобіології. -2005.- Т. №15.- №3.- С. 473. АНОТАЦІЯ Яковлева О.О. Вплив низьких температур на деякі біохімічні і біофізичні характеристики фолікулярної рідини яєчника людини – рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.35 ? кріомедицина. – Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної академії наук України, Харків, 2007. Дисертація присвячена вивченню впливу кріоконсервування на біохімічні та біофізичні властивості фолікулярної рідини яєчника людини, вилученої при екстракорпоральному заплідненні із фолікулів різного розміру. На основі одержаних даних розроблено спосіб кріоконсервування, який полягає у безпосередньому зануренні зразків із фолікулярною рідиною в рідкий азот. Отримані в роботі дані дозволяють зробити висновок, що розмір фолікулів, з яких виділяється фолікулярна рідина, достовірно впливає на її склад. Стан прооксидантно-антиоксидантного балансу фолікулярної рідини людини після швидкого заморожування і довгострокового зберігання (впродовж 12 місяців) при температурі –196оС, а також при подальшому гіпотермічному зберіганні деконсервованих зразків протягом 12 годин при температурі 4оС істотно не змінюється. Густина, рН і осмотичний тиск фолікулярної рідини людини після заморожування-відігрівання статистично достовірно не змінюються, тоді як динамічна в'язкість кріоконсервованої фолікулярної рідини збільшується приблизно на 40%. Деконсервована фолікулярна рідина в концентрації 10%, яка була введена до складу середовища для інкубації сперміїв при використанні методу "спливання", достовірно підвищує кінетичні властивості сперміїв людини при астенозооспермії. Показано, що розморожену фолікулярну рідину можна використовувати для підвищення ефективності культивування ембріональних фібробластів, клітин кумулюсу і гранульози. Ключові слова: кріоконсервування, фолікулярна рідина яєчника людини, спермії людини. АННОТАЦИЯ Яковлева Е.А. Влияние низких температур на некоторые биохимические и биофизические характеристики фолликулярной жидкости яичника человека ? рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.35 ? криомедицина. ? Институт проблем криобиологии и криомедицины Национальной академии наук Украины, Харьков, 2007. Диссертация посвящена изучению влияния криоконсервирования на некоторые биохимические и биофизические параметры фолликулярной жидкости яичника человека, полученной при экстракорпоральном оплодотворении из фолликулов разного размера. Проведено сравнительное изучение влияния быстрого охлаждения со скоростью 300-400оС/мин и двухэтапного способа криоконсервирования на содержание в образцах деконсервированной фолликулярной жидкости стероидных гормонов. Показано, что режимы замораживания-оттаивания фолликулярной жидкости человека и ее хранение при –196оС не влияют на состав стероидных гормонов в ней и не изменяют гормональный профиль фолликулярной жидкости. На основе полученных данных предложен технологически простой и эффективный способ криоконсервирования фолликулярной жидкости, который заключается в прямом погружении образцов в жидкий азот. В работе показано, что размер фолликулов, из которых аспирируют фолликулярную жидкость, влияет на её состав. Методом гель-хроматографии установлено, что фолликулярная жидкость из малых фолликулов содержит несколько больше белковых фракций с молекулярной масой выше 120 кД и меньшее количество низкомолекулярных белков и пептидов с молекулярной масой менее 10 кД, по сравнению с ФЖ, выделенной из больших фолликулов. Состояние прооксидантно-антиоксидантного баланса фолликулярной жидкости человека после быстрого замораживания и длительного хранения (в течение 12 месяцев) при –196оС, а также при последующем гипотермическом хранении деконсервированных образцов в течение 12 ч при температуре 4оС, существенно не изменяется. В работе было показано, что замораживание-оттаивание не влияет на показатели плотности, рН и осмотического давления фолликулярной жидкости человека, тогда как динамическая вязкость криоконсервированной фолликулярной жидкости статистически достоверно увеличивается на 40%. Из полученных результатов следует, что быстрое охлаждение со скоростью 300-400оС/мин и хранение фолликулярной жидкости в жидком азоте не приводит к достоверным изменениям её биофизических и биохимических свойств. В то же время некоторые из исследованных показателей статистически достоверно отличаются в зависимости от величины фолликулов, а именно: на осмотические показатели и реологические свойства фолликулярной жидкости в нативных образцах. Кроме того, хранение деконсервированных образцов фолликулярной жидкости в гипотермических условиях в течение 12 часов не приводит к накоплению ТБК-активных продуктов и модифицированных белков. При использовании нативной и криоконсервированной фолликулярной жидкости в концентрации 10%, введенной в состав среды инкубации спермиев человека, достоверно увеличивались их кинетические показатели при астенозооспермии. Показано, что размороженную фолликулярную жидкость можно успешно использовать в составе среды инкубации спермиев для инсеминации, для культивирования эмбриональных фибробластов, клеток кумулюса и гранулёзы. Ключевые слова: криоконсервирование, фолликулярная жидкость яичника человека, спермии человека. SUMMARY Yakovleva E.A. Low temperature effect on some biochemical and biophysical characteristics of human ovary follicular fluid. –Manuscript. Thesis for the candidate of medical science degree in speciality 14.01.35 – cryomedicine. – Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, 2007. The work is describing the research of cryopreservation effect on some biochemical and biophysical characteristics of human ovary follicular fluid, procured from follicles of various sizes. Basing on the obtained data the author elaborated a cryopreservation method, involving direct plunging of samples with follicular fluid into liquid nitrogen. The obtained data allow to conclude that size of follicles reliably influences the composition of follicular fluid procured. Freeze-thawing of human follicular fluid and its storage at –196(C does not reliably effect the steroid hormones content and does not change the total hormonal profile of follicular fluid. Pro- and antioxidant balance of human follicular fluid after rapid freezing and long-term (1 year) storage at –196(C, and following hypothermic storage of frozen-thawed samples during 12 hrs at 4(C does not significantly change. Density, pH and osmotic pressure of human follicular fluid after freeze-thawing does not statistically and significantly change, while the dynamic viscosity of frozen-thawed follicular fluid increased in about 40%. Frozen-thawed follicular fluid added in 10% concentration to medium for sperm incubation statistically and significantly improves the kinetic properties of motile fractions of human sperm at astenozoospermy. Key words: cryopreservation, human ovary follicular fluid, human sperm. Підписано до друку 19.01.2007р. Формат 60x84 1/16 Наклад 100 прим. Умов. друк. арк. 0,9. Друк на ризографі. Замовл. № б/н. ПП Степанов В.В. м. Харків, вул. Ак. Павлова, 311 PAGE 1

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *