Визначення індивідуальної радіочутливості людини на основі цитогенетичних показників (автореферат)

академія медичних наук україни

науковий центр радіаційної медицини

Рябченко Наталія Миколаївна

УДК 612.014.482:575.191

Визначення індивідуальної радіочутливості людини на основі
цитогенетичних показників

03.00.01 – радіобіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ — 2007

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і
радіобіології

ім. Р. Є. Кавецького НАН України, м. Київ

Науковий керівник: доктор біологічних наук Дьоміна Емілія Анатоліївна,

Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології

ім. Р. Є. Кавецького НАН України, провідний науковий співробітник
відділу радіобіології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Серкіз Ярослав
Іванович,

Інститут ядерних досліджень НАН України,

провідний науковий співробітник відділу структури ядра

доктор біологічних наук, професор Цудзевич Борис Олександрович,
Київський національний університет ім. Тараса Шевченка,

провідний науковий співробітник кафедри біохімії біологічного ф-ту

Захист відбудеться “ 9 ” жовтня 2007 року о 14 годині
на засіданні спеціалізованої

вченої ради Д 26.562.01 Наукового центру радіаційної медицини АМН
України

за адресою: 03115, м. Київ, пр-т Перемоги, 119/121.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Наукового центру
радіаційної медицини

АМН України за адресою: 04050, м. Київ, вул. Мельникова, 53.

Автореферат розісланий “ 5 ” вересня 2007 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Л.О. Ляшенко

1

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема оцінки індивідуальної радіаційної чутливості
(ІР) людини впродовж багатьох років є однією з найактуальніших у
радіобіології (Arlett C.F., 1989; Gatti R.А., 2001; Даренская Н.Г. і
співавт., 2001). Вона має важливе фундаментальне значення, оскільки
пов’язана з механізмами радіаційно-індукованого мутагенезу і
канцерогенезу, основними процесами життєдіяльності клітини, такими, як
репарація ДНК та забезпечення генетичної стабільності клітин (Little
J.B., 2003; Prise K. et al., 2006; Valerie K. et al., 2007).

Широке застосування іонізуючих випромінювань (ІВ) в усіх сферах
антропогенної діяльності потребує кількісної оцінки ІР для практичного
її застосування при визначенні генетичного та канцерогенного ризику для
населення в умовах тривалої дії факторів Чорнобильської аварії, при
санітарно-гігієнічному нормуванні опромінення професіоналів, які
контактують із джерелами ІВ, індивідуальній біологічній індикації
ступеня променевого ураження тощо. Дослідження можливостей спрямованої
модифікації ІР на клітинному та організмовому рівнях необхідні як для
захисту від радіації, так і для оптимізації схем променевої терапії
злоякісних пухлин. З врахуванням безперечної значимості результатів
досліджень ІР людини розробка методів, пошук інформативних та
специфічних маркерів, що дозволять об’єктивно її оцінювати і
прогнозувати (Мінченко Ж.М., 2003; Andreassen C.N. et al., 2003; Krueger
S.A. et al., 2007), є особливо актуальними.

Унікальні властивості лімфоцитів периферичної крові (ЛПК), а саме:
висока радіочутливість, подібність цитогенетичних ефектів в умовах
опромінення in vivo/in vitro низький спонтанний рівень хромосомних
перебудов, мобільність в кров’яному руслі тощо, дозволяють
використовувати їх як інформативну тест-систему для біологічної
дозиметрії/індикації променевих уражень та для оцінки генетичних ефектів
дії різноманітних чинників довкілля на організм людини. При цьому
радіаційно-індуковані аберації хромосом в ЛПК визнані валідованим
маркером дії ІВ (Lloyd D.C., 1998; Бебешко В.Г. і співавт., 2004;
Terzoudi G.I. et al., 2006). Виходячи з цього, загальну частоту
структурних мутацій хромосом та окремих променевих маркерів в ЛПК
розглядають як показник радіочутливості організму людини в цілому
(НКДАР, 1986; МАГАТЕ, 2001; Bayens A. et al., 2004; Пилинская М.А. і 2

співавт., 2007). Зазвичай ІР людини на основі цитогенетичних показників
оцінюють за спонтанним рівнем аберацій хромосом в ЛПК, що є інтегральним
показником дії на організм людини різних генотоксичних чинників довкілля
(Бочков Н.П. і співавт., 2001; Пелевіна І.І. і співавт., 2001). В
останні роки розробляється новий підхід до оцінки ІР, що полягає в
реєстрації цитогенетичних ефектів за умов дії “провокативного” in vitro
опромінення соматичних клітин людини і лежить в основі хромосомного
G2-тесту, який пропонується для виявлення гіперчутливих до радіації осіб
серед онкологічних хворих (Sanford K. et al., 1990; Scott D. et al.,
1999; Baria K. et al., 2001; Bayens A. et al., 2005; Distel L.V. et al.,
2006). Однак порівняно короткий термін застосування цього методичного
підходу свідчить про необхідність подальших фундаментальних досліджень
для його удосконалення, уніфікації і впровадження. Нам не відомі роботи,
в яких цілеспрямовано та систематизовано, на репрезентативній вибірці,
вивчалась ІР умовно здорових осіб.

Встановлено достовірну кореляцію між ризиком виникнення злоякісних
новоутворень та підвищеною частотою аберацій хромосом в соматичних
клітинах людини (Hagmar L. et al., 1998; Bonassi S. et al., 2000;
Дьоміна, 2002; Boffetta P. et al., 2007). Особи з підвищеним рівнем
структурних пошкоджень генома відносяться до групи підвищеного
канцерогенного ризику, а підвищена частота радіаційно-індукованих
аберацій хромосом може слугувати тестом для виявлення осіб зі схильністю
до розвитку радіаційно-індукованих захворювань, в тому числі злоякісних
новоутворень. Тому дослідження ІР умовно здорових осіб з метою вивлення
серед них гіперчутливих до радіації є актуальним і сприятиме підвищенню
ефективності первинної профілактики радіогенних патологій.

Зв’язок роботи з науковими програмами та темами. Дисертаційна робота
виконувалась протягом 2003 – 2007 рр. в Інституті експериментальної
патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України у
відділі радіобіології в рамках науково-дослідних робіт: “Дослідити роль
радіогенних порушень окисного метаболізму і цитогенетичних змін у
формуванні стохастичних ефектів опромінення в залежності від природної
резистентності організму” (№ держреєстрації 0104U00592, шифр 2.2.5.247),
2001 – 2006 рр. та “Особливості функціонування онкогеному” (№
держреєстрації 0102U003228, шифр 2.28.2.10), 2002 – 2006 рр.

Мета дослідження. Визначити величину індивідуальної радіочутливості
умовно здорових осіб за рівнем аберацій хромосом в лімфоцитах
периферичної крові, індукованих тестуючим опроміненням in vitro, та
дослідити вплив процесів репарації на її формування.

3

Задачі дослідження:

Побудувати калібрувальні криві “доза – ефект” і “стадія – ефект” для
загальної частоти та різних типів радіаційно-індукованих структурних
перебудов хромосом з використанням тест-системи ЛПК.

Розробити алгоритм визначення величини ІР умовно здорових осіб за
частотою та спектром аберацій хромосом, індукованих тестуючим
(-опроміненням ЛПК.

Відповідно до розробленого алгоритму у групі обстеження дослідити
частоту та спектр аберацій хромосом, індукованих тестуючим
г-опроміненням в найбільш радіочутливому періоді клітинного циклу
лімфоцитів.

Провести порівняльний аналіз варіабельності одержаних цитогенетичних
показників радіочутливості із застосуванням адекватних методів
математичної статистики для визначення осіб, гіперчутливих до дії ІВ.

Вивчити внутрішньоіндивідуальну варіабельність одержаних цитогенетичних
показників та оцінити їх відтворюваність у осіб з різним ступенем
чутливості до дії радіації.

Дослідити вплив гіпертермії на характер залежності “доза – ефект” при
опроміненні лімфоцитів в S-періоді клітинного циклу.

Оцінити вплив процесів репарації радіаційно-індукованих пошкоджень на
формування ІР осіб з різною чутливістю до радіації.

Розробити показання для першочергового визначення цитогенетичних
показників ІР для різних категорій населення.

Об’єкт дослідження: індивідуальна радіочутливість та її зв’язок з
ефективністю процесів репарації на хромосомному рівні ЛПК умовно
здорових осіб.

Предмет дослідження: частота і спектр аберацій хромосом в культурі
лімфоцитів периферичної крові індивідуумів за дії тестуючого
г-опромінення та додаткової гіпертермії.

Методи дослідження: цитогенетичні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів полягає в тому, що вперше:

розроблено алгоритм оцінки величини ІР умовно здорових осіб за
цитогенетичними ефектами, індукованими тестуючим опроміненням, що
базується на фундаментальних радіобіологічних залежностях “доза –
ефект”, “стадія-ефект” для формування аберацій хромосом; 4

в референтній групі встановлено межі коливань цитогенетичних показників
в нормі, індукованих тестуючим (-опроміненням (1,5 Гр) в G2-періоді
клітинного циклу: 63,7 і 12,8 аберацій хромосом на 100 клітин;

за результатами дослідження встановлено, що 11,6 % групи обстеження
складають особи з підвищеною чутливістю хромосом до дії ІВ;

встановлено, що у осіб, гіперчутливих до дії радіації, емпіричний
розподіл аберацій по клітинах відхиляється від очікуваного теоретичного
розподілу Пуасона за рахунок клітин з множинними абераціями;

за допомогою додаткової дії інгібітора процесів репарації (гіпертермії)
доведено, що їх ефективність корелює з цитогенетичними показниками ІР
людини. Показано, що у осіб, гіперчутливих до дії ІВ, процеси репарації
в 1,6 рази менш ефективні, ніж у донорів з “нормальними” показниками
радіочутливості.

Практичне значення одержаних результатів. Визначений алгоритм оцінки
величини ІР людини пропонується для цитогенетичного обстеження умовно
здорових осіб з метою виявлення серед них гіперчутливих до дії ІВ та
формування груп підвищеного променевого і канцерогенного ризику.

За результатами роботи розроблено показання для першочергового
обстеження різних контингентів населення та оформлено методичні
рекомендації щодо їх використання в онкологічній практиці.

Виявлений істотний вплив процесів репарації на формування
радіаційно-індукованих цитогенетичних показників ІР вказує на те, що
розробка і оцінка дії модифікаторів променевих уражень повинна
враховувати показники ІР людини.

Матеріали досліджень використовуються в педагогічному процесі у циклах
лекцій магістерської програми природничого факультету Національного
університету “Києво-Могилянська Академія”.

Особистий внесок здобувача. Формулювання мети, планування досліджень,
аналіз результатів, підготовку публікацій до друку дисертант виконував
спільно з науковим керівником.

Дисертантом проаналізовано літературу за обраною темою, проведено
патентно-інформаційний пошук, сформульовано задачі дослідження.
Дисертант самостійно виконав запланований об’єм цитогенетичних
експериментів і обстежень донорів, статистичний аналіз

5

та узагальнення одержаних результатів, сформулював висновки щодо
можливих механізмів формування ІР здорових індивідуумів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації
доповідалися та обговорювались на Х Конгресі Світової федерації
українських лікарських товариств (Чернівці, 2004); Міжнародній
конференції “Парадигми сучасної радіобіології. Радіаційний захист
персоналу об’єктів атомної енергетики” (Київ – Чорнобиль, 2004); 5th
European Cytogenetics Conference (Мадрид, 2005); 34th Scientific Meeting
of ESRB and ARR (Leicester, 2005); Міжнародній конференції
“Радіобіологічні ефекти: ризики, мінімізація, прогноз” (Київ, 2005); ХІ
Конгресі Світової федерації українських лікарських товариств (Полтава,
2006); Міжнародному конгресі Європейського товариства з радіаційного
ризику (ESRR) “Chernobyl – 20 years Later” (Берлін, 2006); V
Міжнародному з’їзді з радіаційних досліджень (Москва, 2006); 35th
Scientific Meeting of ESRB (Київ, 2006); ХІ з’їзді онкологів України
(Судак, 2006); щорічній науковій конференції ІЯД (Київ, 2007);
Міжнародній конференції “Віддалені наслідки впливу іонізуючого
випромінювання” (Київ, 2007); 5th International Conference on
Environmental Mutagens in Human Populations (Antalia, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 18 наукових праць: 1
монографія із співавторами, 6 статей у фахових наукових журналах і
збірниках наукових праць, рекомендованих ВАК України, 1 методичні
рекомендації, 10 тез доповідей в матеріалах наукових форумів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 145 сторінках
друкованого тексту, містить 16 таблиць, 23 рисунки; складається з
вступу, огляду літератури, п’яти розділів власних досліджень з аналізом
отриманих результатів, розділу узагальнень, висновків та додатків.
Список використаної літератури містить 177 джерела (з них 132 –
англомовні).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

7,1 років), які проживали в м. Києві та протягом періоду обстеження не
мали свідомого контакту із джерелами ІВ.

6

Матеріалом цитогенетичних досліджень були ЛПК умовно здорових донорів,
культивування яких проводили за модифікованим напівмікрометодом
(Hangeford, 1965), протягом 52 та 58 год (з урахуванням
радіаційно-індукованої затримки мітозу). Відбір метафазних пластинок
здійснювали за загальноприйнятими правилами (Mitelman F., 1995). Аналіз
аберацій хромосом виконували з візуальним груповим каріотипуванням і
враховували: частоту аберантних клітин, загальну частоту аберацій
хромосом, частоту аберацій хроматидного та хромосомного типів.
Аналізували в середньому по 100 – 200 метафаз на одне цитогенетичне
спостереження. Всього проаналізовано близько 39 000 метафаз.

Опромінення культур ЛПК здійснювали г-променями (60Со) на терапевтичному
апараті “Рокус” в дозах 1,0 – 3,0 Гр при потужності дози опромінення 1,0
Гр/хв у відділі променевої терапії Інституту онкології АМН України
(керівник відділу – проф. В.С. Іванкова). Фізична дозиметрія
виконувалась за допомогою іонізаційної камери і феросульфатного
дозиметра. Культури лімфоцитів опромінювались на 0; 24; 40; 46 год
інкубації, що відповідало G0-, G1-, S-, та G2- періодам клітинного циклу
відповідно. Тест-опромінення культур в G2-періоді здійснювали в дозі 1,5
Гр, з потужністю дози 1,0 Гр/хв. Додаткову гіпертермію здійснювали
відразу після опромінення культур в S-періоді, при 420С протягом 1 год
на водяній бані, після чого продовжували культивування при 370С.

Метод варіаційної статистики, застосований в роботі, полягав в побудові
статистичних рядів розподілів досліджуваних показників і розрахунку
основних статистичних параметрів одержаних розподілів: середніх значень
цитогенетичних показників (М), стандартної похибки (SE), моди (Mo),
медіани (Me), стандартного відхилення ((), дисперсії вибірки (s2),
асиметрії й ексцесу, коефіцієнту варіації (CV), рівня надійності при
обраній імовірності тощо та в представленні експериментальних даних у
вигляді гістограм.

Кореляцію досліджуваних показників оцінювали за допомогою коефіцієнтів
Спірмена (r). Математична обробка даних проведена за допомогою пакетів
прикладних програм Microsoft Excel, StatPlus, Origin.

Результати дослідження та їх обговорення.

Головні результати досліджень одержані на підставі: 7

побудови калібрувальних кривих “стадія – ефект”, “доза – ефект”, “час
фіксації –ефект” для різних типів аберацій хромосом та розробку
алгоритму оцінки ІР умовно здорових осіб за цитогенетичними показниками;

дослідження спектра і частоти структурних перебудов хромосом,
індукованих тестуючим опроміненням ЛПК донорів в G2-періоді клітинного
циклу, та їх варіабельності;

вивчення впливу процесів репарації на формування досліджуваних
цитогенетичних показників радіочутливості.

Побудова залежностей частоти та спектра аберацій хромосом від дози
г-опромінення (1,0 – 3,0 Гр) культури ЛПК умовно здорових осіб в різних
періодах клітинного циклу. Зважаючи на те, що радіаційно-індуковані
цитогенетичні ефекти впливають величина дози радіації, період клітинного
циклу, постпроменеві умови культивування (Севанькаєв А.В., 1987, Дьоміна
Е.А., 2006), в рамках даної роботи на власних даних побудовані
калібрувальні криві “стадія – ефект” і “доза – ефект” для аналізу та
коректного порівняння одержаних цитогенетичних показників. Виконано
детальне дослідження радіочутливості хромосом ЛПК умовно здорових осіб
(n = 6) за дії г-опромінення (в діапазоні доз 1,0 – 3,0 Гр ) протягом
клітинного циклу.

При опроміненні лімфоцитів в зазначеному діапазоні доз було зафіксовано
два терміни радіочутливості хромосом: в пізньому G1- і G2-періодах
(рис.1). Дослідження показали, що зміни радіочутливості хромосом між
стадіями циклу залежать від дози опромінення і, як правило, є більш
істотними з її збільшенням. Тому для оцінки індивідуальних
цитогенетичних показників ІР обрано дозу 1,5 Гр, що зумовлює не тільки
високий коефіцієнт їх варіабельності в обстеженій групі, а й дає
можливість одержувати достатню кількість метафаз для аналізу. Однак
форми кривих “стадія – ефект” для загального числа аберацій хромосом і
для аберацій різного типу не залежать від дози г-опромінення. При
просуванні клітин по циклу спостерігається зміна аберацій хромосомного
типу на хроматидний, максимум яких реєструється в G2-періоді (рис. 2). В
першій половині мітотичного циклу переважають аберації обмінного типу, у
другій – фрагменти. 8

9

1,6) реєструється при опроміненні на 46 год інкубації клітин, тобто в
кінці G2-періоду. Одержані результати свідчать: вивчення радіочутливості
хромосом має не тільки опиратися на найчутливіші точки переходу між
періодами клітинного циклу, а й враховувати диференційовану
радіочутливість у межах окремих з них. Тому тестуюче опромінення
доцільно здійснювати на 46 год культивування клітин, що відповідає
пізньому G2-періоду.

Аналіз цитогенетичних даних, одержаних при опроміненні в різних періодах
клітинного циклу, вказує, що в цілому розподіл радіаційно-індукованих
аберацій хромосом відповідає теоретичному розподілу Пуасона, за
вийнятком даних, одержаних при більш пізній фіксації культур (на 58
год). Це свідчить про те, що в цей термін популяція ЛПК є гетерогенною і
містить клітини 2-го та 3-го мітозу. Тому для фіксації культур ми обрали
52 год культивування, що дає змогу аналізувати клітини, які перебувають
в першому мітозі в культурі.

Таким чином, проведені експерименти дозволили визначити алгоритм оцінки
ІР умовно здорових донорів, який передбачає:

тестуюче г-опромінення культури клітин в дозі 1,5 Гр (при потужності
дози 1 Гр/хв), на 46 годині культивування (пізній G2-період);

фіксацію клітин – на 52 год від початку культивування, метафазний аналіз
препаратів в першому постпроменевому мітозі.

Схему досліджень та оптимальні експериментальні умови цитогенетичної
оцінки ІР відображено на рис. 3.

10

0,14 аберацій на 100 клітин (табл. 1). У 90,3% донорів зареєстровано 0
– 3% аберантних клітин, тоді як у 9,7% вибірки індивідуальні значення
фонового рівня аберацій хромосом коливалися від 3,3 до 7 %. Одержане
середньогрупове значення перевищувало середньопопуляційний показник,
описаний в літературі (1,5%; Чеботарев А.Н., 2001), проте було нижче
верхньої границі його норми (3%).

У спектрі аберацій хромосом ЛПК в групі донорів переважали аберації
хроматидного типу в індивідуальних межах від 0,3 до 5 на 100
проаналізованих метафаз. Найчастіше зустрічалися хроматидні фрагменти –
делеції та ізохроматидні делеції (86% та 14% відповідно). 11

Таблиця 1

Спектр та частота спонтанних аберацій хромосом в групі умовно здорових
осіб

0,14 —

Спонтанний рівень аберацій хромосом в групі обстеження характеризується
значною індивідуальною варіабельністю (CV = 15%), головним чином за
рахунок аберацій хроматидного типу.

Аналіз цитогенетичних показників, індукованих тестуючим опроміненням в
G2-періоді клітинного циклу, виявив їх високу міжіндивідуальну
варіабельність (табл.2). Найвища варіабельність одержаних даних
характерна для аберацій хроматидного типу (CV = 42,1%). В їх спектрі
переважали одиночні фрагменти (хроматидні делеції, CV = 37,5%). Вони
складали в середньому по групі 84% від загального числа пошкоджень, що
дозволяє розглядати їх як специфічний цитогенетичний показник
радіочутливості хромосом, опромінених в G2-стадії.

Додатково був проведений аналіз кореляційних зв’язків між
середньогруповими показниками радіочутливості хромосом за G2-тестом та
віком і статтю донорів. У дослідженій віковій групі (20 – 52 роки)
статистично значущих асоціацій між віком та досліджуваними показниками
радіочутливості не виявлено (r = 0,26, p = 0,05). Порівняння дисперсії
розподілу одержаних показників радіочутливості у чоловіків та жінок
показав, що вона була практично однаковою в двох групах (s2 =152,4; s2
=158,0; р = 0,01). Це свідчить про однакову варіабельність цих
показників у чоловіків та жінок. 12

Таблиця 2

Середньогрупові цитогенетичні показники в лімфоцитах периферичної крові
умовно здорових донорів при тестуючому опроміненні в G2-періоді
мітотичного циклу

SE Медіана Мода Стандартне відхилення( Коефіцієнт варіації,

1,6 28,5 30 12 37,5

Проведені дослідження не виявили залежності між індивідуальними
значеннями спонтанного рівня аберацій хромосом та значеннями
радіочутливості хромосом за G2-тестом (r = 0,07 при р = 0,05 для
загального числа аберацій хромосом). При розподілі групи обстеження за
спонтанним рівнем аберацій хромосом нижче та вище верхнього
популяційного значення (>3>%) одержано аналогічні результати:
коефіцієнти кореляції – 0,11 та 0,03 відповідно. Це можна пояснити тим,
що на відміну від дослідження спонтанного рівня хромосомних перебудов
запропонований методичний підхід дає можливість оцінювати
радіочутливість хромосом за прямої дії променевого агента в найбільш
радіочутливий період мітотичного циклу та виокремити із загальної
чутливості до стрес-агентів саме радіаційну компоненту. При цьому
радіаційно-індуковані аберації хромосом за дії провокуючого опромінення
є більш специфічним показником ІР, оскільки частота індукованих розривів
хромосом відображає рівень нерепарованих пошкоджень ДНК і, таким чином,
ефективність процесів репарації (Parshad R., 2001). Визначення
спонтанного рівня аберацій хромосом та реєстрація в його спектрі
специфічних маркерів радіаційної дії без сумніву є менш чутливим для
визначення ІР, оскільки спонтанний рівень аберацій хромосом є
інтегральним показником дії на організм різноманітних мутагенних та
канцерогенних чинників довкілля.

Визначення внутрішньоіндивідуальної варіабельності цитогенетичних
показників радіочутливості у 7-и донорів в динаміці (протягом 3-х років,
число повторів складало від 3 13

до 7 разів) показало, що використаний методичний підхід дозволяє в
цілому одержувати надійні відтворювані індивідуальні значення
цитогенетичних показників радіочутливості (табл. 3).

Таблиця 3

ae

ae

@ t Ae

i

?

ae

ae

e

e

Ae

AE

E

E

? L’P’R’X/.5u9?;o;oe;-Z@iA:C0D$E/iiaaa*NNaaaIEE???????

&

??????????

dh`„?

&

dha$

2c8¤>¤@¤uuuuuuuuuiiiiiiiiiiiiaOea

dh`„?a$

!

j

j

!

!

!

!

!

!

!

!

!

!

a$

?ii4(

Варіабельність загального числа радіаційно-індукованих аберацій хромосом
при динамічному обстеженні умовно здорових донорів

0,7 1,5 7,1

0,05).

Оцінка граничних значень “норми” одержаних цитогенетичних показників ІР
та визначення гіперчутливих осіб за допомогою 90-го персентиля показала,
що верхня границя “нормальних” значень показників радіочутливості
хромосом у референтній вибірці складає 64 аберацій/100 метафаз, а 12%
осіб з обстеженої групи мають підвищену ІР хромосом до тестуючого
опромінення.

2( визначило 14

граничні значення досліджуваних цитогенетичних показників
радіочутливості в групі донорів з нормальною чутливістю: 63,1 та 12,8
аберацій на 100 метафаз відповідно.

15

Кількість гіперчутливих донорів становила 11,6 % референтної вибірки.
Верхня межа “норми” при цьому практично співпадає з точкою розділу на
дві групи осіб (64 аберацій/100 метафаз, 12% гіперчутливих осіб) та
середньогруповими значеннями радіочутливості хромосом, визначеними за
допомогою методу персентилей, що свідчить про об’єктивність оцінки
одержаних даних.

Таблиця 4

Зміни цитогенетичних показників, індуковані тестуючим опроміненням в
лімфоцитах умовно здорових осіб з нормальною (І) та підвищеною (ІІ)
радіочутливістю

1,8 8,0 13,1

Аналіз даних поклітинного розподілу кількості аберацій для донорів з
різною радіочутливістю за G2-тестом показав, що емпіричне число клітин з
однією аберацією було значно нижчим за очікуване в ІІ групі донорів.
Натомість число клітин з множинними абераціями перевищували теоретичні
показники (відхилення від розподілу Пуасона в групі гіперчутливих були
статистично значущими при р < 0,01). Частка клітин з множинними абераціями у групі ІІ була значно вищою, ніж у групі І і складала 15,8 та 6,5% відповідно. Таким чином, специфічними показниками радіочутливості хромосом ЛПК умовно здорових осіб можна вважати як частоту одиночних хроматидних делецій (що здійснюють головний кількісний внесок у загальну частоту аберацій хромосом та її варіабельність), так і рівень клітин з множинними абераціями. Слід відмітити, що в обстеженій групі умовно здорових осіб не було виявлено радіорезистентних донорів, цитогенетичні показники яких менші за 12,8/100 метафаз. 16 Математичний аналіз одержаних цитогенетичних даних ІР, індукованих тестуючим опроміненням в G2-стадії мітотичного циклу, виявив бімодальність у їх розподілах (тобто існування двох підгруп донорів – з нормальною та підвищеною радіочутливістю). Ми припускаємо, що розроблений методичний підхід оцінки ІР людини дає змогу виявити особи з генетичною схильністю до підвищеної радіочутливості. З метою перевірки цього припущення були виконані досліди по з’ясуванню зв’язку між одержаними цитогенетичними показниками ІР та вираженістю процесів репарації на хромосомному рівні ЛПК. Дослідження впливу процесів репарації на формування індивідуальної радіочутливості людини на хромосомному рівні лімфоцитів периферичної крові. Виявлені радіаційно-індуковані аберації хромосом в ЛПК, що відображають радіочутливість обстежених осіб, є, перш за все, показниками існуючих порушень в системі репарації пошкоджень ДНК. У дослідженні впливу цих процесів на формування цитогенетичних показників ІР ми виходили з гіпотези про механізми радіосенсибілізації при сумісній променевій і гіпертермічній дії на соматичні клітини людини (Sneed P.K. et al., 1991; Kampinga H.H., 2006; Дьоміна Е. А., 2006). Для цього були вивчені якісні та кількісні закономірності формування радіаційно-індукованих аберацій хромосом та цитогенетичні ефекти гіпертермії в S-періоді, оскільки найвища активність процесів репарації пов’язана з цим періодом клітинного циклу (табл. 5). Одержані таким чином дані, ми взяли за основу при визначенні внеску процесів репарації у формування ІР і провели порівняльний аналіз рівня аберацій хромосом при опроміненні в дозі 1,5 Гр в S-періоді з додатковим постпроменевим гіпертермічним пригніченням процесів репарації (42 0С, протягом 1 год) у лімфоцитах осіб з нормальними (І група) та підвищеними (ІІ група) показниками радіочутливості хромосом за модифікованим G2-тестом. 1,7 відповідно. Найбільший модифікуючий ефект гіпертермії виявлявся в групі осіб з індивідуальними показниками радіочутливості, близькими до середньогрупового значення (І група) (рис.5). 17 Таблиця 5 Частота аберацій хромосом /на 100 клітин/ при комбінованій дії г-опромінення та підвищеної температури на ЛПК людини в S-періоді (40 год інкубації; фіксація 52 год) Доза, Гр Вивчено метафаз Число аберантних метафаз, % Загальна кількість аберацій Хроматидний тип Хромосомний тип делеції ізоделеції обміни фрагменти ацентричні кільця аномальні кільця центричні кільця дицентрики 42 С0 200 4,5 ( 1,4 4,5 ( 1,4 4,5 - - - - - - - 1,0 Гр 300 16,6(2,1 18,2(2,4 8,0 3,0 2,0 4,3 0,3 - 0,3 0,3 1,0 Гр + 42 0 С 300 33,0(2,7 41,2(3,7 18,0 8,3 2,7 6,6 2,3 0,3 - 3,0 1,5 Гр 250 20,5(2,2 22.6(2,0 12 3,5 2,4 3,5 0,2 - 0,3 0,5 1,5 Гр + 42 0 С 200 46,0(2,7 50,5(2,8 20,5 10,0 8,5 8,5 1,0 - 0,5 1,5 2,0 Гр 200 30,0(3,2 34,0(4,1 19,0 6,0 3,0 3,0 - - 1,0 2,0 2,0 Гр + 42 0 С 200 45,0(3,5 54,0(5,2 22,0 11,0 11,0 1,0 3,0 - - 6,0 3 Гр 200 39,5(3,3 49,5(5,0 19,5 8,5 15,0 5,0 1,0 - 0,5 - 3,0 Гр + 42 0 С 200 56,0(3,5 84,0(6,4 24,0 18,0 20,0 10,0 - 3,0 4,0 5,0 18 Це означає, що в осіб, гіперчутливих до дії радіації, процеси репарації істотно знижені (за нашими даними – у 1,6 рази), що, в свою чергу, зумовило порівняно незначний ефект радіомодифікації. Одержані результати вказують на вирішальну роль процесів репарації у формуванні підвищеної ІР людини на хромосомному рівні соматичних клітин. Крім того, з цих даних випливає важливий висновок: соматичні клітини осіб з підвищеною радіочутливістю потенційно менш чутливі до дії модифікаторів. В зв’язку з цим, при вивченні дії модифікаторів променевого ураження організму людини, доцільно враховувати показники його ІР. Таким чином, розроблений та апробований цитогенетичний спосіб оцінки ІР здорових осіб базується на фундаментальних радіобіологічних положеннях з урахуванням характеру залежностей “доза – ефект”, “стадія –ефект”, метафазного аналізу радіаційно-індукованих перебудов хромосом в першому мітотичному циклі, репараційного потенціалу індивідуума. Головні висновки та наукові положення, які випливають з одержаних результатів цитогенетичних досліджень, мають наукове значення для розуміння механізмів хромосомного мутагенезу та формування ІР на хромосомному рівні соматичних клітин людини. Представлені дослідження підтвердили істотний вплив процесів репарації на формування ІР людини, інтенсивність яких, як відомо, є генетично детермінованою ознакою. При цьому частота радіаційно-індукованих аберацій хромосом в G2-періоді може слугувати тестом для раннього виявлення осіб з підвищеною чутливістю до дії ІВ та сприятиме ефективності первинної профілактики радіогенних патологій, в тому числі злоякісних новоутворень. ВИСНОВКИ У дисертації наведено теоретичне узагальнення та нове практичне вирішення поставленого наукового завдання, що заключається в оцінці ІР людини на основі цитогенетичних показників, індукованих тестуючим опроміненням ЛПК умовно здорових осіб. В результаті грунтовного цитогенетичного дослідження розроблено алгоритм визначення показників ІР умовно здорових осіб та оцінено вплив процесів репарації на її формування. 19 На основі досліджень залежностей “стадія – ефект”, “доза – ефект” “час – ефект” для виходу аберацій хромосом при г - опроміненні культури ЛПК розроблено алгоритм оцінки ІР умовно здорових осіб, який полягає в тому, що за дії тестуючого опромінення в найбільш радіочутливому G2-періоді клітинного циклу ЛПК визначаються цитогенетичні показники, рівень яких, відповідно до сучасних фундаментальних уявлень радіобіології, відображає величину ІР організму. Він включає наступні умови: тестуюче г-опромінення культур ЛПК в дозі 1,5 Гр (потужність дози 1,0 Гр/хв) та його термін – пізній G2- період першого мітозу (46 год культивування); метафазний аналіз аберацій хромосом в першому післяпроменевому мітозі (фіксація культур на 52 год від початку культивування). Встановлено високу міжіндивідуальну варіабельність загальної частоти аберацій хромосом, індукованих тестуючим опроміненням ЛПК в групі обстеження, зумовлену варіабельністю одиночних делецій хроматидного типу (CV становить 34,5 та 37, 5% відповідно). Показано, що значення коефіцієнту міжіндивідуальної варіації радіочутливості хромосом в G2-періоді істотно перевищує одержане значення внутрішньоіндивідуальної варіації цитогенетичних показників ІР (34,5 і 6,1% для загального числа аберацій хромосом відповідно), що свідчить про високий ступінь відтворюваності досліджених показників. Вперше встановлено, що розподіл одержаних цитогенетичних показників ІР у референтній вибірці здорових індивідуумів не відповідає закону Гауса. Застосування методів варіаційної статистики виявило існування двох підгруп донорів – з нормальною і підвищеною радіочутливістю хромосом ЛПК (11,6% вибірки) та дозволило визначити граничні значення “норми” цитогенетичних показників ІР в групі обстеження: 12,8 і 63,1 аберацій хромосом/100 метафаз. Визначено, що індивідуальні розбіжності в радіочутливості хромосом формуються за рахунок рівня радіаційно-індукованих одиночних хроматидних делецій та клітин з множинними абераціями. В групі донорів з підвищеною чутливістю хромосом до тест-опромінення значення цих показників більш ніж удвічі перевищують одержані значення в групі донорів з нормальною радіочутливістю (61,0(1,8 делецій на 100 метафаз і 15,8% клітин з множинними абераціями проти 27,0(1,4 і 5,5% відповідно). 20 Встановлено, що в умовах гіпертермічної інактивації ферментів репарації найбільший її модифікуючий ефект виявляється в групі осіб із визначеними нормальними цитогенетичними показниками радіочутливості. У осіб з підвищеною ІР (за даними G2-тесту) репараційний потенціал знижений у 1,6 рази, що вказує на істотний вплив процесів репарації на формування підвищеної ІР. Результати оцінки ІР здорових осіб на оcнові цитогенетичних показників пропонуються для застосування в комплексних обстеженнях умовно здорового населення з метою визначення осіб, гіперчутливих до дії ІВ та підвищення ефективності первинної профілактики радіогенних патологій. ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ Пропонується впровадження розробленого методичного підходу до оцінки ІР на основі досліджуваних цитогенетичних показників та методичних рекомендацій у практику закладів охорони здоров’я, що здійснюють нагляд за особами, які мають (або мали) контакт із джерелами ІВ, зазнають впливу хронічного опромінення внаслідок дії факторів Чорнобильської катастрофи тощо з метою підвищення ефективності первинної профілактики радіогенних новоутворень. Список робіт, опублікованих по темі дисертації Індивідуальна радіочутливість людини / Дьоміна Е.А., Дружина М.О., Рябченко Н.М. ІЕПОР ім Р.Є. Кавецького НАН України. – К.: Логос, 2006. – 126 с. (написання окремих розділів, оформлення монографії). Цитогенетичний спосіб (G2-assay) визначення індивідуальної радіочутливості людини з метою первинної профілактики радіогенного раку / Дьоміна Е.А., Рябченко Н.М., Дружина М.О., Чехун В.Ф.: Методичні рекомендації. – Київ, 2007. – 28 с. (опрацювання та аналіз даних G2-тесту, оформлення). Дьоміна Е.А., Рябченко Н.М., Кудрявцева А.Г., Войціцький В.М. Оцінка і прогнозування індивідуальної радіаційної чутливості на основі тест-системи лімфоцитів периферичної крові людини // Вісник Київського національного ун-ту ім. Т. Шевченка. Біологія. – 2005. 21 - № 45/46. – С. 62-63 (участь у проведенні досліджень, обговоренні результатів і написанні статті). Рябченко Н.М., Дьоміна Е.А. Дослідження радіочутливості організму людини на основі використання тест-системи лімфоцитів периферичної крові // Проблеми радіаційної медицини та радіобіології: Зб. наук.праць. – Київ: НЦРМ, 2005. – Вип. 11. – С. 708-711 (проведення досліджень, участь у обговоренні результатів і написанні статті). Дьоміна Е.А., Рябченко Н.М. Оцінка індивідуальної радіочутливості умовно здорових осіб на основі розробленої схеми цитогенетичного обстеження // Лаб. діагностика.– 2006. – Т. 36, № 2. – С. 30-34 (проведення досліджень, опрацювання результатів, обговоренні результатів і написанні статті). Рябченко Н.М., Дьоміна Е.А. Індивідуальна радіочутливість хромосом лімфоцитів периферичної крові людини та значення процесів репарації у її формуванні // Актуальні проблеми акушерства і гінекології та медичної генетики: Зб. наук. праць. – Луганськ, 2006. – Вип. 13. – С. 239-243 (проведення досліджень, опрацювання результатів, написання статті) Рябченко Н.М., Дьоміна Е.А., Бариляк І.Р. Молекулярно-генетичні механізми формування радіочутливості людини // Вісник Укр. тов. генетиків і селекціонерів. – 2006. – Т.4, № 2. – С. 236–249 (пошук та аналіз літератури за тематикою, опрацювання результатів досліджень, написання статті). Dyomina E.A., Ryabchenko N.M., Druzhina M.O., Berezetskaya N.M., Klyushin D.A. Determination of individual radiosensitivity of relatively healthy donors on the basis of cytogenetic investigations // Current problems of radiation research. Proc. 35th annual meeting of the ERRS. – Kyiv: Inst.of cell diol. and genet.ingineering, 2007. – P. 162 – 168 (участь у проведенні досліджень, аналізі результатів, написанні та оформленні статті). Дьоміна Е.А., Рябченко Н.М. До питання про спонтанний рівень аберацій хромосом у лімфоцитах периферичної крові людини в постчорнобильський період // Х конгрес світ. федерації укр. лікарських товариств. Чернівці, 26 – 28 серпня 2004 р. – Чернівці -Київ-Чікаго, 2004. – С. 613. Дьоміна Е.А., Рябченко Н.М., Дружина Н.А., Клюшин Д.А., Іванкова В.С. Дослідження частоти аберацій хромосом в лімфоцитах периферичної крові мешканців м. Києва, індукованих тестуючим опроміненням in vitro (G2 assay) // Міжнар. конф. “Парадигми 22 сучасної радіобіології. Радіац. захист персоналу об’єктів в атомної енергетики”. Київ-Чорнобиль, 27 верес. –1 жовт. 2004 р. – Чорнобиль, 2004. – С. 55. Dyomina E.A., Ryabchenko N.M. Radiosensitivity of human chromosomes estimated on the basis of the application of the test-system of peripheral blood lymphocytes // Chromosome Res. – 2005. – Vol.13, Suppl. 1. – P. 109. Ryabchenko N., Dyomina E., Druzhyna M. Role of reparation in the formation of human individual radiosensitivity // Mat. 34th Sci. Meeting of ESRB. Leichester (UK), 5 – 9 Sept. 2005. – Leichester, 2005. – P. 207. Dyomina E.A., Ryabchenko N.M. Estimation of Human Individual Radiosensitivity in the Post-Chernobyl Period // Mat. ECRR International Congress “Chernobyl – 20 years Later”. Berlin, 3 – 5 April 2006. – Berlin, 2006 – P. 64-65. Рябченко Н.М., Демина Э.А., Иванкова В.С. Индивидуальные различия в радиочувствитeльности хромосом лимфоцитов человека: роль процессов репарации в их формировании//V Съезд по радиационным исследованиям. Москва, 10-14 апреля 2006. – Москва, 2006.– T. 1. – С. 68. Демина Э.А., Рябченко Н.М. Целесообразность исследования индивидуальной радиочувствительности условно здоровых лиц после Чернобыльской катастрофы // Int.J.Rad. Medicine. – 2006. – No 8(1). – P. 42. Diomina Е.А., Ryabchenko N.M. Individual sensitivity of human lymphocytes chromosomes to radiation: stage-effect dependence // Eropean J. Human Genetics. – 2006. – Vol. 14, Suppl. 1. – P. 171. Рябченко Н.М., Дьоміна Е.А. Визначення індивідуальної радіочутливості людини з метою первинної профілактики радіогенного раку // Тези доп. міжнар. наук.-практ. конф. “Віддалені наслідки впливу іонізуючого випромінювання”. Київ, 26 – 27 квітня 2007 р. – К.: “НІЧЛАВА”, 2007. – С. 178. Ryabchenko N., Dyomina E. Іndividual radiosensitivity assessment in healthy individuals in post chornobyl period // Proc. 5th Int. Conf. on Environmental Mutagens in Human Populations. Antalia 20 – 24 May, 2007. – Antalia, 2007. – P. 54. 23 АНОТАЦІЯ Рябченко Н.М. Визначення індивідуальної радіочутливості людини на основі цитогенетичних показників. ( Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.01 – радіобіологія. Науковий центр радіаційної медицини АМН України. Київ, 2007. На основі досліджень залежностей “стадія – ефект”, “доза – ефект” для виходу аберацій хромосом при г - опроміненні культури лімфоцитів периферичної крові розроблено алгоритм цитогенетичної оцінки індивідуальної радіочутливості умовно здорових осіб. Застосування методів варіаційної статистики дозволило виявити в групі обстеження існування донорів з нормальною і підвищеною радіочутливістю хромосом (11,6 % вибірки) та визначити граничні значення “норми” цитогенетичних показників радіочутливості. Визначено істотний вплив процесів репарації на формування підвищеної радіочутливості людини та показано, що репараційний потенціал у осіб з підвищеною чутливістю до радіації (за G2-тестом) знижений у 1,6 рази. Розроблений спосіб визначення ІР здорових осіб на оcнові цитогенетичних показників пропонується для комплексних обстежень умовно здорового населення з метою визначення осіб, гіперчутливих до дії ІВ та підвищення ефективності первинної профілактики радіогенних патологій. Ключові слова: іонізуюче випромінювання, індивідуальна радіочутливість, аберації хромосом, G2-тест. аннотация Рябченко Н.Н. Определение индивидуальной радиочувствительности человека на основе цитогенетических показателей. ( Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.01 – радиобиология. Научный центр радиационной медицины АМН Украины. Киев, 2007. 24 Результаты экспериментальных исследований диссертационной работы представляют оригинальное решение актуальной научно-практической задачи радиобиологии, а именно – оценка индивидуальной радиочувствительности человека на основе цитогенетических показателей, индуцированных тестирующим (in vitro) облучением в лимфоцитах периферической крови в G2-периоде клеточного цикла. На основе исследований зависимостей “стадия – эффект”, “доза – эффект” для выхода аберраций хромосом при г-облучении культуры лимфоцитов разработан алгоритм определения радиочувствительности условно здоровых лиц, который предусматривает: тестирующее г-облучение культур в дозе 1,5 Гр (мощность дозы 1,0 Гр/мин) и его срок – поздний G2-период первого митоза; метафазный анализ аберраций хромосом в первом постлучевом митозе. Изучение полученных индивидуальных цитогенетических показателей радиочувствительности 103-х условно здоровых лиц выявило их высокую вариабельность. Коэффициент вариации общего числа аберраций хромосом составил 34,5%, хроматидных делеций – 37,5%. Последние доминировали в спектре радиационно-индуцированных в G2-периоде аберраций хромосом и обусловили вариабельность полученных показателей, что позволяет рассматривать их в качестве специфического цитогенетического показателя индивидуальной радиочувствительности человека. Показано, что межиндивидуальная вариабельность индуцированной в G2-тесте частоты аберраций хромосом была значительно выше внутрииндивидуальной вариабельности (34,5% и 6,1% соответственно), что свидетельствует о высокой воспроизводимости полученных индивидуальных показателей радиочувствительности. Применение методов вариационной статистики и анализ выявленного бимодального распределения исследуемых показателей позволило установить пределы их нормальных значений и выявить лица с повышенной радиочувствительностью хромосом (11,6% выборки), детерминированной генетически. Апробированная схема цитогенетического исследования позволила оценить существенное влияние процессов репарации, а именно их угнетения, на формирование повышенной радиочувствительности. Показано, что в условиях постлучевой гипертермической инактивации ферментов репарации наибольший модифицирующий эффект наблюдается в группе лиц с показателями радиочувствительности, близкими к среднегрупповому значению. У лиц с повышенными индивидуальными показателями 25 радиочувствительности хромосом (по данным G2-теста) репарационный потенциал снижен в 1,6 раза. Разработанный способ оценки индивидуальных цитогенетических показателей радиочувствительности предлагается в комплексных обследованиях здорового населения с целью определения лиц, гиперчувствительных к действию радиации и повышения эффективности первичной профилактики радиогенных патологий. Ключевые слова: ионизирующее излучение, индивидуальная радиочувствительность, аберрации хромосом, G2-тест. summary Ryabchenko N.M. Determination of human individual radiation sensitivity on the basis of cytogenetic parameters. – Manuscript. Thesis for the scientific degree of Candidate of Biological Sciences, speciality 03.00.01 - radiobiology. Research Centre for Radiation Medicine of Academy of Medical Sciences of Ukraine. Kyiv, 2007. On the basis of the investigations of “stage-effect” and “dose-effect” dependencies for chromosomal aberrations induced by г-irradiation in human peripheral blood lymphocytes the algorythm of cytogenetic evaluation of human individual radiosensitivity was adopted. Application of the variation statistics made it possible to determine individuals with increased chromosomal radiosensitivity (11.6% of referent sample) and limits of normal cytogenetic parameters values of radiosensitivity. Essential influence of repair processes on chromosomal individual radiosensitivity formation was investigated. It was shown that repair efficiency in radiosensitive cells is 1.6 times lower than in normal. Developed method of human individual radiosensitivity estimation based on cytogenetic parameters is proposed for complex examinations among healthy population with the purpose to determine individuals with the increased radiosensitivity and promote primary prevention of radiogenic pathologies. Key words: ionising radiation, individual radiosensitivity, chromosomal aberrations, G2-assay. Рис.1. Кінетика загальної частоти аберацій хромосом в культурі лімфоцитів людини, індукованих г-опроміненням протягом клітинного циклу (лінії А – фіксація на 58 год, решта – фіксація на 52 год).

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *