Вивчення імунобіологічних властивостей збудника та розробка інактивованої вакцини проти вірусної діареї великої рогатої худоби (автореферат)

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

Національний науковий центр

“ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ

ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ”

ГОДОВСЬКИЙ ОЛЕКСІЙ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

УДК 619:616.98:578.833.3

Вивчення імунобіологічних властивостей збудника та розробка
інактивованої вакцини проти вірусної діареї великої рогатої худоби

16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Харків – 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному науковому центрі “Інститут
експериментальної і клінічної ветеринарної медицини”.

Науковий керівник кандидат ветеринарних наук, старший науковий
співробітник Стеценко Володимир Іванович, Національний науковий центр
“Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини”,
завідувач відділу вірусології.

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор Ковальов Василь
Львович, Південна філія “Кримський агротехнологічний університет”
Національного аграрного університету Кабінету Міністрів України,
завідувач кафедри епізоотології, паразитології та ветсанекспертизи;

кандидат ветеринарних наук, старший науковий співробітник Кучерявенко
Олександр Олександрович, Інститут ветеринарної медицини Української
академії аграрних наук, провідний науковий співробітник лабораторії з
вивчення лептоспірозу сільськогосподарських тварин.

Захист відбудеться “ 4 ” грудня 2007 р. о 13 годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 у ННЦ “ІЕКВМ” за адресою: 61023,
м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ННЦ “ІЕКВМ” за адресою:
61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий “ 26 ” жовтня 2007 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор ветеринарних наук, професор Бабкін А. Ф

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Провідну роль в етіології пневмоентеритів телят
відіграють збудники вірусної природи: інфекційного ринотрахеїту,

парагрипу-3, вірусної діареї, парвовірусної та аденовірусної інфекцій
великої рогатої худоби (ВРХ). Вірусна діарея займає особливе місце в
інфекційній патології молодняку великої рогатої худоби, а на думку
окремих дослідників вона відіграє провідну роль (Афонюшкин В.Н., 2004;
Бабкін М.В., 1998; Білоконь В.С., 1970; Кучерявенко В.В., 2005;
Кучерявенко Р.О., 1999;

Стеценко А.В., 1999; Стеценко В.І. 2004; Сюрин В.Н., 1998; Закутский
Н.И., 1998, Фісенко С.А., 1999; Чебанюк І.В., 2004; Чечоткіна Н.П.,
1999; Baker J.C. 1987; Bolin S.R., 1995; Ring C., 1985; Smith
D.R.,1998; Houe H., 1995).

Економічні збитки, які завдає вірусна діарея, обумовлені тривалою
персистенцією збудника та його здатністю викликати імуносупресію, що
сприяє розвитку інших інфекційних хвороб та змішаних інфекцій. У випадку
ураження вірусом плоду можуть народжуватись імунотолерантні до вірусу
діареї або персистентно інфіковані телята, які є стаціонарним
резервуаром вірусу в стаді. Персистентна інфекція є причиною гострого
перебігу хвороби слизових та загибелі тварин у випадку їх зараження
цитопатогенним штамом вірусу діареї (Сюрин В.Н., 1984; Barber D.M.L.,
1985; Duffell S.J., 1984).

Найбільш ефективним методом боротьби з вірусною діареєю залишається
вакцинація сприйнятливого поголів’я тварин. На жаль, до останнього часу
в Україні не існувало впроваджених у виробництво засобів специфічної
профілактики цієї хвороби.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна
робота виконувалась відповідно до плану науково-дослідних робіт ІЕКВМ
УААН за завданнями: 05. “Розробити та впровадити комплексну систему
діагностики, терапії та профілактики інфекційних та незаразних хвороб
жуйних тварин” (2001–2005 рр.), державна реєстрація № 0101U001610, та

04. “Розробити на основі прогресивних технологій ефективну систему
діагностики, терапії та профілактики хвороб, спільних для різних видів
тварин” (2001–2005 рр.), державна реєстрація № 0101U001616.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи – вивчити імунобіологічні
властивості збудника та розробити інактивовану вакцину проти вірусної
діареї великої рогатої худоби.

Основні завдання досліджень:

провести аналіз епізоотичної ситуації та вакцинопрофілактики щодо
вірусної діареї в світі;

вивчити особливості репродукції трьох штамів вірусу діареї в
перещеплюваних культурах клітин, підібрати штам-продуцент вірусного
антигену та систему його накопичення;

відпрацювати мікрометод титрування вірусу діареї та методику постановки
реакції нейтралізації мікрометодом;

відпрацювати параметри інактивації вірусу діареї формаліном;

оцінити вплив живого вірусу діареї та різних зразків інактивованої
вакцини на імуногормональний статус тварин;

підібрати ад’ювант і визначити його оптимальне співвідношення з
антигеном у вакцині;

розробити технологію виготовлення вакцини, вивчити її властивості на
тваринах та визначити оптимальну дозу щеплення.

Об’єкт дослідження: вірусна діарея великої рогатої худоби, специфічна
профілактика вірусної діареї великої рогатої худоби.

Предмет дослідження: епізоотична ситуація та поширення вірусної діареї в
світі, біологічні властивості штамів вірусу діареї, клітинні системи для
накопичення вірусу та режими його культивування, технологічні етапи
виробництва та контролю на стерильність, імуногенність, нешкідливість,
антигенну активність інактивованої вакцини проти вірусної діареї великої
рогатої худоби.

Методи досліджень: епізоотологічні, вірусологічні, серологічні,
біотехнологічні, клінічні, біохімічні, імунологічні та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше в Україні:

визначено тенденцію розвитку епізоотичного процесу щодо вірусної діареї
ВРХ у світі;

вивчено антигенну спорідненість та відмінності трьох штамів вірусу
діареї, а також імуногормональну відповідь організму тварин на введення
живого та інактивованого вірусу діареї;

розроблено й впроваджено у виробництво інактивовану вакцину проти
вірусної діареї великої рогатої худоби;

вивчено реактогенні та імуногенні властивості вакцини, виготовленої на
основі кремнійвміщуючого ад’юванту “КЕ 10-01”, на лабораторних і
сільськогосподарських тваринах;

визначено дозу вакцини, яка забезпечує утворення і підтримку напруженого
імунітету впродовж 6 місяців (термін спостереження).

Новизна розробки підтверджена деклараційним патентом Украйни

№ 6072 на корисну модель “Вакцина інактивована проти вірусної діареї
великої рогатої худоби”, опубл. 15.08.2004 року.

Практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень
використані при розробці нормативної документації на вакцину
інактивовану проти вірусної діареї великої рогатої худоби (інструкція з
виготовлення і контролю препарату, яка розглянута та схвалена методичною
радою

ННЦ „ІЕКВМ” та затверджена 8 грудня 2004 року, протокол № 16;

ТУ У 24.4-00497087-010:2006 та настанову по застосуванню вакцини, які
затверджені Головним державним інспектором ветеринарної медицини України
24 листопада 2006 р. На вакцину отримане реєстраційне посвідчення

№ 2511-04-0292-07, видане Державним департаментом ветеринарної медицини
України 23 березня 2007 року.

Розроблено регламент виготовлення та впроваджено у виробництво в умовах
Сумської біологічної фабрики інактивовану вакцину проти вірусної діареї
великої рогатої худоби, де виготовлено понад 27 000 доз вакцини.
Запропоновано оптимальні параметри інактивації вірусу формаліном,
використання ад’юванту КЕ 10-01 та його оптимальне співвідношення з
антигеном. Відпрацьовано мікрометоди визначення інфекційної активності
вірусу діареї та постановки реакції нейтралізації.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведено аналіз
літературних даних за темою дисертаційної роботи; самостійно проведено
аналіз епізоотичної ситуації щодо вірусної діареї ВРХ у світі;
розроблені схеми проведення експериментів у лабораторних та виробничих
умовах; виконано експериментальні та аналітичні дослідження; проведено
аналіз та узагальнення отриманих результатів; сформульовано висновки та
практичні пропозиції; підготовлено проект нормативної документації з
виготовлення, контролю та застосування інактивованої вакцини проти
вірусної діареї великої рогатої худоби.

Гематологічні дослідження проведено спільно з співробітниками
лабораторії біохімії ННЦ “ІЕКВМ” (к. біол. Н. Л. В. Коваленко,

к. біол. н. М. Є. Романько). Визначення належності досліджуємих штамів
до вірусної діареї проведено у полімеразній ланцюговій реакції у
лабораторії молекулярної діагностики ННЦ “ІЕКВМ” спільно з к. вет. н.
А.П. Геріловичем. Цитологічні дослідження проведено за участю наукового
співробітника лабораторії вивчення лейкозу Н.В. М’ягких. Методичні
вказівки по постановці реакції нейтралізації мікрометодом для визначення
нейтралізуючих антитіл до вірусу діареї–хвороби слизових великої рогатої
худоби підготовлено за участю завідувача лабораторії епізоотології ННЦ
“ІЕКВМ” к. вет. н. М. В. Бабкіна. Дослідження гормонального статусу
тварин проведено спільно з

к. біол. н. Симиренко Л.Л.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації
представлені та обговорені на засіданнях Вченої ради ННЦ “ІЕКВМ”
2000–2006 рр., засіданнях методичної ради ННЦ “ІЕКВМ” та на міжнародних
науково-практичних конференціях: “Актуальні проблеми ветеринарної
медицини в умовах сучасного ведення тваринництва”, м. Феодосія, АР Крим,

26 травня – 2 червня 2003 р.; “Сучасні проблеми діагностики інфекційних
хвороб тварин”, м. Харків, 2–3 грудня 2003 р.; “Ветеринарна
медицина–2004: сучасні аспекти розробки, маркетингу і виробництва
ветеринарних препаратів”, АР Крим, м Феодосія (24–31 травня 2004 р.);
“Ветеринарна медицина–2005: сучасний стан та актуальні проблеми
забезпечення ветеринарного благополуччя тваринництва”, присвяченої 90
річчю від дня народження академіка Івана Микитовича Гладенка, АР Крим,
м Ялта (30 травня–4 червня 2005 р.). Міжлабораторні та виробничі
комісійні випробування вакцини інактивованої проти вірусної діареї
великої рогатої худоби проведено у 2005-2006 роках.

Публікації. Основні положення дисертаційної роботи викладені

у 5 наукових працях, опублікованих у фахових виданнях, перелік яких
затверджено ВАК України; методичних вказівках, отримано деклараційний
патент України на корисну модель.

Структура та обсяг дисертації. Основний зміст дисертації викладено на
131 сторінці друкованого тексту і складається з таких розділів: вступ,
огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати власних
досліджень, обговорення отриманих результатів, висновки, список
використаної літератури, додатки. Роботу ілюстровано 13 рисунками та 19
таблицями. Список використаних літературних джерел включає 260
найменувань, в тому числі

152 зарубіжних авторів.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Наукові дослідження виконувалися протягом 1997–2006 рр. у лабораторії
вірусології та лабораторії епізоотології ННЦ “ІЕКВМ”. Міжлабораторні та
міжвідомчі комісійні випробування вакцини проводили у неблагополучних
щодо вірусної діареї господарствах Харківської та Полтавської областей.

Епізоотичну ситуацію щодо вірусної діареї в світі вивчали за офіційними
звітними даними Міжнародного епізоотичного бюро (МЕБ).

В лабораторних дослідах використовували;

– перещеплювані культури клітин трахеї теляти (ТрТ), нирки вівці (НВ),
коронарних судин теляти (КСТ) та нирки теляти (НТ);

– штами вірусу діареї: Oregon C24V – еталонний з вихідним інфекційним
титром 5,5 lg ТЦД50/см3 і епізоотичні 25 з вихідним інфекційним титром

5,0 lg ТЦД50/см3 та ВК- 1 з вихідним інфекційним титром 5,75 lg
ТЦД50/см3;

– 279 проб сироватки крові, які отримували від лабораторних тварин та
великої рогатої худоби з неблагополучних щодо вірусної діареї
господарств Харківської та Полтавської областей.

Досліди проведено на 160 білих мишах вагою 20–25 г, 42 кролях масою від
2,0 до 4,0 кг, 48 телятах 3–4- місячного віку та 60 коровах. Вакцина
випробувана в комісійних дослідах на 4357 головах великої рогатої худоби
різних вікових груп.

Дослідження проводили, керуючись принципами гуманного відношення до
тварин у відповідності з Міжнародними рекомендаціями, з дотриманням
біоетичних норм і вимог Міжнародного комітету по науці та вимог статті
26 закону України про захист тварин від жорстокого поводження (правила
поводження з тваринами, що використовуються в наукових експериментах,
тестуванні, навчальному процессі та виробництві біопрепаратів).

Інфекційну активність різних штамів вірусу діареї визначали їх
титруванням у культурі клітин за макро- та мікрометодами. Титр вірусу
розраховували за методикою Ріда та Менча, який виражали в тканинних
цитопатогенних дозах (ТЦД50/см3) (Перадзе Т. В., 1985). Специфічність
цитопатогенної дії вірусу діареї підтверджували за допомогою реакції
імунофлуоресценції з використанням комерційного набору для діагностики
вірусної діареї – хвороби слизових великої рогатої худоби в реакції
імунофлуоресценції виробництва ДП “Ветеринарна медицина” (Україна).

З метою підбору клітинної системи для культивування і накопичення вірусу
діареї інфікували моношар клітин НТ, НВ, ТрТ, КСТ штамами Oregon C24V,
25 та ВК- 1 в дозі 0,02 – 0,05 ТЦД50/кл. Проведено дев’ять послідовних
пасажів на кожній культурі клітин із визначенням інфекційної активності
штамів вірусу на рівні 3-го, 6-го та 9-го пасажів.

Належність штамів, що досліджувались, до вірусу діареї та відсутність
контамінації вірусом діареї культури клітин, яку використовували для
репродукції, визначали за допомогою полімеразної ланцюгової реакції
(ПЛР) з використанням комерційного набору для виявлення РНК вірусу
діареї виробництва НВО “Нарвак” (Москва, Російська Федерація).

Постановку реакції нейтралізації (РН) проводили макрометодом у пробірках
та мікрометодом у культуральних планшетах з постійною дозою вірусу
1000 ТЦД50/см3 та дворазовими розведеннями досліджуваних сироваток
крові. За титр антитіл досліджуваної сироватки приймали останнє
розведення, яке стримувало розвиток цитопатогенної дії вірусу у 50 %
пробірок з інфікованою культурою клітин.

Антигенну спорідненість штамів вірусу діареї визначали за методичними
рекомендаціями з визначення антигенної споріденості, відмінностей та
домінування вірусів у серологічних реакціях (Прискока В.А., Собко А.И.,
Манний К.В. 1987).

Контроль вакцини здійснювали за такими показниками якості: стерильність,
нешкідливість, повнота інактивації вірусу, антигенна та імуногенна
активність.

Стерильність визначали за ДСТУ 4483:2005 “Препарати ветеринарні
імунобіологічні. Методи виявлення контамінації бактеріальною та
грибковою мікрофлорою”. Нешкідливість зразків та дослідних серій вакцини
перевіряли за ГСТУ 46.024-2002 “Препарати ветеринарні. Методи визначення
нешкідливості”. Повноту інактивації вірусу визначали на культурі клітин
КСТ за відсутністю цитопатогенної дії вірусу у трьох послідовних
пасажах. Антигенну активність вакцини визначали за наявністю специфічних
антитіл до вірусу діареї у сироватці крові щеплених тварин у реакції
нейтралізації. Імуногенну активність зразків вакцини оцінювали в реакції
нейтралізації за приростом антитіл до вірусу діареї у сироватках крові,
за приростом маси тіла та рівнем загибелі молодняку щеплених тварин.

Реактогенні та антигенні властивості зразків інактивованої вакцини проти
вірусної діареї великої рогатої худоби визначали на кролях, яким вводили
вакцину у дозі 0,5 см3 внутрішньом’язово з інтервалом 14 діб. На 7-му,
14-ту, 21-шу та 28-у доби відбирали проби крові для серологічних та
гематологічних досліджень.

Оцінку стану клітинного імунітету за показниками фагоцитарної
активності, фагоцитарного числа, кількості лейкоцитів та лейкоцитарної
формули проводили за методом В. Н. Чеботкевича, С. І. Латинського
(1998).

Вміст загального білка в сироватці крові визначали за допомогою набору
реактивів виробництва НВП “Реагент” (Україна).

Визначення рівня серомукоїдів у пробах сироватки крові проводили за
методом Веймера та Мошина (Чеботкевич В.Н., 1998), циркулюючих імунних
комплексів (ЦІК) – за методом Ю. А. Гриневича шляхом преципітації 3,5 %
розчином поліетиленгликолю (ПЕГ-тест), ОЩ 280 (Меньшиков В. В., 1987).

Участь гормонів системи гіпофіз–щитовидна залоза (тиреотропіну,
тироксину та трийодтироніну) та глюкокортикоїдної функції кори
надниркової залози (кортизолу) в процесі формування поствакцинального
імунітету до інактивованого вірусу діареї досліджували у лабораторних
умовах на кролях.

Концентрацію гормонів визначали у сироватці крові за допомогою
стандартних наборів реактивів для радіоімунологічного аналізу
виробництва Інституту біоорганічної хімії АН (Республіка Білорусь).
Зразки крові відбирали з крайової вушної вени, зранку, до годівлі.

Антигенну активність вакцини вивчали на глибокотільних коровах: тваринам
трьох груп вводили вакцину у дозі 3, 5 та 10 см3 відповідно. Для
визначення динаміки накопичення вірусонейтралізуючих антитіл у тварин
відбирали кров через 14, 21-ну та 28-м діб після введення вакцини, у
день отелення та через 7 діб, через 3 та 6 місяців після вакцинації. Від
усіх тварин відбирали проби молозива та молока за схемою: у день
отелення, на 2-гу, 3-тю, 7-му, 14-ту та 21-шу доби після отелення. Проби
досліджували за допомогою реакції нейтралізації.

Статистичну обробку результатів досліджень проводили з визначенням
критеріїв вірогідності за Ст’юдентом (Рокицкий П. Ф., 1973; Чистяков И.
А., 1966). Облік результатів здійснювали за допомогою програми “Excel –
XP”

з програмного пакету Мс Office XP на персональному комп’ютері ІВМ
РС/АТ.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Стан епізоотичної ситуації щодо вірусної діареї ВРХ у світі. Вірусна
діарея має значне та нерівномірне поширення у світі, хворобу реєструють
на всіх континентах. Найбільш поширена вона в Європі (35 країн) та
Америці

(26 країн). В Азії, згідно звітів МЕБ, більшість країн благополучні на
вірусну діарею. Найменш з’ясована епізоотична ситуація в Африці, де за
період

1996–2004 рр. у 14 з 47 країн не визначено статус щодо вірусної діареї.
Стаціонарно неблагополучна щодо вірусної діареї великої рогатої худоби
Австралія та Нова Зеландія. Результати проведеного аналізу свідчать про
значне розповсюдження захворювання в економічно розвинених країнах
Європи та Америки. З 46 країн Європи благополучними щодо вірусної діареї
вважаються лише 5, а в Америці з 34 країн – лише 6.

За даними МЕБ, для боротьби з вірусною діареєю досить широко
використовують вакцинацію тварин. У 1996 році щеплення проти вірусної
діареї застосовувалось у 15 країнах, а у 2004 році кількість країн, які
застосовують вакцинопрофілактику вірусної діареї, зросла до 22, що
свідчило про зростання уваги в світі до цього захворювання. За період,
що було проаналізовано, суттєво зросла загальна кількість тварин, які
були вакциновані проти вірусної діареї. У 1996 році щеплено 111 426, а у
2004 році

вже 13 818 153 тварин. Але слід приймати до уваги, що не всі країни
надають інформацію щодо кількості тварин, які були піддані вакцинації
проти вірусної діареї великої рогатої худоби, тому ці показники можуть
бути дещо занижені. Так, відсутні дані про обсяги застосування
вакцинації проти вірусної діареї великої рогатої худоби у таких країнах,
як Аргентина, Болгарія, Канада, Німеччина , Корея, Нова Зеландія, Перу,
Іспанія, Китай, Венесуела, Зімбабве, Ямайка та деяких інших. За даними
МЕБ, на 2004 рік епізоотична ситуація щодо вірусної діареї в Україні не
визначена, але, за результатами досліджень співробітників ННЦ “ІЕКВМ”:
Білоконь В.С., Кучерявенко В.В.,

Кучерявенко Р.О., Стеценко А.В., Стеценко В.І., Фісенко С.А., Чебанюк
І.В., Чечоткіна Н.П., вірусна діарея має значне поширення на території
нашої країни.

Розробка технології виготовлення інактивованої вакцини проти вірусної
діареї великої рогатої худоби. Розробка технології виготовлення
інактивованої вакцини проти вірусної діареї великої рогатої худоби
передбачала вивчення біологічних властивостей вірусу, підбір оптимальної
клітинної системи для культивування вірусу та найбільш активний в
антигенному відношенні штам вірусу, оптимізацію умов культивування та
інактивації збудника, підбір ад’юванту.

Підбір штаму вірусу діареї та клітинних систем для його культивування.
За результатами досліджень чутливості культур клітин до різних штамів
вірусу діареї встановлено, що в культурах клітин ТрТ і КСТ на рівні 9-го
пасажу забезпечувалось накопичення вірусу штамів ВК–1 та 25 у титрах

(7,38±0,05) lg ТЦД50/см3 та (7,08±0,21) lg ТЦД50/см3, відповідно.
Специфічність цитопатогенної дії підтверджено за допомогою РІФ та ПЛР,
завдяки чому було визначено належність РНК досліджених вірусних штамів
до вірусу діареї та відсутність контамінації вірусом культури клітин
КСТ.

Дослідженнями щодо визначення оптимальних умов та режиму культивування
вірусу діареї було виявлено залежність рівня накопичення вірусу від
ступеня виповнення моношару культури клітин при його інфікуванні та від
дози інфікування культури клітин вірусом. Встановлено, що вихід вірусу
був найвищим за умов зараження в період найвищої мітотичної активності
клітин – 7,4 lg ТЦД 50/см3 та 7,0 lg ТЦД 50/см3 для культур клітин КСТ
та ТрТ відповідно та знижувався на 0,6–0,5 lg ТЦД50/см3 при інфікуванні
культури у стаціонарній фазі росту клітин.

Експериментально доведено, що оптимальна множинність зараження культури
клітин вірусом діареї складала – 0,1 — 0,01 ТЦД 50/клітину.

З метою відбору штаму-продуценту вивчено антигенну спорідненість та
відмінності між різними штамами вірусу діареї. Для цього на кролях були
отримані штамоспецифічні сироватки з активністю: до штаму

ВК-1 – (6,25±0,25) log2, до штаму 25 – (5,0±0,04) log2, та до штаму
Oregon C24V – (4,75±0,25) log2. Для постановки перехресної РН було
використано штами вірусу діареї на рівні дев’ятого пасажу: ВК-1 з титром
7,38 lg ТЦД50/см3; 25 з титром 7,08 lg ТЦД50/см3 та штам Oregon C24V з
титром 6,55 lg ТЦД50/см3.

За результатами досліджень була встановлена ступінь антигенної
спорідненості між дослідженими штамами: між ВК-1 і 25 – 87 %, між ВК-1
і Oregon C24V – 83 % та між Oregon C24V і 25 – 80 %. Антигенна
відмінність для вищезазначених штамів складала: між ВК-1 і 25 – 4,9 %,
між ВК-1 і Oregon C24V – 4,8 %, між Oregon C24V і 25 – 6,2 %.

Найвища антигенна спорідненість виявлена між штамами ВК-1 і 25 вірусу
діареї. Антигенна відмінність між штамами ВК-1 і 25 та ВК-1 і Oregon
C24V була майже на одному рівні – 4,9 та 4,8 %, відповідно. Отже, штам
ВК-1 визначено найбільш антигенноспорідненним до польового та музейного
штамів вірусу діареї, тому його обрали для подальших досліджень з
розробки інактивованої вакцини.

Визначення параметрів інактивації вірусу. Результати вивчення
інактивуючої дії формаліну на вірус діареї в залежності від дози
формальдегіду та часу інактивації наведено на рис. 1.

Рис. 1 Динаміка інактивуючої дії різних концентрацій формальдегіду на
вірус діареї

За результатами досліджень встановлено оптимальну концентрацію
формальдегіду для інактивації вірусу діареї, яка складала 0,1 %

протягом 18 годин. Оскільки в інактивованій вакцині вірус повинен
повністю втратити інфекційну активність, строк інактивації збільшено до
24 годин за

температури 37 °С.

Вивчення імуногормональних взаємозв’язків у динаміці формування
поствакцинального імунітету. Стимуляцію імуногенезу з боку зростаючого
рівня гормонів системи гіпофіз–щитовидна залоза у відповідь на антигенне
навантаження кролів живим вірусом діареї визначали протягом 14-добового
періоду. Відсутність стимуляції функціональної активності щитовидної
залози тиреотропним гормоном гіпофізу вказує на прояв супресії
клітинного та гуморального імунітету, що підтверджувалось низьким титром
антитіл у щеплених тварин.

З метою з’ясування імуногормональних взаємозв’язків було вивчено
особливості глюкокортикоїдної функції
гіпоталамо-гіпофізарно-адренокортикальної системи у кролів в динаміці
формування поствакци-нального імунітету при використанні інактивованого
вірусу діареї.

Встановлено позитивний взаємозв’язок між глюкокортикоїдним статусом
тварин до вакцинації та рівнем антитілогенезу на 14-ту добу після
ревакцинації. Рівень антитіл до вірусної діареї корелював з
концентрацією кортизолу у сироватці крові.

Процес формування поствакцинального імунітету у кролів, щеплених двома
варіантами вакцини з інактивованим вірусом діареї, не супроводжувався
вірогідними змінами у глюкокортикоїдному статусі, що вказувало на
відсутність супресорного впливу інактивованого вірусу на антитілогенез.

Вибір ад’юванту та його оптимального співвідношення з антигеном при
розробці інактивованої вакцини проти вірусної діареї. З метою вибору
ефективного ад’юванту були виготовлені зразки вакцини з вірусу діареї
штаму ВК–1, інактивованого формаліном в кінцевій концентрації 0,1 %, та
різних за складом та механізмом дії адьювантів: ГОА, КЕ 10-01, аеросилу,
марколу та колоїдного заліза. Встановлено, що через 14-ть діб після
другого введення зразків вакцини кролям найвищий рівень противірусних
антитіл виявлено в групах, в яких застосовували препарат з КЕ 10-01 та
ГОА, в титрі — 7,41 log2 та 7,0 log2, відповідно, а найнижчий — в групі
з “колоїдним залізом”, який склав 5,83 log2. Динаміка гематологічних
показників у крові кролів, щеплених зразками інактивованої вакцини, була
позитивною і характеризувалася помірним лейкоцитозом вже на перше
введення препарату.

?

?

?

® ? F

~

D

|

yyyya$ |

?

E

E

?

?

&

&

&

\

&

&

d ¤x`„?a$

0акопичення антитіл у різних видів тварин, подальші досліди щодо підбору
ад’юванту проводили на телятах.

У телят, двічі щеплених препаратом з ГОА, титр антитіл (АТ) через 14 діб
після другого введення становив 4,0±0,3 lоg2 (Р ? 0,05), що на 2,2 lоg2
вище, ніж вихідний титр. У телят, яким було інокульовано вакцину з КЕ
10-01, титр антитіл до вірусу діареї підвищився до 6,0±0,3 lоg2 (Р ?
0,05) – на 4 lоg2 вище у порівнянні з титром до застосування вакцини, а
у групі, в якій було використано ад’ювант маркол, антитіла виявляли в
титрах 5,2±0,6 lоg2

(Р ? 0,05), тобто вищих на 3,2 lоg2. У тварин контрольної групи
сероконверсії до вірусу діареї не спостерігали протягом всього досліду.
Отже, більш активну імунну відповідь стимулював зразок препарату з
ад’ювантом КЕ 10-01.

Для отримання максимального рівня противірусних антитіл при застосуванні
інактивованої вакцини виникла необхідність визначити оптимальне
співвідношення антигену та ад’юванту. Були виготовлені зразки, які
вміщували 10, 20, 40, 60 та 80 % ад’юванту. Кожен зразок вводили
дворазово з інтервалом 14 діб окремій групі з 5 морських свинок масою

300–400 г. Контролем були інтактні тварини-аналоги. Від тварин відбирали
кров через 14, 21, 28, 35 та 42 доби після останнього введення препарату
та отримували сироватку, в якій визначали титр противірусних антитіл.
Результати дослідження наведені на рис. 2.

Рис. 2 Результати визначення залежності титру противірусних антитіл у
тварин від співвідношення ад’юванту та антигену в складі вакцини

Швидке падіння титрів противірусних антитіл у групах тварин, яким
застосовували вакцину з 10 та 20 % ад’юванту, вказувало на недостатнє
утворення депо препарату в місці введення або на швидке його
розсмоктування. Застосування 40, 60 та 80 % ад’юванту в складі вакцини
сприяло утворенню стабільного рівня противірусних антитіл в організмі
тварин, який по групах суттєво відрізнявся, що, на нашу думку, було
пов’язано зі зниженням вмісту антигену в складі вакцини.

За результатами вивчення біологічних властивостей вірусу, режимів
культивування та інактивації вірусу діареї, підбору ад’юванту для
виготовлення вакцини було відібрано штам ВК–1, інактивований формаліном
при кінцевій концентрації 0,1 % з 40 % кремнійвміщуючого ад’юванту КЕ
10-01.

Вивчення імунобіологічних властивостей вакцини інактивованої проти
вірусної діареї великої рогатої худоби. З метою вивчення властивостей
вакцинного препарату нами визначено оптимальну імунізуючу дозу,
біохімічні показники крові щеплених тварин, антигенні та імуногенні
властивості вакцини при застосуванні на великій рогатій худобі різних
вікових груп та фізіологічного стану у виробничих умовах.

Щеплення тварин у дозі 5 та 10 см3 викликало утворення високого рівня
противірусних специфічних антитіл у тварин, але суттєвої різниці в
напруженості імунітету між цими дослідними групами нами не було виявлено
(рисунок 3), тому ми вважаємо дозу щеплення 10 см3 економічно не
доцільною.

Рис. 3 Динаміка приросту специфічних антитіл у сироватці крові корів
щеплених проти вірусної діареї

У проведеному досліді встановлено, що найвищий рівень антитіл
спостерігали в крові та молозиві щеплених проти вірусної діареї великої
рогатої худоби тварин у день отелення (рис 3,4), який зберігався в крові
щеплених тварин на рівні – 4,6±0,18 log2 протягом 6 місяців (термін
спостереження). У молоці рівень специфічних антитіл до вірусу діареї
поступово знижувався і практично зникав на 21-шу добу після отелення
(рис. 4).

Рис. 4 Титри специфічних до вірусу діареї антитіл у молозиві та молоці
щеплених корів

При біохімічному дослідженні сироватки крові щеплених проти вірусної
діареї корів було встановлено, що динаміка змін вмісту загального білка
корелювала зі змінами рівня імуноглобулінів, про що свідчила кореляція з
титром специфічних антитіл. При цьому концентрація альбумінів у
сироватці крові щеплених тварин протягом експерименту вірогідно не
відрізнялась від відповідних показників у контрольній групі та
коливалась у межах

42,5– 49,0 г/дм3.

Отримані дані свідчили про активацію гуморальної ланки імунної системи у
відповідь на дворазове введення вакцини інактивованої проти вірусної
діареї, що супроводжувалось як підвищенням кількості загального білка
та глобулінів, так і утворенням циркулюючих імунних комплексів (ЦІК)
середньої молекулярної маси в сироватці крові щеплених тварин.
Починаючи з 14 доби, відмічали поступове зростання цього показника, яке
тривало протягом всього експерименту, включно до 6 місяців після другого
введення препарату. Отже, достовірне підвищення концентрації ЦІК через
14 діб після першого введення та 7, 14, 21-ну доби після другого
введення складало 8,16; 18,40; 76,45; 43,00 та 27,73 %, відповідно.

Одним з важливих показників якості імунізуючого препарату є відсутність
його імуносупресивного впливу на організм тварини. Одержані результати
вказували на вірогідне зниження вмісту серомукоїдів у щеплених тварин
відносно значень показника в контрольній групі вже на 7-у добу після
першого введення препарату, а саме 10,61±0,67 мкг/см3 проти

12,68±0,60 мкг/см3. В подальшому рівень серомукоїдів у щеплених корів
коливався у межах 9,69–14,06 мкг/см3, що було нижче контрольних значень
в середньому на 8,52–26,43 %. Останнє дозволяло нам стверджувати, що
введення вакцини не викликало збільшення кількості серомукоїдів у крові
і свідчило про відсутність імуносупресивного впливу даного вакцинного
препарату на організм щеплених тварин.

Удосконалення методу титрування вірусу діареї та реакції нейтралізації
для визначення антитіл до вірусної діареї. Реакція нейтралізації є
універсальним, високоспецифічним і чутливим тестом, та служить еталоном
для оцінки інших реакцій у вірусології. З іншого боку вона трудомістка
та потребує значних витрат матеріалів. За нашими спостереженнями
проведення досліджень мікрометодом у порівнянні з класичною методикою
постановки РН дозволяло скоротити витрати компонентів реакції у 5 разів
та час на проведення досліджень у 8 разів.

За цих обставин було відпрацьовано й оптимізовано режими та умови
вирощування клітин КСТ та ТрТ у мікропланшетах, техніку та облік
результатів титрування вірусу, техніку постановки РН за мікрометодом для
визначення титрів специфічних до ВД антитіл. Визначено оптимальну
посівну концентрацію при вирощувані у мікропланшетах для клітин ТрТ та
КСТ, яка склала 3 х 105 клітин/см3 поживного середовища. Вона
забезпечувала формування рівномірного моношару клітин на 90–100 %
впродовж 24±2 годин. Зниження посівної концентрації суттєво збільшувало
строк формування моношару в лунках мікропланшет, а підвищення посівної
концентрації до 4х105–5х105, хоча і скорочувало термін формування, але
знижувала якість отриманого моношару.

При порівнянні результатів титрування мікрометодом та макрометодом нами
було проведено визначення титрів 6-ти зразків вірусу діареї в культурі
клітин КСТ за обома методами. Титр вірусу визначений за обома методами
відрізнявся лише на 0,02 – 0,07 lg ТЦД50/см3. Статистичний аналіз
отриманих даних підтвердив відсутність вірогідної різниці між титрами
вірусу, які визначали за мікро- та макрометодами (Р>0.05).

Таким чином, нами було встановлено, що мікрометод титрування вірусу
діареї є вірогідним і може бути використаний як базовий для проведення
подальших дослідів.

Дослідженням 18-ти імунних сироваток великої рогатої худоби у реакції
нейтралізації за мікро- та макрометодами не виявлено вірогідної різниці
в результатах досліджень за цими методами (Р>0.05).

Вивчення терміну зберігання вакцини інактивованої проти вірусної діареї
великої рогатої худоби. Під час зберігання вакцини термін її придатності
вивчали за такими показниками: стерильність, нешкідливість,
імуногенність, залишкова кількість формальдегіду, повнота інактивації
вірусу та стабільність.

Аналіз отриманих результатів показав, що:

вакцина залишалась стерильною за весь термін зберігання за

температури 4,0–8,0 (С;

була нешкідливою для лабораторних тварин – усі піддослідні миші вижили;

результати дослідження рівня імунної відповіді, яку індукувала вакцина,
свідчили про її високу активність, яка дорівнювала 5,0 log2 , та
зберігалась протягом 12-ти місяців (термін спостереження);

при дослідженні повноти інактивації вірусу в складі вакцини, (протягом
трьох послідовних пасажів у перещеплюваній культурі клітин)
цитопатогенної дії вірусу не виявлено, що свідчило про повну його
інактивацію і відповідало вимогам ТУ У;

дослідженням стабільності вакцини встановлено, що при тривалому
зберіганні вакцина частково розшаровувалась, але при легкому струшуванні
утворювала гомогенну емульсію;

доведено, що розроблена нами технологія виготовлення вакцини
інактивованої проти вірусної діареї великої рогатої худоби забезпечувала
отримання стерильного, нешкідливого та високоімуногенного препарату.

При дотриманні стандартних умов зберігання вакцина залишалась придатною
до застосування протягом 12-ти місяців (термін спостереження) з моменту
її виготовлення.

Визначення профілактичної ефективності вакцини проти вірусної діареї.
Профілактичну ефективність вакцини оцінювали за рівнем загибелі телят,
отриманих від щеплених корів та нетелей, у дослідному господарстві УААН.
Після щеплення вакциною захворіло з ознаками діареї та загинуло

до 6-місячного віку 6 новонароджених телят (2,4 %), у той час як у
попередньому році, коли вакцину проти вірусної діареї не застосовували,
загинуло з ознаками діареї 20 новонароджених телят, що складало 9,9 %.

З позитивними результатами вакцину випробувано для профілактики вірусної
діареї у неблагополучному щодо вірусної діареї господарстві Полтавської
області на поголів’ї понад 4000 голів великої рогатої худоби.

Максимальний титр антитіл в реакції нейтралізації отримано

на 28-му добу після другого введення вакцини – 6,7 log2 у телят та
7,4 log2 у корів. В порівнянні з рівнем антитіл до щеплення він
збільшився на 5,6 log2 і 5,4 log2, відповідно.

Збереженість телят зросла до 97,03 %, зменшилася кількість випадків
респіраторно-шлункових захворювань, середньодобовий приріст маси тіла
збільшився на 17 г, зменшилися економічні збитки в господарстві, що
свідчить про значну профілактичну ефективність розробленої нами вакцини.

Отримані дані дають підставу рекомендувати схему імунізації великої
рогатої худоби проти вірусної діареї, згідно якої вакцину вводять
нетелям та глибокотільним коровам за два місяці до отелення та телятам –
з

1 – 1,5 — місячного віку.

ВИСНОВКИ

На підставі аналізу даних про поширення вірусної діареї в світі,
вивчення основних імунобіологічних властивостей (інфекційних, антигенних
та імуногенних) епізоотичних (ВК-1, 25) та еталонного (Oregon C24V)
штамів вірусу діареї великої рогатої худоби, відпрацювання оптимальних
параметрів інактивації вірусу та підбору ад’юванту розроблено,
випробувано в комісійному досліді та впроваджено у виробництво вакцину
інактивовану проти вірусної діареї великої рогатої

худоби (ТУ У 24.4-00497087-010:2006, реєстраційне посвідчення

№ 2511-04-0292-07).

Вірусна діарея великої рогатої худоби зареєстровано в усіх частинах
світу. За даними МЕБ протягом 1996–2004 рр. цю хворобу встановлено у

110 країнах. Найбільш неблагополучною є ситуація щодо цього захворювання
в країнах Європейського континенту, де реєструється 32 % випадків
вірусної діареї в світі. За період спостереження (9 років) кількість
країн, де застосовують вакцинопрофілактику вірусної діареї, зросла в 1,5
рази, загальна кількість вакцинованих тварин – у 126 разів.

При вивченні чутливості культур клітин НТ, ТрТ, КСТ, НВ до вірусу діареї
встановлено їх різну чутливість до епізоотичних штамів ВК-1 і 25 та
еталонного Oregon C 24 V. Найвищу інфекційність мав вірус діареї штам
ВК-1, який накопичувався в культурі клітин КСТ у титрі

(7,38±0,05) lg ТЦД50/см3 та ТТр у титрі 7,08±0,21 lg ТЦД50/см3.

Вірус діареї штам ВК-1 антигенно споріднений з епізоотичним

штамом 25 (на 87 %) та з еталонним Oregon C24V (на 83 %). Антигенна
відмінність між цими штамами складала 4,9 % та 4,8 % відповідно.

Доведено стимуляцію функціональної активності щитовидної залози
тиреотропним гормоном гіпофізу у відповідь на щеплення тварин живим
вірусом діареї, що свідчить про супресивну дію вірусу та відсутність
супресивного впливу на імунокомпетентні клітини тварин після його
інактивації.

Концентрація формальдегіду 0,1 % є оптимальною для інактивації вірусу
діареї штаму ВК-1 за температури 37 °С протягом 24 годин. Застосування
ад’юванту КЕ 10-01 у вакцині інактивованій проти вірусної діареї
забезпечує найбільш виражені імуностимулюючі та пролонгуючі властивості,
про що свідчить приріст на 4 log2 противірусних антитіл в організмі
щеплених вакциною тварин та їх збереження в организмі тварин впродовж
6-ти місяців (термін спостереження). Оптимальне співвідношення антигену
та ад’юванту в вакцині складає 60 та 40 %, відповідно.

Визначення титру вірусу та постановка реакції нейтралізації за
мікрометодом скорочує витрати компонентів у 5 разів, а час на проведення
дослідження у 8 разів. Доведено відсутність вірогідної різниці у
результатах титрування вірусу та постановки реакції нейтралізації макро-
та мікрометодами (Р > 0,05).

Вакцина інактивована проти вірусної діареї при щепленні телят і корів у
дозі 5 см3 забезпечує високий рівень специфічного противірусного
імунітету впродовж 6-ти місяців (термін спостереження). Після
застосування вакцини антитіла до вірусу діареї накопичуються в молозиві
на рівні

6,8 log2 у день отелення і поступово зникають до 21 доби в молоці.
Своєчасне випоювання молозива новонародженим телятам сприяє їх захисту
від вірусної діареї та формуванню групового імунітету у стаді.

Розроблена технологія виготовлення вакцини інактивованої проти вірусної
діареї великої рогатої худоби дозволяє отримувати стерильний,
нешкідливий та антигенно активний препарат. У разі дотримання
стандартних умов зберігання вакцина залишається придатною до
застосування протягом 12 місяців (термін спостереження) з моменту її
виготовлення.

Пропозиції виробництву

“Методичні вказівки по постановці реакції нейтралізації мікрометодом
для визначення антитіл до вірусу діареї–хвороби слизових великої рогатої
худоби”, затверджені науково-методичною радою Державного департаменту
ветеринарної медицини МАП України (протокол № 1 від 12 грудня 2003 р.).

“Вакцина інактивована проти вірусної діареї великої рогатої худоби”:

ТУ У 24.4-00497087-010:2006 на “Вакцину інактивовану проти вірусної
діареї великої рогатої худоби”, затверджені Головним державним
інспектором ветеринарної медицини України 24 листопада 2006 року;

реєстраційне посвідчення № 2511-04-0292-07, видане Державним
департаментом ветеринарної медицини України 23 березня 2007 року;

“Інструкція з виготовлення та контролю вакцини інактивованої проти
вірусної діареї великої рогатої худоби”, розглянута методичною радою та
затверджена директором ННЦ „ІЕКВМ” 20 січня 2005 року;

“Настанова з застосування вакцини інактивованої проти вірусної діареї
великої рогатої худоби”, затверджена Головним державним інспектором
ветеринарної медицини України 24 листопада 2006 року.

СПИСОК основних праць,

опублікованих за темою дисертації

Вивчення реактогенних та антигенних властивостей дослiдних зразкiв
iнактивованої вакцини проти вiрусної дiареї великої рогатої худоби
/В. I. Стеценко, О. В. Годовський, Л. I. Кучерявенко, Л. П. Тризна//
Вет. медицина: Мiжвiд. темат. наук. зб.- Х., 2003.- Вип. 81.- С.343-350.
(Дисертантом проведені всі експериментальні дослідження, обробка даних
та частково їх узагальнення).

Годовский А. В. Оценка иммуногенной активности образцов инактивированной
вакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота с применением
различных адьювантов / А. В. Годовський // Вет. медицина: Мiжвiд. темат.
наук. зб. — Х., 2004. — Вип.83. — С.42-46.

Годовський О. В. Використання мікрометоду реакцiї нейтралiзацiї для
проведення монiторингу та визначення серопозитивностi до вiрусної
дiареї великої рогатої худоби / О. В. Годовський, М. В. Бабкiн // Вет.
медицина: Мiжвiд. темат. наук. зб.- Х., 2004.- Вип.84.- С.225-229.
(Дисертантом проведені всі експериментальні дослідження, обробка даних
та частково їх узагальнення).

Годовський О. В. Антигенна активнiсть iнактивованої вакцини проти
вiрусної дiареї великої рогатої худоби при застосуваннi на
глибокотiльних коровах/ О. В. Годовський // Вет. медицина: Мiжвiд.
темат. наук. зб. — Х., 2005. — Вип. 85, т. I. — С.289-293.

Деклараційний патент на корисну модель № 6072 Україна МПК А61К39/00
Вакцина інактивована проти вірусної діареї великої рогатої худоби / Б.
Т. Стегній, В. І. Стеценко, О. В. Годовський, М. В. Бабкін,
Л. І. Кучерявенко, Р. О. Кучерявенко (Україна). — № 20040806878; заявл.
16.08.2004; опубл. 15.04.2005; Бюл. № 4. — 2 с.

Годовський О.В. Вивчення імунобіологічних властивостей збудника та
розробка інактивованої вакцини проти вірусної діареї великої рогатої
худоби. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за
спеціальністю 16.00.03 – ветеринарна мікробіологія та вірусологія.

ННЦ “Інститут експериментальної та клінічної ветеринарної медицини”,
Харків, 2007.

Дисертація присвячена вивченню епізоотичної ситуації в світі та розробці
інактивованої вакцини проти вірусної діареї великої рогатої худоби. У
роботі теоретично обґрунтовано необхідність розробки вітчизняної вакцини
проти вірусної діареї великої рогатої худоби. Вивчено біологічні
властивості різних штамів вірусу діареї та їх антигенну спорідненість,
оптимізовано умови та режими культивування й інактивації штаму ВК–1
вірусу діареї, досліджено імуногормональну відповідь на щеплення живим
та інактивованим вірусом діареї, підібрано ад’ювант. Досліджені
гематологічні та біохімічні показники крові тварин, щеплених зразками
вакцини. Визначено оптимальну імунізуючу дозу, тривалість напруженого
імунітету та рівень антитіл до вірусу діареї у молозиві та молоці
щеплених тварин. Вдосконалено метод титрування вірусу діареї та
постановки реакції нейтралізації для визначення антитіл до вірусу
діареї. Визначено термін придатності вакцини, її профілактичну
ефективність. Розроблено нормативну документацію на вакцину та проведено
її комісійні випробування.

Ключові слова: вірусна діарея великої рогатої худоби, вірус діареї,
велика рогата худоба, реакція нейтралізації, інактивована вакцина,
антигенні властивості.

Годовский А.В. Изучение иммунобиологических свойств возбудителя и
разработка вакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота. –
Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по
специальности 16.00.03 – ветеринарная микробиология и вирусология.

ННЦ “Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины”,
Харьков, 2007.

Диссертация посвящена изучению эпизоотической ситуации в мире и
разработке инактивированной вакцины против вирусной диареи крупного
рогатого скота.

Установлено, что вирусная диарея крупного рогатого скота широко
распространена в мире. Наибольшее распространение она получила в Европе
(35 стран) и Америке (26 стран). Большинство стран Азии, по данным
Международного епизоотического бюро, благополучны в отношении вирусной
диареи крупного рогатого скота. Для профилактики вирусной диареи широко
используют вакцинацию животных. В период с 1996-го по 2004-й год
количество стран, в которых применяется вакцинопрофилактика против
вирусной диареи крупного рогатого скота, выросло в 1,5 раза, а общее
количество иммунизированных животных увеличилось в 126 раз.

В работе теоретически обоснована необходимость разработки отечественной
инактивированной вакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота.
Изучены биологические свойства разных штаммов вируса диареи.

Проведено по 9 последовательных пассажей каждого штамма вируса диареи:
Oregon С24V, ВК-1 и 25 в перевиваемых культурах клеток ТрТ, КСТ, ПТ и
ПО. По результатами исследований штаммы ВК–1 и 25 вируса диареи на
уровне 9-го пассажа в культурах клеток ТрТ и КСТ накапливались в

титрах (7,38±0,05) lg ТЦД50/см3 и (7,08±0,21) lg ТЦД50/см3
соответственно. Специфичность цитопатогенного действия вируса была
подтверждена в реакции имунофлуоресценции и полимеразной цепной реакции.

Изучено антигенное родство и различия между штаммами ВД. В результате
исследований было установлено родство между штаммами

ВК-1 и 25 на уровне 87 %, между штаммами ВК-1 и Oregon C24V – 83 %, а
между штаммами Oregon C24V и 25 – 80 %. Антигенное отличие рассчитанное
для этих штаммов, составило 4,9; 4,8 и 6,2 %, соответственно (В. А.
Прискока и др., 1983). По результатам этих исследований штамм ВК-1
выбран для конструирования вакцины.

При изучении условий инактивации вируса диареи установлено, что
оптимальная концентрация формальдегида составила 0,1 % с экспозицией 24
часа при температуре 37 °С.

Установлено отсутствие стимуляции функциональной активности щитовидной
железы тиреотропним гормоном гипофиза в ответ на введение живого вируса
диареи, что свидетельствует об иммуносупресивном действии живого вируса
и отсутствии иммуносупресивного действия после его инактивации.

В результате проведенных на лабораторных животных и крупном рогатом
скоте исследований по подбору адъюванта в составе вакцины было выбрано в
качестве адъюванта кремниевую эмульсию “КЭ 10-01” в соотношении 60 %
антигена к 40 % адъюванта.

С целью изучения свойств разработанного вакцинного препарата нами
определена оптимальная иммунизирующая доза – 5 см3 для животных всех
возрастных групп, продолжительность напряженного иммунитета у животных
составила 6 месяцев (срок наблюдения). Установлено, что антитела к
вирусу диареи находились в молозиве в максимальных титрах на уровне 6,8
log2 и постепенно снижались до контрольного уровня в молоке к 21-му дню
после отела.

При биохимическом исследовании сывороток крови вакцинированного против
вирусной диареи коров было установлено, что динамика изменений
содержания общего белка коррелировала с ростом уровня иммуноглобулинов,
что в свою очередь свидетельствовало о приросте количества общего белка
за счет увеличения концентрации специфических антител. При этом
концентрация альбуминов в сыворотке крови привитых животных в течение
эксперимента достоверно не отличалась от контрольных значений.

Усовершенствован метод титрования вируса диареи и постановки реакции
нейтрализации для определения антител к вирусу диареи, что позволило
сократить расходы компонентов реакции в 5 раз. Определен срок
пригодности вакцины, который составляет 12 месяцев. В комиссионном
исследовании изучена профилактическая эффективность разработанной
вакцины, подготовлена и утверждена нормативная документация на вакцину
инактивированную против вирусной диареи крупного рогатого скота.

Ключевые слова: вирусная диарея крупного рогатого скота, вирус диареи,
крупный рогатый скот, реакция нейтрализации, инактивированная вакцина,
антигенные свойства.

Godowskiy O.V. Studying of immunobiological properties of the pathologic
agent and development of inactivated vaccine against bovine viral
diarrhea.

– Manuscript.

Dissertation for Academic degree of Candidate of Veterinary Sciences,
specialty – 16.00.03 – Veterinary Microbiology and Virology. NSC
„Institute of Experimental and Clinical Veterinary Medicine”, Kharkiv,
2007.

Dissertation is devoted to the study of epizootic situation and
development of an inactivated vaccine against bovine viral diarrhea
virus. The necessity of development of the Ukrainian inactivated vaccine
against bovine viral diarrhea virushas been theoretically substantiated
in this work. Biological properties of different strains of bovine viral
diarrhea virus were studied. Conditions and regulations of the
cultivation of bovine viral diarrhea virus were optimized; VK — 1
strain, antigenic congeniality, conditions of virus inactivation were
studied. Immunohormonic response to inoculation of laboratory animals
with active and inactive virus of bovine viral diarrhea virus and VK — 1
strain were investigated; an adjuvant was chosen. Hematological and
biochemical indices in blood of rabbit, which had been vaccinated with
the samples of an inactivated vaccine, were studied. An optimal
immunized dose of the vaccine, duration of animals’ expressed immunity
and antibody level to the bovine viral diarrhea virus in inoculated
animals’ colostrums and milk was studied. The method for titration of
the bovine viral diarrhea virus and the neutralization test for the
determination of antibodies to the bovine viral diarrhea virus were
improved. Keeping time of the vaccine was determined, prophylactic
efficiency of the developed vaccine was studied. Technical documents on
the inactivate vaccine for bovine viral diarrhea virus were developed
and the commission tests were held.

Keywords: bovine viral diarrhea virus, bovine viral diarrhea,
neutralization test, inactivated vaccine, antigenic properties.

PAGE 20

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *