.

Цитологічні та імуноцитохімічні особливості епітелію шийки матки і цервікального каналу жінок фертильного віку при вірусному та бактеріальному інфікув

Язык: украинский
Формат: реферат
Тип документа: Word Doc
189 3569
Скачать документ

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

ПУСТОВАЛОВА ОЛЬГА ІВАНІВНА

УДК: 618.146:616.988+576.8.077.3/-022.7-076.5

Цитологічні та імуноцитохімічні особливості епітелію шийки матки і
цервікального каналу жінок фертильного віку при вірусному та
бактеріальному інфікуванні

14.03.09 – гістологія, цитологія та ембріологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ-2007

Дисертацією

є рукопис

Робота виконана в Інституті педіатрії, акушерства та гінекології АМН
України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

Задорожна Тамара Данилівна

Інститут педіатрії, акушерства та гінекології АМН України,
завідувач лабораторії патоморфології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Стеченко Людмила Олександрівна,
Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, професор кафедри
гістології та ембріології;

кандидат медичних наук, Шатрова Клавдія Михайлівна, Національна медична
академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, доцент
кафедри патологічної анатомії.

Провідна установа: Тернопільська державна медична академія імені І.Я.
Горбачевського, кафедра гістології, цитології та ембріології, МОЗ
України, м. Тернопіль.

Захист відбудеться „_____”_________________2007р. о_______ годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.06 при Національному
медичному університеті імені О.О. Богомольця (03057, м. Київ, проспект
Перемоги, 34, морфологічний корпус).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного
університету імені О.О. Богомольця (03057, м. Київ, вул. Зоологічна, 1)

Автореферат розісланий „______”_________________________2007р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук, професор
Грабовий О.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Запальні захворювання шийки матки займають одне з
перших місць у структурі захворюваності жінок, при цьому їх кількість
продовжує зростати, особливо в групі пацієнток репродуктивного віку
[Анишина М.Б., 2003; Глуховец Б.И., Глуховец Н.Г., 2006]. Інфекційні
урогенітальні захворювання, етіологічними агентами яких можуть бути як
бактеріальні, так і вірусні фактори, являють собою важливу
медико-соціальну проблему у зв’язку з можливістю розвитку важких
ускладнень з боку репродуктивної системи жінок [Сидорова И.С., Леваков
С.А. 2006]. Серед захворювань, які передаються статевим шляхом, особливе
значення мають папіломавірусна (ВПЛ) та герпетична (ВПГ) інфекції
геніталій. Це пов’язано, по-перше, з досить високою частотою
розповсюдженості інфекції, по-друге, ВПЛ та ВПГ надзвичайно складні для
діагностики, особливо їх латентні форми, при яких морфологічні зміни в
клітинах не спостерігаються, по-третє – високою онкогенною активністю
вірусів [Кулаков В.И., Аполихина И.Ф., 1999; Киселев В.И., 2004].

У зв’язку з широкою розповсюдженістю запальних ушкоджень шийки матки,
все більшу актуальність набувають цитологічні дослідження, результати
яких є важливими для ранньої діагностики неопластичних змін епітелію
шийки матки [Бахутова Г.А., Тамразова Л.И., 2004]. В останні роки
цитологічні дослідження поповнилися важливими для діагностики
імуноцитохімічними методами, які набувають широкого застосування у
світі. Особливе місце серед них займають методи направлені на виявлення
рецепторів апоптозу та проліферації, оскільки порушення регуляторних
механізмів апоптозу може призводити до проліферації клітин з
неопластичними змінами [Райхлин Н.Т., Райхлин А.Н., 2002]. Встановлено,
що гормони здатні індукувати ріст епітелію шийки матки, пошкодженого
вірусами, з утворенням кондилом, а також підвищують рівень
вірус-специфічних ДНК, а деякі епідеміологічні дослідження відводять
експозиції естрогену таку ж роль як інфекції папіломавірусу людини в
цервікальному канцерогенезі [H.B. Nair, R. Luthra, N. Kirma et. al.,
2005].

Аналіз наукових робіт показав, що значна кількість їх присвячена
особливостям терапевтичного лікування жінок з вірусним та бактеріальним
інфікуванням. Морфологічні аспекти проблеми у вітчизняній та зарубіжній
літературі освітлені у меншому ступені, ніж етіологічні, лікувальні та
профілактичні. Сучасна морфологічна діагностика хронічних запальних
захворювань шийки матки потребує принципово інших підходів. Поява
імуноцитохімічних методів дослідження з використанням моноклональних
антитіл відкрила нові перспективи в якісній діагностиці патологічних
станів шийки матки.

До теперішнього часу в літературі не висвітлені імуноцитохімічні маркери
процесу апоптозу, не встановлені важливі для клінічної діагностики
показники апоптозного, проліферативного індексів та їх співвідношення в
епітелії шийки матки жінок фертильного віку при хронічних запальних
захворюваннях репродуктивних органів. Тому дуже важливим є вивчення
імуноцитохімічних особливостей факторів, які беруть участь у запуску
процесу апоптозу та його регуляції, таких як Fas(APO-1\CD95) та вcl-2,
маркерів проліферативних процесів (Кі-67, PCNA), особливостей експресії
рецепторів до естрогенів та прогестерону, проведення CIN-тесту на ген
р16 (INK4a/CDKN2a), який визначає клітини з онкоцитодеструкцією на
ранніх стадіях.

Зв’язок роботи з науковими програмами, темами, планами. Основні
положення дисертації були розроблені в рамках Державної
науково-технічної програми: “Захист генофонду населення України”.
Фрагменти роботи виконувались в рамках науково-дослідних робіт ІПАГ АМН
України: „Визначення ролі апоптоза і апонекроза в розвитку склеротичних
процесів з метою виявлення маркерів хронізації соматичних захворювань у
дітей та жінок”, № держреєстрації – 01.03. U 002 250; „Вивчити
структурні особливості апоптозу і проліферативних реакцій, як можливих
маркерів змін фето-плацентарного комплексу”, № держреєстрації –
01.00U000144; „Клініко-морфологічні особливості та порівняльна
цитологічна, гістологічна і імуноцитохімічна характеристика стану
ендометрію у жінок фертильного віку в різні фази менструального циклу”,
№ держреєстрації – 01.04. U009106.

Мета дослідження – визначення цитологічних та імуноцитохімічних
особливостей епітелію піхвової поверхні і цервікального каналу шийки
матки жінок фертильного віку при вірусному та бактеріальному інфікуванні
для виявлення ранніх структурних змін.

Задачі дослідження:

На підставі загальноцитологічних та імуноцитохімічних методів
дослідження виявити особливості клітин епітелію піхвової поверхні та
цервікального каналу шийки матки з визначенням індексів апоптозу,
проліферації і експресії рецепторів до естрогенів і прогестерону,
проведення CIN- тесту на ген р16 (INK4a/CDKN2a) в мазках жінок
фертильного віку при вірусному інфікуванні (герпетична та
папіломавірусна інфекції).

На підставі загальноцитологічних та імуноцитохімічних методів
дослідження виявити особливості клітин епітелію піхвової поверхні та
цервікального каналу шийки матки з визначенням індексів апоптозу,
проліферації і експресії рецепторів до естрогенів і прогестерону,
проведення CIN-тесту на ген р16 (INK4a/CDKN2a) у мазках жінок
фертильного віку при бактеріальному інфікуванні.

Дати порівняльну оцінку цитологічних та імуноцитохімічних проявів
процесів апоптозу, проліферації та експресії рецепторів до естрогенів і
прогестерону, показників CIN- тесту на ген р16 (INK4a/CDKN2a) в епітелії
шийки матки жінок при бактеріальному та вірусному інфікуванні.

На підставі загальноцитологічних методів дослідження провести
морфометричний аналіз клітинного складу мазків з шийки матки з
урахуванням клітин запальної інфільтрації (нейтрофілів, лімфоцитів) та
макрофагальної реакції.

Визначити маркери та критерії діагностики ушкоджень епітелію шийки матки
жінок фертильного віку при бактеріальному та вірусному інфікуванні.

Об’єкт дослідження – цитологічні мазки з піхвової поверхні та
цервікального каналу шийки матки жінок фертильного віку в фолікуліновій
фазі менструального циклу.

Предмет дослідження – цитологічні та імуноцитохімічні особливості
епітелію піхвової поверхні і цервікального каналу шийки матки жінок
фертильного віку при вірусному та бактеріальному інфікуванні.

Методи дослідження: загальноцитологічний, морфометричний,
імуноцитохімічні методи та статистичний аналіз, за допомогою якого
оцінювали достовірність одержаних результатів.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше на підставі імуноцитохімічних досліджень встановлено підвищення
індексів апоптозу та проліферації в клітинах плоского епітелію шийки
матки жінок з вірусним інфікуванням порівняно з групою контролю.
Співставлення показників цих індексів виявило переважання
проліферативних процесів при вірусному інфікуванні, що свідчить про
порушення регенераторних механізмів і є передумовою розвитку
гіперпластичних процесів.

Встановлено, що підвищення рівня експресії рецепторів до естрогенів в
ядрах клітин плоского епітелію цервікального каналу на фоні позитивного
CIN- тесту на ген р16 (INK4a/CDKN2a) при вірусному інфікуванні жінок є
прогностичним маркером розвитку неопластичних процесів в шийці матки.

Вперше на підставі імуноцитохімічних методів дослідження представлені в
порівняльному аспекті маркери апоптоза (Fas(APO-1\CD95), вcl-2),
проліферативних процесів (Кі-67, PCNA), експресія рецепторів до
естрогенів та прогестерону в епітелії шийки матки жінок при вірусному та
бактеріальному інфікуванні.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені цитологічні та
імуноцитохімічні критерії ушкодження клітин епітелію шийки матки та
визначені індекси апоптозу і проліферації доцільні для використання у
практиці патоморфологічних і спеціалізованих імуноцитохімічних
лабораторій для оптимізації ранньої диференціальної діагностики та
розробки обґрунтованої індивідуальної тактики лікування жінок при
вірусному та бактеріальному інфікуванні. Теоретичні положення та
практичні рекомендації можуть бути використані у навчальному процесі
післядипломної підготовки цитологів та патоморфологів.

Особистий внесок здобувача. Розробку завдань, відбір груп дослідження,
загальноцитологічні, імуноцитохімічні, морфометричні дослідження,
підрахунок та статистичну обробку отриманих результатів, співставлення
їх між групами, аналіз та фотодокументування усіх цитологічних
препаратів, підготовку наукових даних до публікацій проведено автором
самостійно. Узагальнення отриманих результатів, обгрунтування висновків
та практичних рекомендацій проведено спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися
19.09.2006 на засіданні лабораторії патоморфології ІПАГ АМН України.
Дисертаційна робота апробована 05.12.2006 року на засіданні
лабораторно-експериментального відділу ІПАГ АМН України.

Публікації. Матеріали дисертації знайшли своє відображення у 3 статтях,
надрукованих у фахових наукових виданнях, рекомендованих ВАК України.

Структура та обсяг дисертації. Результати дисертації викладено на 148
сторінках (обсяг тексту основної частини 122 сторінки). Робота
складається із вступу, огляду літератури, розділу “Матеріали та методи
дослідження”, розділу власних досліджень, аналізу одержаних результатів,
висновків, списку використаних джерел. Роботу проілюстровано 71 рисунком
та 22 таблицями. Список літератури містить 192 джерела вітчизняних та
зарубіжних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Нами вивчалися цитологічні мазки з
піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки 110 жінок
фертильного віку, які знаходились на обстеженні у відділенні проблем
здоров’я жінок фертильного віку Інституту педіатрії, акушерства та
гінекології АМН України, у фолікуліновій фазі менструального циклу.
Матеріал забраний при первинному звертанні пацієнток, тобто до
проведення будь-якої терапії.

Досліджений матеріал було розподілено на наступні групи:

контрольну групу спостережень становили цитологічні мазки від жінок без
проявів запальних процесів репродуктивних органів (1 група,
вірус-негативна) – 20 досліджень;

до 2 групи увійшли цитологічні мазки від жінок з ВПЛ-інфікуванням (тип
16, 18) – 30 досліджень;

до 3 групи увійшли мазки від жінок з інфікуванням ВПЛ (тип 16, 18),
асоційованим з ВПГ 2 – го типу – 30 досліджень;

до 4 групи увійшли цитологічні мазки від жінок зі змішаним бактеріальним
інфікуванням (гарднерела, факультативно анаеробні коки), асоційованим з
трихомонадною інфекцією -30 досліджень;

Для вирішення поставлених завдань у дослідженні були використані
наступні методи:

1) загальноцитологічний – забарвлення за Романовським–Гімзе та
Папаніколау;

2) морфометричний:

а) підрахунок клітин з дистрофічними змінами у перерахунку на 500
клітин; б) підрахунок клітин, які характеризують запальну інфільтрацію
(нейтрофіли, лімфоцити та макрофаги) у перерахунку на 500 клітин; в)
підрахунок клітин, які характеризують морфологічні зміни в епітелії під
впливом бактеріальних та вірусних агентів (дискаріоз, паракератоз,
койлоцитоз, дво- та багатоядерність, дезагрегація хроматину та інш.) у
перерахунку на 500 клітин; г) індекс апоптоза (ІА) визначали за
результатами імуноцитохімічного дослідження (кількість позитивно
забарвлених клітин поділену на 1000 клітин і помножену на 100%); д)
індекс проліферації (ІП) визначали за результатами імуноцитохімічного
дослідження (кількість позитивно забарвлених клітин поділену на 1000
клітин і помножену на 100%).

3) імуноцитохімічні методи: непрямі стрептавідин – пероксидазні методи
виявлення експресії антигену рецепторів Fas(Apo-1/CD95),
антиапоптотичного протеїну всl-2, проліферативного антигену Кі-67,
ядерного антигену проліферативної активності клітин (PCNA), рецепторів
до естрогенів та прогестерону. З метою виявлення неопластичних змін в
клітинах епітелію шийки матки використовували CIN-тест для визначення
експресії антигену інгібітора кіназ CdK4,6-білка р16NK4a.

Імуноцитохімічні дослідження виконували на цитологічних мазках після
заморожування (-20єС), які потім фіксували в ЗФА (забуферений
формалін-ацетон), блокували ендогенну пероксидазну активність
пероксидазним блоком (DAKO), неспецифічне зв’язування білків – двома
краплями 1 – процентного бичачого сивороткового антигену (BSA). Після
промивання у фосфатному буфері рН 7,4 (PBS) проводили імуноферментну
реакцію. На першому етапі наносили немічені первинні антитіла до
відповідного антигену (фірма DAKO, Данія) на одну годину. На другому
етапі наносили вторинні антитіла на 30 хв. Потім промивали в PBS –
буфері, наносили дві краплі комплексу стрептавідин–пероксидази та
інкубували на протязі 30 хв., промивали і наносили АЕС – хромоген-розчин
– інкубація від 5 до 20 хв., до появи червоно-коричневого забарвлення, з
наступним дофарбовуванням гематоксиліном Майєра.

Інтерпретацію результатів імуноцитохімічного забарвлення проводили
залежно від типу реакції. Розповсюдженість та інтенсивність
імуноцитохімічної реакції оцінювали напівкількісним методом в балах, від
0 до 3:

1) розповсюдженість (у 8-ми полях зору):

а) 0 – немає забарвлення; б) 1 – менше 10% позитивно забарвлених клітин;
в) 2 – більше 10% і менше 50% позитивно забарвлених клітин; г) 3 –
гомогенне забарвлення більше 50% клітин.

2) інтенсивність реакції:

а) 0 балів – немає видимого забарвлення; б) 1 бал – слабке забарвлення;

в) 2 бали – помірне забарвлення; г) 3 бали – виражене забарвлення;

Бактеріоскопію здійснювали по мазкам виділень, пофарбованим по Граму, а
також за методикою Романовського-Гімзе із трьох досліджуваних ділянок
(сечовивідний канал, канал шийки матки та піхва). Визначали наявність
патогенної флори: трихомонад, гарднерел, коків.

Бактеріологічні посіви виділень із статевих шляхів проводились на
кров’яному агарі, грунті Етта, цукровому бульйоні для виявлення St.
aureus, St. Epidermal, Str. Agalact, Klebsiella, E. Colli, Enterococcus
та грибів роду Candida.

Для тестування в досліджуваному матеріалі (цервікальному слизу) міко- і
уреаплазми, виявлення ДНК онкогенних типів ВПЛ (16, 18), ДНК ВПГ 2-го
типу та Trichomonas Vaginalis використовували метод полімеразної
ланцюгової реакції (ПЛР).

Оцінка диспластичних процесів в шийці матки проводилась згідно з
класифікацією “Bethesda system” (2001). Визначався легкий, помірний та
виразний ступені цервікальної інтраепітеліальної неоплазії (CIN 1; 2;
3).

Отримані данні були статистично оброблені за допомогою програми SPSS for
Windows (версія 13.0) та Microsoft Office Excel2003 на персональному
комп’ютері Рentium 4 ІВМ. Морфологічні, морфометричні та бактеріскопічні
дослідження цитологічних препаратів проведено на базі лабораторій
патоморфології і бактеріології Інституту ПАГ АМН України. Дослідження
препаратів в прохідному світлі проводили на дослідницькому мікроскопі
“Olуmpus ВН-2” (Японія).

Отже, комплекс загальноцитологічних, імуноцитохімічних та морфометричних
методів дослідження було здійснено так, щоб отримати дані по невивченим
або вивченим недостатньо питанням цитологічних та імуноцитохімічних
особливостей епітелію шийки матки жінок фертильного віку при вірусному
та бактеріальному інфікуванні.

Результати дослідження та їх обговорення. Для проведення порівняльної
цитологічної, морфометричної та імуноцитохімічної характеристики стану
епітелію піхвової поверхні та цервікального каналу шийки матки ми
відібрали цитологічні мазки від жінок, які проходили профілактичний
огляд, без проявів запальних процесів репродуктивних органів (1 група –
контрольна, вірус-негативна).

В результаті проведеного комплексного цитологічного, морфометричного та
імуноцитохімічного дослідження мазків з піхвової поверхні та
цервікального каналу шийки матки жінок 1 групи у фолікуліновій фазі
менструального циклу встановлено, що клітинний склад мазків повністю
відповідав фазі менструального циклу, дистрофічні зміни клітин епітелію
піхвової поверхні шийки матки становили в середньому (1,80+0,05) %, в
цервікальному каналі – (0,91+0,03) %. Клітини запальної інфільтрації
були представлені, в основному, поодинокими нейтрофілами, які в
середньому в мазках з піхвової поверхні шийки матки становили
(6,00(0,18) %, в мазках з цервікального каналу – (3,60(0,10) %,
лімфоцитами – (0,35(0,01) % та (1,40(0,04) % відповідно, що свідчить про
відсутність запальних процесів репродуктивних органів. У досліджених
мазках макрофаги виявлено в незначній кількості, в середньому вони
становили (2,95(0,09) % та (1,95(0,06) % відповідно. Мікрофлора
характеризувалася наявністю в мазках лактобактерій, які забезпечують
підтримку нормального біоценозу піхви.

Аналіз даних імуноцитохімічних досліджень виявив помірний рівень
експресії (1-2 бали) антигену рецепторів Fas (Apo-1/CD95) на фоні слабко
вираженої експресії антигену антиапоптотичного протеїну bcl-2 (0-1 бал)
в цитоплазмі клітин епітелію. Індекс апоптозу становив в середньому
(1,60+0,05) % в мазках з піхвової поверхні шийки матки та (2,20+0,07)% в
плоскому епітелії цервікального каналу. Рівень експресії
проліферативного антигену Кі-67 та ядерного антигену проліферативної
активності клітин (PCNA) в ядрах епітеліальних клітин був слабким (0-1
бал), індекс проліферації в епітелії піхвової поверхні та цервікального
каналу шийки матки в середньому становив (2,10+0,06 та 2,60+0,09) %
відповідно, розповсюдженість становила 1-2 бали. Експресія антигену до
рецепторів естрогенів в ядрах епітеліальних клітин була слабо виразною
(до 1 балу), до рецептору прогестерону та антигену інгібітора кіназ
CdK4,6-білка р16NK4a – негативна.

Таким чином, в результаті проведеного комплексного цитологічного,
морфометричного та імуноцитохімічного дослідження мазків з піхвової
поверхні та цервікального каналу шийки матки жінок 1 групи можна зробити
висновок, що клітинний склад мазків повністю відповідає фазі
менструального циклу, морфологічні зміни в клітинах епітелію не
спостерігаються, гострі та хронічні запальні процеси – відсутні.
Проліферативна та апоптотична активність клітин плоского і залозистого
епітелію невисока, що вказує на збалансованність цих процесів і
узгоджується з даними літератури [J.H. Zhou, H.Z. Chen et al., 2006].
Помірний рівень експресії рецепторів до естрогенів (ЕР) і відсутність
експресії рецепторів до прогестерону (ПР) відповідає фазі менструального
циклу. CIN-тест показав негативний результат, що свідчить про
відсутність неопластичних змін в клітинах епітелію шийки матки жінок
контрольної групи.

Проведене комплексне цитологічне, морфометричне та імуноцитохімічне
дослідження мазків з піхвової поверхні та цервікального каналу шийки
матки жінок з інфікуванням вірусом папіломи людини 16, 18 типів (2
група) виявило наявність виразних дистрофічних змін клітин епітелію
піхвової поверхні і цервікального каналу шийки матки, які проявлялись у
вигляді каріолізису, каріопікнозу, оголеності ядер, появою шарів клітин
залозистого і плоского епітелію з ознаками розпаду, дифузною вакуольною
дистрофією цитоплазми, збільшенням розмірів клітин та ядер.

Характерним для вірусного інфікування є формування цитоплазматичних та
ядерних включень і вакуолей. Нашими дослідженнями встановлено значне
збільшення кількості епітеліальних клітин з вакуолізацією ядра та
цитоплазми. Дистрофічні зміни цитоплазми епітеліальних клітин піхвової
поверхні шийки матки становили в середньому (76,35+2,33)%, вакуолізація
ядер – (26,70+0,85) %, в епітеліальних клітинах цервікального каналу
відповідно – (73,90+2,22) %, (31,2+0,96) %.

При цьому, як в мазках з цервікального каналу, так і в мазках з піхвової
поверхні шийки матки виявлялись характерні для вірусного інфікування
цитологічні ознаки, обумовлені цитопатогенною дією ДНК- вмісних вірусів
папіломи людини: койлоцити, двоядерні клітини, кератиноцити, відмічалась
амфофілія цитоплазми. Ці морфологічні зміни були достовірно (р

Нашли опечатку? Выделите и нажмите CTRL+Enter

Похожие документы
Обсуждение

Ответить

Курсовые, Дипломы, Рефераты на заказ в кратчайшие сроки
Заказать реферат!
UkrReferat.com. Всі права захищені. 2000-2020